Lab 4 Accion Enzimatica

I.

INTRODUCCIÓN:

Las enzimas son biocatalizadores, de naturaleza proteica en su mayoría, de las reacciones químicas que realizan en las células. La mayoría de las reacciones químicas de las células ocurrirían muy lentamente si no fuera por la catálisis enzimática. El alimento constituye un complejo sistema, en el cual las enzimas están en constante acción para mantenerlo en equilibrio. En la industria alimentaria es importante conocer el mecanismo de acción de las enzimas, para así  poder aprovechar los efectos beneficiosos e inhibir los perjudiciales. La actividad enzimática puede ser útil como indicador del estado y conservación de un alimento. Un manejo adecuado favorece la transformación y conservación de alimentos. Esto depende de factores como temperatura, pH, etc. El color café que se forma cuando se exponen al aire las superficies cortadas o maltratadas de frutas, verduras y mariscos, se conoce como pardeamiento enzimático porque las reacciones iniciales que intervienen en este fenómeno están catalizadas por enzimas. En la presente práctica se demostrará experimentalmente la actividad enzimática de las enzimas presentes en la levadura durante la fermentación de harina de trigo y harina de chuño además de observar el pardeamiento enzimático y la inactivación de enzimas enzimas por calor realizando la prueba de guayacol en muestras de manzana y plátano.

II.

MATERIALES Y MÉTODOS: PRUEBA DE LA PROBETA 

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Harinas de origen vegetal (trigo y chuño). Levadura. Probeta graduada de 100 ml. Baño maría a 35°C 

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Materiales:

Procedimiento:

Pesar 1 g de levadura y disolverla en 30 ml de agua potable en un vaso de 250 ml, añadir seguidamente una mezcla de 9 g de harina de trigo y 1 g de harina de chuño. Mezclar rigurosamente con la ayuda de una bagueta, enseguida transferir a una probeta graduada de 100 ml (P1), medir el volumen inicial y llevar a incubar a un baño maría a 26.5 °C. Anotar el volumen de la suspensión a intervalos de 5 minutos, comparando así la rapidez y acción de las levaduras. Conjuntamente llevar un control (P2) solamente de harina de trigo. Registrar estos resultados y obtener la rapidez de las levaduras expresadas en el tiempo necesario para alcanzar el máximo. INACTIVACIÓN DE LAS ENZIMAS POR CALOR 

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Muestras alimenticias (plátano y manzana). Cocinas. Solución de guayacol 0.05% Peróxido de hidrógeno (de la misma botella). Vasos de precipitado. 

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Materiales:

Procedimiento:

Pelar las muestras y cortarlas en rodajas de 1 cm de espesor. Colocarlas en un recipiente con agua hirviente por periodos de 0; 0.5; 1; 1.5; 2; 2.5 y 3 minutos. Dejar unas rodajas de testigo (sin calor).

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Realizar las pruebas de guayacol en c/u de las rodajas, es decir cubrir la superficie de la rodaja con guayacol al 0.05 % y peróxido de hidrógeno cada vez que sean sacadas de la olla. Determinar el tiempo necesario para la inactivación de las enzimas presentes en la muestra.

III.

REVISIÓN LITERARIA:

IV.

RESULTADOS Y DISCUSIONES: PRUEBA DE LA PROBETA

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Baño María para la activación de la enzima:

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Volúmenes de la probeta:

VOL. Harina de trigo + H. chuño.

VOL. Harina trigo

CUADRO 1: Tiempo (min)

Volumen (Harina de trigo) (mL) Tubo control

0

38

Volumen (Harina de Trigo + Harina de chuño) (mL) Tubo 1 38

5

38,5

38.5

10

39

39

15

39

39

20

40

39.5

25

41

40

30

42

41

35

44

42

40

48

44.5

45

49

46

50

50

46

55

50

45

60

48

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60 50     ) 40    L    m     (    n    e 30    m    u     l    o    V

Tubo control Tubo 1

20 10 0 0

5

10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Tíempo (min)

Ilustración 1 GRÁFICO DEL VOLUMEN VS. TIEMPO 

La curva de color rojo representa el volumen de suspensión del tubo 1 (harina de trigo más harina de chuño); mientras que la curva azul representa los volúmenes del tubo 2 o tubo control (solamente harina de trigo). -

Sustrato: Harina de trigo. Harina de Chuño. Enzima: levadura, principalmente la amilasa que actúa sobre el almidón y la convierten en 2 productos azucares y CO2.

Tubo control: Es el que presenta mayor crecimiento del volumen con respecto al tiempo. Según Fennema 1993, el aire, el agua y los azúcares presentes en una masa favorecen a las levaduras a multiplicarse rápidamente. La amilasa producida por la enzima durante la fermentación va a convertir el almidón en azúcar y CO2. Este va a querer salir al ambiente pero se va a aquedar atrapado en la estructura tridimensional de la proteína que es el gluten y por eso se va hinchar, se va formar una espuma y va aumentar su volumen. Se tomó la medida del volumen cada 5 minutos ya que bajo la acción del calor las enzimas se activan y transforman mucho azúcar, la levadura se nutre mucho más produciendo así más gas y alcohol hasta la temperatura de 50°C que muere. A partir de este instante, la fermentación cesa y comienza la cocción (Bennion 1967) Mayor es la espuma en el tubo control y también es mayor su estabilidad e n e l tiempo por los efectos del gluten. El que tiene más gluten (Tubo control) va a mantener mejor la estructura de la solución.

Según Bennion (1967), las proteínas del gluten están conformadas por la glutenina, que da la estructura; la gliadina, que da plasticidad y elasticidad; y las globulinas. Sólo el trigo posee estas proteínas juntas y se menciona que el trigo de Manitoba es el que mejor atrapa el anhídrido carbónico a pesar de contener igual cantidad de gluten que otros tipos de trigo.

Tubo 1: Es el que contiene una mezcla de 9g de harina de trigo y 1 g de harina de chuño. La amilasa producida por la enzima durante la fermentación pasa por el mismo proceso que en el tubo control convirtiendo el almidón en azúcar y CO2 pero en este caso la harina de chuño no tiene proteína gluten (LEISA 2004) entonces, la harina de chuño no captura al CO2 que se escapa, siendo la harina de trigo la única que capta el CO2 y a quien se debe el aumento del volumen. 1g de chuño marca la diferencia en el tubo 1. Además en este tubo los procesos de oxidación del almidón retardarán el crecimiento del volumen. INACTIVACIÓN DE LAS ENZIMAS POR CALOR 

Alimentos cortados en rodajas

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Alimentos después de la prueba de guayacol

Observando las imágenes de las mesas 1 y 4, se evidencia que los resultados no fueron del todo igual; a pesar que se analizó la inactividad enzimática por el calor aplicando la prueba de guayacol, las muestras de manzana fueron las que mejor mostraron este comportamiento. La discordancia de los resultados se puede deber a muchos factores, siendo algunos de estos: el tipo de fruta, los cortes no fueron del mismo grosor para las dos mesas, las personas que realizaron la prueba del guayacol no fueron las mismas, la cantidad de guayacol y peróxido añadidos no fueron iguales, así  como los recipientes en los cuales se realizaron el baño maría no fueron del mismo tamaño: por lo cual no hubo un reparto uniforme de calor a todas las muestras, etc. Sin embargo, se puede observar también que si hay una tendencia o relación (entre el tiempo y la inactivación enzimática) en los resultados para ambas mesas; de ahí que se puede inferir en siguiente cuadro:

MUESTRAS: MANZANA Y PLÁTANO TIEMPO (MIN) 0

0.5

1.0

1.5

2.0

OBSERVACIONES Es la rodaja de testigo. Gran presencia de coloración marrón en las rodajas, ya que no se le aplicó calor. Regular presencia de coloración marrón en las frutas, a partir de estas rodajas se aplicó calor. Poca presencia de coloración marrón en las rodajas. Las dos primeras rodajas después de la aplicación de guayacol aun tienen el color marrón lo que indica que las enzimas están actuando. Reducida coloración marrón en las rodajas. El color del guayacol va disminuyendo a medida que se aumenta el tiempo. No hay presencia de coloración oscura o marrón en las rodajas. Por lo tanto, este es el tiempo óptimo para inactivar a las enzimas.

2.5

No hay presencia de coloración marrón.

3.0

No hay presencia de coloración marrón. Hay una inactivación enzimática total, por lo tanto, hay inactivación total enzimática.

La mayor parte de las enzimas, en el rango de 30  –40ºC se encuentran en el óptimo de su actividad, y sobre los 45ºC comienzan a desnaturalizarse (CHANDIA, 2000), por este motivo trabajamos con las rodajas sometidas al calor de una olla con agua hirviendo. Las enzimas, al ser proteínas, se desnaturalizan con tratamientos térmicos, cumpliéndose uno de los objetivos primordiales del escaldado. La desactivación de las enzimas por tratamientos térmicos se debe a una ruptura de las fuerzas que mantienen la estructura terciaria (pocas enzimas están activas a más de 60ºC y muchas de ellas ya se alteran a 40  – 50ºC). La misma ecuación de Arrhenius utilizada para determinar la energía de activación de las reacciones enzimáticas se utiliza para determinar la "energía de activación de la desactivación térmica” (Reed citado por JIMENEZ, 1993). EDIRIWEERA et al. (1987) señala que debido a que la energía de activación para los procesos de desactivación térmica es más alta para las enzimas, la velocidad de inactivación aumenta rápidamente al aumentar la temperatura, comprobándolo en la práctica. Las principales enzimas que originan estas transformaciones en los alimentos son la lipoxigenasa, peroxidasa, polifenol oxidasa, lipasas, celulasa, tiaminasa, pectinasas, clorofilasa, entre otras (MATHEIS, 1990), que canalizan las reacciones de deterioro en el interior de la célula (endógenas), afectando la calidad de los vegetales congelados. Estas enzimas difieren en su resistencia térmica, lo que implica que la velocidad de desactivación enzimática variará dependiendo del tipo de enzima, variedad del vegetal, etc. En este caso la diferencia la marca los dos tipos de fruta trabajadas. El calor y el peróxido de hidrogeno consiguen la coagulación de las proteínas y la inactivación de las enzimas necesarias para su normal metabolismo.

Bibliografia: -

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