Lab 4 Cinetica Enzimatica ArreglADO...

Laboratorio de Bioquímica Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática de la Fosfatasa ácida de germen de trigo.

 Juna Brito  Jonathan Muñoz  Stefanhia Vielma Universidad de Santiago de Chile, Ingeniería en 13-6-2011 Biotecnología

Universidad de Santiago de Chile Ingeniería en Biotecnología Departamento de Ingeniería Química

Introducción Las enzimas son los catalizadores de las reacciones en los sistemas biológicos y son las proteínas de mayor especialización (1). Estas proteínas poseen un gran poder  catalítico, a menudo muy superior a los catalizadores sintéticos o inorgánicos (2) y un alto grado de especificidad por su sustrato (3). Las enzimas participan con gran relevancia en todos los procesos bioquímicos. Actuando como un sistema organizado catalizan cientos de reacciones, tanto de catabolismo como de anabolismo, en donde la regulación de estos sistemas enzimáticos se coordina de un modo eficaz en las actividades metabólicas necesarias en los procesos vitales. La reacción más sencilla que pueden catalizar las enzimas está representada por  la ecuación (4): E+S

 → ←  

ES

 → ←  

EP

 → ←  

E+P

Donde E, S y P, representan a la enzima, al sustrato y al producto, respectivamente, mientras que ES y EP representan los complejos transitorios enzima –  sustrato y enzima-producto. Las enzimas se clasifican de acuerdo a la reacción que catalizan, pudiendo ser, según la clasificación internacional, oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas (5). La enzima estudiada en este práctico corresponde a la fosfatasa ácida del germen de trigo (AcP por sus siglas en inglés), la cual se clasifica como una hidrolasa, que cataliza la reacción de hidrólisis de fosfatos monoésteres con la liberación de fosfato inorgánico según la siguiente reacción:

En este práctico se determinarán las condiciones óptimas de temperatura de la actividad enzimática de la AcP, utilizando p-nitrofenilfosfato (p-NPP) como sustrato artificial.

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La actividad enzimática de la AcP será determinada cuantificando el producto de la hidrólisis (p-nitrofenol) en NaOH, por espectrofotometría a 405 nm, longitud de onda a la que el p-nitrofenol presenta absorbancia máxima (6).

Materiales y Métodos 1.1 Elaboración de la curva de calibración de p-nitrofenol. Se prepararon seis tubos Eppendorf que contienen cada uno 0, 125, 250, 500, 750 y 1000 μL de una solución de p-nitrofenol 60 μM en NaOH 0,05 M. Posteriormente los seis tubos se completan hasta 1 mL con la solución de NaOH 0,05 M. Finalmente se cargaron 200 μL de las soluciones preparadas anteriormente sobre una  placa de ELISA, para medir la absorbancia en el espectrofotómetro a 405 nm. Para confeccionar la curva de calibración se graficó la absorbancia de las soluciones de p-nitrofenol versus la cantidad en moles de éstas.

1.2 Determinación de las condiciones óptimas de Temperatura de la actividad enzimática de la AcP a pH 5. Se prepararon tres tubos Eppendorf A, B y C, a los cuales se le agregó a cada uno 200 μL de p-NPP en buffer citrato (citrato de sodio 100 mM, EDTA 150 mM pH 5,0) y 200 μL de buffer citrato. Los tubos A, B y C se incubaron por tres minutos a 4, 37 y 60 °C respectivamente. Finalizado los tres minutos a los tubos A, B y C se le agrega 100 μL de solución de AcP 1:20 con respecto al stock (10 mg/ mL en buffer  citrato). Se mezcló e inmediatamente se sacó una alícuota de 100 μL de los tubos A, B y C, reincorporándolos a sus temperaturas de incubación. Las alícuotas extraídas se adicionan a tres tubos que contienen 900 μL de una solución de NaOH 0,05 M. Este es el control denominado tiempo cero de reacción. Análogamente se repitió el   procedimiento a los tiempos 5, 10 y 20 minutos obteniéndose como resultado doce tubos. Se cargaron 200 μL de las soluciones de los doce tubos a una placa de ELISA y se midió su absorbancia a 405 nm. Los resultados de absorbancia obtenidos se interpolan en la curva de calibración descrita en 1.1 para calcular los moles de pnitrofenol y luego determinar la temperatura óptima de actividad enzimática de la AcP.

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Resultados Se estudió el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática de la fosfatasa ácida de germen de trigo, a partir de la cuantificación de producto liberado (pnitrofenol) a tres diferentes temperaturas de ensayo: 4, 37 y 60 °C. Para la estimación de la cantidad de producto liberado en µmol se usó la curva de calibración de p-nitrofenol (figura 1), que fue confeccionada a partir de la tabla 1, en donde las absorbancias de las concentraciones conocidas de p-nitrofenol fueron medidas por espectrofotometría a 405 nm. La ecuación de la recta de la figura 1 (y= 17,583x +0,0011) fue usada para interpolar las absorbancias de la soluciones de los 12 tubos Eppendorf, obtenidos a distintos tiempos, a partir de los tubos de reacción A, B y C sometidos a las temperaturas 4, 37 y 60 °C, respectivamente. Curva de Calibración de p-nitrofenol 1,2 1   a    i   c 0,8   n   a    b   r 0,6   o   s    b 0,4    A

0,2 0 0

0,01

0,02

0,03

0,04

p-nitrofenol (μmol) y = 17,583x + 0,0011 R2 = 1

0,05

0,06

0,07

pnitrofenol (µmol) 0 0,0075 0,0150 0,0300 0,0450 0,0600

Absorbanc ia 0 0,132 0,268 0,530 0,788 1,058

Los resultados de la cantidad de p-nitrofenol obtenidos por la interpolación de la absorbancia de los 12 tubos mencionados anteriormente se muestran en la tabla 2. Además, se muestra en la tabla 2 la velocidad inicial (V 0) de reacción para las temperaturas 4, 37 y 60 °C, las cuales corresponden a 0,0005, 0,0010 y 0,0021 µmol/min, respectivamente. Considerando las temperaturas de ensayo y las velocidades iniciales respectivas a esas temperaturas se confecciona el gráfico 2, el cual muestra el

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  perfil de actividad enzimática frente a la temperatura. En donde se observa que el mínimo de actividad es a los 4° C y el máximo a los 60 °C.

Tabla 2: Datos de absorbancias de las soluciones de doce tubos para los tiempos 0, 5, 10 y 20 min, respecto a las distintas temperaturas de ensayo 4, 37 y 60 °C, además se muestra la cantidad de pnitrofenol (µmol) en cada uno de los tubos y las velocidades iniciales a las t emperaturas respectivas.

 Temperatura °C

 Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

4

37

60

 Tiempo (min) 0 5 10 20 0 5 10 20 0 5 10 20

p-nitrofenol (μmol)

Absorbancia 0 0,043 0,082 0,093 0 0,085 0,174 0,356 0 0,165 0,335 0,728

0 0,00238 0,00460 0,00523 0 0,00477 0,00983 0,02018 0 0,00932 0,01899 0,04134

V0 (µmol/min)

0,0005

0,0010

0,0021

Actividad Enzimática vs Temperatura 0,0025 60

0,002    )   n    i   m0,0015    /    l   o   m   µ 0,001    (    0    V 0,0005

37

4

0 0

10

20

30

40

50

60

70

Temperatura (°C)

Gráfico 2: Perfil de actividad frente a la temperatura de la fosfatasa ácida de germen de trigo. En donde  se observa que el mínimo de actividad es a los 4°C y el máximo a los 60°C.   Esta curva se confeccionó a partir de las medidas de las velocidades iniciales respectivas a cada temperatura de ensayo.

Discusión

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En este estudio se determinó la temperatura óptima de actividad para la fosfatasa ácida de germen de trigo. Para establecer la temperatura a la cual la actividad enzimática es máxima, nos basamos en los resultados apreciables en el gráfico 2, en donde se observa claramente que la máxima actividad de la enzima es a la temperatura de ensayo de 60°C, con respecto a las otras dos temperaturas. Además se observa, en el gráfico 2, que al aumentar la temperatura también aumenta la actividad enzimática. Lo anterior es un resultado esperado, ya que al aumentar la temperatura, crece la velocidad enzimática de reacción porque el sustrato (p-NPP) colisiona con el sitio activo con mayor frecuencia cuando las moléculas se mueven con rapidez (7). Sin embargo la actividad enzimática no aumenta indefinidamente con la temperatura, ya que la agitación térmica de la enzima rompe los puentes de hidrógeno, los enlaces iónicos y otras interacciones débiles que estabilizan la estructura activa (8). Luego, el calor  modifica su estructura terciaria y la enzima se desnaturaliza y pierde su función (9). Como la temperatura óptima de la AcP es de 60°C (10), cabe esperar que a temperaturas superiores la actividad de la enzima disminuya debido a desnaturalización. Finalmente, es importante destacar, que si bien la temperatura de ensayo de mínima actividad es de 4°C, el resultado no se debe a desnaturalización de la enzima,   puesto que las temperaturas bajas detienen la actividad enzimática pero no desnaturalizan a la enzima en cuestión. (11).

Referencias

Universidad de Santiago de Chile Ingeniería en Biotecnología Departamento de Ingeniería Química

(1) NELSON, D.L.; COX, M.M. “Principios de Bioquímica”, 4°edición, p.190, Editorial Ediciones Omega S.A, Barcelona, España, (2005).

(2) Ibíd, p. 190. (3) Ibíd, p. 190. (4) Ibíd, p. 193. (5) Ibíd, p. 192. (6) DICKERSON, R.E., “Principios de Química”, 3° edición, p. 855, Editorial Reverté S.A., España, (1992).

(7) CAMPBELL, N.A.; REECE, J.B., “Bilogía”, 7° edición, p. 154, Editorial Médica Panamericana S.A., España, (2007). (8) Ibíd, p. 154.

(9) SADAVA; HELLER; ORIANS; PURVES y HILLIS, “Vida. La Ciencia de la Biología”, 8° Edición, p. 134, Editorial Médica Panamericana S.A., España, (2008). (10)Revista Española de Fisiología, Volumen 24, Consejo Superior de Investigaciones Cientfícas, España (1968). (11) MONTOYA H.H., “Microbiología básica para el área de la salud y afines”, 2° edición, p. 61, Editorial Universidad de Antioquia, Colombia, (2008).