Laboratorio de Bioquimica Caseina

 

PRACTICA Nº 03 EXTRACCION DE LA CASEINA Y DETERMINACION DEL PUNTO ISOELECTRICO I.

INTRODUCCION:

Agua: La leche es 90% de agua, lo que hace al agua el más importante componente de la

Ø

leche.

Proteína: La leche contiene entre 3 y 4 % de proteína, dependiendo en la raza de la vaca.

Ø

Leche con mucha grasa también tiene mucha proteína, y viceversa. Ø

Grasa: La grasa está entre 3.5 y 5.25%, dependiendo en la raza de la vaca y su nivel de nutrición. La grasa da a la leche un color amarillo, cuando esta cuenta cuenta con poco contenido graso entonces se torna más blanca

Ø

Lactosa: La lactosa es “el azúcar” de la leche y está presente en un 5%, da a la leche su sabor dulce y forma el 52% de los sólidos en leche. Ø Vitaminas y Minerales: · Vitamina A: Protege contra enfermedades y mantiene la piel. · Vitamina D: Ayuda a absorber el calcio. ·

Calcio:

Regula el corazón, ayuda a los nervios, nervios, y hace huesos y dientes fuertes.

CASEINA: La caseína caseína conti contiene ene vi vitamina taminass (pri (principa ncipalmente lmente tiamin tiamina, a, rib riboflav oflavina, ina, ac acido ido pa pantoté ntoténico nico y vitami vitaminas nas A, D, y K), minerale mineraless (calc (calcio, io, pot potasi asio, o, sod sodio, io, fos fosfor foroo y met metale aless en peq pequeñ ueñas as cantidades), proteínas (incluyendo todos los aminoácidos esenciales), carbohidratos (lactosa) y lípidos. Los únicos elementos importantes de los que carece la leche son el hierro y la vitamina C. Las proteínas se pueden clasificar de manera general en proteínas globulares y fibrosas. Las  proteínas

globulares son aquellas que tienden a agregarse en formas esferoidales y no

establecen interacciones intermoleculares como son los puentes de hidrogeno (característicos de las proteínas fibrosas) siendo solubilizadas en suspensiones coloidales. E n la leche hay tres clases de proteínas: proteínas: caseína, lacto albuminas y lacto globulinas (todas globulares). La ccaseína aseína es una proteína proteína conj conjuga ugada da de la leche de tipo tipo fos fosfop foprot roteín eínaa que se sep separa ara de la lec leche he por  acidificación y forma forma una mas masaa blanca. Las fosfoproteínas sson on un grupo de proteínas que están químicamente unidas a una sus sustancia tancia que contiene acido fosfórico. En la caseína la amyoria de los grupos grupos fosfa fosfato to están unidos por los grupos hidroxilo de los aminoác aminoácidos idos serina y treonina.

 

BIOQUIMICA

 

La caseína caseína en la leche se encu encuentra entra en forme de sal cálcic cálcicaa (caseina (caseinato to calcico) calcico).. La caseína repres rep resent entaa cerc cercaa del 77% al 82% de la lass pro proteín teínas as pre presen sentes tes en la lec leche he y el 2,7% en composición de la leche líquida. La caseína está formad formadaa por α (s1), α (s2)- caseína, β-caseína, y kappa-cas kappa-caseína eína for formando mando

una mic micela ela o unid unidad ad solub soluble. le. N i la alfa nnii la beta cas caseína eína son

solubles en la leche, solas o combinadas. S Sii se añade la kappa-caseína a las dos anteriores o a cada una de ellas por separado se forma forma un complejo de caseína que es solubilizado en forma de micela. micela. Esta micela está estab estabilizad ilizadaa por al kappa caseína mien mientras tras que la alfa y beta son fosfoproteínas que precipi precipitan tan en presen presencia cia de iones de calcio.

  La kappa caseina, sin embargo, tiene pocos pocos grupos fosfato y un alto contenido de carbohidratos unidos a ella. Tambien tiene todos sus residuos residuos de serina y treonina treonina con sus corre correspondientes spondientes grupos hidroxilo, asi como los carbohidratos dispuestos en una sola cara de su superficie por lo que esta parte exterior es fácilmente soluble en agua gracias a los grupos polares que posee. La otra parte de su superficie se une fácilmente a las alfa y beta caseína insolubles, lo que da lugar  a la formación de la micela.

La propiedad característica de la caseína es su baja solubilidad a pH 4,6. El pH de la leche es 6,6 aproximadamente, estando a ese pH la caseína cargada negativamente y solubilizada como sal cálcica. Si se añade ácido a la leche, la carga negativa de la superficie de la micela se neutraliza (los grupos fosfato se protonan) y la proteína neutra precipita.

2

 

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La conformación de la caseína es similar a las proteínas desnaturalizadas globulares. El alto número de residuos de prolina en la caseína causa un especial plegamiento en la cadena de proteína e inhibe la formación de una fuerte y ordenada estructura secundaria. La caseína no contiene puentes di sulfuro. De igual manera la falta de estructura secundaria es importante para la estabilidad de la caseína frente a la desnaturalización por calor. La carencia de estructura terciaria facilita la situación al exterior de los residuos hidrofóbicos lo que facilita la unión entre unidades proteicas y la convierte en prácticamente insoluble en agua. En cambio es fácilmente dispersable en álcalis diluidas y en soluciones salinas tales como oxalato sódico y acetato sódico. La función biológica de las micelas de caseina es transportar grandes cantidades de Ca y P altamente insoluble en forma líquida a los lactantes y formar un coagulo en el estomago  para favorecer una nutrición eficiente. Además de caseína, Ca y P la micela formada también contiene citrato, iones, lipasa, enzimas plasmáticos y suero. Estas micelas ocupan del 6-12% del volumen total de la leche. Las proteínas que aparecerán en el sobrenadante cuando precipitemos la caseína en medio ácido son proteínas globulares, hidrofilicas y fácilmente solubles en agua así como susceptibles de desnaturalización por calor. Las principales son ß -lacto globulina, alphalactalbumina, bovine serum albumin (BSA), y inmunoglobulinas (Ig). La caseína se emplea en la industria para la fabricación de pinturas especiales y en el apresto de tejidos, la clarificación de vinos, la elaboración de preparados farmacéuticos y la fabricación de  plásticos. La pintura de caseína ha sido usada desde la antigüedad por los egipcios.

b) PUNTO ISOELECTRICO Todas las macromoléculas de la naturaleza adquieren una carga cuando se dispersan en agua. Una característica de las proteínas y otros biopolímeros es que la carga total que adquieren depende del pH del medio. Así, todas las proteínas tienen una carga neta dependiendo del pH del medio en el que se encuentren y de los aminoácidos que la componen, así como de las cargas de cualquier ligando que se encuentre unido a la proteína de forma covalente (irreversible). Debido a la composición en aminoácidos de la proteína, los radicales libres pueden existir en tres formas dependiendo del pH del medio: catiónicos, neutros y aniónicos. Cualquier proteína tendría una carga neta positiva si se encuentra en un medio lo suficientemente ácido debido a que los grupos COOH de los aminoácidos aspártico y glutámico estarían en su forma neutra pero los grupos amino de Arginina y lysina estarían protonados ( NH3+).

3

 

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De igual forma si la proteína se encuentra en un medio con un pH muy alto estaría cargada negativamente ya que en este caso los grupos carboxilo estarían desprotonados (COO-) y los grupos amino estarían en su forma neutra (NH2). De lo anterior se deduce que las proteínas tienen un pH característico al cual su carga neta es cero. A este pH se le denomina punto isoeléctrico (pI). En el punto isoeléctrico (pI), se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y negativas por  lo que la pro proteín teínaa pre presen senta ta su máx máxima ima pos posibi ibilid lidad ad par paraa ser pre precip cipitad itadaa al dis dismin minuir uir su solubilidad y facilitar su agregación. Si suponemos una proteína formada únicamente por aminoácidos sin grupos laterales ionizables la carga neta de la proteína dependería exclusivamente de la protonación / desprotonación de los grupos amino y carboxilo terminal. En la realidad las proteínas están formadas por multitud de aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos y la carga va a depender de los grupos ionizables que poseen los aminoácidos que la componen (anexo I) y del  pH del medio.

II.

MATERIALES Y METODOS a. MATERIALES i. MAT MATER ERIAL IALES ES DE LA LABOR BORAT ATORI ORIO O

 

  Un vaso de precipitado de 250ml



  Tubos de ensayo   Probeta de 25ml



  Matraz afo aforado rado de 50 ml



  pipeta gradu graduada ada de 5,0 ml



  pipeta gradu graduada ada de 1,0 ml



  pipeta gradu graduada ada de 10,0 ml



  Embudo de vidr vidrio io mediano



  Espátula



  Papel de filtro



  Termómetro



  Balanza analítica    Leche entera corriente ( 1 litro) 4

 

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ii. REACTIVOS 

  Soluciones buffer pH 4,0 y 77,0 ,0 para calibrar el potenciómetro



  Agua destilada



  Acetato sódico 0,1 N



  Ácido acético 0,01 N



  Ácido acético 00,1 ,1 N



  Ácido acético 11,0 ,0 N



  NaOH 1N



  Éter etílico



  Etanol al 70%

iii. EQUIPOS Potenciómetro (pH-metro)

b. METODOS A. Ais Aislam lamien iento to de de la ccase aseína ína:: 1)

Ca Cali lien ente te eenn un vaso vaso de ppre reci cipi pitad tadoo 15 150m 0mll de agua agua ddes esti tila lada da a 38 38ºC ºC,, añada 50ml de leche y luego gota a gota y con agitación, adicione ácido acético 1M hasta que observe que se forma un precipitado (la leche se corta).

2)

Mid Midaa el pH par paraa sab saber er si se ha lleg llegado ado a 4,6 teó teóric ricoo de la cas casina ina..

3)

De Deje je ssed edim imen enta tarr y fi filt ltre re ssob obre re ppap apel el ddee fi filt ltro ro uusa sand ndoo un em embu budo do ddee cristal.

5

 

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4)

Lav Lavee el pre precip cipitad itadoo con 20m 20mll de etan etanol ol en el mis mismo mo fil filtro tro..

5)

Seque el preci precipitad pitadoo coloc colocando ando vario varioss plieg pliegues ues de papel de filtro filtro..

6)

Col Coloqu oquee el pre precip cipita itado do en un vas vasoo ddee pre precip cipita itado do peq pequeñ ueñoo pre previa viamen mente te  pesado, vuelva a pesar el vaso con el precipitado y luego adicione 5ml/g de éter etílico.

7)

Filt Filtre re nueva uevame ment nte. e.

8)

Des Desech echee el líquid líquidoo qued quedand andoo uunn pprec recipi ipitad tadoo bblan lanco co ddee ffáci ácill manipulación que es la caseína.

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6

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E S Q U E M A D E P

U R IF IC A C IO N

 

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B. Pre Prepar paraci ación ón de la ssolu olució ción n de cas caseín eína: a: 1)

Col Coloqu oquee apr aproxi oximad madame amente nte 250 mg de cas caseín eínaa en un vas vasoo de 50m 50ml. l.

2)

Agr Agregu eguee 220ml 0ml de agu aguaa ddest estilad iladaa y 5 ml de NaO NaOH H 11N; N; agi agite te has hasta ta log lograr  rar  una solución total de la caseína.

3)

Un Unaa ve vezz di disu suel elta ta llaa ca case seín ína, a, ssee vi vier erte te eenn uunn ma matr traz az aafo fora rado do ddee 50 ml, ml, adicione 5 ml de ácido acético 1N y diluya con agua destilada hasta 50ml y mezcle bien.

4)

La soluc solución ión debe ser clara y limpia y si no es así, debe volv volver er a filtra filtrar. r.

C. Dete Determina rminación ción del pI de la case caseína: ína: 1)

En die diezz tub tubos os lim limpio pioss y sec secos os adi adicion cionee exa exacta ctamen mente te los vol volúme úmenes nes de los reactivos según la siguiente tabla.

TABLA DE DISOLUCIONES TUBO Acetato 0,1N Acético 0,1N 1   0,5 9,5 2   1 9 3   1,5 8,5 4 5 6 7 8 9 10 2)

             

2 3 4 6 8 6 8

Acét Ac étic icoo 0, 0,01 01N N pH calc calcul ulad adoo

8 7 6 4 2 -

-

3,2 3,6 3,8

4 2

4,0 4,2 4,5 4,7 5.1 5.5 6.1

Med Medir ir exp experi erimen mental talmen mente te el pH de tod todos os los vas vasos, os, que deb debee cub cubrir rir un rango aproximado semejante al teórico (3 a 6,5). Anotar los valores reales en la Tabla, que deben ser semejantes a los expresados y en todo caso creciente.

3) 4)

Aña Añadir dir 1 ml de dis disolu olució ciónn de cas caseín eínaa a cad cadaa tub tubo. o. Agita Agitarr suav suavemente emente cada uno y espe esperar rar aprox aproximadam imadamente ente 3 minuto minutos. s.

5)

Me Medi dirr la abso absorb rban anci ciaa de cada cada mu mues estr traa a 6640 40 nm con con la lass ccub ubet etas as ddee colorimetría de 1cm de paso óptico, teniendo la precaución de agitar   bien el contenido de cada tubo para obtener una solución / suspensión homogénea antes de verter una parte en la cubeta.

6)

Anota Anotarr resu resultado ltados, s, repre representa sentarr la abso absorbanc rbancia ia fren frente te al pH, y deter determinar  minar  el pI aproximado de la caseína.

7

 

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III.

RESULTADOS:

En la ssiguiente iguiente tabla podemos observar el pH determinado por el Potenciómetro (pHmetro) y además la absorbancia que la determinamos por el espectrofotómetro.

TUBO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

A cetato 0,1N   0 ,5   1   1 ,5   2   3   4   6   8   6   8

Acético 0,1N 9,5 9 8,5 8 7 6 4 2 -

Acético 0,01N 4 2

pH calculado 3,2 3,6 3,8 4,0 4,2 4,5 4,7 5.1 5.5 6.1

pH determinado 3,63 3,18 3,21 3,60 3,77 4,05 4,55 4,97 5,60 5,80

Absorbancia 640nm 0,024 0,142 0,030 0,048 0,152 0,066 0,053 0,034 0,025 0,038

CASEINA PURIFICADA

IV.

CONCLUSIONES:



  Al final de la práctica llegamos a oobtener btener la caseína purificada. purificada.



  Al final de la práct práctica ica se descubri descubrióó que se pued pueden en obtener una amplia vari variedad edad sub productos que tiene su uso e importancia en varias ramas de la iindustria ndustria y la química.



  Ninguna de los componentes de la leche, debería ser menos menospreciado preciado puesto que todos constituyen una emulsión compuesta de componentes orgánicos vitales. o

  Se aprendió a caracterizar la caseina m mediante ediante reacciones si simples mples que dan lugar  a observaciones para diferenciar sus características y propiedades.

V.

BIBLIOGRAFÍA:

- Miller D.D. 2001. Química de Alimentos, Manual de Laboratorio. Limusa Wiley, México 8

 

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VI.

CUESTIONARIO

1) Repr Represen esentar tar A64 A6400 fren frente te al pH de cada cada tub tuboo en el apartad apartadoo 3.

¿Qué sucedería si se representa representa la transmitancia? Io 640nm I 0,02 4 0,14 2 0,03 0 0,04 8 0,15 2 0,06 6 0,05 3 0,03 4 0,02 5 0,03

0,0000375

0,00375

0,000221875

0,0221875

0,000046875

0,0046875

0,000075

0,0075

0,0002375

0,02375

0,000103125

0,0103125

0,0 ,000 0008 0828 2812 1255

0, 0,00 0082 8281 8125 25

0,000053125

0,0053125

0,0 ,000 0003 0390 9062 6255

0, 0,00 0039 3906 0625 25

00,,000059375

0,0059375 9

 

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8

Representacion de la Transmitancia con la Absorbancia 0.03

0.02

    a      i     c     n 0.02     a     t      i     m     s 0.01     n     a     r      T 0.01 0 0

0.02

0 .04

0 .0 6

0.0 8

0 .1

0 .12

0 .1 4

0.1 6

Absorbancia

2) ¿Cuá ¿Cuáll es el el punto punto isoeléc isoeléctrico trico de la caseína? caseína? Una propiedad clásica, que ha servido durante un siglo para su definición operacional, es que las caseínas precipitan a pH 4,6, que es su punto isoeléctrico (a temperatura ambiente).

3) ¿Por q qué ué las pr proteín oteínas as tien tienen en solubili solubilidad dad mín mínima ima en el pI pI?? En el punto isoeléctrico (pl) se equilibran exactamente las cargas opuestas, por lo tanto, la  proteína no demuestra migración neta; generalmente, su solubilidad es mínima en este punto.

ANEXO 1 Preparar 1) 500 ml de acet acetato ato ssódic ódicoo 0,1 N (4, (4,11 g acet acetato ato een n 50 5000 ml agua desti destilada) lada) C H 3 COONa 1 N → 82 g → 1000 m l C H 3 COONa 0,1 N → 8,2 g → 1000 m l C H 3 COONa 0,1 N → 4,1 g → 500 m l 2) 500 ml de ácido ácido acético acético 0, 0,11 N (3 g aacétic céticoo glac glacial ial en 50 5000 ml agu aguaa des destilad tilada) a) C H 3 COOH 1 N → 30 g → 500 m l C H 3 COOH 0,1 N → 3 g → 500 m l 3) 400 ml áci ácido do acét acético ico 0,01 N (0,24 (0,24 g acéti acético co glac glacial ial en 400 ml agu aguaa desti destilada) lada)  X ml C H 3 COOH 0,1 N  100 ml C H 3 COOH 0,01 N  X=10 ml y lo completo a 100 ml =

4) 500 ml ác ácido ido ac acético ético 1 N (30 (30 g acéti acético co glac glacial ial en 500 m mll agua de destilad stilada) a) C H 3 COOH 1 N → 30 g → 500 m l C H 3 COOH 1 N → 60 g → 1000 m l C H 3 COOH 1 N → 6 g → 100 m l 5) 300 m mll NaO NaOH H 1 N (12 (12 g N NaOH aOH een n 300 ml agu aguaa de destilad stilada) a) 10

 

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   NaOH 1 N → 12 g → 300 m l  NaOH 0,1 N → 6 g → 300 m l

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