Labo 4 Extraccion ARN Mora

 

UNIVERSIDAD POLITECNICA SALESIANA INGENIERIA EN BIOTECNOLOGIA BIOLOGIA MOLECULAR

NOMBRES: Grace Pila, Martín Rojas, Danny Segarra. NIVEL: 6to semestre, grupo 2

PRACTICA N° 4 TEMA: EXTRACCIÓN DE ARN TOTAL EN MATERIAL VEGETAL. OBJETIVO GENERAL:  -  Extraer ARN de frutos de mora.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS: -  Extraer ácido ribonucleico (ARN) mediante un kit profesional. -  Conocer la función de los diferentes reactivos utilizados en la extracción del ARN.

MARCO TEÓRICO En los organismos celulares, el ARN es la molécula encargada de dirigir la síntesis de  proteínas, pues aunque el ADN es el que contiene la información que determina la estructura de estas, no puede actuar solo y se vale del ARN para traducir esta información y  producir las proteínas necesarias para el desarrollo y actividades de la célula. La mayor dificultad en la extracción del ARN es evitar la contaminación con RNAsas, enzimas muy estables que no requieren cofactores para su función. Por lo tanto, se deben tratar las soluciones y los materiales con Dietil-pirocarbonato (DEPC), el cual inactiva las ribonucleasas por modificación covalente (Herráez, 2012). La metodología que se va a utilizar en esta práctica, permite recuperar el ARN de la fase acuosa como ya se mencionó, igualmente el ADN y las proteínas pueden ser recuperados de la fase orgánica por  precipitación secuencia, así con etanol se logra precipitar pr ecipitar el ADN de la interfase y con una  precipitación adicional pueden recuperarse las proteínas p roteínas de la fase orgánica.

 

RECURSOS UTILIZADOS MATERIALES (todo el material para el laboratorio de biología molecular debe ser autoclavado). DESCRIPCIÓN

CANTIDAD Por curso

Por grupo

Morteros y pistilos medianos estériles

1

Vaso de precipitación con etanol 70% para desechos

1

Tubos eppendor de 1.5 mL autoclavados 4

4

Tubos falcon de 10mL estériles

1

Caja de puntas para micropipetas pequeñas,

1 de c/u

medianas y grandes Micropipetas 0,5-10, 10- 100 ul

1 de c/u

Marcador para vidrio

1

Carrusel para micropipetas Papel Aluminio

1 1

Papel toalla

1

Espátulas estériles

1

Pinzas estériles

1

Mango de bisturí

1

Bisturí

1

REACTIVOS DESCRIPCION

CANTIDAD Por curso

Kit de extracción de ARN en plantas

Por grupo 1 ul

Aspersor con etanol al 70%

1

Agua destilada

2 lt

Etanol 70%

100ml

Mercaptoetanol

10ml

 

 Nitrógeno liquido

200ml

EQUIPOS DESCRIPCION

CANTIDAD

Vórtex

Por curso 1

Microcentrifuga

1

Cámara de flujo

1

Congeladora

1

Balanza analítica

1

Por grupo

PROCEDIMIENTO 1. Realizar una maceración en morteros de la muestra con hielo seco o nitrógeno líquido, hasta obtener una masa homogénea. 2. Agregar 250mg de la muestra macerada en un tubo Eppendorf de 1.5mL. 3. En un tubo falcon preparar la solución del Buffer de Lisis que debe contener 1% de 2-mercaptoetanol por cada procedimiento de purificación, para el cual se adiciona 10µl de 2mercaptoetanol por cada 1mL de Buffer de Lisis. Se adiciona 1mL de Buffer de Lisis en el tubo Eppendorf que contiene la muestra macerada 5. Llevar la preparación al vórtex durante un minuto para realizar una homogenización. 6. Para sedimentar la muestra llevamos a la centrifuga por 2min a 12000 x g. 7. Pasar 1mL del sobrenadante a un tubo Eppendorf nuevo y colocar 500mL de etanol al 70%. 8. Llevar el tubo al vórtex durante un minuto para realizar una homogenización. 9. Pasar 700µl a un tubo de columna y llevar a la centrifuga por 15s a 12000 x g. 10. Descartar el líquido y se repite este procedimiento por duplicado. 11. Se adiciona 700µl de Wash Buffer I y llevar a la centrifuga por 15s a 12000 x g.

 

12. Descartar el líquido. 13. Se adiciona 500µl de Wash Buffer II y se lleva a la centrifuga por 15s a 12000 x g este  procedimiento se realiza por por duplicado. 14. Descartar el líquido y se lleva el mismo tubo de columna a la centrifuga por 2min a 12000 x g. 15. La columna se coloca en un tubo de recuperación. 16. Se adicionan 50µl de Agua libre de ARNasas y se lleva a la centrifuga por 2min a 12000 x g. 17. Adicionar 1µl del protector inhibidor de ARNasas (Roche). 18. Conservar la muestra a -20ºC hasta realizar la transcripción, que debería ser realizada el mismo día. Si no es así se puede congelar la muestra a -80 por un par de días.

RESULTADOS El ARN del fruto de la mora se obtuvo por maceración en nitrógeno líquido agregando los diferentes reactivos del kit comercial Roche. En esta práctica de laboratorio se logró identificar el  proceso de extracción de ARN, además se conoció la función de los reactivos utilizados para la extracción de ARN, como son el mercaptoetanol, los diferentes buffers de lisis y de lavados así como el inhibidor. Al utilizar este protocolo para la extracción del ARN se logró obtener ARN purificado, el éxito de todo el proceso proceso estuvo en evitar la degrada degradación ción por la acción de las ribonucleasas; la mayoría de los protocolos existentes se basan en la rápida inactivación de estas enzimas.

DISCUSION Las moras son fuente de sales minerales y vitaminas, constituyendo así un importante aporte nutricional que podría incluirse en cualquier tipo de dieta. Las concentraciones varían dependiendo de uno uno u otro género y especie. Las moras también contienen alta cantidad de

antocianos y

carotenoides, asociados en diversos estudios a ciertas propiedades consideradas beneficiosas para el organismo. (Liegeois, 2012)  Para la extracción de

ARN

se deben tomarse las máximas precauciones para evitar

contaminaciones con RNasas y la degradación del RNA (Zabala, 2005). Es importante trabajar en un ambiente libre de RNasas, y debe tratarse todo el material para su eliminación. Deben usarse guantes a lo largo de todo el proceso.

 

Intentar trabajar lo más rápido posible, con el fin de evitar la degradación del RNA durante la manipulación. Con el fin de obtener los mejores rendimientos, se usó muestras frescas como material de partida. Utilizamos nitrógeno líquido para mantener la muestra de ARN como menciona (Luque, 2001), es importante utilizar RNA purificado recientemente. El almacenamiento del RNA a -70 ºC ev evita ita su degradación. La extracción de ADN es una técnica que se debe realiz realizar ar con mucho cuidado ya que el ARN se desnaturaliza fácilmente. (Jiménez, 2003)

CONCLUSIONES: El ARN de mora fue extraído con gran éxito gracias al uso de un kit profesional de extracción, lo que permitio el aislamiento de ARN de mora dejando un material puro y sin contaminantes. Se utilizó ARNasa ayudo a eliminar cualquier residuo extra para poder tener el ADN puro y de alta calidad. Con el buffer de lisis se pudo romper la membrana celular para que el material intracelular pueda salir al exterior de la mora pero preservando su estructura. El mercaptoetanol actuó como un antioxidante y estabilizador de las enzimas que pueden degradar nuestro material de interés. Para los últimos pasos el buffer de lavado eliminaron todos los rastros de las proteínas y sales que  pueda tener el ARN, pudiendo realizar más de 3 lavados para asegurar que la calidad del ARN sea el más óptimo.

CUESTIONARIO 1.  ¿Qué tipo de ARN extrajimos? ARN de cadena simple de mora macerada.

2.  ¿Cuáles son las diferencias entra la extracción de ADN, ARN y proteínas? Material ADN

Diferencias -  Procesos simples pudiendo trabajar con kits comerciales para evitar cualquier tipo de contaminación a diferencia de ARN que se debe tomar en cuenta la utilización de los reactivos para evitar contaminación y degradación

 

-  Se debe trabajar más rápido que en cualquier otro proceso para evitar la

ARN

degradación durante la manipulación. -  Se debe trabajar en un medio libre de ARNasas. -  Se debe usar guantes en todo el proceso -  Tomar muestras frescas para el proceso

PROTEINAS

-  Proceso más simple que los anteriores, porque las proteínas son moléculas más abundantes. -  Tiene solo 3 procesos básicos: lisis, separación de componentes moleculares y tratamiento para separación de fracciones subcelulares.

Gonzales Pamela. Lugo Ana .Et all (2015) 

3.  ¿El mercaptoetanol qué genera en el proceso de extracción de ARN?

Es mercaptoetanol es un antioxidante utilizado por su capacidad para romper enlaces disulfuro, por ejemplo en la desnaturalización de proteínas y de ribonucleasa (RNAsas). En la extracción de ARN, el mercaptoetanol genera en el proceso la desnaturalización o ruptura de RNAsas, enzimas que catalizan la hidrolisis del ARN en componentes más  pequeños, es decir propician la ruptura del ARN; por lo que es necesario que la muestra se encuentre libre de estas enzimas

4.  ¿Cómo se puede analizar la expresión génica?   Gen reportero:  Un análisis del gen del reportero se utiliza para determinar el



 potencial regulador r egulador de uuna na sserie erie de la DNA que sea desconocida. d esconocida. Esto implica una un a serie del promotor que es conectada a un gen perceptible del reportero tal como luciferase, β-galactosidasa o β-glucuronidase. Los Ejemplos de los métodos usados

 para determinar la proteína expresada del gen del reportero son fluorescencia, absorción y luminiscencia.   El borrar Septentrional:  Esto es una técnica usada para detectar las moléculas



específicas del ARN presentes dentro de una mezcla del ARN. El borrar Septentrional se emplea en el análisis de una muestra del ARN de un tipo o de un tejido de la célula para determinar la expresión del ARN de ciertos genes . 

 

    El borrar Occidental: El borrar Occidental es una técnica para detectar las



moléculas de proteína específicas dentro de una mezcla de la proteína. Esta mezcla  pudo incluir todas las proteínas qque ue se asocian a un cierto tipo o tejido de la célula. La técnica puede ayudar a determinar la talla de una proteína, y cuánto de él se expresa.

  Hibridación in situ Fluorescente (FISH): Ésta es una técnica citogenética que se

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 puede utilizar para determinar y para localizar series específicas del gen. Los  pescados pueden ser utilizados para visualizar aberraciones del número de copia tales como la cancelacíon, el desplazamiento o la amplificación de cromosomas. La técnica se utiliza en diagnosis prenatal y también proporciona a una herramienta útil en la diagnosis y el pronóstico previsto de diversos sarcomas. La técnica también se utiliza en dermatología para ayudar a evaluar espolones anormales.   Reacción en cadena Reversa de polimerasa de la transcripción (RT-PCR):  Ésta

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es la técnica más sensible disponible para detectar y cuantificar el mRNA. Usando RT-PCR, los tamaños de muestra extremadamente pequeños se pueden utilizar en la cuantificación del mRNA y la técnica puede de hecho hacer esto usando apenas una célula.

  Análisis Serial de la Expresión Génica (SABIO ):  El SABIO es una técnica usada



 para crear una biblioteca ddee las etiquetas cortas de la serie s erie que se s e pueden pued en cada uno utilizar para detectar una transcripción. El nivel de la expresión de la transcripción  puede ser determinado evaluando cuántas veces se detecta cada etiqueta. Esta tecnología activa análisis completo de la expresión a través del genoma.

 

  Microarray de la DNA: También sabido como de biochip o de viruta de la DNA,



un microarray de la DNA es una superficie sólida a la cual una colección de manchas microscópicas de la DNA se asocia. Los microarrays se utilizan para determinar niveles de la expresión a través de un gran número de genes o para realizar genotyping a través de diversas regiones de un genoma.   ARN Seq: Esto refiere a los métodos usados para medir la serie de las moléculas del

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ARN. Los Ejemplos incluyen la secuencia de la escopeta de las moléculas del cDNA detectadas del ARN con la transcripción reversa y tecnologías usadas para ordenar las moléculas del ARN de una muestra biológica de modo que la serie y la abundancia primarias de cada molécula del ARN puedan ser resueltas.



  Tejar matrices: Un arsenal del embaldosado es un tipo de viruta del microarray,

con las metas etiqueta de la DNA o del ARN cruzadas por hibridación a las antenas

asociadas a una superficie sólida. Sin Embargo, las antenas usadas difieren a ésas usadas con microarrays tradicionales. Bastante que las series sabidas o los genes  previstos que son sond sondados, ados, tejando matrices sonde para las series sabidas para estar  presente en una región contigious. Esto puede proporcionar a la información sobre las regiones se ordenan que pero para cuáles son en gran parte desconocidas las funciones locales Almonacid, C Pinilla G (2015). 

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