Laboratorio 4 Membrana Plasmatica

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE INGENIERIA DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA DE MATERIALES

CURSO:

Organización y Funcionamiento Celular 

DOCENTE(s): Beltrán Orbegoso, Raúl

 Alumno: Gil Ledesma Santiago

TURNO: Tarde : 2-4 pm

FECHA: 28/05/2013

TRUJILLO  – PERÚ

Laboratorio Número 6: Demostración de la fragilidad osmótica de la MP de eritrocitos humanos Demostración de la diálisis en biomembranas Objetivo: 

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Demostrar el grado de resistencia de los eritrocitos a la acción hemolizante de soluciones hipotónicas Demostrar la dialisis

Introducción: Fragilidad osmótica Si una membrana separa dos soluciones que se encuentran en diferentes concentraciones de solutos, la diferencia de presión osmótica causa un flujo en sentido opuesto al de la presión. El intercambio catiónico que produce la célula esta determinado por las propiedades de la membrana del hematíe, que controla el flujo pasivo de iones y la competencia metabólica de la célula, que determina a su vez el bombeo activo de los cationes contra los gradientes de concentración.(2) Tanto el liquido intracelular como extracelular contienen proteínas no difusibles a través de la membrana debido a su gran tamaño. En condiciones normales no hay movimiento transmembranal de agua debido a que la osmolaridad total y la concentración de solutos no difusibles es igual a ambos lados de las membranas, en otras palabras, los líquidos intra y extracelulares son isoosmoticos e isotónicos entre si. Esta situación sin embargo, se puede alterar cuando disminuye la concentración de proteínas en el plasma sanguíneo como consecuente perdida de proteínas en la orina. Al disminuir la concentración de proteínas, este se hace hipotónico respecto del líquido circundante, el que a su vez se hace hipertónico respecto al anterior. (2) Los términos hipertónico, hipotónico e isotónico, se refieren a los movimientos de agua que causan las perspectivas soluciones. La fragilidad osmótica de los hematíes refleja su capacidad de captar una cierta cantidad de agua antes de la lisis. Viene dada por el cociente volumen/área de superficie. La capacidad del hematíe normal para soportar la hipotonicidad se debe a su forma bicóncava, que permite que la célula incremente su volumen en cerca de un 70% antes de que la superficie de su membrana se distienda; una vez que se alcanza este limite se produce lisis.(1)

Cuando existe una alteración de la forma, como por ejemplo, en la esferocitosis hereditaria, este limite disminuye y la hemolisis ocurre en presencia de soluciones salinas mas concentradas.(3) El aumento de la fragilidad osmótica de los hematíes normales que se produce se debe a la hinchazón de las células asociadas con una acumulación de sodio que excede la perdida de potasio. Otra causa está relacionado con el incremento de la osmolaridad interna de los eritrocito por el reemplazo del polianión 2,3-DPG por Cl-, que ejerce aproximadamente 3.7 veces más efecto osmótico.(1) El test de fragilidad osmótica que consiste en mezclar sangre del paciente con soluciones decrecientes de NaCL y medir la hemolisis que se produce para cada una de alas. Prueba se basa en la pobre capacidad del esferocito para soportar la hipotonía del medio externo.

La medición de la fragilidad osmótica eritrocitaria nos da una información valiosa sobre la normalidad de los hematíes del paciente, ya que un resultado anormal indica la presencia de una anomalía.(4) El aumento de la fragilidad osmótica o la reducción de resistencia a la hemolisis es un rasgo de los esferocito, por los tanto esta prueba puede indicar esferocitosis congénita, anemia hemolítica idiopática adquirida, enfermedad hemolítica isoinmune del recién nacido, y otras anemias hemolíticas, por consiguiente se muestra un cuadro de enfermedades identificadas de acuerdo al aumento o disminución de la fragilidad osmótica. (6) ENFERMEDADES QUE CURSAN CON ALTERACIONES DE FOE AUMENTO DE LA FOE DISMINUCION DE LA FOE Esferocitosis hereditaria Talasemias Estomatocitosis congénita o hidrocitosis Anemia ferropenicas Anemia hemolítica autoinmune con Hemoglobina S esferocitosis Anemia hemolítica microangiopatica Hemoglobina C

SULONAMIDAS SULFONAS NITROFURANOS ANALGESICO DIVERSOS

FARMACOS QUE AFECTAN LOS GLOBULOS ROJOS Sulfametoxazol, sulfacetamida, silfanilamida Dapsona, tiazolesulfona Nitrofuratoina Acetanilida Azul de metileno, fenilhidrazina, naftaleno.

Comúnmente estas drogas están asociadas a hemolisis por oxidación.

A veces el fármaco actúa como un hapteno y el eritrocito actúa como un portador. En este caso, se producen anticuerpos fijadores de complemento que provocan la aparición de la hemolisis intravascular. Otras veces el anticuerpo es una IgG no fijadora de complemento dirigida contra el fármaco y se produce una anemia parecida a la provocada por anticuerpos calientes, con hemolisis extravascular. Una alteración importante que causa hemolisis eritrocitaria es la deficiencia de glucosa-6- fosfato deshidrogenasa (6GDP), las alteraciones de las enzimas que intervienen en el cortocircuito de la hexosa o en el metabolismo del glutatión, disminuye la capacidad de los eritrocitos para protegerse de la lesión oxidativa que los fármacos provocan y por consiguiente causan una anemia hemolítica. La 6GDP es un compuesto comprometido en diversos procesos fisiológicos, por  ejemplo defensa antioxidante. GSH son los responsables del potencial redox efectivo para proteger del estrés oxidativo tanto a los grupos sulfhidrilo de la membrana celular, como a las enzimas y a la hemoglobina que compromete la supervivencia del eritrocito

El mecanismo exacto de destrucción de los glóbulos rojos por estos fármacos todavía no está esclarecido. Compuestos como el azul de metileno y el monosulfato de fenacina oxidan directamente el NADPH a NADP+. Otros como el ascorbato, la nitrofurantoína y el doxorubicina oxidan el GSH. Hay otros compuestos químicos como la primaquina y el daunorubicina que oxidan tanto al NADPH como al GSH. Los episodios típicos de hemólisis se producen de 1 a 3 d después de la administración del fármaco.

La membrana eritrocitaria es semipermeable, es decir, permite el libre paso de agua a través, pero restringe el de ciertos solutos iónicos (Cl, K, Na). La medida de la capacidad de una población de eritrocitos para resistir el efecto hipotónico del medio se denomina fragilidad osmótica eritrocitaria. Por lo tanto ciertas soluciones producen cambios en los eritrocitos.(3)

Hipertonía Si se colocan glóbulos rojos en una solución hipertónica, es decir, de concentración iónica superior en el exterior de la célula, a la del interior de esta misma, se produce un flujo de agua desde el interior de la célula hacia el exterior, por lo tanto pierde agua y de deshidrata, esto produce el efecto conocido como crenación de las células, lo que significa que adquiere un aspecto dentado por diminución de su volumen.

Isotonía Si las células son colocadas en una solución hipotónica con respecto a la concentración interna se produce el efecto contrario, es decir el ingreso de agua a la célula y por consecuencia, una hidratación del eritrocito.

Hipotonía Si la hipotonía del medio supera cierto límite, las células se hinchan por efecto del aumento de volumen llegando eventualmente a romper la membrana, se aprecia una alteración de la membrana por la cual se produce una salida masiva de la hemoglobina hacia el medio. El proceso de ruptura de la pared celular se denomina hemolisis, cuando la hipotonía es absoluta la hemolisis es del 100%.

Por estos motivos es importante cuando una persona requiere que se le suministran soluciones intravenosas están sean isotónicas con los fluidos intracelulares. Si esta precaución no es tenida en cuenta se puede producir la crenación o la hemolisis con graves consecuencias para la salud del paciente

Materiales e Instrumentos Entre los materiales que se usaron para reconocer la presencia de aminoácidos tenemos:

Reactivos  

solucion de salina (ringer mamífera) agua destilada

Muestras 

Muestra hematológica humana

Instrumentos    

Gradillas Tubos de ensayo Pipetas(buretas) Material para venopuncion

Procedimientos y Resultados

1.

Se prepara las solucion de la siguiente forma: 1 tubo : 8ml de Ring. Mamifera 2 tubo : 6ml de Ring. Mamifera + 2 ml de H2O 3 tubo : 4 ml de Ring. Mamifera + 4 ml de H2O 4tubo : 8ml de Ring. Mamifera +1 ml de H2O

2.

Se agrega a cada tubo 2 gotas de muestra hematologica

3.

Se mesclan bien las muestras, teniendo en cuenta la precaucion de colocarle un trozo de papel para que no se derrame las muestras y se mesclen mas uniformemente

4.

Al final se obtuvieron los siguientes resultados

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En el primer tubo se esncuentra un medio isotonico al presentar 0.9% de sales al igual que la sangre, no ocurre reaccion alguna. Tiene una tonalidad turbia En el 2do tubo el color es un poco mas claro por la presencia de agua ya que esta corrumpe el medio isotonico En el 3er tubo la solucion es aun mas clara ya que la proporcion entre agua y la solucion salina estan en 50/50 En el 4to tubo la solucion es de un color rojo brillante, ya que los eritrocitos se han lisado (roto) de alli el color caracteriztico.

Dialisis Las membranas celulares son barreras selectivas que separan las células y forman compartimientos intracelulares. Entre sus funciones están: 

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Regular el transporte de moléculas que entran o salen de la celula o del organelo Generar señales para modificar el metabolismo Adherir células para formar tejidos

La membrana celular está formada por una capa doble de fosfolípidos, proteínas y carbohidratos. (Fig; 7.1). Cada fosfolípido está compuesto por glicerol, ácidos grasos y fosfato, que en conjunto crean una barrera hidrofóbica entre los compartimientos acuosos de la célula. Las proteínas permiten el paso de moléculas hidrofílicas a través de la membrana, determinan las funciones específicas de ésta e incluyen bombas, canales, receptores, moléculas de adhesión, transductores de energía y enzimas. Las proteínas periféricas están asociadas con las superficies, mientras que las integrales están incrustadas en la membrana y pueden atravesar completamente la capa doble. La función de los carbohidratos adheridos a las proteínas (glucoproteínas) o a los fosfolípidos (glucolípidos) es la de adhesión y comunicación intercelular. El colesterol, que es un esteroide (lípido), determina la fluidez de la membrana.

Materiales e Instrumentos Reactivos     

NaCl H2O Sal AgNO3 HNO3

Material biológico  

Ovoalbúmina Buche de ave

Instrumentos    

Vaso de precicpitacion Tubos de ensayo Gradilla buretas

Procedimiento y resultados En un buche de ave se coloca 15ml de ovoalbúmina + una pizca de sal (NaCl). Luego se introduce en el vaso de precipitación, previamente llenado con agua destilada

Se deja reposar por espacio de 20 min sin dejar que se derrame el contenido en el agua destilada, pasado este tiempo se desecha el buche dejando solo el agua destilada para el análisis Luego se vacía el agua en dos tubos de ensayo: 1) Al primer tubo se le agrega 2 gotas de AgNO3 formándose un precipitado blanco , dando lugar a la formación de AgCl; ratificando la presencia de Clen el agua destilada

2) En el segundo tubo se agrega 2 gotas de HNO3 para confirmar que la proteína se ha quedado dentro del buche y no lo traspasó

Análisis y conclusiones

Mediante las pruebas hechas en el laboratorio se pudo determinar lo siguiente:  

Se pudo demostrar la fragilidad de los eritrocitos frente a diferentes medios Se comprobó la permeabilidad del buche al detectar la presencia de Cl- en el agua destilada dándose así el fenómeno de diálisis

Bibliografía  

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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=mcb.chapter. http://www.biology-online.org/9/3_movement_molecules.htm http://en.wikipedia.org/wiki/Cell_membrane