Laporan 3 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Laporan Praktikum KI2221 Pemisahan dan Elektrometri Percobaan 3 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Nama

: Airlangga Diandra Putra

NIM

: 10512038

Kelompok

: 4

Tanggal Percobaan

: 22 April 2014

Tanggal Pengumpulan

: 29 April 2014

Asisten, NIM

: Kurniawan

LABORATORIUM KIMIA ANALITIK PROGRAM STUDI KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2014

Modul 3 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

I.

Tujuan Percobaan Menentukan konsentrasi kafein dalam sampel kopi dan teh

II.

Teori Dasar Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan berdasarkan partisi senyawa analit terhadap fasa diam dan fasa gerak. Metoda kromatografi cair kinerja tinggi (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) merupakan metoda kromatografi dimana digunakan tekanan yang tinggi untuk mendorong pelarut (fasa gerak) menuju suatu kolom (fasa diam) yang berisi partikel-partikel pengemasnya. Kafein adalah senyawa polar yang larut dalam metanol. Apabila kadar kafein ingin ditentukan dengan kromatografi, kafein harus diekstrak dari sampel ke pelarut yang lebih non-polar. Tetapi, apabila fasa diam yang digunakan bersifat non-polar dengan fasa gerak yang polar, ekstrasi tersebut tidak perlu dilakukan. Pada monitor kromatogram akan terbentuk dimana tingginya berbanding lurus dengan konsentrasi kafein, sehingga konsentrasinya dapat ditentukan.

III.

Alat dan Bahan a. Bahan

b. Alat

1. Larutan standar kafein 500 ppm

1. Gelas kimia

2. Larutan asam fostfat 5%

2. Gelas ukur

3. Metanol(aq)

3. Pipet tetes

4. Aqua Bidest

4. Instrumen HPLC

5. Produk minuman ber-kafein

5. Labu takar

6. Aqua DM

6. Syringe 7. Ultrasonic Bath

IV.

Cara Kerja Dimasukkan 140 mL Aqua Bidest ke dalam gelas kimia lalu ditambahkan 1.4 mL H3PO4 5% dan 60 mL metanol, dihilangkan gas terlarut dengan ultrasonic bath. Dibuat 5 mL larutan standar kafein 20, 40, 60, 80, dan 100 ppm dari larutan standar kafein 500 ppm dengan eluen sebagai penanda-batas pada labu takar. Dilarutkan sampel serbuk kopi dan teh celup dalam air dan dipanaskan dilanjutkan dengan pengenceran hingga 25 mL (eluen sebagai penanda-batas). Dilakukan analisis terhadap kelima larutan standar kafein dan terhadap kedua sampel dengan kromatografi cair kinerja tinggi. Dilakukan pembilasan terhadap syringe dan tempat injeksi syringe yang akan dipakai terlebih dahulu menggunakan aqua DM dan larutan yang akan diuji. Ditentukan waktu retensi dari larutan analit dan ditentukan konsentrasi kafein di dalam sampel.

V.

Data Pengamatan Fasa diam

: C-18

Panjang kolom

: 12.5 cm

Ukuran partikel

: 5.0 µm

Fasa gerak

: Metanol-air (65%-35%)

Laju alir

: 1.0 mL/menit

Volum injeksi

: 20.0 µL

Tekanan gas

: 180.0 barr

Panjang gelombang UV

: 280.0 nm

1. Larutan standar kafein 20 ppm

Tinggi

Puncak

tr

Tipe

w

Luas area

ke-

(menit)

Puncak

(menit)

(mAU*s)

1

0.994

BB

0.0873

22.19830

3.53165

2.2758

2

1.179

BV

0.1225

34.01767

3.59002

3.4875

3

1,348

VB

0,0813

919,20111

174,96242

94,2367

975.41708

182.08409

Total

puncak (mAU)

%Luas area

2. Larutan standar kafein 40 ppm

Tinggi

Puncak

tr

Tipe

w

Luas area

ke-

(menit)

Puncak

(menit)

(mAU*s)

1

0.998

BB

0.0744

16.58859

3.10160

0.9144

2

1.182

BV

0.1188

39.20728

4.36484

2.1613

3

1.350

VB

0.0819

1758.28345

331.32278

96.9243

1814.07932

338.78922

Total

puncak (mAU)

%Luas area

3. Larutan standar kafein 60 ppm

Tinggi

Puncak

tr

Tipe

w

Luas area

ke-

(menit)

Puncak

(menit)

(mAU*s)

1

1.000

BB

0.0713

16.16898

3.29210

0.6679

2

1.186

BV

0.1161

41.82574

4.68939

1.7276

3

1.352

VB

0.0813

2363.00488

449.92599

97.6045

2420.99960

457.90749

Total

4. Larutan standar kafein 80 ppm

puncak (mAU)

%Luas area

Tinggi

Puncak

tr

Tipe

w

Luas area

ke-

(menit)

Puncak

(menit)

(mAU*s)

1

0,772

BV

0,1213

103,18629

12,12074

3,0456

2

1,000

VB

0,0677

19,324430

4,197310

0,5704

3

1,186

BV

0,114

42,561270

4,894970

1,2562

4

1,352

VB

0,0804

3222,92432

622,59247

95,1277

3387,99631

643,80538

Total

puncak (mAU)

%Luas area

5. Larutan standar kafein 100 ppm

Tinggi

Puncak

tr

Tipe

w

Luas area

ke-

(menit)

Puncak

(menit)

(mAU*s)

1

1.002

BB

0.0616

13.85685

3.257185

0.3136

2

1.190

BV

0.1105

46.66743

5.526670

1.0560

3

1.353

VB

0.0809

4358.54736

834.61401

98.6304

4419.07164

843.39787

Total

puncak (mAU)

%Luas area

6. Larutan sampel teh

Tinggi

Puncak

tr

Tipe

w

Luas area

ke-

(menit)

Puncak

(menit)

(mAU*s)

1

1.114

BV

0.5172

5794.49609

548.89172

53.6271

2

1.353

VV

0.0890

3728.34521

630.58948

34.5052

3

1.608

VB

0.3159

1282.31665

55.848860

11.8676

1.08052-E4

1235.33006

Total

7. Larutan sampel kopi

puncak (mAU)

%Luas area

Tinggi

Puncak

tr

Tipe

w

Luas area

ke-

(menit)

Puncak

(menit)

(mAU*s)

1

1.148

BV

0.1204

1.27686-E4

1544.72083

53.2653

2

1.350

VV

0.0879

1.01700-E4

1800.25854

42.4250

3

1.525

VB

0.0924

686.20221

110.51438

2.86260

4

1.744

BB

0.0878

137.87712

25.199636

0.57520

5

2.531

BV

0.0974

42.105380

6.513920

0.17560

6

2.698

VBA

0.1792

166,94238

14.84260

0.69640

2.39717-E4

3502.04963

Total

puncak (mAU)

%Luas area

Pengolahan Data 1. Pembuatan kurva kalibrasi larutan standar kafein [Kafein] (ppm)

Luas area (mAU*s)

Tinggi puncak (mAU)

20.0

919.201110

174.96242

40.0

1758.28345

331.32278

60.0

2363.00488

449.92599

80.0

3222.92432

622.59247

100.0

4358.54736

834.61401

Kurva kalibrasi luas vs konsentrasi kafein Luas area (mAU*s)

4650 3900

y = 41.717x + 21.392 R² = 0.9886

3150 2400 1650 900 20

40

60

80

100

Konsenrasi kafein (ppm)

Kurva kalibrasi tinggi vs konsentrasi kafein 850

Tinggi puncak (mAU)

VI.

750

y = 8.0529x - 0.4883 R² = 0.9897

650 550 450 350 250 150 20

40

60

Konsentrasi kafein (ppm)

80

100

2. Penentuan konsentrasi kafein dalam sampel teh dan sampel kopi Sampel

Luas area (mAU*s)

Tinggi puncak (mAU)

Teh

3728.34521

630.589480

Kopi

10170.0000

1800.25854

a. Berdasarkan luas kromatogram y

= 41.717x + 21.392 ; (y adalah luas puncak, x adalah konsentrasi kafein)

Teh

→

3728.34521

= 41.717 [Kafein] + 21.392

[Kafein]sampel = 88.8595 ppm x faktor pengenceran [Kafein]sampel = 88.8595 ppm x 5 = 444.2975 ppm Kopi

→

10170.0000

= 41.717 [Kafein] + 21.392

[Kafein]sampel = 243.2727 ppm x faktor pengenceran [Kafein]sampel = 243.2727 ppm x 5 = 1216.3635 ppm b. Berdasarkan tinggi puncak kromatogram y

= 8.0529x - 0.4883 (y adalah tinggi puncak, x adalah konsentrasi kafein)

Teh

→

630.589480

= 8.0529 [Kafein] - 0.4883

[Kafein]sampel = 78.3665 ppm x faktor pengenceran [Kafein]sampel = 78.3665 ppm x 5 = 391.8326 ppm Kopi

→

1800.25854

= 8.0529 [Kafein] - 0.4883

[Kafein]sampel = 223.6147 ppm x faktor pengenceran [Kafein]sampel = 223.6147 ppm x 5 = 1118.0735 ppm

Sampel

Konsentrasi kafein1 (ppm)

Konsentrasi kafein2 (ppm)

Teh

444.2975

391.8326

Kopi

1216.3635

1118.0735

Keterangan.

1

Pengukuran berdasarkan luas kromatogram

2

Pengukuran berdasarkan tinggi puncak kromatogram

VII.

Pembahasan Pada percobaan kali ini, dilakukan penentuan kadar kafein di dalam larutan sampel teh dan sampel kopi dengan metoda pemisahan kromatografi cair kinerja tinggi (High Performance Liquid Chromatography, HPLC). Metoda kromatografi ini merupakan analisis kualitatif sekaligus kuantitatif, dengan variabel kualitatifnya adalah waktu retensi dari sampel. Prinsip kerja dari HPLC adalah menggunakan suatu pompa bertekanan tinggi untuk mendorong fasa geraknya yan berupa pelarut agar dapat melewati fasa diam yang berupa kolom berisikan partikel pengemas. Pada percobaan ini digunakan HPLC dengan jenis fasa terbalik, yaitu fasa diamnya nonpolar (C-18) dan fasa geraknya polar (metanol:air = 65:35). Pada instrumen HPLC, pelarut-pelarut harus dihilangkan komponen gasnya untuk menghalangi pembentukan gelembung-gelembung, dan penghilangan ini dapat dilakukan menggunakan ultrasonic bath. C-18 merupakan senyawa silika yang pada permukaannya diberikan lapisan Xilena, sehingga fasa diam ini bersifat non-polar. Komposisi metanol-air yang digunakan sebagai eluen dipilih 65-35 dikarenakan komposisi tersebut yang memberikan hasil pemisahan kromatogram yang baik dengan waktu analisis yang sesebentar mungkin (dengan pembanding hasil percobaan pada komposisi lain). Metoda peng-elusi-an analit yang dilakukan adalah elusi isokratik, yaitu komposisi eluen yang dipakai selama proses elusi adalah tetap (65-35), tidak berubah, sedangkan metoda elusi lainnya adalah elusi gradien, komposisi eluen berubah selama proses elusi. Air merupakan fasa gerak yang lemah dan memiliki retensi yang besar, sedangkan metanol memiliki kekuatan elusi yang lebih besar dibandingkan dengan air, pelarutpelarut ini sering digunakan karena harga yang lebih murah dibandingkan pelarut organik lain dan tidak terlalu berbahaya jika dibuang ke lingkungan. Pada percobaan ini digunakan metoda elusi isokratik dikarenakan sudah diketahui bahwa komponen penyusun sampel tidaklah terlalu banyak sehingga tidak perlu dilakukan pemisahan yang banyak dengan metoda elusi gradien. Suatu komponen dapat terpisah dari komponen penyusun senyawa lainnya dalam kromatografi dikarenakan perbedaan interaksi antara komponen tersebut dengan fasa gerak dan fasa diam. Interaksi yang dimaksudkan dalam HPLC ini adalah interaksi kemiripan sifat kepolaran, komponen suatu senyawa memiliki sifat kepolaran yang berbeda-beda, sifat tersebut dapat dimanfaatkan untuk dilakukan pemisahan. Kemiripan sifat kepolaran akan menyebabkan suatu komponen akan lebih

terlarut dalam satu fasa yang kepolarannya lebih mendekati dibandingkan fasa yang lainnya. Kafein merupakan komponen yang ingin dipisahkan, komponen ini memiliki sifat yang polar, maka dari itu digunakan HPLC fasa terbalik yang tujuannya mempercepat waktu analisis. Kafein yang bersifat polar akan lebih terlarut dalam fasa diam dan akan memiliki waktu retensi yang lebih rendah dibandingkan komponen lainnya yang lebih bersifat non-polar namun akan memiliki waktu retensi yang lebih besar dibandingkan komponen lainnya yang bersifat lebih polar dibandingkan kafein. Waktu retensi akan bervariasi tergantung kepada: tekanan yang digunakan (mempengaruhi laju alir pelarut); sifat fasa diam (komponen dan ukuran partikel); komposisi pelarut; dan suhu kolom. Detektor

yang

digunakan

pada

instrumen

HPLC

kali

ini

adalah

spektrofotometer UV-VIS, sebuah metoda umum yang mudah untuk menjelaskan menggunakan penyerapan ultra-violet. Banyak senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Jika seberkas sinar UV dilewatkan pada aliran cairan yang keluar dari kolom, dan detektor UV berada pada bagian berlawanan dari berkas cahaya, maka dapat didapatkan pembacaaan langsung berapa banyak cahaya yang diserap. Jumlah cahaya yang diserap bergantung kepada jumlah senyawa tertentu yang melewati sinar pada saat itu. Pelarut yang digunakan juga menyerap sinar UV, tetapi senyawa yang berbeda akan menyerap sinar terkuat dalam bagian berbeda pada spektrum UV. Metanol menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan air dibawah 190 nm. Sehingga jika digunakan campuran metanol-air sebagai pelarut harus digunakan panjang gelombang yang lebih besar dari 205 nm untuk mencegah pembacaan pelarut dalam analit. Output akan direkam sebagai rangkaian puncak, masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melewati detektor dan menyerap sinar UV. Tinggi dan luas puncak dapat digunakan untuk mengukur jumlah dari senyawa ini. Konsentrasi kafein dalam percobaan ini ditentukan dengan cara metoda kurva kalibrasi (penggunaan serangkaian larutan standar sebagai pembanding). Perbedaan nilai konsentrasi dari kafein yang diperoleh berdasarkan perhitungan dengan menggunakan luas kromatogram maupun tinggi kromatogram dapat disebabkan oleh adanya udara yang masuk ke dalam kolom sehingga mempengaruhi tekanan dalam kolom.

VIII.

Kesimpulan Konsentrasi kafein dalam sampel teh dan kopi berdasarkan hasil kurva dari luas area kromatogram adalah 444.2975 ppm dan 1216.3635 ppm dan dari tinggi puncak kromatogram sebesar 391.8326 ppm dan 1118.0735 ppm.

IX.

Daftar Pustaka www.scimedia.com/chem-ed/sep/lc/hplc.htm, diakses 21/04/2014 20:37 WIB http://hplc.chem.shu.edu/NEW/HPLC_Book/Detectors/det_uv.html, diakses 22/04/2014 21:31 WIB www.sciencelab.com/msdsList.php, diakses 19/04/2014 15:11 WIB www.chem-is-try.org/materi_kimia, diakses 19/04/2014 15:18 WIB