Laporan Aktivitas Enzimatik Mikroorganisme TM 8

Laporan Praktikum Mikrobiologi

Nama NIM Kelas Kelompok Hari/Tanggal Waktu PJP Asisten

: Hartadi Gunawan : J3L112182 : KIM 2C P1 :4 : Jumat/15 November 2013 : 08.00-11.20 WIB : M. Arif Mulya, S.Pi : Ramdhani Yuriska Sekar Rani Lia Suliani

AKTIVITAS ENZIMATIS MIKROORGANISME

PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIA PROGRAM DIPLOMA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013

Pendahuluan Mikroorganisme adalah sumber enzim yang paling banyak digunakan dibandingkan dengan tanaman dan hewan. Sebagai sumber enzim, mikroorganisme lebih menguntungkan karena pertumbuhannya cepat, dapat tumbuh pada substrat yang murah, lebih mudah ditingkatkan hasilnya melalui  pengaturan kondisi pertumbuhan dan rekayasa genetik, serta mampu menghasilkan enzim yang ekstrim. Adanya mikroorganisme yang unggul merupakan salah satu faktor penting dalam usaha produksi enzim. Oleh karena itu, penggalian mikroorganisme indigenous penghasil protease perlu dilakukan di Indonesia. Keragaman hayati yang tinggi memberikan peluang yang besar untuk mendapatkan mikroorganisme yang potensial untuk dikembangkan sebagai  penghasil enzim (Dwijoeseputro 1990). Mikroba memerlukan nutrisi untuk pertumbuhannya sama halnya dengan mahluk hidup lainnya. Mikroba memiliki karakteristik dan ciri-ciri yang berbeda beda didalam persyaratan pertumbuhannya. Ada mikroba yang bisa hidup pada media yang menngandung sulfur dan ada juga yang tidak mampu untuk hidup  pada media yang mengandung sulfur. Selain itu ada juga mikroba yang bisa menghidrolisis pati menjadi glukosa, ada yang mampu menghidrolisis lipid menjadi asam lemak dan ada juga yang mampu menghidrolisis protein menjadi asam-asam amino. Untuk menghidrolisis polimer tersebut menjadi  bentuk yang sederhana, maka dibutuhkan bantuan enzim. Enzim juga yang digunakan berbeda-beda ada yang khusus untuk polimer pati, polimer protein dan lipid (Djide et al 2006). Enzim adalah biokatalisator yang merupakan molekul biopolimer dan tersusun dari serangkaian asam amino dalam komposisi dan susunan rantai yang teratur dan tetap. Enzim memiliki peranan yang sangat penting dalam berbagai reaksi kimia yang terjadi di dalam sel yang mungkin sangat sulit dilakukan oleh reaksi kimia biasa. Enzim alfa amilase merupakan salah satu jenis enzim yang  berperan atau berfungsi menghidrolisis ata memecah molekul-molekul pati menjadi molekul-molekul lain yang lebih sederhana seperti dekstrin, maltosa, dan glukosa. Mekanisme kerja dari enzim alfa amilase adalah dengan cara memecah ikatan α-1,4 α-1,4 glikosidik rantai glukan pati dari sebelah dalam (Darmajan et all  2008). Enzim terbentuk dari protein yang sangat peka terhadap perubahan suhu lingkungannya, ketika suhu lingkungannya sesuai, enzim akan aktif atau akan  bekerja dengan optimal, akan tetapi apabila suhu lingkungannya tidak sesuai, maka enzim tidak aktif atau tidak bisa melakukan aktivitasnya (pekerjaannya),  bahkan bisa terdenaturasi. Berdasarkan uraian tersebut, maka dalam percobaan ini dilakukan uji terhadap aktivitas enzimatis pada mikroba. Sehingga kita bisa tahu  pada suhu berapa enzim itu dapat bekerja atau dapat beraktivitas secara optimal (Pelczar 1988). Enzim berdasarkan tempat bekerjanya dapat digolongkan menjadi dua yaitu eksoenzim dan endoenzim. Endoenzim disebut juga enzim intraseluler, yaitu enzim yang bekerjanya di dalam sel. enzim ini digunakan untuk proses sintesis di dalam sel dan untuk pembentukan energi (ATP) yang berguna untuk proses kehidupan sel, misalnya dalam proses respirasi sedangkan, Eksoenzim disebut  juga enzim ekstraseluler, yaitu enzim yang bekerjanya di luar sel. Umumnya  berfungsi untuk “mencernakan” substrat secara hidrolisis, untuk   dijadikan

molekul yang lebih sederhana dengan BM lebih rendah sehingga dapat masuk melewati membran sel. Energi yang dibebaskan pada reaksi pemecahan substrat di luar sel tidak digunakan dalam proses kehidupan sel (Volk dan Wheeler 1988). Tujuan Praktikum ini bertujuan untuk mengamati pengaruh enzim terhadap aktivitas mikroorganisme. Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan yaitu inkubator, tabung reaksi berpenutup, kawat oase, bunsen, cawan petri, pipet tetes, object glass dan glass dan spidol. Bahan-bahan yang digunakan yaitu biakan padat bakteri  E.coli   E.coli  dan  Bacillus sp, sp, Larutan lugol’s iodine, nutrient  agar,  agar, Skim Milk Agar (SMA), HCl 10%, dan H 2O2 3%. Metode percobaan Uji amilolitik dilakukan dengan cara terlebih dahulu nutrient   agar yang mengandung pati (2 g/l) dengan  E. Coli dan Bacillus sp diinokulasi, setelah diinokulasi, cawan petri yang berisi media dan bakteri tersebut diambil dengan menggunakan kawat oase sambil didekatkan ke api, kemudian goreskan ke cawan  petri yang berisi media, lalu diinkubasi selama 48 jam pada suhu 370C, setelah diinkubasi larutan lugol’s iodine diteteskan secukupnya sehingga seluruh  permukaan media yang berisi bakteri terkena. Hasil positif pada uji ini yaitu terbentuk zona bening pada bakteri sedangkan, hasil negatif pada uji ini yaitu tidak terbentuk zona bening. Uji proteolitik dilakukan dengan cara terlebih dahulu Skim Milk Agar (SMA) dengan  E. Coli dan Bacillus sp diinokulasi, setelah diinokulasi, cawan  petri yang berisi media dan bakteri tersebut diambil dengan menggunakan kawat oase, kemudian goreskan ke cawan petri yang berisi media, lalu diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37 0C, setelah diinkubasi larutan HCl 10% diteteskan secukupnya sehingga seluruh permukaan media yang berisi bakteri terkena. Hasil  positif pada uji ini yaitu terbentuk zona bening di sekitar s ekitar bakteri sedangkan, hasil negatif pada uji ini yaitu tidak terbentuk zona bening di sekitar bakteri. Uji katalase dilakukan dengan cara koloni bakteri diambil dengan menggunakan kawat oase secara aseptis dan diinokulasi pada object glass, glass, setelah diinokulasi, object glass ditetesi glass ditetesi larutan H2O2 3% secukupnya. Hasil positif pada uji ini yaitu terbentuk gelembung pada bakteri sedangkan, hasil negatif pada uji ini yaitu tidak terbentuk pada bakteri. Hasil dan Data Pengamatan Hasil uji aktivitas enzim pada mikroorganisme diantaranya uji amilolitik, uji proteolitik, dan uji katalase. Enzim yang digunakan pada percobaan ini memiliki aktivitas dan identifikasi yang berbeda pada setiap bakteri, perbedaan tersebut mempengaruhi aktivitas, sehingga dapat dengan mudah membedakan  bakteri yang memiliki enzim amilum atau tidak, memiliki enzim protease atau tidak, dan proses respirasi secara aerobik. Setiap uji pada percobaan dapat dilihat  pada Tabel 1 yaitu sebagi berikut :

Tabel 1 hasil pengamatan uji aktivitas enzimatis pada Bacillus pada  Bacillus sp dan E. dan E. Coli Uji aktivitas eksoenzim Uji aktivitas eksoenzim Uji katalase Amilolitik Proteolitik E. Coli Bacillus A A

B

B

B A

Gambar 1 hasil uji Gambar 2 hasil uji amilolitik pada (A) E. (A) E. amilolitik pada (A) E. (A) E. Coli dan Coli dan (B) Bacillus (B) Bacillus Coli dan Coli dan (B) Bacillus (B) Bacillus  sp  sp

Gambar 4 hasil Gambar 3 hasil Uji katalase uji katalase  E. Coli (A) Coli (A) Kontrol   Kontrol   Bacillus sp dan (B) Bakteri yang diujikan.

Pembahasan Enzim adalah golongan protein yang berfungsi sebagai katalisator untuk realsi-reaksi kimia di dalam sistem biologi dan banyak terdapat dalam sel hidup. Sintesis enzim terjadi di dalam sel dan sebagin besar enzim dapat diperoleh dengan ekstraksi dari jaringan tanpa merusak fungsinya, reaksi-reaksi seperti hidrolisis dan oksidasi berlasung sangat cepat di dalam s el-sel hidup pada pH kirakira netral dan pada suhu tubuh. Ini dapat terjadi karena adanya enzim. Enzim disintesis di dalam sel, tetapi banyak enzim dapat diekstraksi dari sel tanpa kehilangan aktivitasnya. Enzim berbeda dengan katalisator anorganik dan organik sederhana yang umumnya dapat mengatalisis sebagai reaksi kimia. Enzim mempunyai spesitas yang sangat tinggi, baik terhadap reaktan ( subtract ) maupun  jenis reaksi yang dikatalisiskan. Suatu enzim hanya mengatalisis satu jenis reaksi dan bekerja pada suatu subtrat tertentu. Kemudian, enzim dapat meningkatkan laju reaksi yang luar biasa tanpa pembentukan produk samping dan molekul  berfungsi dalam larutan encer pada keadan biasa (fisiologis) tekanan, suhu, dan  pH normal (Rehm dan Reed 1987). 1987). Percobaan yang dilakukan beberapa uji aktivitas enzimatis terhadap mikroba. Percobaan ini, media yang digunakan adalah media PDA, NA dan SMA yang merupakan subtarat yang baik untuk mengisolasi mikroba (bakteri). menghidrolisis polimer-polimer tersebut menjadi bentuk yang lebih sederhana, sehingga dengan mudah menghidrolisis polimer-polimer tersebut dibutuhkan  batuan dari enzim, yakni ada enzim amilase untuk hidrolisis pati pada uji amilolitik, lipase untuk hidrolisis lipid pada uji lipolitik dan protease untuk

hidrolisis protein pada uji proteolitik, dan uji katalase untuk mengetahui respirasi secara aerobik pada mikroorganisme (Umbreit 1960). Amilolitik merupakan aktivitas bakteri dalam merombak pati dengan  bantuan enzim amilase. Enzim amilase adalah enzim yang mampu menghidrolisis  pati menjadi senyawa lebih sederhana seperti maltosa dan glukosa. Enzim ini  banyak digunakan untuk keperluan industri. Enzim ini dapat memecah atau menghidrolisa pati, glikogen dan turunan polisakarida dengan cara memecah ikatan glikosidik pati. Enzim amilase dibedakan menjadi 3 grup yaitu α -amilase yang disebut juga endoamilase, β-amilase β -amilase yang disebut juga eksoamilase dan glukoaminase (Rehm dan Reed 1987). Amilum memiliki berat molekul tinggi, terdiri atas polimer glukosa yang  bercabang-cabang yang diikat dengan ikatan glikosidik. Degradasi amilum membutuhkan enzim amilase yang akan memecah/menghidrolisis menjadi  polisakarida yang lebih pendek (dextrin), dextrin), dan selanjutnya menjadi maltosa. Hidrolisis akhir maltosa menghasilkan glukosa terlarut yang dapat ditransport masuk ke dalam sel. Indikator yang dipakai pada uji amilolitik adalah iodine. iodine. Amilum akan bereaksi dengan iodine membentuk iodine membentuk warna biru hitam yang terlihat  pada media. Prosedur di bawah ini menunjukkan aktivitas amilase. NA yang tersuspensi pati digunakan sebagai media. Indikator yang dipakai adalah iodine. iodine. Amilum akan bereaksi dengan iodine membentuk iodine membentuk komplex warna biru hitam yang terlihat pada media. Warna biru hitam terjadi jika iodine masuk iodine masuk ke dalam bagian kosong pada amilum yang berbentuk spiral. Reaksi yang terjadi pada uji amiloliti k dapat dilihat pada Gambar 5 di bawah ini (Friedmann dan Herbert 1981):

Gambar 5 Reaksi uji amilolitik Uji amilolitik ini menggunakan Nutrien Agar yang mengandung pati 2%, hal ini karena media tersebut merupakan medium untuk pertumbuhan bakteri, selain itu kandungan pati yang terkandung dalam media NA yang nantinya akan digunakan untuk produksi amilase. Larutan iodin digunakan untuk deteksi adanya amilase dalam medium atau bahan. Larutan iodin i odin yang digunakan karena degradasi yang terjadi pada pati dapat diketahui dengan hilangnya material yang terwarnai oleh iodin. Uji deteksi α  amylase yang menghidrolisis α-1,4-glikogen dan poliglucosan lainnya. Saat awal perlakuan terjadi penurunan yang cepat berat molekul pati yang dihasilkan dari pewarnaan iodin. Amilum akan bereaksi dengan iodin membentuk kompleks warna biru hitam yang terlihat pada media. Warna hitam ini terjadi karena iodin masuk kedalam bagian kosong pada amilum yang

 berbentuk spiral. Produk akhir utama dari degradasi ini adalah oligosakarida dengan berat molekul yang rendah. Hasil percobaan pada uji amilolitik positif menngandung enzim amilase pada bakteri  Bacillus sp. sp. Hal ini ditunjukkan oleh adanya produksi enzim amilase oleh koloni bakteri pada media ditunjukkan adanya zona bening dengan penambahan larutan iodin di sekitar koloni bakteri (Prescott dan Harley 2002). Aktivitas proteolitik menghasilkan sedikit penggumpalan. Bakteri  proteolitik adalah bakteri yang memproduksi enzim protease ekstraseluler yaitu enzim pemecah protein yang diproduksi di dalam sel kemudian dilepaskan keluar dari sel. Semua bakteri mempunyai enzim protease di dalam sel, tetapi tidak semua mempunyai enzim protease ekstraseluler. Dekomposisi protein oleh mikroorganisme lebih kompleks daripada pemecahan karbohidrat dan produk akhirnya juga lebih bervariasi. Hal ini disebabkan struktur protein yang lebih kompleks. Mikroorganisme melalui suatu sistem enzim yang kompleks, memecah  protein menjadi senyawa-senyawa yang lebih sederhana (Prescott dan Harley 2002). Uji proteolitik ditujukan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme menghasilkan enzim protease. Protein yang digunakan dalam bentuk kasein susu seperti media Skim Milk Agar (SMA). Hidrolisis kasein secara bertahap akan menghasilkan monomernya berupa asam amino. Proses ini dinamakan  peptonisasi atau proteolisis. Protease merupakan enzim penting dan memiliki nilai ekonomi yang tinggi karena aplikasinya yang sangat luas. Industri pengguna  protease di antaranya ialah industri deterjen, kulit, tekstil, makanan, hidrolisat  protein, pengolahan susu, farmasi, makanan, bir, film, dan limbah. Oleh karena itu, tidak mengherankan apabila penggunaan protease mencapai 60% dari total enzim yang diperjual belikan di seluruh dunia (Purwati Sri et al 2011). Protease merupakan enzim proteolitik yang mengkatalisis pemutusan ikatan peptida pada protein. Protease dibutuhkan secara fisiologi untuk kehidupan organisme pada tumbuhan, hewan maupun mikroorganisme lainnya. Penggunaan tumbuhan sebagai sumber protease dibatasi oleh tersedianya tanah untuk  penanaman dan kondisi yang cocok untuk pertumbuhan. Disamping itu, proses  produksi protease dari tumbuhan sangat memakan waktu. Protease tumbuhan yang dikenal antara lain papain, bromelain, dan keratinase. Protease hewan yang  paling dikenal adalah tripsin, kimotripsin, pepsin dan renin. Enzim-enzim ini dapat diperoleh dalam keadaan murni dengan jumlah besar. Reaksi yang terjadi  pada uji proteolitik dapat dilihat pada Gambar 6 di di bawah ini (Gobel dkk 2008):

Gambar 6 Reaksi uji proteolitik Penggunaan mikroorganisme sebagai sumber enzim protease dan kemungkinannya untuk melakukan manipulasi genetik, menjadikan protease mikroba lebih banyak dikembangkan. Banyak protease komersial, baik itu netral maupun alkali dihasilkan oleh genus  Bacillus.  Bacillus. Protease netral dari bakteri mampu aktif pada pH 5-8, dan memiliki toleransi suhu yang relatif rendah. Sehingga,  penggunaan HCl 10% bertujuan untuk mempercepat terjadinya reaksi hidrolisis

atau pemutusan ikatan peptida pada protein. Neutrase, suatu protease netral  banyak digunakan pada pada proses hidrolisis protein makanan dalam industri makanan dengan derajat hidrolisis yang rendah. Beberapa protease netral termasuk jenis  protease logam dan membutuhkan ion logam divalen untuk aktivitasnya. Sebagian Sebagian lagi termasuk protease serin, tidak membutuhkan ion logam dalam aktivitasnya. Protease alkalin dari bakteri memiliki aktivitas tertinggi pada pH 10 dan suhu optimal pada suhu 60 oC. Sifat-sifat yang dimiliki protease ini membuatnya cocok untuk digunakan dalam industri detergen (Umbreit 1960). Termofilik sebagai salah satu jenis bakteri dapat tumbuh pada suhu tinggi o yaitu 45 C-70oC dan berada di atas suhu tumbuh rata-rata bakteri mesofil. Oleh karena memiliki ciri khas demikian, maka bakteri ini sebagian besar tumbuh dan hidup pada daerah bersuhu tinggi, seperti sumber airpanas, kawah gunung berapi, dan tempat pengomposan. Keuntungan dari bakteri ini adalah memiliki protein yangdapat bekerja pada kondisi lingkungan dengan suhu tinggi dimana protein/ enzim lain dapat mengalami denaturasi. Salahsatu protease termostabil dapat dihasilkan darimikroorganisme termofilik yaitu  Bacillus subtilis (Umbreit 1960). Hasil percobaan pada uji proteolitik positif menngandung enzim protease  pada bakteri Bacillus bakteri  Bacillus sp. sp . Hal ini ditunjukkan oleh adanya produksi enzim amilase oleh koloni bakteri pada media ditunjukkan adanya zona bening dengan  penambahan larutan HCl 10% di sekitar koloni koloni bakteri. Uji katalase ini dilakukan untuk mengidentifikasi kelompok bakteri bentuk kokkus. Penentuan adanya katalase katalase ini terlihat dari pembentukan gelembung udara di sekitar koloni setelah ditambahkan larutan H2O2 3% atau suatu pengujian respirasi aerobik (proses fosforilasi oksidatif) pada mikroorganisme, beberapa  bakteri yang memiliki flavoprotein dapat mereduksi O2  dengan menghasilkan hidrogen peroksida (H2O2) atau superoksida (O2-). Kedua bahan ini merupakan  bahan yang toksik dan menghancurkan kompenen sel dengan sangat cepat. Bakteri harus dapat mempertahankan diri seperti dengan produksi O 2  atau akan terbunuh. Beberapa bakteri dapat memproduksi enzim yang dapat mengkatalisis superoksids yaitu yaitu peroksida dismutase, dan juga katalase atau peroksidase yang yang dapat mendekstruksi hidrogen peroksida (Hardioetomo 1983). Katalase adalah enzim yang mengkatalisasikan penguraian hidrogen  peroksida (H2O2) menjadi air dan O2. Hidrogen peroksida terbentuk sewaktu metabolisme aerob, sehingga mikroorganisme yang tumbuh dalam lingkungan aerob dapat menguarikan zat toksik tersebut. Mikroorganisme tersebut akan menghasilkan hidrogen peroksida, bahkan ada yang menghasilkan superoksida yang sangat beracun. Senyawa ini dalam jumlah besar akan menyebabkan kematian pada mikroorganisme. Senyawa ini dihasilkan oleh mikroorganisme aerobik, fakultatif aerob maupun mikroaerofilik yang menggunakan jalur respirasi aerobik. Superoksida dismutase adalah enzim yang bertanggung jawab untuk  penguraian khususnya superoksida pada organisme aerob yang bersifat katalase negatif. Produksi katalase bisa diidentifikasi dengan menanmbahkan reagen H2O2 pada suspensi bakteri. Jika J ika dihasilkan gelembung gas, berarti bakteri tersebut mampu memproduksi enzim katalase. Jika tidak dihasilkan gelembung gas berarti uji katalase dinyatakan negatif. Reaksi kimiawi yang dikatalisasikan oleh enzim terlihat dapat dilihat pada Gambar 7 dan Gambar 8 sebagai berikut (Irianto 2007) :

Sehingga

Gambar 7 Reaksi uji katalase

Gambar 8 Reaksi uji katalase Hasil percobaan pada uji katalase pada bakteri  Bacillus sp dan  dan  E. Coli menunjukkan hasil yang positif. Hal ini ditunjukkan oleh adanya terbentuk gelembung udara ketika ditambahkan larutan H 2O2, sehingga dapat disimpulkan  bahwa pada bakteri Bacillus bakteri Bacillus sp dan E. dan E. Coli terjadi proses respirasi secara aerob. Simpulan Berdasarkan hasil percobaan yang dilakukan, dapat disimpulkan bahwa  pada uji amilolitik dan proteolitik pada bakteri  Bacillus sp menunjukkan hasil  positif, sedangkan pada bakteri E. bakteri  E. Coli menunjukkan hasil negatif, sehingga pada  bakteri  Bacillus sp dan  E. Coli mengandung enzim protease dan enzim amilum,  begitu juga pada uji katalase pada bakteri  Bacillus sp dan  E. Coli menunjukkan hasil positif, berarti bakteri Bacillus bakteri  Bacillus sp dan E. dan  E. Coli terjadi proses respirasi secara aerob yaitu terbentuknya gelembung udara. Daftar Pustaka

Djide, et al . 2006. Dasar-Dasar 2006.  Dasar-Dasar Mikrobiologi. Mikrobiologi. Makassar: Universitas Hasanuddin Press. Dwijoeseputro. 1990. Dasar-Dasar 1990.  Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang: Djambatan Press. Friedmann, Herbert. 1981. Biokimia 1981.  Biokimia.. Jakarta: PT. Gramedia. Gobel, Risco, B dkk. 2008.  Mikrobiologi Umum Dalam Praktek . Makasar : Universitas Hasanuddin. Hardioetomo RSS. 1983. Mikrobiologi 1983.  Mikrobiologi dalam Praktek . Bogor: IPB-Press. Irianto K. 2007. Mikrobiologi 2007. Mikrobiologi.. Bandung: Yrama Widya. Pelczar, 1988. Dasar-Dasar 1988. Dasar-Dasar Mikrobiologi 2. Universitas Indonesia Press:Jakarta. Prescott, Harley. 2002. Laboratory 2002. Laboratory Exercises in Microbiology. Microbiology. New York The MC-Graw Hill Companies.

Purwati Sri, et al.  al.  2011.  Aplikasi Protease dan Pengaruh Suhu Pada Asidifikasi  Digestasi Anaerobik Dua-Tahap Lumpur Ipal Biologi Industri  Kertas.  Kertas. Jurnal selulosa, Vol. 1 (1). Rehm, Reed. 1987.  Biotechnology. Vol 8: enzyme Technology.  Technology.  VCH Verlags: Weinhaim Press. Umbreit WW.1960. Aplied WW.1960. Aplied Microbiology. London : Academic Press. Volk, Wheeler. 1988.  Dasar-Dasar Mikrobiologi. Mikrobiologi. Soenartono Adisoemarto,  penerjemah. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari:  Principles of  Microbiology.