LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA Tincion y Hongos

 

UNIVERSIDAD MARIANA FACULTAD DE INGENIERÍA INGENIERÍA DE PROCESOS MICROBIOLOGIA

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

TECNICAS DE COLORACION Fajardo Jojoa Kelly Stefania Zambrano Vallejo Juan Ernesto Andrade Barco Daniel Esteban Eraso Solarte Jhovan Andrés  Andrés  RESUMEN Las técnicas de coloración o fijación nos permiten observar de manera correcta las  bacterias y sus diferentes estructuras celulares, la observación se hará a través del microscopio con la suspensión de microrganismos extendidas en portaobjetos (frotis), secadas y fijadas; la fijación de la muestra se puede hacer a temperatura tempe ratura ambiente o utilizando el calor para poder teñirla.

Palabras Clave: Coloración, Técnicas, Observación, Bacterias, Coloración de Gram. 1.  INTRODUCCION

microorganismos, pero no las estructuras internas. La fijación química con agentes

La tinción es una técnica que permite incrementar el contraste entre la célula y su entorno, contribuyendo a mejorar la imagen

observada.

En

como etanol, formaldehido y ácido acético entre otros, se utiliza para preservar las estructuras celulares.

Microbiología

todas las tinciones se realizan a partir de la

La fijación por calor es la más

suspensión de microrganismos extendidas

utilizada para la observación de bacterias,

en portaobjetos (frotis), secadas y fijadas.

consiste en pasar el portaobjetos, con la suspensión bacteriana extendida y seca, a

La fijación por calor preserva la morfología

externa

de

los

través de la llama del mechero.

 

UNIVERSIDAD MARIANA FACULTAD DE INGENIERÍA INGENIERÍA DE PROCESOS MICROBIOLOGIA

TIPOS DE COLORACIONES

  Colorantes de Gram.



  Azul de metileno.



. Simple:  se utiliza un solo

   Nigrosina o tinta china.



colorante, y permute determinar la forma, tamaño y tipo.

  Agua destilada.



  Microscopio.



  Mechero.

Diferencial:  aplicación de dos



colorantes, las más utilizadas la de Gram y



la de ácido alcohol resistencia.



.

  Pinzas.

  Pipeta Pasteur.

  Botella lavadora.



. De estructuras:  para colorear

  Recipiente

.

con



estructuras como flagelos, capsulas.

desinfectante

solución

(hipoclorito

de

sodio)

Micro químicas:  para detectar

  Lugol.



compuestos químicos.

  Etanol-cetona 95%



. Negativa: lamina con fondo oscuro

  Fucsina - Safrina



(tinta china y agua), las bacterias brillan. En esta práctica se aplicarán dos

. De ácido resistencia:  separa las

técnicas de coloración:

la coloración

 bacterias que se decoloran de las que no se

simple y la coloración diferencial (Tinción

dejan decolorar con el ácido.

de Gram).



MATERIALES Y MÉTODOS

Coloración simple

Coloración simple y diferencial

Ponemos una gota de agua destilada

  Cultivo

sobre un portaobjetos, calentamos un asa de

Staphylococcus

aureus. 

  Cultivo de Escherichia Coli.



  Portaobjetos y cubreobjetos.



  Asas microbiológicas

microbiológica hasta el rojo vivo para esterilizar, y la enfriamos en el medio de cultivo.

Tomamos

una

muestra

del

microorganismo y la extendemos sobre el  portaobjetos,

la

homogenizamos;

 

UNIVERSIDAD MARIANA FACULTAD DE INGENIERÍA INGENIERÍA DE PROCESOS MICROBIOLOGIA

utilizando

unas

pinzas

se

coge

el

 portaobjetos y utilizando la llama del mechero secamos el agua para fijar el microorganismo, tenemos cuidado de no quemar la muestra. Dejamos enfriar el  portaobjetos y añadimos una gota de azul

Figura 1 ASA AL ROJO VIVVO 

de metileno por 5 minutos. Transcurrido los 5 minutos, lavamos el

portaobjetos

con

agua

destilada,

secamos la lámina y ponemos encima de la muestra un cubreobjetos. Observamos la muestra.

Figura 2 TOMA DE MUESTRA

Figura 3 SECADO DE MUESTRA

 

UNIVERSIDAD MARIANA FACULTAD DE INGENIERÍA INGENIERÍA DE PROCESOS MICROBIOLOGIA

Tinción de Gram Tomamos muestra del cultivo a observar, luego de haber calentando al rojo vivo las asas microbiológicas,  posteriormente se enfrían en un costado interno de la caja Petri y tomamos la muestra, depositamos 2 gotas de agua destilada en un portaobjetos y ponemos la muestra obtenida y procedemos a secado de la muestra.

Figura 5 LAVADO CON AGUA DESTILADA Agregamos dos gotas de lugol, esperamos 1 minuto y lavamos con agua

Figura 4 SECADO

destilada.

Luego del secado y reposo de la muestra adicionamos dos gotas de violeta de genciana y la dejamos un minuto, después del minuto lavamos con agua destilada.

Figura 6 ADICION DE LUGOL Lavamos la muestra con etanol por 30 segundos (s), lavamos nuevamente con agua destilada.

 

UNIVERSIDAD MARIANA FACULTAD DE INGENIERÍA INGENIERÍA DE PROCESOS MICROBIOLOGIA

RESULTADOS: Observe todas las  bacterias con las diferentes coloraciones, determine su morfología y determine si son bacterias Gram positivas o bacterias Gram negativas. Dibuje lo observado.

Figura 7 LAVADO CON ETANOL

El

Añadimos safranina dejamos actuar  por un minuto, lavamos con agua destilada

dibujo

representa

al

Staphylococcus en un lente 4X. Sin forma definida, bacteria Gram +.

y secamos el exceso de líquido con una toalla

absorbente,

cubreobjetos

y

ponemos

observamos

en

el el

microscopio.

Figura 9 STAPHYLOCOCCUS EN UN LENTE 4X. Figura 8 ADICION DE FUCSINA O SAFRINA

Escherichia coli, lente de 4X sin forma definida. Bacteria Gram observar en microscopio.

Figura 10 E. COLI - 40X

al

 

UNIVERSIDAD MARIANA FACULTAD DE INGENIERÍA INGENIERÍA DE PROCESOS MICROBIOLOGIA

Microorganismos

vistos

2. ¿Cuál es el fundamento de la

en

coloración de Gram?

microscopio.

Tinción de Gram Esta tinción diferencial fue propuesta por el medico danés Christian Gram, que examinando tejido pulmonar de enfermos e nfermos fallecidos por neumonía

observó

que

la

bacteria

Streptococcus pneumoniae, presente en

FIGURA 11 . ESCHERICHIA COLI 40X

los

pulmones,

conocido

retenía

como

el

colorante

marrón

Bismark

(sustituido posteriormente por el cristal violeta), mientras que el tejido pulmonar no era capaz de retener el colorante. Es utilizada

la

tinción

de

diferencial

forma

rutinaria

más y

 prácticamente la primera prueba a la que

FIGURA 12 STAPHYLOCOCCUS AUREUS 40X

se someten las muestras de cualquier origen antes de su estudio. Proporciona una información esencial, sobre la forma, tamaño y agrupación celular, como del tipo y composición de la pared que  presentan

las

bacterias.

La

tinción

de Gram divide a las bacterias con pared del Dominio Bacteria en dos grandes grupos: bacterias con pared de tipo Gram

FIGURA 13 STAPHYLOCOCCUS AUREUS 100X

 positiva y bacterias con pared de tipo Gram negativa.

 

UNIVERSIDAD MARIANA FACULTAD DE INGENIERÍA INGENIERÍA DE PROCESOS MICROBIOLOGIA

La

y

de los microorganismos a esta tinción,

organización de la pared celular en estos

 parece que q ue la diferencia se debe tanto a la

dos tipos de organismos hace que ambos

estructura física como a la composición c omposición de

grupos respondan de manera distinta, así

la pared celular, en bacterias Gram

mientras las bacterias Gram positivas

 positivas la la gruesa capa de péptidoglucano

mantienen y conservan el complejo cristal

con abundantes entrecruzamientos parece

violeta-iodo, las bacterias Gram negativas

contribuirá la retención del colorante

se decoloran rápidamente con la aplicación

fundamental, cristal violeta, mientras que

del alcohol, admitiendo el colorante de

en bacterias Gram negativas la delgada

contraste que proporciona un color entre

capa de peptidoglucano junto con la

rosa y rojo que contrasta con el intenso

abundancia de lípidos en la membrana

color violeta.

externa de la pared celular incrementan la  porosidad y por ello, contribuyen a la

Se

diferente

han

estructura

propuesto

diferentes

explicaciones para justificar la respuesta

 pérdida del colorante fundamental fundamental después de la decoloración con alcohol.

 

UNIVERSIDAD MARIANA FACULTAD DE INGENIERÍA INGENIERÍA DE PROCESOS MICROBIOLOGIA

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

LOS HONGOS RESUMEN La observación macroscópica y microscópica de los hongos nos permiten establecer características de este tipo de microorganismos a simple vista y con imágenes aumentadas  para distinguir las estructuras que los componentes como hifas, conidias, esporas y esporangios.

Palabras Clave: Microorganismos, Hongos, Características, Observación, Mohos.  

Son capaces de crecer en condiciones extremas y llegar a formar micro toxinas.

INTRODUCCIÓN Los hongos son microorganismos eucarióticos (tienen el núcleo rodeado por una membrana) unicelulares o  pluricelulares que no n o forman tejidos y sus células se agrupan formando un cuerpo filamentoso muy ramificado. El conjunto de filamentos de un hongo se llama micelio. Los

hongos

tienen

alimentación

heterótrofa, puesto queno notienen puedenclorofila. realizar la fotosíntesis porque Su forma de reproducción puede ser asexual, por esporas, y sexual. Pueden tener forma redonda, ovalada o en forma de fibras. Las fibras pueden formar un entramado o red, visible a simple vista, como por ejemplo los mohos en los alimentos. Los hongos viven en lugares húmedos, con abundante materia orgánica en descomposición y en ausencia de luz sola

Los hongos tienen una gran importancia económica: las levaduras son las levaduras las responsables de la  fermentación de la fermentación la la cerveza  cerveza y el el pan,  pan,   y el cultivo de setas de setas como las trufas. las trufas.   Desde 1940 se han empleado para producir industrialmente antibióticos, industrialmente  antibióticos,   así como enzimas como  enzimas (especialmente proteasas) (especialmente proteasas).. Los hongos se dividen en mohos y levaduras.

Mohos Los mohos son microorganismos eucariotas no fotosintéticos, que se caracterizan por formar un entramado filamentoso conocido como micelio.  



Morfología. A partir de las esporas o células reproductoras, se desarrolla una agrupación celular en forma de filamentos llamados hifas, que se agrupan formando el micelio o cuerpo vegetativo.

 

UNIVERSIDAD MARIANA FACULTAD DE INGENIERÍA INGENIERÍA DE PROCESOS MICROBIOLOGIA

El micelio se desarrolla de forma radial, colonizando el sustrato de forma superficial o por el interior, tomando distintos aspectos: algodonoso, seco, húmedo.  



Los mohos invaden con rapidez cualquier sustrato, gracias a su eficacia en la diseminación, a un crecimiento rápido y a que poseen una rica carga enzimática.

La mayoría de los mohos se desarrollan entre 15 y 30 °C con un óptimo de crecimiento alrededor de 20-25 °C,

Clasificación de los Hongos: existen varias clasificaciones de los Hongos, las más actualizadas las simplifican y les da a los hongos cinco divisiones    

Basidiomicetos Ascomicetos   Glomeromicetos

   

   



Zigomicetos Quitridiomicetos Por las características de las esporas sexuales:

Los filamentos de los cuales están compuestos los mohos se llaman Hifas y  presentan 3 formas: 1.  Septadas o cenocíticas 2.  Sepatadas con mononucleadas 3.  Septadas con  plurinucleadas.

 



Aspergillus 

es un hongo filamentoso hialino ubicuo,  productor de enfermedades.

células células

Fusarium: Extenso género de micro hongos filamentosos ampliamente distribuido en el suelo y en asociación con plantas.

Las levaduras son unicelulares, esféricas y ovales, no forman hifas, ni micelio.

 

UNIVERSIDAD MARIANA FACULTAD DE INGENIERÍA INGENIERÍA DE PROCESOS MICROBIOLOGIA

  Fruta con hongos. ➔  Cinta pegante transparente ➔

Penicillium

tijeras.

Es un hongo filamentoso hialino, saprófito perteneciente al filo Ascomycota.

y

PROCEDIMIENTO: La práctica de hongos se limitó a realizar en nuestro caso con los hongos presentes en la papaya.

Mucor Hongo filamentoso, hifas largas, no septadas y curvas.

MATERIALES Y MÉTODOS   Cajas con hongos filamentosos

➔

 

➔ ➔

    ➔  ➔  ➔  ➔  ➔

 

➔

(Penicillium, Aspergillus, Fusarium) Azul de lactofenol. Portaobjetos y cubreobjetos. Estiletes. Porta y cubreobjetos. Mechero. Microsocopio. Beaker con solución desinfectante (hipoclorito de sodio 1%). Pan con hongos.

A simple vista el hongo tenía una forma ovalada con zonas negras y blancas y en la  periferia gris oscuros, con textura aterciopelada y suave. En un portaobjetos extendimos la muestra que obtuvimos de la papaya, luego de que el estilete estuvo al rojo vivo y fue enfriado e nfriado y previamente se adiciono una gota de azul de lactofenol en el portaobjetos, cubrimos la muestra con un cubreobjetos y  procedemos a observar la muestra en el microscopio. Observamos la muestra.

RESULTADOS: Dibuje lo que observa en los diferentes objetivos y señale principales estructuras observadas.  1.

Las estructuras que se observan son filamentosas, alargadas y otras curvas. Unas colonias con estructuras circulares.

 

UNIVERSIDAD MARIANA FACULTAD DE INGENIERÍA INGENIERÍA DE PROCESOS MICROBIOLOGIA

Identifique el tipo de hifa y órganos de reproducción del hongo.   2.

En la muestra pudimos observar: Hifas septadas con células poli nucleadas, esporangios y esporangiosporas.