LABORATORIO N°5 DE MICROBILOGIA SANITARIA

ACCION BACTERIOSTATICA DEL CRISTAL VIOLETA 1. OBJETIVOS

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Demost Demostrar rar el efecto efecto de difere diferente ntes s conce concentr ntraci acion ones es de crista cristall violet violeta a sobre bacterias Gram positivas y Gram negativas.

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Demostrar como las concentraciones en que se diferencia cada crisol varia el crecimiento de microorganismos.

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Hacer la tinción Gram para determinar si la bacteria es cocos o bacilos según los pasos que hicimos con anterioridad.

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Saber a qué tipo de agrupación pertenece dicha bacteria.

2. FUNDA FUNDAME MENT NTO O TEO TEORIC RICO O Cristal violeta Los colorantes colorantes del grupo trifenilmetano trifenilmetano presentan presentan una marcada marcada acción acción bacteriosttica selectiva sobre las bacterias Gram positivas! en diluciones que aparentemente no afectan a las Gram negativas. "sta propiedad se aprove aprovech cha a median mediante te la incorp incorpora oració ción n de alguno alguno de esos esos colora colorante ntes s en medios de cultivo con el fin de facilitar el aislamiento de bacterias Gram negativas. "ntre los colorante colorantes s usados usados con estos propósitos propósitos estn# cristal violeta! fucsina bsica! verde brillante y verde malaquita. Las condi condicio ciones nes de salud salud en una nación nación estn estn determ determina inadas das!! en gran gran parte! por la capacidad de sus habitantes para controlar efica$mente los prob proble lema mas s micr microb obia iano nos. s. La cost costum umbr bre e diar diaria ia de puri purifi fica carr el agua agua!! pasteuri$ar la leche o la conservación de alimentos! son métodos para controlar las poblaciones microbianas. Los microorganismos son también capace capaces s de destru destruir ir materi materiale ales s valios valiosos os como como madera madera y fibras fibras te%tile te%tiles! s! causando pérdidas que necesitan evitarse con medidas eficaces. La tinción de Gram es una técnica diferencial comúnmente empleada en el diagnostico microbiano! fue descubierta por Hans &hristian Gram en '((). La mayor parte parte de de las muestras sometidas a e%amen e%amen cuando se sospecha infección infección bacterian bacteriana a deben ser e%tendida e%tendidas s en frotis sobre laminilla laminillas s de vidrio! te*idas e%aminadas en el microscopio.

Los reactivos empleados en la tinción de Gram son el cristal violeta +colorante bsico,! lugol+mordiente,! alcohol cetona+decolorante, y safranina+colorante de contraste. "l crista cristall violet violeta a sirve sirve como como colora colorante nte bsic bsico o unién uniéndos dose e a la pared pared celula celular  r  bacteriana! con ayuda del mordiente +lugol, que refuer$a la unión del colorante. Las bacterias Gram positivas! debido a la estructura y composición bioqu-mica de su pared celular retienen el compleo cristal violeta/lugol y aun después del tratamiento con el colorante bsico! por lo que se observa de color purpura o violeta al microscopio. Las bacterias Gram negativas pierden el colorante bsico cuando son tratados con el decolorant decolorante e debido debido a que el alcohol alcohol disuelve el contenido contenido lip-dico lip-dico de la pared celular +lo que aumenta la permeabilidad celular,! dando como resultado la pérdida del compleo cristal vileta/lugol. Las bacterias decoloradas captan ento entonc nces es el colo colora rant nte e de cont contra rast ste! e! ra$ó ra$ón n por por la cual cual esta estas s bact bacter eria ias s se observan de color roo al microscopio. "l cristal violeta es un colorante que penetra la pared celular de bacterias Gram positivas y negativa. 0osteriormente se agrega el lugol que es mordiente y se forma un compleo con el cristal violeta. Durante el proceso de decoloración con alcohol/acetona! la gruesa pared de los Gram positivos impide la salida del colorante manteniendo la coloración violeta. "n cambio! por el alto contenido lip-dico de la pared de los Gram negativos! el alcoho alcohol/a l/acet cetona ona genera genera poros! poros! por los cuales cuales!! escapa escapa el crista cristall violet violeta! a! la bacteria se decolora y ti*e de color roo con el colorante de contraste. ¿or !"# "$as %a&terias se ti'e$ (e violeta ) otras rosa(as* Las (i+ere$&i (i+ere$&ias as %,si&as %,si&as que nos permit permiten en ver las bacter bacterias ias de distin distintos tos colores residen en la -are( %a&teria$a! %a&teria$a! las paredes celulares de bacterias de tipo gramnegativo poseen una capa lip-dica e%terna la cual se ti*e con cristal violeta al igual que la pared de las células de tipo Gram positivo pero con la diferencia de que estas no tienen una esa capa lip-dica! que al ser tratada con alcoho alcoholl desap desapare arece ce +debid +debido o a que que el alcoho alcoholl es un disolv disolvent ente e orgni orgnico co y disuelve la pared lip-dica, y por tanto la célula queda de nuevo sin te*ir y para poder observarla basta con a*adir safranina +colorante, que se quedar en la capa de mureina que ha quedado ahora e%puesta.

 

1igura' "n la figura ' se observa que las Gram+2, por tener varias capas superpuestas en paralelo de peptidoglucano se ti*en violeta y las Gram+3, por tener una sola capa de peptidoglucano y por su capa e%terna se ti*e roi$o.

. METODOLO/IA

Materiales

E!"i-o

'. 0ipetas 4. 5ubos de prueba 6. 0icetas con agua destilada ). 7agueta 8. 9lgodón :. &anastilla ;. Gradilla (. 1rascos de vidrio echero bunsen Gradilla y tr-pode 9utoclave

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echamos el agar en un vaso precipitado y agregamos 6??ml de agua! luego mover con una vagueta para disolver  el agar nutritivo.

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0ara disolver meor el agar nutritivo calentarlo con el mechero.

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Luego colocar el agar nutritivo en 4? tubos de prueba! conteniendo cada uno '8ml! tapar los tubos con algodón.

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Después colocar los tubos en una canastilla y colocarlo en el autoclave. 0ara la esterili$ación de agar.

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"sterili$ar los materiales a usar en el horno.

Distri%"&i$ (e los e(ios (e &"ltivo0 •

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) tubos con agar nutritivo estéril! conteniendo '8ml cada tuboB para cada grupo. 6 tubos con < ml de agua destilada. Solución cristal violeta de '#'??? 6 pipetas de 'ml para repartir el cristal violeta luego de la dilución. ) placas estéril para cada grupo ' inoculador para cada grupo &olonias 9 y = para la muestra de bacterias. ro&e(iie$to

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>antener ) tubos con agar nutritivo fundido en el ba*o >ar-a a )8C&.

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"n 6 tubos de prueba y echar icrobiolog-a. &uarta edición +segunda edición en espa*ol,

ANE5OS CUESTIONARIO 1. 6"# es "$ a7e$te %a&teriost,ti&o ) !"e !"iere (e&ir "$a a&&i$ %a&teriost,ti&a sele&tiva* .I$(i!"e al7"$as a-li&a&io$es -r,&ti&as (e este +e$e$o. Se observa cuando se inhibe la proliferación pero no tiene lugar la muerte celular. U$ a7e$te %a&teriost,ti&o#

Enhibe la s-ntesis de prote-nas.  9ctúa uniéndose a las ribosomas 0uede actuar el efecto dilución. "emplo# Streptomicina! 5etraciclina! &loramfenicol 5etraciclinas y estreptomicinas +6?S, &loramfenicol +8?S, La acción bacteriosttica se fundamenta en la inhibición del desarrollo microbiano mediante el bloqueo de diferentes factores de reproducción. o las mata directamente! pues una población de bacterias sin capacidad de reproducción o con capacidad disminuida para la misma es una población condenada a su desaparición. "n cambio un agente bactericida es aquel capa$ de matar a las bacterias. A&&i$ %a&teriost,ti&a sele&tiva0 "s aquel efecto que sólo inhibe el crecimiento o reproducción de cierto grupo de microorganismos! mientras que no afecta o afecta en menos proporción a otro grupo de microorganismos. "s por ello que se agregan a medios de cultivos agentes bacteriostticos para que éstos tengan carcter selectivo. A-li&a&io$es0 &ontrol con agentes qu-micos

Son sustancias qu-micas que tienen la capacidad de inhibir o matar a los microorganismos. Destr"&tores

I$8i%i(ores

=acterias

=actericidas

Ba&terioest,ti&os

Hongos

1ungicida

1ungistaticos

7irus

7irucida

7irustaticos

"l aOH se utili$a en la industria del vino para limpiar las cubas de madera. "l o$ono es utili$ado desde antes para tratamiento de agua! ahora se ha e%tendido su utili$ación y se aplica para tratar ambientes e incluso podemos tratar directamente sobre el organismo con fines terapéuticos +concentraciones de ?.?' ppm a menos,. Los antibióticos son usados para preservar los alimentos! as- tenemos las tetraciclinas.  9gentes bacteriostticos se utili$an en la industria te%til como protección de materiales. "n la industria del maquillae para las cremas! lociones para después de afeitar! en perfumes. Sustancia o 9gente capa$ de actuar sobre los microorganismos! ya sea inhibiendo su crecimiento o causando su muerte. N9MO"S 09N9 &O5NOL9N >E&NOONG9ES>OS =enéficos que generan el control d microrganismos por estos agentes#

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0revenir la transmisión de las infecciones y las enfermedades. 0revenir la contaminación o la proliferación de microorganismos perudiciales. "vitar el deterioro o destrucción de materiales por los microorganismos.

ACCION OLI/ODINAMICA DE LOS METALES ESADOS

1. OBJETIVOS 

Demostrar la acción oleodinmica de algunos metales.

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Denotar las diferencias de cada grupo para ver las diferencias y similitudes y as- poder saber en qué se equivocó cada grupo.

2. FUNDAMENTO TEORICO A&&i$ oli7o(i$ai&a (e los etales -esa(os.

Los iones de algunos metales pesados en altas diluciones son capaces de eercer una acción tó%ica sobre las bacterias y otros microorganismos. Si se coloca una moneda o un tro$o de cobre debao o sobre un medio de cultivo sólido recién inoculado con un microorganismo! luego de incubar se puede observar que no hay crecimiento en la $ona alrededor del metal. "sta es la $ona oligodinmicaB con frecuencia las colonias en el borde del halo de inhibición son de mayor tama*o que en el resto de la placa! debido a que tuvieron una mayor disponibilidad de nutrientes que no fueron utili$ados en la $ona sin crecimiento.  9cción oligodinmica! son activos en muy baas concentraciones +ppm,. Enactiva espec-ficamente en$imas claves al reaccionar con grupos SH. Son muy tó%icos y su actividad disminuye con la e%istencia de fluidos biológicos. METALES ESADOS 9 SUS COMUESTOS La mayor-a de metales pesados! ya sean solos o en ciertos compuestos! causan da*o a los microorganismos. Los ms efectivos son el mercurio! plata cobre.

Metales -esa(os :a&&i$ oli7o(i$,i&a;

La acción oligodinmica es la propiedad que tienen ciertos metales en cantidades sumamente peque*as! en particular la plata! de eercer efectos letales sobre las bacteriasB el término proviene de dos palabras palabras griegas oligos! que significa peque*o! poco y dynamis! que significa! fuer$a! poder. "ste fenómeno se demuestra fcilmente en el laboratorio poniendo un peda$o de metal limpio +plata o cobre, sobre una placa de cultivo. Después de la incubación! se ver una $ona de inhibición +sin desarrollo, rodeando al metal. La cantidad de metal involucrada en el efecto inhibidor se puede e%presar en partes por millón. Se cree que la eficacia de estas peque*as cantidades de metal se debe a la gran afinidad de que tienen ciertas prote-nas celulares por los ionesB se acumulan grandes cantidades en las células a partir de las soluciones diluidas. Los metales con actividad oligodinmica! particularmente la plata! se han usado en diferentes aplicaciones con el propósito de controlar las poblaciones microbianas como el tratamiento de los suministros de agua! preparación de art-culos antisépticos como vendaes y ungPentos! y la impregnación de diferentes teidos. La acción oligodinmica proporcionar un acercamiento notable para el control de los microorganismos y al parecer se han reali$ado muchos dise*os y art-culos tomando como base este fenómeno. Co-"estos (e etales -esa(os >uchos compuestos de metales pesados son útiles como germicidas o agentes antisépticos. Los compuestos de metales pesados que ms descuellan son los de mercurio! plata y cobre. Los metales pesados y sus compuestos actúan contra los microbios al combinarse con las prote-nas celulares y desnaturali$arlas. "n el caso del cloruro de mercurio la inhibición es directamente sobre las en$imas que contienen grupos sulfhidrilos. Las sales de los metales pesados también precipitan las prote-nas! y a grandes concentraciones estas sales causan la muerte de las células. Sin embargo! la dilución mayor a la cual algunos de estos compuestos muestran su acción bactericida o bacteriosttica sugiere interferencias ms sutiles con los mecanismos celulares normales. Me&a$iso (e (esi$+e&&i$ e(ia$te io$i. RECOMENDACIONES 

5ener cuidado cuando desinfectamos la moneda! ya que la placa esta al aire libre y se pude contaminar por agentes e%ternos.

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desinfectar nuestras manos! en este caso no estaban desinfectadas y as- agarramos la moneda de die$ céntimos.

?. BIBLIO/RAFIA I$+ore >E&NO=EOLOGE9. 9utor# >ichael U 0elc$ar. 4da "dición 'e$cla =ordelesa,. Los compuestos de $inc también son fungicidas por lo que se utili$an para tratar el pie de atleta.