Lab Oratorio 2 Curva d Ringboom

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS (Universidad del Perú, Decana de América)

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

QUÍMICA ANALÍTICA INSTRUMENTAL “CURVA DE RINGBOWN. DETERMINACIÓN DE LA ZONA DE TRABAJO. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN ÓPTIMA” PROFESORA:

Mg. Norma Carlos Casas INTEGRANTES: Aguilar Puente, Antonio Martin Campos Salazar, Antony Brayan Cárdenas Toribio, Karen Regina Chávez Pacheco, Sair Máximo Colonio García, Katia Stephanie Martinez Cabrejos, Karen Janet Pizarro Herrera, Víctor Romario Quevedo Torres, Sergio Quinteros Espino, Norah Miryam  Torres Chipana, Melissa Mercedes LIMA-PERÚ 2010

OBJETIVOS Aprender a graficar la curva de Ringbom. Conocer la concentración óptima de un compuesto para que cumpla con la Ley de Lambert – Beer a través de la curva de Ringbom. Conocer las limitaciones de la ley de Lambert – Beer.

INTRODUCCIÓN En la primera práctica aprendimos la constitución, el manejo y el cuidado del espectrofotómetro UV-vis y la importancia que tenía dicho instrumento para el reconocimiento de una sustancia. Para reconocer una sustancia hallamos su curva espectral la cual después era comparada con la curva espectral de una sustancia patrón, otra manera es que debe de cumplir con la Ley de Lambert – Beer pero debemos de saber que esta ley tiene sus limitaciones y que una de las limitaciones tiene que ver con la concentración del analito. En esta práctica se aprenderá a hallar la concentración óptima para una mejor lectura en el espectrofotómetro UV-vis y para que el analito cumpla con la Ley de Lambert - Beer, esto lo lograremos con el uso de la Curva de Ringbom. La curva de Ringbom relaciona la absortancia con la concentración del analito. Mediremos la absorbancia de diferentes concentraciones de un analito, hallaremos el porcentaje de transmitancia y con esto la absortancia, luego la relacionaremos sus concentraciones y de acuerdo a la curva reconoceremos la concentración óptima en la cual se cumpla con la Ley de Lambert – Beer.

FUNDAMENTO TEÓRICO LEY DE LAMBERT Y BEER Ocurre cuando en el caso de la radiación monocrómatica, la absorbancia es directamente proporcional a la longitud b de la trayectoria a través de un medio y la concentración c de la especie absorbente. Ésta relación se representa con la siguiente fórmula: A= abc a : constante de proporcionalidad llamada absortividad b : longitud (cm) c : concentración (g/L) Cuando la concentración de la ecuación se expresa en moles por litro y el largo de la celda está en centímetros, la absortividad se llama absortividad molar, y se representa con el símbolo especial Ɛ. Por tanto, cuando b está en centímetros y c en moles por litro se tiene: A = Ɛbc Se han encontrado pocas excepciones a la generalización de que la absorbancia está relacionada en forma lineal con la longitud de la trayectoria. Por otra parte, se ha encontrado desviaciones frecuentes de la proporcionalidad directa entre la absorbancia medida y la concentración cuando b es constante. Para que no ocurran errores durante nuestro análisis y hacerlo demanera adecuada hacemos uso de la curva de ringbown.

GRÁFICA DE RINGBOW Cuando se realiza un análisis espectroscópico se debe trabajar, en lo posible, se debe trabajar, en lo posible, con concentraciones que permitan que se cumpla la ley de Beer, con el fin de obtener una curva de calibración que tenga una relación lineal. Para obtener el intervalo óptimo de concentraciones primero se construye la curva de Ringbom, que consiste en construir una gráfica de absorbancia (100- %T) vs. lg Concentración. Los datos se obtienen preparando una serie de soluciones patrón del analito, que cubran una variación de por lo menos dos órdenes de magnitud de concentración de este y se miden las transmitancias correspondientes a la longitud de onda analítica escogida. Para la mayoría de los sistemas la curva de Ringbown corresponde a una curva en forma de S. La parte lineal de esta gráfica permite obtener el intervalo de concentraciones óptimo o el intervalo que presentara una relación lineal entre absorbancia y concentración. En esta gráfica, los cruces de la parte recta (la

intermedia), con la parte baja y con la parte alta, pueden servir para determinar un valor para los límites de detección mínimo y máximo, respectivamente.

A partir de esta gráfica podemos obtener otros datos como: Es la cantidad o concentración mínima de sustancia que puede ser detectada con fiabilidad por un método analítico determinado. Intuitivamente sería la concentración mínima obtenida a partir de la medida de una muestra (que contiene el analito) que seríamos capaces de discriminar de la concentración obtenida a partir de la medida de un blanco, es decir, de una muestra sin analito presente. Límite de detección mínimo:

Sería la cantidad o concentración más pequeña del analito que produce una señal XL significativamente diferente de la señal del ruido de fondo Xb.

El criterio utilizado para que la concentración mínima detectable sea distinguible con certeza del ruido de fondo es que la diferencia entre la señal del analito, de concentración muy baja, y la señal de los blancos sea igual a tres veces la desviación estándar de la señal de los blancos, utilizados para medir el ruido de fondo. Es decir que: En donde XL es la señal límite, obtenida para la concentración mínima detectable de analito, Xb es la señal promedio de los blancos, y sb es la desviación estándar de las lecturas del blanco.

Límite de detección máximo:

Vendría a ser la máxima concentración de un analito que se puede analizar. Esto se debe a que las soluciones se hacen tan concentradas, que en el caso de los métodos espectrofotométricos, toda la luz es atrapada por el analito y tenemos una situación equivalente al ajuste del 0 % de transmitancia. En este caso, el detector no diferencia dos soluciones de concentraciones altas.La determinación queda limitada a concentraciones menores del valor de límite de detección máximo, pero en este caso, a diferencia del límite de detección mínimo, el problema se soluciona fácilmente mediante una dilución adecuada. En el caso del límite de detección mínimo, las soluciones deben concentrar la muestra o usar otra técnica con límite de detección menor. El límite de detección máximo, se puede obtener de la parte superior de la curva de Ringbown.

TRANSICIONES ORGÁNICAS

ELECTRÓNICAS

EN

MOLÉCULAS

Clasificación:

Las bandas de absorción en las regiones Ultravioleta y Visible que presentan los compuestos orgánicos se asocian con transiciones electrónicas en la capa de valencia. Los electrones involucrados en dichas transiciones corresponden a aquellos mas débilmente atraídos por el conjunto de núcleos atómicos que componen la molécula y cuyos estados pueden ser descritos a través de orbitales moleculares que se expresan como combinaciones lineales de orbitales atómicos de la capa de valencia. Las transiciones electrónicas a orbitales moleculares más externos dan lugar a las denominadas transiciones Rydberg presentes en el Ultravioleta de Vacío. Por otra parte las transiciones electrónicas que involucran a los electrones de las capas internas son muy energéticas y se presentan en la región de los rayos X del espectro electromagnético. Nuestro análisis se reducirá a las transiciones electrónicas en la capa de valencia. A estos efectos resulta conveniente recordar la clasificación convencional de los orbitales moleculares en la capa de valencia de los compuestos orgánicos. Orbitales σ y σ*. Son orbitales moleculares localizados a lo largo del eje

de unión de los átomos. Los orbitales σ generan una densidad electrónica elevada en la región internuclear teniendo un carácter fuertemente enlazante. Los orbitales σ*, como todos los orbitales antienlazantes, presentan un

plano nodal perpendicular al eje del enlace en la región internuclear y tienen un acentuado carácter antienlazante.

Orbitales π y π *. Estos orbitales se emplean en la descripción de los

enlaces múltiples. Las regiones de mayor densidad electrónica correspondiente a los mismos son aquellas colaterales al eje del enlace. El carácter enlazante o antienlazante de estos orbitales es menos acentuado que el de los orbitales σ. Orbitales n. Estos orbitales moleculares tienen un acentuado carácter

local y describen pares electrónicos libres asociados con heteroátomos (O, S, N, Hal). Energéticamente tienen carácter no-enlazante.

Figura.1 se representan esquemáticamente la distribución energética de los orbitales moleculares antes tratados.

Las principales transiciones electrónicas que se consideran para muchas especies moleculares son: ,n *. σ *, π → π *, n A continuación se presentan algunas de las transiciones más importantes en moléculas orgánicas: σ   → σ  

→ 

→ π  

a. La transición

es la que requiere mayor energía para que se lleve a cabo, este tipo de transiciones generalmente ocurre en el ultravioleta al vacío en longitudes de onda menores que 150 nm. Entre los enlaces típicos que presentan esta transición se

encuentran C-H con absorción cercana a 125 nm y el enlace C-C con absorción cercana a 135 nm. Así, compuestos orgánicos como los hidrocarburos saturados y cadenas saturadas - enlaces sigma- presentarán absorción solamente en el ultravioleta lejano y por tanto son transparentes en el UV cercano. generalmente requiere menos energía que la transición s ® s * Estas transiciones generalmente se

b. La transición

n

presentan entre 150 y 220 nm. Muchas de estas transiciones se observan en moléculas orgánicas que contienen un heteroátomo: N,O,S,Cl,Br,I, como haluros de alquilo, aminas, éteres, tioles, etc. Por ejemplo el CH3OH presenta una banda n * en 180 nm con e = 315 M-1cm-1. Se considera para este tipo de transición que un electrón que se encuentra en el orbital p del heteroátomo - u orbital n de la molécula – es excitado al orbital s de la 



c. Las transiciones

implican que el cromofóro debe poseer  al menos una insaturación para proveer el orbital molecular pi antienlazante π *, moléculas con dobles o triples enlaces frecuentemente presentan absorción entre 160 y 220 nm  para cromóforos aislados es decir  separados por más de un enlace sencillo. En el caso de moléculas con grupos cromofóros que entren en conjugación como dienos, enonas, o con anillos aromáticos la absorción se encuentra generalmente entre 200 y  360 nm, en el UV cercano y puede presentarse en el visible 360700 si el sistema conjugado es grande.Las transiciones π → π * presentan coeficientes de absortividad e altos que oscilan entre 1000 y 15000 M -1cm-1

Las bandas atribuidas a las transiciones π → π * de sistemas conjugados como el butadieno polienos, enonas, el benceno o moléculas aromáticas que poseen sustituyentes que a su vez son cromóforos (como el estireno, benzaldehido, o acetofenona) se denominan bandas K  (del alemán konjugierte). Estas transiciones p ® p *, bandas K , se caracterizan por  absortividades molares altas e máx  >104   y sufren desplazamiento batocromico cuando hay aumento en la polaridad del solvente.

d. Las transiciones

implican que el cromofóro debe poseer  una insaturación (para proveer el orbital molecular  π   *) con un heteroátomo que contenga un par de electrones no compartido, electrones n, por ejemplo cromóforos como C = O, N = N, NO, n

NO2, entre otros, presentan absorción entre 200 y 350nm para cromóforos aislados. Se considera que uno de los electrones del orbital molecular no enlazante, n, ( o que uno de los electrones de un orbital átomico no enlazante del heteroátomo ) es excitado al orbital antienlazante * asociado con el doble o triple enlace. 

Las transiciones

presentan coeficientes de absortividad e bajos, que oscilan entre 10 y 102 M-1cm-1, son prohibidas y estos valores permiten distinguirlas de las transiciones π → π *. n

→  π  

*

Las transiciones n →  π   *también son llamadas bandas R (del alemán radikalartig). Se caracterizan además de sus bajos coeficientes de absortividad por el efecto hipsocrómico que se observa con el incremento en la polaridad del solvente.

CÁLCULO DE ERRORES: ERROR ABSOLUTO, ERROR RELATIVO Bien sea una medida directa (la que da el aparato) o indirecta (utilizando una fórmula) existe un tratamiento de los errores de medida. Podemos distinguir dos tipos de errores que se utilizan en los cálculos: Es la diferencia entre el valor de la medida y el valor tomado como exacta. Puede ser positivo o negativo, según si la medida es superior al valor real o inferior (la resta sale positiva o negativa).  Tiene unidades, las mismas que las de la medida. Error absoluto.

Es el cociente (la división) entre el error absoluto y el valor exacto. Si se multiplica por 100 se obtiene el tanto por ciento (%) de error. Al igual que el error absoluto puede ser positivo o negativo (según lo sea el error absoluto) porque puede ser por exceso o por defecto. No tiene unidades. Error relativo.

Parte Experimental

Espectrofotometría: Absorbancia y %T EQUIPOS Y REACTIVOS entre MATERIALES, una sustancia inorgánica y una Equipo: orgánica UV-2100 Spectrophotometer Materiales:

Matraz Aforado (100, 50, 25 y 10ml)

los datos leídos en el espectrofotómetro. Lo  Tomaremos a continuación Pipeta volumétrica (15,10,5,2,1)

que buscamosMatraz es determinar la longitud óptima analítica y comparar la simple (250, 100ml) naturaleza de Tubos dos sustancias diferentes: Una es orgánica (heliantina) y de ensayo la otra, inorgánica Vaso(permanganato precipitado (250, de potasio). 100 ml) Reactivos:

Aseptil Rojo-Absorbancia (Azosulfamida Las curvas espectrales vs 5%) Longitud de onda y %T vs Permanganato de potasio Longitud de ondaserán graficadas al final del presente informe. Anaranjado de metilo Agua destilada

Permanganato de potasio (KMnO4) λ (nm)

%T

A

Anaranjado de metilo (Heliantina) λ (nm)

400

83.9

0.0762

410

85.2

0.0695

420

85.5

430

%T

A

400

42.1

0.3757

0.0680

410

37.9

0.4213

85.7

0.0670

420

34.8

0.4584

440

85.4

0.0685

450

84.9

0.0660

430

32.2

0.4921

460

83.7

0.0773

440

30.2

0.5199

470

81.7

0.0873

450

28.3

0.5482

480

78.7

0.1040

490

75.1

0.1243

460

27.9

0.5543

500

70.4

0.1524

470

29.3

0.5331

510

68.2

0.1662

480

32.7

0.4854

520

64.1

0.1931

530

65.1

0.1864

490

38.7

0.4122

540

65.9

0.1837

500

47.6

0.3223

550

67.7

0.1694

510

58.2

0.2350

560

75.6

0.1214

570

77.4

0.1112

520

80.2

0.0958

580

85.7

0.0670

530

87.7

0.0570

590

90.2

0.0447

540

87.7

0.0570

600

91.5

0.0385

610

92.1

0.0357

550

92.4

0.0343

620

92.6

0.0333

560

93.3

0.0301

630

92.9

0.0319

640

93.4

0.0296

Procedimiento Lectura del espectrofotómetro: Longitud óptima de la onda y % Transmitancia

Realizamos dos tipos de análisis: 1. Determinación de la longitud óptima de onda para poder graficar las curvas espectrales –Absorbancia vs Longitud de onda– respectivas del permanganato y la heliantina (Inorgánica vs Orgánica) de la 2. Determinación concentración óptima de la muestra (verificar del mismo modo la   zona de trabajo). Permite graficar la curva de Ringbown.

Longitud Óptima Azosulfamida: 530 nm Longitud óptima Anaranjado metilo: 460 nm Longitud óptima Permanganato: 520 nm

de de de de

Lectura del espectrofotómetro: % Transmitancia

1°Para poder comparar la forma de las curvas espectrales entre dos sustancias de naturaleza distinta: Inorgánica vs Orgánica. El procedimiento a seguir fue el desarrollado en la primera práctica: La sustancia es colocada, junto a un patrón –Agua–; en el espectrofotómetro medimos la transmitancia conforme aumentamos la longitud de onda. El punto en el cual la transmitancia sea la más baja posible será nuestra absorbancia más alta, es decir: La longitud óptima de la onda nos otorga la absorbancia más alta posible de la sustancia problema.

2° Si deseamos graficar la curva de Ringbown (la que nos permite formar nuestra curva de calibración) primero debemos realizar las disolución. Prepararemos soluciones de una concentración (C) desde 0.1 ug/ml, 0.2 ug/ml, 1 ug/ml, 2 ug/ml, 5 ug/ml, 10 ug/ml, 15 ug/ml, 20 ug/ml, 30 ug/ml, 200 ug/ml hasta 500 ug/ml a partir de la solución estándar de aseptil rojo (Azosulfamida 5%). Con las diluciones ya hechas, procedemos a realizar las lecturas en el espectrofotómetro. Las lecturas serán del % Transmitancia, nuestra labor consiste en determinar la absortancia: Absortancia=100-%T. Para luego graficar nuestra curva Absortancia vs Log (C). Preparamos cada concentración a partir de la muestra estándar de aseptil rojo. La forma en cómo se procedió con las diluciones está

Una vez que ya tenemos nuestras diluciones preparadas, podemos comenzar con las lecturas de la transmitancia. La longitud de onda a utilizar será: La longitud óptima de cada sustancia, 530nm para la azosulfamida y 460nm para la heliantina. Iremos añadiendo en las cubetas del espectrofotómetro cada dilución unitariamente. El análisis de la transmitancia será llevado a cabo en la longitud óptima. Nuestros datos serán acoplados en las posteriores tablas.

A partir de la transmitancia leída estaremos en la facultad de poder graficar la Curva de Ringbown (Absortancia vs Log [C]).

Curva de Ringbown: Absortancia vs Concentración ~ Azosulfamida y Azosulfamida Heliantina [μgml]

%T

Absortancia

0.1 parte 98.6 1.4 En esta desarrollaremos la curva de Ringbown, la cual nos permite encontrar la  zona de trabajo y lo más importante: La 0.2 97.8 2.2muestra. concentración óptima de la Anaranjado de metilo 0.4 96.7 3.3 %T las Absortancia *Cabe resaltar que nuestro grupo[μgml] trabajó con diluciones de la azosulfamida 0.6 96.0 4.0 0.2 74.4 25.6 0.8

94.4

5.6

0.3

95.7

4.3

1.0

93.0

7.0

0.6

69.7

30.3

1.5

84.7

15.3

0.8

69.7

30.3

2.0

85.1

14.9

1.5

90.8

9.2

2.5

84.2

15.8

3.0

35.4

64.6

3.0

78.8

21.2

3.5

30.7

60.3

3.5

75.1

24.6

4

12.2

87.8

4.0

75.6

24.4

5

5.5

94.5

5.0

71.9

28.1

6

3.1

96.9

6.0

66.1

33.9

10

0.0

100

80

57 7

42 3

0

00

Azosulfamida: Sustancia estudiada 1. Tabla completa: Absortancia, Log C y % Transmitancia.

Azosulfamida µg/mL

mg/mL

log C

%T

Absortancia

0.1

100

2

98.6

1.4

0.2

200

2.30103

97.8

2.2

0.1

100

2

96.7

3.3

0.6

600

2.7781513

96

4

0.8

800

2.90309

94.4

5.6

1

1000

3

93

7

1.5

1500

3.1760913

88.3

11.7

2

2000

3.30103

85.1

14.9

2.5

2500

3.39794

84.2

15.8

3.5

3500

3.544068

75.5

24.5

4

4000

3.60206

75.6

24.4

5

5000

3.69897

71.9

28.1

6

6000

3.7781513

66.1

33.9

8

8000

3.90309

57.7

42.3

10

10000

4

50.7

49.3

15

15000

4.1760913

38.7

61.3

20

20000

4.30103

27.5

72.5

30

30000

4.4771213

11.5

88.5

40

40000

4.60206

6.4

93.6

60

60000

4.7781513

0.001

99.999

DISCUSIÓN DE RESULTADOS CURVA DE RINGBOWN: AZOSULFAMIDA

Para obtener el intervalo óptimo y adecuado de concentraciones con el menor error por lectura primero se construye la curva de Ringbown que consiste en construir una gráfica de absortancia (100%-T) vs la concentración. La zona lineal corresponde al intervalo de concentraciones de mínimo error, ∆ C/C, por lectura y el punto de inflexión corresponde al valor de: 100%-%T= 49.3; T=50.7; que corresponde al valor de mínimo error. Para la mayoría de los sistemas la curva de Ringbom corresponde a una curva en forma de S. La parte lineal de esta gráfica permite obtener el intervalo de concentraciones óptimo o el intervalo que presentara una relación lineal entre absorbancia y concentración.

En esta gráfica, los cruces de la parte recta (la intermedia), con la parte baja y con la parte alta, pueden servir para determinar un valor para los límites de detección mínimo y máximo, respectivamente. En la curva de Ringboom para la azosulfamida resulto como concentración optima el valor de 6.4565 µg/mL así como la concentración mínima cuantificada a 3.715 µg/mL y la concentración máxima cuantificada a 11.2 µg/mL.

CURVA DE RINGBOWN: ANARANJADO DE METILO La curva de Ringbom del Anaranjado de Metilo presenta una zona de trabajo de concentraciones 1 a 5 ug/ml con las absortancias respectivas de 26.8 y 94.5 respectivamente. Además la concentración óptima es de 2.2 ug/ml. No pudiendo comparar estos datos debido a que no encontramos información bibliográfica sobre el tema.

BIBLIOGRAFIA •

Skoog Douglas, Principios de análisis instrumental. 6ta edición. 2007

•

Química analítica instrumental I Precisión en espectrofotometría. 2007. URL: http://depa.pquim.unam.mx/amyd/archivero/Documento_de_A poyo:_Precision_en_espectrofotometria_2598.pdf 

•

Universidad Nacional de Colombia. Establecimiento de un método espectrofotométrico.URL:http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ ciencias/2001184/lecciones/Cap10/01_01_01.htm