Laporan Fraksinasi Sel

FRAKSINASI SEL Muhammad Zulfikar Mahmudin 1147020042 Kelompok 3, 4B Jurusan Biologi Fakultas Sains dan Teknologi UIN Sunan Gunung Djati Bandung E-mail : [email protected] ABSTRAK Fraksinasi sel adalah teknik untuk memisahkan bagian-bagian sel. Secara umum, teknik ini melibatkan homogenisasi, yaitu pemecahan sel secara halus, dan sentrifugasi, yaitu pemisahan komponen-komponen sel oleh gaya sentrifugal dalam alat sentrifuge. Tujuan dari praktikum kali ini adalah memisahkan komponen sel untuk membedakan komponenkomponen sel tersebut. Prosedur kerja pertama menyiapkan alat dan bahan, kemudian membuat homogenate daun bayam dengan blender yang telah diberi larutan sukrosa 2%, mengambil 1,5 ml homogenate pada tabung mikrofuge, dan memutarnya dengan sentrifugasi 5000 rpm selama 15 menit, memisahkan supernatan dan memindahkan ke tabung mikrofuge yang baru, mengencerkan endapan atau pellet dengan menambahkan 200µl PBS, menambahkan metylen blue dengan perbandingan 1:1, meneteskan pada kaca objek dan memeriksa dibawah mikroskop dengan perbesaran 40x10, mengamati komponen sel yang di dapat, memutar kembali supernatant yang di dapat dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit, mendiamkan sejenak kemudian mengulangi dengan kecepatan yang sama selama 5 menit, memisahkan endapan dan membuang supernatan, mengencerkan kembali endapan atau pellet dengan menambahkan 100 µl PBS dan memberi janus green di bawah mikroskop dengan perbesaran 10x100, mengamati organel sel yang di dapat dan membuat catatan maupun gambarnya. Hasil yang didapat adalah densitas inti sel lebih besar dibandingkan dengan densitas mitokondria ditunjukkan dari bobot inti sel yang lebih besar dibandingkan dengan bobot mitokondria. Kata Kunci: Bayam, Fraksinasi, Homogenate, Pellet, Sentrifugasi.

I.

PENDAHULUAN

Perkembangan teknologi yang

bagian bawah tabung sentrifuge, dan

semakin pesat memungkinkan orang

supernatan, yang terdiri atas bagian-

untuk bisa melihat struktur yang paling

bagian sel yang lebih kecil yang

kecil dalam kehidupan kita yaitu sel.

tersuspensi dalam cairan di atas pelet

Pengamatan sel dengan mikroskop terus

tersebut

memperoleh kemajuan seiring dengan

sentrifugasi kembali dengan kecepatan

penemuan

penyempurnaan

yang lebih tinggi untuk mendapatkan

mikroskop itu sendiri. Sebagai bagian

pelet yang lebih ringan atau kecil

dari makhluk hidup juga mengandung

daripada

banyak komponen atau bagian-bagian

sentrifugasi

dari sel yang kemudian dikenal dengan

disentrifugasi dengan kecepatan yang

organel. Untuk bisa mempelajari organel

makin

sel dapat di lakukan dengan teknik

komponen yang makin kecil dalam pelet

fraksionasi sel, sehingga kita dapat

yang berurutan. Pelet tersebut dapat di

memisahkan organel utama sehingga

resuspensi dan dimurnikan lebih lanjut

fungsinya dapat dipelajari (Ningsih,

dengan sentrifugasi densitas gradien

2006). teknik

(Horton , 2006). Fraksionasi sel digunakan untuk

untuk memisahkan bagian-bagian sel.

mempelajari sifat biokimia dan fisiologi

Secara umum, teknik ini melibatkan

organel di luar sel. Prosedur dasar

homogenisasi,

fraksionasi

sel

secara halus, dan sentrifugasi, yaitu

homogenasi

untuk

pemisahan

sel

membran plasma dan dinding sel untuk

gaya sentrifugal dalam alat

mengeluarkan sitoplasma dan kemudian

sentrifuge. Pemutaran homogenat di

dilanjutkan dengan sentrifugasi untuk

dalam

memisahkan organel sel. Kemurnian tiap

dan

Fraksinasi

oleh

sel

yaitu

adalah

pemecahan

komponen-komponen

sentrifuge

akan

sel

memisahkan

.

Supernatan

pelet

pertama,

diferensial,

tinggi

sehingga

dengan

didapatkan

dimulai

komfirmasi

di

supernatan

dengan

menghancurkan

bagian-bagian sel kedalam dua fraksi,

fraksi

yaitu pelet, yang terdiri atas struktur-

mikroskop (Metzler, 2001).

struktur lebih besar yang terkumpul di

di

dapat

menggunakan

Teknik yang digunakan untuk

Alat

yang

digunakan

pada

pemisahan organel sel adalah semata-

praktikum kali ini adalah homogenizer

mata di dasarkan pada sentrifugasi,

(blender), sentrifuge, mikro pipet dan tip

kepadatan

dan

(100µl, 1000µl), tabung mikrofuge,

perbedaan

koefisien

kecepatan

membuat

kepadatan

dan

mikroskop cahaya, kaca objek dan gelas

sedimentasi. Hasil akhir dari proses

penutup. Bahan yang digunakan adalah

sentrifugasi yaitu organel sel dapat

daun bayam, sukrosa 2%, PBS (Phospat

keluar atau lepas dari membran plasma.

Buffer Saline), metylen blue, janus

Pelet yang di hasilkan dari skema atau proses

sentrifugasi

pertama

dapat

mengandung organel namun dengan presentase kecil. Fraksi lebih lanjut pada proses sentrifugasi akan menghasilkan inti,

mitokondria,

serta

mikrosom

masing-masing dengan densitas yang berbeda. Langkah-langkah sentrifugasi di lakukan dalam larutan buffer

agar

struktur protein tetap lestari (Nilsson, 2004). Tujuan dari praktikum kali ini adalah memisahkan komponen sel untuk membedakan komponen-komponen sel

II.3.

green. Langkah Kerja Langkah pertama yang dilakukan adalah menyiapkan alat dan bahan, kemudian membuat homogenate daun bayam dengan cara menghancurkan daun bayam menggunakan blender yang sebelumnya telah diberi larutan sukrosa 2%. Selanjutnya mengambil 1,5 ml homogenate pada tabung mikrofuge, dan memutarnya dengan sentrifugasi 5000 rpm selama 15 menit, memisahkan supernatant dan memindahkan ke tabung mikrofuge yang baru, lalu mengencerkan endapan

tersebut.

atau

pellet

dengan

menambahkan 200µl PBS, kemudian II.

METODE II.1. Lokasi

menambahkan metylen blue dengan dan

Waktu

Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Terpadu I UIN Sunan Gunung Djati Bandung pada pukul 15.30-18.00 WIB. II.2. Alat dan Bahan

perbandingan 1:1, meneteskan pada kaca objek

dan

memeriksa

dibawah

mikroskop dengan perbesaran 40x10, lalu mengamati komponen sel yang di dapat, dan membuat catatan maupun gambarnya.

Selanjutnya

memutar

kembali supernatant yang di dapat

sebelumnya dengan kecepatan 12.000

endapan

rpm selama 10 menit, setelah selesai lalu

menambahkan 100 µl PBS dan memberi

mendiamkan

kemudian

janus green di bawah mikroskp dengan

mengulangi lagi dengan kecepatan yang

perbesaran 10x100, dan yang terakhir

sama selama 5 menit, lalu memisahkan

adalah mengamati organel sel yang di

endapan dan membuang supernatant,

dapat juga membuat catatan maupun

kemudian

gambarnya.

III.

sejenak

mengencerkan

kembali

atau

pellet

dengan

HASIL DAN PEMBAHASAN

IV.

V.

VI.

Foto Pengamatan

Literatur

No.

VIII. IX. XII. 2 2 1

VII. 1.

X.

Perbesaran: 10x10 Sumber: (Dokumentasi Pribadi, 2016). XV. Keterangan: 1. Inti Sel 2. Mitokondria

XI.

XVI.

Percobaan

ini

(Rickwood, 2000). Fraksionasi sel ini

adalah mengenai fraksinasi subseluler.

dapat digunakan untuk mempersiapkan

Prinsip dari percobaan ini adalah partikel

komponen-komponen spesifik sel dalam

yang tersuspensi akan mengendap ke

jumlah besar untuk mengkaji komposisi

dasar karena pengaruh gravitasi, juga

dan

didasarkan atas massa, ukuran, panjang

Komponen spesifik yang ada pada

partikel,

percobaan

dan

densitas

kali

XIII. Perbesaran: 10x10 XIV. Sumber: (Behike, 2010)

partikel

fungsinya ini

(Campbell ialah

inti

2000) sel

dan

mitokondria.

Kedua

organel

ini

negara isotonik. PBS sering digunakan

merupakan perpustakaan genetik yang

sebagai

dimiliki oleh sel eukariot. Hal itu

berbagai

dikarenakan keduanya memiliki struktur

mempertahankan pH protein. Protein

DNA yang mengontrol sistem kerja pada

memerlukan kisaran pH tertentu untuk

sel tersebut. Pada proses fraksinasi

menjaga netralitas pada asam amino

digunakan

yaitu

tertentu, untuk mempertahankan struktur

sukrosa 2%m dan PBS (Phosphat Buffer

protein. Jika tidak, struktur protein akan

Saline),

dua

bahan

menurut

menjelaskan

bahwa

kimia

larutan

penyangga

eksperimen

Artika

(2010)

terdenaturasi.

sukrosa

EDTA

XVII.

dalam untuk

Fraksionasi

sel

berfungsi untuk menjaga struktur bayam

dilakukan dengan menggunakan alat

supaya tidak mati sel-selnya sehingga

sentrifuse yang prosesnya dinamakan

ketika diisolasi masih bisa berfungsi.

sentrifugasi. Sentrifugasi ini dilakukan

Sedangkan fungsi PBS menurut Yuwono

berdasarkan perbedaan densitas molekul

(2008) adalah PBS sering digunakan

sel.

dalam percobaan biologi sel untuk

sentrifugasi untuk pemisahannya. Prinsip

mempertahankan osmolaritas sel. Garam

kerja

mengandung ion, yang menyeimbangkan

substansi

jumlah ion garam di dalam sel. Jika sel

molekul dengan cara memberikan gaya

yang tenggelam ke dalam solusi yang

sentrifugal sehingga substansi yang lebih

memiliki terlalu banyak garam ion, air

berat (pelet) akan berada di dasar

akan bocor keluar dari sel,menyebabkan

sedangkan substansi yang lebih ringan

sel menyusut. Sebaliknya, jika sel

(supernatan) akan terletak di atas. Teknik

terbenam ke dalam solusi yang memiliki

ini dapat digunakan untuk mengisolasi

ion terlalu sedikit garam, air akan masuk

dan mengkarakterisasi molekul biologi

ke dalam sel, menyebabkan sel pecah.

juga komponen subseluler (Underwood,

Oleh karena itu, sangat penting saat

2002).

melakukan percobaan biologi sel untuk

dilakukan sentrifugasi sebanyak dua

menjaga sel-sel di osmolaritas tertentu.

kali. Penyebabnya organel mitokondria

PBS adalah pada osmolaritas yang

yang kecil membutuhkan perbedaan

benaruntuk

kecepatan yang besar dalam sentrifugasi.

menjaga

sel-sel

dalam

Percobaan sentrifus

ini adalah

berdasarkan

Isolasi

fraksi

menggunakan memisahkan berat

jenis

mitokondria

Hal ini dikarenakan semakin kecil

Metylen blue tidak beracun, sehingga

ukuran suatu komponen sel maka akan

aman digunakan. Secara fisik, metylen

semakin

blue memberi warna pada sel, namun

sulit

untuk

mendapatkan

fraksinya dan semakin besar kecepatan

secara

yang

metabolisme

digunakan

untuk

mengisolasi

komponen tersebut (Hendra, 2001). XVIII.

kimia

tidak

dalam

menggangu sel,

sehingga

pengamatan tetap akurat. Selain itu,

Berdasarkan

metylen blue bisa menjadi indikator

perbedaan densitas tersebut, mitokondria

adanya

yang memiliki densitas yang lebih

warnanya berangsur-angsur memudar,

rendah dibandingkan dengan inti sel. Hal

maka sel yang diamati masih hidup dan

itu terbukti dengan praktikum yang telah

menghasilkan enzim yang menguraikan

dilakukan

metilen biru. Jika warnanya tetap biru,

dengan

mensentrifugasi

homogenat pada kecepatan 700 g dalam waktu 10 menit menghasilkan pellet yang di dalamnya terdapat inti sel sedangkan sentrifugasi supernatannya pada kecepatan 5000 g dalam waktu 15 menit menghasilkan pellet yang di dalmnya

terdapat

mitokondria.

Berdasarkan prinsip ketergantungan laju pengendapan terhadap densitas, semakin berat densitas partikel maka semakin banyak diperlukan kecepatan dan waktu untuk

mensentrifugasinya.

Pada

pengamatan dibawah mikroskop pellet yang telah di sentrifugasi diberi metylen blue yang diteteskan pada kaca objek, fungsi metylen blue ini adalah menurut Hendra

(2001)

menjelaskan

bahwa

metylen blue berfungsi untuk mewarnai sel-sel yang diamati melalui mikroskop.

kehidupan

dalam

sel.

Jika

berarti sel yang diamati sudah mati. XIX. KESIMPULAN XX.

Metode

yang

digunakan untuk fraksinasi subseluler adalah sentrifugasi. Prinsip sentrifugasi pada

percobaan

ini

perbedaan

massa,

partikel,

dan

Sentrifugasi mengisolasi molekul

berdasarkan

ukuran,

panjang

densitas

partikel.

digunakan

untuk

dan

biologi

mengkarakterisasi juga

komponen

subseluler yaitu inti sel dan mitokondria berdasarkan perbedaan densitas yang dimiliknya. Inti sel dan mitokondria memiliki DNA yang sangat penting untuk metabolisme sel terutama sintesis protein. Densitas inti sel lebih besar dibandingkan

dengan

densitas

mitokondria ditunjukkan dari bobot inti

sel yang lebih besar dibandingkan

XXVIII. Ningsih,

Dian

Riana.,

dengan bobot mitokondria. Semakin

Warsinah, dan Suwandri. 2006.

kecil ukuran suatu komponen sel maka

Fraksinasi

Ekstrak

akan semakin sulit untuk mendapatkan

Kulit

BatangRhizophora

fraksinya dan semakin besar kecepatan

mucronatadan

yang

Hambatnya

digunakan

untuk

mengisolasi

komponen tersebut. XXI. XXII.

Escherichia

Metanol

Uji

Daya Terhadap

coli.

Jurnal

Molekul. Vol. 1. No. 1. Hal: 15-

DAFTAR PUSTAKA

Artika, Mega. 2010. Struktur dan Fungsi Subseluler. Bogor: Departemen Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor.

30. XXIX. Rickwood D. 2000. Centrifugation : a practical approach. Washington DC : IRLPress.

XXIII. Campbell. 2000. Biologi Jilid Kesatu Edisi Kelima. Jakarta: Erlangga.

XXX.

XXIV.

Hendra A. 2001. Teknik Pemisahan dalam Analisis Biologis. Bogor: IPB Press.

XXXI. Yuwono, Tribowo. 2008. Biologi Molekuler. Jakarta : Erlangga.

XXV.

Horton, H. R. et al. 2006.

Biochemistry: The Chemical

XXXII. Behike, Joachim dan Otto Ristau. 2010. Enhanced Resolution of Sedimentation CoefficientDistribution Profiles by Extrapolation to Infinite Time. Journal Biophysics. 2(39): 449-455.

Reactions of Living Cells,2nd

XXXIII. LAMPIRAN

Principles of Biochemistry, 4th ed. Upper Saddle River, NJ: Pearson/Prentice Hall. XXVI. Metzler, D.E.

2001.

ed.San Diego: Academic Press. XXVII. Nilsson, T., et al. 2004. Mass spectrometry

in

high

throughput proteomics: ready forthe big time. Journal of Sitology. 7(9): p. 68-15.

Underwood AL. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta :Erlangga.

XL. XXXIV. XXXV.

XLI.

Gambar 4. Proses Centrifuge

Gambar 1. Proses Homogenizer Pada Bayam

XLII. XLIII.

Gambar 5. Hasil Centrifuge 5000 rpm

XXXVI. XXXVII.

Gambar 2. Proses Pengambilan Supernatan Bayam Menggunakan Mikropipet

XLIV. XLV.

Gambar 6. Endapan di Ambil

XXXVIII. XXXIX.

Gambar 3. Supernatan yang Telah di Homogenizer

XLVI. XLVII.

Gambar 7. Endapan Setelah Diberi Metylen Blue

LI.

Gambar 9. Proses Pemasukan Kedalam Freezer

XLVIII. XLIX.

Gambar 8. Hasil Centifuge ulang 12.000 rpm

LII.

LIII.

Gambar 10. Hasil setelah di Freezer

L.