Laboratorio-Enzima

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Informe laboratorio n° 6-7 “Estudio cinético de la β-galactosidasa; Influencia del pH y la temperatura en la reacción enim!tica"

 #signatura$

-

%étodo %étodos s de an!li an!lisis sis en bio&u'mica

Integrantes$

-

%ar'a #guilar  Ignacio (andia )elipe (astillo %arcela (astro *anesa %ic+aga

,ocente$

-

% .ilo (ar/a0al

Introducción Las enzimas son proteínas de alto peso molecular con propiedades capaces de cumplir funciones catalizadoras con el objetivo de acelerar reacciones en el metabolismo del ser vivo. Son altamente especícas dado que poseen un centro activo con los componentes responsables para cada catálisis. Por esto, es fundamental estudiar el comportamiento de las enzimas a nivel del organismo con el objetivo de comprender como este trabaja. La cintica enzimática es el mtodo más antiguo para estudiar mecanismos de reacci!n enzimáticos " consiste en la determinaci!n de la velocidad de la reacci!n " el modo en que sta cambia en respuesta a cambios en los parámetros e#perimentales $Le%ninger, &''(). Para que una reacci!n se lleve a cabo, se debe contar con sustrato, la enzima, un cofactor " la formaci!n de producto. *ic%aelis " *enten propusieron un modelo simple para e#plicar la ma"oría de las reacciones catalizadas por enzimas. +n este modelo la enzima se combina reversiblemente con su sustrato para formar el complejo enzimasustrato $+S) que subsecuentemente se rompe para formar el producto, %ec%o que regenera a la enzima.

+#isten factores naturales que pueden alterar la velocidad de la reacci!n catalizada por la enzima, estos corresponden a emperatura, P del medio, presencia de in%ibidores " la concentraci!n de sustrato. La modicaci!n que realizan en la reacci!n se relaciona considerando que la enzima es una proteína " tiene propiedades como tal, pudiendo llegar siempre a la desnaturalizaci!n en condiciones no favorables. +n este laboratorio se presentará una demostraci!n e#perimental de las alteraciones de la temperatura " p en la actividad enzimática utilizando la enzima /-galactosidasa proveniente de la bacteria E.coli  0&'. +sta enzima se clasica como %idrolasa " su sustrato natural es la lactosa, sin embargo, se utilizará el 1-nitrofenil-/-galactosido como sustrato $en presencia de agua), con el objetivo de obtener como producto 2alactosa " ortonitrofenol.

Procedimiento Para el estudio cinético (laboratorio n°6) &. Se preparan un tubo de volumen nal &3 mL con los siguientes componentes. +nzima 4-galactosidasa 4u5er fosfato 3.36 *, p 7,8 • •

9gua Se prepara 1:P2 " una soluci!n blanco $sin sustrato) para uso posterior. Se pre incuba el tubo a (7;< por = minutos. Se prepara un set de > tubos con carbonato de sodio 3.' * en volumen nal '.= ml, completando con agua destilada. Se adiciona 1:P2 al tubo preincubado e inmediatamente se e#traen 3.> ml de este %acia el primer tubo del set con carbonato de sodio. Luego de un minuto se adiciono 3.> ml del incubado al siguiente tubo del set %asta completar los > tubos. ?inalmente se midi! la absorbancia el set de tubos a 83= nm. •

'. (. 8. =. 6. 7.

Para la infuencia del pH – 8,5(laboratorio n°7 – parte ) &. Se preparan un tubo de volumen nal &3 mL con los siguientes componentes. +nzima 4-galactosidasa 4u5er fosfato 3.36 *, p >,= 9gua '. Se prepara una soluci!n blanco $sin sustrato) " una soluci!n de 1:P2 para uso posterior. (. Se pre incuba el tubo a (7;< por = minutos. 8. Se prepara un set de > tubos con carbonato de sodio 3.' * en volumen nal '.= ml, completando con agua destilada. =. Se adiciona 1:P2 &3 m* al tubo preincubado e inmediatamente se e#traen 3.> ml de este %acia el primer tubo del set con carbonato de sodio. 6. Luego de un minuto se adiciono 3.> ml del incubado al siguiente tubo del set %asta completar los > tubos. 7. ?inalmente se midi! la absorbancia el set de tubos a 83= nm. • • •

Para la infuencia de temperatura – 56°! (laboratorio n°7" parte #) &. Se preparan un tubo de volumen nal &3 mL con los siguientes componentes. +nzima 4-galactosidasa 4u5er fosfato 3.36 *, p 7,8 9gua '. Se prepara 1:P2 " una soluci!n blanco $sin sustrato) para uso posterior. (. Se pre incuba el tubo a =6;< por = minutos. 8. Se prepara un set de > tubos con carbonato de sodio 3.' * en volumen nal '.= ml, completando con agua destilada. =. Se adiciona 1:P2 al tubo preincubado e inmediatamente se e#traen 3.> ml de este %acia el primer tubo del set con carbonato de sodio. 6. Luego de un minuto se adiciono 3.> ml del incubado al siguiente tubo del set %asta completar los > tubos. 7. ?inalmente se midi! la absorbancia el set de tubos a 83= nm. • • •

$esultados %&'$&$I 6 Preparar bufer Fosato de Sodio 0,06M, pH 7.4. p@ p0 a A log B4C   B9C 7,8@ 6,>' A log B4C (,>3&>B9C @ B4C B9C

3,=>@ log B4C

anti log B9C B9C A B4C @

3,36 * B9C A (,>3&>B9C@3,36 B9C $& A (,>3&>) @ 3,36 * 3,3&'8 *

B9C @ 3,36 *  

B4C A 3,3&'8 * @ 3,36 * 3,3876 * B9C :a'P18

B9C @

8,>3&> B4C@ 3,36 D 3,3&'8

&=6,3&

g

*ol

3,3&'8 * @

B4C@

E

&=6,3& gFmol G 3,= L

E@ 3,H67' gr B4C :a'P18

&8&,H6

g

*ol

3,3876 * @

E

&8&,H6 gFmol G 3,= L

E@ (,(7>6 gr R// Para preparar un Bufer Fosato de Sodio 0,06 M a pH 7,4 se necesitan 0,67! "r de #aH !P$4  % &,&7'6 "r de #a!HP$4 para lue"o ser aorado (asta los )00 *+ con a"ua destilada. Preparar solución de o-nitroenol –  – !alactósido "#$P%& a '0 (M. & mol @ 3.33'= mol E

&333 m* &3 m*

3,3& * @

E 3,'= L

3,33'= mol G (3&,'6 gFmol

3,7=( gr

R// Para prepara la solucin de $#P- a 0 *M se necesitan 0,7)& "ra*os %  lue"o aorar (asta los !)0 *+. Preparar solución de )arbonato de Sodio "$a *)#+ & al 0,* M 3,' * @

E 3,'= L

@ 3,3= moles G &3=,H> @ =,'HH gramos

R// Se necesitan ),! "ra*os de caronato de sodio para tener una *olaridad de 0,! M en !)0 *+.

abla 

7 ubos 'lanco +olución madre ubos  # ; 3 5 6 7

!arbona to de sodio (ml)

&*ua destilada (ml)

+ustrat o P (ml)

.n/ima 0– *alactosidasa  (1%)

'u2er  (pH 7,3) (ml)

& ' #

3,7 & '

# # 8

E # >3

# ' 8

Soluci!n madre $ml) $I: 3,> 3,> 3,> 3,> 3,>

9bsorbancia $8&= nm) &,HH=8 3 3 3 3 3 3

&4 P$  P$.+.&$ &'+$'&!I&+ . %& &$I& %+ '+, .!II+ !&'I&$ %&+ P$P$!I.+ . .++9 abla # ($.PII!I .% .:P.$I.)

8 ubos ubos 'lanco +olución madre  # ; 3 5 6 7 8

!arbona to de sodio (ml)

&*ua destilada (ml)

3,= (,= +olución madre 3,= = (ml) = #

+ustrat o P (ml)

.n/ima 0– *alactosidasa  (1%)

'u2er  (pH 7)   (ml)

#

# &3 &3

E (,> (,>

&bsorbancia # (35 nm) &,'

(I!'& a ;7 3,> 3,> 3,> 3,> 3,> 3,> 3>

3,8==> 3,>>>8 3,>=66 &,38=H 3,>>6> 3,>86( 3,>((& 3 >8H8

-ra=cas

!ur>a de calibración P 3.3( f$#) @ 3.H8#

3.3' 3.3'

&bsorbancia 3.3& 3.3& 3 3

3.3&

3.3&

3.3'

3.3'

3.3(

3.3(

!oncentración P ? m

 ubos & ' ( 8

>8@ 3,H83(# 3,>=66@ 3,H83(# &,38=H@ 3,H83(#

87 3,H88> 3,H&3H &,&&'(

= 6 7 >

3,>>6>@ 3,H83(# 3,>86(@ 3,H83(# 3,>((&@ 3,H83(# 3,>8H8@ 3,H83(#

3,H8(& 3,H333 3,>>=H 3,H3((

!ur>a de Pro*reso '" -alactosidasa &.'

f$#) @ 3.&6# MN @ 3.>(

& 3.>

!oncentración (u) 3.6 3.8 3.' 3 3

&

'

(

8

=

6

7

>

H

iempo (minutos)

 l tie(po i!ual a 4 (inutos la eni(a alcana su (aor capacidad catal/tica a pH 7.4  +7) de te(peratura, 1abiendo utiliado 0.0' (! de eni(a.

%&'$&$I ° 74 I@%.!I& .% PH +'$. %& A.%!I& . %& $.&!!IB .CI&I!& D. !&&%IC& %& ' " -&%&!+I&+& Preparar bufer Fosato de Sodio 0,06M, pH 2.3. p@ p0 a A log B4C   B9C >,=@ 6,>' A log B4C 87,>6B9C @ B4C B9C

&,6>@ log B4C

anti log B9C B9C A B4C @

3,36 * B9C A 87,>6B9C@3,36 B9C $& A 87,>6) @ 3,36 * &,''7H # &3 -( *

B9C @ 3,36 *  

8>,>6

B4C A &,''7H # &3 -( *@ 3,36 * B4C@ 3,3=>7 *

B4C@ 3,36 D &,''7H # &3 -( *

B9C :a'P18

@ &,''7H # &3 -( * @

&=6,3& g

B9C @

E

*ol

&=6,3& gFmol G

3,'= L E@ 3,387> gr B4C :a'P18

&8&,H6

g

3,3=>7 * @

*ol

E

&8&,H6 gFmol G 3,'= L

E@ ',3>(' gr R// Para preparar un Bufer Fosato de Sodio 0,06 M a pH ',) se necesitan 0,047' "r de #aH !P$4  % !,0'&! "r de #a!HP$4 para lue"o ser aorado (asta los !)0 *+ con a"ua destilada. Preparar solución de o-nitroenol –  – !alactósido "#$P%& a '0 (M. Preparar solución de )arbonato de Sodio "$a *)#+ & al 0,* M

abla ;

8 ubos 'lanco +olución madre ubos  # ; 3 5 6 7 8 -ra=cas

!arbona to de sodio (ml)

&*ua destilada (ml)

+ustrat o P (ml)

.n/ima 0– *alactosidasa  (1%)

'u2er  (pH 8,5)   (ml)

3,= 3,= #

(,= = =

# # &,'

# &3 &3

E (,> (,>

Soluci!n madre $ml) $I: 3,> 3,> 3,> 3,> 3,> 3,>

9bsorbancia $8&= nm) 3,&783 3,(>>= 3,6&'& 3,7>=' 3,>>'8 3,'HHH 3,H3=6 3,>H>>

!ur>a de calibración P 3.3( f$#) @ 3.H8#

3.3' 3.3'

&bsorbancia 3.3& 3.3& 3 3

3.3&

3.3&

3.3'

3.3'

3.3(

3.3(

!oncentración P? m

 ubos & ' ( 8 = 6 7 >

?ormula 3,&783@3,H83(# 3,(>>=@3,H83(# 3,6&'&@3,H83(# 3,7>='@3,H83(# 3,>>'8@3,H83(# 3,'HHH@3,H83(# 3,H3=6@3,H83(# 3,>H>>@3,H83(#

=3 3,8&(& 3,6=3H 3,>(=3 3,H(>8 3,(&>H 3,H6(3 3,H==>

!ur>a de pro*reso '"-alactosidasa con infuencia de pH (8,5) &.' &

f$#) @ 3.&(#

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!oncentración (u) 3.6 3.8 3.' 3 3

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iempo (minutos)

%&'$&$I °7 4 I@%.!I& . %& .P.$&$& +'$. %& A.%!I& . $.&!!I .CI&I!& D. !&&%IC& %& ' " -&%&!+I&+& Preparar bufer Fosato de Sodio 0,06M, pH 7.4. Preparar solución de o-nitroenol –  – !alactósido "#$P%& a '0 (M.

Preparar solución de )arbonato de Sodio "$a *)#+ & al 0,* M

abla 3

8 ubos 'lanco +olución ubos madre  # ; 3 5 6 7 8 -ra=cas

!arbona to de sodio (ml)

&*ua destilada (ml)

+ustrat o P (ml)

3,= (,= 3,= = #Soluci!n madre = $ml) $I: 3,> 3,> 3,> 3,> 3,> 3,>

.n/ima 0– *alactosidasa  (1%)

# # &,' 9bsorbancia $8&= nm) 3,338( 3,33'6 3,33(8 3,33'> 3,33(3 3,33'& 3,333( 3,333&

# &3 &3

!ur>a de calibración P 3.3( f$#) @ 3.H8#

3.3' 3.3'

&bsorbancia 3.3& 3.3& 3 3

3.3&

3.3&

3.3'

3.3'

3.3(

3.3(

!oncentración ? m

 ubos & ' ( 8 = 6 7 >

?ormula 3,338(@3,H83(# 3,33'6@3,H83(# 3,33(8@3,H83(# 3,33'>@3,H83(# 3,33(3@3,H83(# 3,33'&@3,H83(# 3,333(@3,H83(# 3,333&@3,H83(#

ml al tubo n;6 o fuera del tiempo correspondiente. Sin embargo, analizando la curva puede observarse un avance de la reacci!n más estable que a p@7.8 retardando el decaimiento de la actividad enzimática, lo cual puede ser til para pr!#imas actividades prácticas en donde se requiera un tiempo de acci!n ma"or a 8 minutos. +sto puede deberse a que a p >.= la enzima posee $por arreglo espacial de grupos ionizados de la proteína) un sitio activo distinto al que contiene a p 7.8, generando un lapso de tiempo entre uno " otra molcula de sustrato, retardando la saturaci!n por sustrato o producto,

como ocurre en el p más acido. ?inalmente, la actividad enzimática en relaci!n a una temperatura de =6;< se puede concluir a travs de la curva de progreso, que la acci!n enzimática fue mu" irregular o casi nula. +n general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones químicasO por cada &3< de incremento, la velocidad de reacci!n se duplica. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta le" general. Sin embargo, al ser proteínas, a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor. +n este paso practico, se incub! a =6;