Laboratorio 5 Cromatografía

PRÁCTICAS DE LABORATORIO CURSO : QUÍMICA ORGÁNICA

Capítulo 5 :

CROMATOGRAFÍA

• LABORATORIO SEM_6

LOGROS DE APRENDIZAJE Conocimiento de un método de identificación y purificación de mezclas de compuestos.

Verificación de un método de separación basado en la distribución o en la diferencia velocidad con que se desplazan los compuestos entre 2 fases en íntimo contacto.

Identificación de compuestos en una mezcla.

Conocimiento de la versatilidad de las técnicas cromatográficas.

REFLEXIÓN DESDE LA EXPERIENCIA En la imagen observamos diferente puntos de inicio con un respectivo color. • ¿Qué sucede cuando agregamos agua al vaso que contiene el papel con los 5 puntos? • ¿Porqué crees que sucede lo que observas? • ¿Será un método de separación ?

LOGRO DE SESION: TÍTULO Al termino de la sesión de aprendizaje el estudiante será capaz de: • Conocer el método de identificación y purificación de mezclas de compuestos haciendo uso de un simulador virtual a través del cual verificará que la cromatografía es un método de separación basado en la distribución o en la diferente velocidad con que se desplazan los compuestos entre 2 fases en íntimo contacto reconociendo y valorando la versatilidad de las técnicas cromatográficas.

https://www.youtube.com/watch?v=sndgYGGlJMs

TÍTULO Es un conjunto de Técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes

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TÍTULO

¿En qué consiste la cromatografía? Fase Móvil

Fase Estacionaria

Consiste en un liquido o gas que es arrastrado a través de la fase estacionaria Consiste en un solido o un liquido fijado a un solido por donde el cual pasa la fase móvil

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TIPOS DE CROMATOGRAFÍA

TÍTULO

En Columna

Plana

En papel

En capa fina

Intercambio Iónico

Por Afinidad

Por Exclusión Molecular

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TÍTULO EXPLICACIÓN DE LA CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

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SECCIÓN DE REFERENCIA

Análisis cualitativos En Papel La fase estacionaria se representa por un papel de filtro y la móvil por un disolvente.

SECCIÓN DE REFERENCIA

Separar Componentes Puros

En Capa Fina Una fase móvil (normalmente, un disolvente) y a una fase estacionaria (la llamada capa fina, que puede ser papel o gel de sílice)

SECCIÓN DE REFERENCIA

https://www.youtube.com/watch?v=rHeH3cOm_nI Depósito

Proteína Simple (Fase Móvil)

Matriz porosa sólida (Fase Estacionaria)

Soporte Poroso Efluido

Cromatografía de Exclusión Molecular

✓Separa

proteínas

según

su

tamaño. ✓La

fase sólida consiste en pequeñas perlas que contienen unos poros o cavidades de tamaño calibrado. ✓Las proteínas de mayor tamaño no

pueden entrar en las cavidades.

La cromatografía de filtración molecular es un método de cromatografía en columna por el cual las moléculas se separan en solución según su peso molecular.

✓ Las proteínas mas pequeñas

penetran en las cavidades.

TIPOS DE CROMATOGRAFIA EN COLUMNAS Partículas más pequeñas

Partículas más grandes

Espacio interno entre partículas Fibras de la matriz polimérica Volumen de intersticio entre partículas

Representación de un lecho comatográfico formado por micropartículas porosas como las empleadas en cromatografía de exclusión molecular.

TIPOS DE CROMATOGRAFIA EN COLUMNAS

SECCIÓN DE REFERENCIA

TIPOS DE CROMATOGRAFIA EN COLUMNA Cromatografía de Intercambio Iónico

En este tipo de Cromatografía la Fase Eestacionaria tiene grupos cargados que interaccionan electroestáticamente con iones de signo contrario de la fase móvil.

TIPOS DE CROMATOGRAFIA EN COLUMNAS

En el caso de los intercambiadores catiónicos, las proteínas con carga neta negativa se desplazan más rápido y eluyen antes. Partículas poliméricas con grupos funcionales cargados negativamente

Se añade la mezcla de proteínas a la columna que contiene intercambiadores de cationes

Las proteínas se desplazan a través de la columna a velocidades determinadas porsu carga neta al pH que se esta utilizando.

SECCIÓN DE REFERENCIA

TIPOS DE CROMATOGRAFIA EN COLUMNAS La cromatografía de afinidad permite la separación de mezclas proteicas por su afinidad o capacidad de unión a un determinado ligando

Cromatografía por Afinidad

LECTINAS

COFACTORES

INHIBIDORES ENZIMATICOS

ANTICUERPOS LIGANDO DE AFINIDAD

SECCIÓN DE REFERENCIA

TIPOS DE CROMATOGRAFIA EN COLUMNAS LIGANDO DE AFINIDAD

MOLÉCULAS BIOQUÍMICAS RESPONSABLES DE LA RETENCION ESPECIFICA DE LOS SOLUTOS- ANALITICOS ,( PROTEINAS).

NATURALEZA

acromoléculas biológicas o moléculas de bajo peso molecular

ACCION

Ligando específicos Biomolèculas pequeñas o macromoléculas bioquímicas Anticuerpo

Ligando generales Lectinas y nucleótidos

TIPOS DE CROMATOGRAFIA EN COLUMNAS

CROMATOGRAFIA DE ADSORCIÓN TÍTULO Es aquel sistema cromatográfico en que la fase fija es un sólido y la separación o desplazamiento depende del equilibrio adsorcióndesorción entre el compuesto y las fases fija y móvil. La adsorción es un fenómeno físico de superficie que consiste en que las moléculas de una sustancia (adsorbato) se adhieren o concentran en la superficie de un sólido finamente dividido (adsorbente). El proceso inverso, o sea la separación de las moléculas adsorbidas se denomina desorción. Por consiguiente, la velocidad con que se desplaza un compuesto depende de la polaridad de sus moléculas, de la actividad del adsorbente y de la polaridad de la fase móvil o solvente. 3

CROMATOGRAFIA TÍTULO DE REPARTO O PARTICIÓN En este método la fase fija es un líquido (generalmente agua) colocado sobre un soporte inerte sólido. La fase móvil es otro líquido o un gas. Existirán 2 tipos de separación: líquidolíquido y gas-líquido. El único factor que influye en el desplazamiento de un compuesto, es la solubilidad relativa de éste en las fases. Las sustancias que son solubles sólo en la fase móvil o solvente, se desplazarán a la misma velocidad que éste, mientras que aquellas solubles únicamente en la fase fija no se desplazarán de donde fueron depositadas.

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RELACION DE FRENTE o Rf

TÍTULO

Es una constante usada especialmente en el caso de la cromatografía sobre papel y en capa fina. Estos métodos pueden servir para intentar la identificación de un compuesto ya que el desplazamiento de una sustancia respecto al desplazamiento del disolvente es constante y característico de ella (siempre que todas las condiciones permanezcan constantes), conociéndose como Rf. Se obtiene al dividir la distancia recorrida por la sustancia entre la distancia recorrida por el solvente:

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PARTE EXPERIMENTAL

TÍTULO

Experimento 1: CROMATOGRAFÍA SOBRE PAPEL Para esta parte solo necesitara alcohol; papel toalla cortada en tiras, una regla, un plato cinta adhesiva y plumones de diferente color dos vasos del mismo tamaño Procedimiento: Seguirás los pasos que el video te señala:

Cuando la fase móvil haya ascendido unos 8-10 cm, retire el papel, marque el frente del solvente (con lápiz) y déjelo secar. Observe y compare las muestras sembradas y calcule el Rf de cada sustancia. 3

SECCIÓN DE REFERENCIA

Experimento 2:

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA PARA PROTEÍNAS:EXCLUSIÓN MOLECULAR, INTERCAMBIO IÓNICO, AFINIDAD

Estimado estudiante, la parte experimental lo haremos haciendo uso de un simulador en el cual podrán apreciar la separación cromatográfica de proteínas, para ello deberás de ingresar al simulador de la dirección que se señala http://biomodel.uah.es/lab/cromat/columna.htm?es

Análisis de cromatograma en el simulador 1. Matriz cromatográfica: Superosa 6

2. Matriz cromatográfica: CM celulosa

Composición de la muestra a analizar:

Composición de la muestra a analizar:

Ribonucleasa A

Aprotinina

Ferritina

Aldolasa

Glutation reductasa Tampon de elución: HEPES pH 7.0

Fosfogluconato deshidrogenasa Tampón de elución : Tris- HCl pH 7.4

SECCIÓN DE REFERENCIA

Experimento 3:

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

Estimado estudiante, la parte experimental lo haremos haciendo uso de un simulador en el cual podrán apreciar la separación cromatográfica de proteínas, para ello deberás de ingresar al simulador de la dirección que se señala https://www.edumedia-sciences.com/es/media/451-cromatografia-de-capa-fina

INTEGRAMOS LO APRENDIDO FASE MÓVIL PARTES

FASE ESTACIONARIA Reparto o partición.

CROMATOGRA FÍA

SEGÚN EL MECANISMO

Adsorción Intercambio Iónica.

TIPOS

Papel Capa fina Según el medio HPLC Columna

ACTIVIDAD ASINCRÓNICA • Próxima semana: Presentación de informe de Laboratorio 5(Capítulo 5): Propiedades de los compuestos orgánicos. Envío hasta una hora antes del inicio de la 6ta clase.

MUCHAS GRACIAS

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