LAB 2Pruebas Generales Para Aminoacidos y Proteinas (1)

UNIVERSIDAD DEL CAUCA Facultad de Ciencias Naturales, Exactas y de la Educacion Departamento de Quimica Laboratorio de Bioquimica I Periodo de 2011

Pruebas Generales para Aminoácidos y Proteínas David Alejandro Mera Benavides1, Mónica Alexandra Rodríguez Burbano1, Daniel Mauricio Sarmiento Torres1 1

Ingenieria Ambiental, Facultad de Ingeniería Civil, Universidad del Cauca, Carrera 2 con Calle 15 Norte Esquina, Sector Tulcán - Edificio de Ingenierías, Popayán, Cauca, Colombia Recibido: 4 de Abril de 2011 Resumen En la práctica de laboratorio, se usaron distintas pruebas para la caracterización de aminoácidos tales como: la prueba Xantoprotéica, la de Biuret, la de Nihidrina, Hopkins-Cole, Ehrlich. Esto con el fin de ver las características y propiedades de las pruebas y de los aminoácidos estudiados. La muestra problema en la práctica, es el triptófano, aunque haya dado negativo para la prueba de Ehrlich. Palabras claves: estructuras de aminoácidos, pruebas de cualificaión de aminoácidos Abstract In the actual laboratory, different tests for the characterization from amino acids were used such as: the Xantoprotéica test, the one of Biuret, the one of Nihidrina, Hopkins-Cole, Ehrlich. This with the purpose of to see the characteristics and properties of the tests and the studied amino acids. The sample problem actually, is the triptófano, although it has given negative for the test of Ehrlich. Key words: structures of amino acids, tests of cualificaión of amino acids

Introducción: Los aminoácidos forman parte de todas las células de los seres vivos, y participan en muchas reacciones bioquímicas del cuerpo. Los aminoácidos son los componentes de las proteínas de tejidos estructurales del cuerpo, y son esenciales para la vida. Desempeñan un papel importante en funciones de neurotransmisores, regulación del factor pH, metabolismo del colesterol, control del dolor y de inflamación y en los procesos de desintoxicación. La medición de de cualificación y cuantificación de aminoácidos es una parte integral de toda evaluación metabólica y alimenticia. Las proteínas son compuestas de carbono, oxigeno hidrogeno y nitrógeno. La mayoría de ellas contienen además azufre, y algunos fósforos. Sus moléculas son de proporciones coloidales, todas son muy complejas molecularmente y tienen alto peso molecular. La molécula proteica esta compuesta de una combinación de aminoácidos por condensación. Las pro teosas, peptonas, péptidos y aminoácidos son derivados de las proteínas formados en síntesis e hidrólisis. Hay ciertas reacciones coloreadas que dan las proteínas y dependen de los aminoácidos presentes en la molécula pro-

teica. Se basan en reacciones típicas de los aminoácidos dependiendo de la estructura de éstos y con eso lleva a la distinta coloración o incoloración de las sustancias. Objetivos: 

Reconocer la presencia de Aminoácidos y Proteínas en una muestra a través de la realización de pruebas generales bioquímicas de identificación.



Conocer la importancia y sus principales característica de los Aminoácidos y Proteínas en Bioquímica.

Consultas Preliminares:

1.

Aminoácidos Esenciales y no Esenciales:

De los 20 aminoácidos que se combinan para formar las proteínas, algunos pueden ser sintetizados por el organismo, por lo que se denominan no esenciales (alanina, arginina, ácido aspártico, asparragina, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, prolina, serina y tirosina). Hay otros, los denominados aminoácidos esenciales o indispensables que,

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sin embargo, no pueden ser sintetizados por el hombre por lo que tienen que ser aportados por los alimentos, por la dieta, condicionando su esencialidad. Estos son: histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano y valina. La arginina puede ser esencial para los niños muy pequeños ya que sus requerimientos son mayores que su capacidad para sintetizar este aminoácido. Hay también dos aminoácidos no esenciales que se forman a partir de otros esenciales: cisteína (y cistina) a partir de metionina y tirosina a partir de fenilalanina. Si la dieta no aporta suficiente cantidad de fenilalanina o si el organismo no puede transformar la fenilalanina en tirosina por algún motivo como sucede en la enfermedad hereditaria denominada fenilcetonuria-, entonces la tirosina se convierte en esencial. 2.

Frases R y S:

Acido Nítrico:  R35: Provoca quemaduras graves.  S23: No respirar los gases/humos/vapores/aerosoles [denominación(es) adecuada(s) a especificar por el fabricante].  S26: En caso de contacto con los ojos, lávense inmediata y abundantemente con agua y acúdase a un médico.  S36/37/39: Úsense indumentaria y guantes adecuados y protección para los ojos/la cara.  S45: En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente al médico (si es posible, muéstrele la etiqueta). Sulfato Cúprico:  R22: Nocivo por ingestión.  R36/38: Irrita los ojos y la piel.  S22: No respirar el polvo. Ninhidrina:  R22: Nocivo por ingestión.  R36/37/38: Irrita los ojos, la piel y las vías respiratorias. Acido Sulfúrico:  R35: Provoca quemaduras graves.  S26: En caso de contacto con los ojos, lávense inmediata y abundantemente con agua y acúdase a un médico.  S30: No echar jamás agua a este producto.  S45: En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente al médico (si es posible, muéstrele la etiqueta).

Hidróxido de Sodio:  R35: Provoca quemaduras graves.  S26: En caso de contacto con los ojos, lávense inmediata y abundantemente con agua y acúdase a un médico.  S37/39: Úsense guantes adecuados y protección para los ojos/la cara.  S45: En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente al médico (si es posible, muéstrele la etiqueta). Acido Sulfanilico:  R36: Irrita los ojos.  R38: Irrita la piel.  R43: Posibilidad de sensibilización en contacto con la piel.  S24: Evítese el contacto con la piel.  S37: Úsense guantes adecuados. Hidróxido de Amonio:  R34: Provoca quemaduras.  R50: Muy tóxico para los organismos acuáticos.  S26/37/39: Úsense indumentaria y guantes adecuados y protección para los ojos/la cara.  S45: En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente al médico (si es posible, muéstrele la etiqueta).  S61: Evítese su liberación al medio ambiente. Recábense instrucciones específicas de la ficha de datos de seguridad. Acido Acético:  R10: Inflamable.  R35: Provoca quemaduras graves.  S23: No respirar los gases/humos/vapores/aerosoles [denominación(es) adecuada(s) a especificar por el fabricante].  S26: En caso de contacto con los ojos, lávense inmediata y abundantemente con agua y acúdase a un médico.  S36/37/39: Úsense indumentaria y guantes adecuados y protección para los ojos/la cara.  S45: En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente al médico (si es posible, muéstrele La etiqueta). Nitrito de Sodio:

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  

R8: Peligro de fuego en contacto con materias combustibles. R25: Tóxico por ingestión. S45: En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente al médico (si es posible, muéstrele la etiqueta).

Datos y Resultados:

Tabla #1: Resultados de las pruebas de coloración de Aminoácidos y Proteínas.

PRUEBA

XANTOPROTEICA

BIURET

NINHIDRINA

HOPKINS - COLE

EHRLICH

Ovoalbumina

+(Amarillo)

+

+ (Violeta)

+

+ (Rojo)

Gelatina

- (Incolora)

+

- (Incolora)

-

- (Naranja Oscuro)

Asparagina

- (Incolora)

+

+ (Naranja)

-

-(Naranja)

Histidina

- (Incolora)

-

+ (Violeta)

-

+ (Rojo)

Triftofano

+(Naranja)

-

+ (Azul Oscuro)

+

+ (Rojo)

Muestra Problema

+(Naranja)

-

+ (Violeta)

+

-(Naranja)

Agua

- (Incolora)

-

- (Incolora)

-

- (Naranja)

Identificación de Muestra problema:

Triptófano

Análisis y Discusion

Prueba Xantoprotéica Algunos aminoácidos contienen grupos aromáticos que derivan del benceno. Una reacción característica del benceno y sus derivados, es la nitración del benceno con ácido nítrico. Los aminoácidos tirosina y triptófano contienen

anillos aromáticos activos (lo que indica que pueden nitrarse). El aminoácido fenilalanina también tiene en su estructura un anillo aromático pero no está activado, por lo tanto no va por el proceso de nitración fácilmente. La reacción de nitración, cuando se usa para identificar la presencia de un benceno activo, es llamada la prueba xantoprotéica. Es llamada xantoprotéica porque la palabra xantoprotéica viene de la palabra griega “xanthos” , que significa “amarillo”. El producto de la reacción es amarillo. La intensidad del color depende si la reacción ocurre en una solución básica. Esta reacción también ocurre cuando se derrama ácido nítrico en la piel. Las proteínas de la piel que

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contienen tirosina y triptófano, se vuelven amarillas porque se nitratan. En la práctica del laboratorio, la prueba dio positivia para la muestra problema, el triptófano y la la albúmina. Este resultado es debido a que en la estructura del triptófano se encuentra un anillo aromático:

Reacción de biuret Al llevar a cabo esta reacción se noto un cambio de color para la albumina, gelatina y la asparagina, el color al que cambio fue violeta, mientras que para los restantes se torno azul. La presencia de proteínas en una solución se puede determinar mediante la reacción del Biuret. El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina gracias a la presencia de NaOH . La reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta, debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos.

O C

C O

HN

NH

(Figura 1. Estructura del triptófano) R CH

En la albúmina también da positiva la prueba ya que en su estructura contienen aminoácidos como la leucina, isoleucina, lisina, fenilalanina, treonina, triptófano y valina. De los cuales la fenilalanina (fig 2.) y el triptófano tienen un anillo aromático, por lo tanto reaccionaría con estos dos aminoácidos para que de una coloración amarilla. En la muestra problema, la prueba nos dió positiva; indicando que en la sustancia desconocida, se encuentra un anillo aromático. En las demás muestras, nos dio negativa. Esto se debe a que ninguna de las demás muestras posee un anillo aromático en su estructura.

HC R Cu2+

O C

C O

HN

NH

R CH

HC R

La gelatina, aasparagina y albumina poseen enlaces peptidicos y proteínas para las cuales la prueba debería ser positiva, las demás soluciones dan negativas ya que estas muestras no presentan péptidos ni proteínas. Prueba de Ninhidrina El grupo alfa-amino de los aminoácidos forma complejos coloreados con la ninhidrina: violeta azuloso en la mayoría de los aminoácidos cuyo grupo amino es primario, amarillo para la prolina e hidroxiprolina y café para la asparagina que tiene un grupo amino en la cadena lateral. Esta reacción también identifica los grupos alfa-amino libres presentes en péptidos y proteínas.

-

(fig 2. Estructura de la fenilalanina)

Ovoalbumina: La prueba es postiva, en la gran cadena larga de aminoácidos, esta proteína contiene a lo largo de su cadena de aminoácidos grupos amino el cual es primario.

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-

-

-

-

-

Gelatina: La prueba es negativa, la gelatina esta compuesta de colágeno, la cual no contiene en su estructura grupos aminos, por tanto es incolora a esta prueba. Asparagina: La prueba es postiva, dando un color naranja o amarillo oscuro, es color tenue entre el color café también, esto demuestra que la Asparagina contiene un grupo amino en la cadena lateral. Histidina: La prueba es positiva, este aminoácido contiene un grupo amino en uno de sus extremos. Triftofano: La prueba es positiva, al igual que la Ovoalbumina, la Asparagina y la Histidina, este aminoácido contiene un grupo amino en su estructura. Muestra Problema La prueba es positiva, para seguir constryendo la estructura de este aminoacido o proteína, un elemento que la constituye, es un grupo amino en su cadena. Agua: La prueba es negativa, por no ser un aminoacido o una proteína, obviamente además de su estructura, no contiene ningún grupo amino en su estructura, su formula como se sabe es H2O. Reacción de Hopkins-Cole El resultado positivo de esta prueba se puede evidenciar con el anillo indolico que degrada el aminoácido triptófano a Indol produciendo compuestos de color rojizo- anaranjado. A diferencia del triptófano, el Indol es soluble en el alcohol y sólo este compuesto reaccionará con el aldehído produciendo el anillo coloreado característico de esta prueba. Con las soluciones de gelatina, asparagina, histidina, y agua la prueba dio negativa, pero con la albumina, el triptófano y la muestra problema se evidencio la formación del anillo indolico, por lo que esta ultima debe tener como uno de sus componentes el triptófano.

Prueba de Ehrlich La presencia de anillos aromáticos fenólicos o nitrogenados en la cadena lateral de los Aminoácidos se puede identificar mediante la reacción con ácido sulfanílico y nitrito de Sodio por formación de sales de Diazonio fuertemente coloreadas permitiendo así detectar la presencia de Tirosina e Histidina libres o formando péptidos y proteínas. Ovoalbumina: La prueba es positiva, demostrando asi la presencia de aniilos fenolicos o nitrogenados, ambos provenientes de benceno, en la cadena de aminoácidos de esta proteína. Gelatina: La prueba es negativa, observándose un color

peculiar naranja oscuro, como se muestra el colágeno no contiene anillos fenolicos o nitrogenados. Asparagina: La prueba es negativa, este aminoacido no contiene en su estructura ningún anillo fenolico o nitrogenado. Histidina: La prueba es positiva, debido a que la prueba de Elrich identifica en proteínas, aminoacidos como la Histidina y la Tirosina, por lo tanto esta prueba da un colo rojo intenso. Triftofano: La prueba es positiva, fuerte color rojo, el triftofano en su estrucura contiene un anillo nitrogenado. Muestra Problema: La prueba es negativa, esta proteinao aminoácido no contiene ningún anillo nitrogenado o fenolico. Agua: La prueba es negativa, el agua no contiene en su estructura anillos organicos de ningún tipo.

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Identificación de la muestra problema Se estableció que la muestra problema era una solución con el aminoácido triptófano. Esto se debe a lo siguiente: En la prueba de la nihidrina, se obtuvo que es positiva, por lo tanto debía ser una proteína, un polipéptido o un aminoácido ya que estos tienen grupos amino. La muestra problema dio negativa para el test de Biuret, indicando que se trata de un aminoácido y no de una proteína o un polipéptido. Esto se debe a que da positiva para las sustancias con enlaces peptídicos las cuales son proteínas y polipéptidos.

2. Reacción con la albúmina:

Sabiendo que es un aminoácido, la prueba Xantoprotéica nos ayuda a determinar más específicamente qué tipo de aminoácido es. La muestra dio positiva, indicando que en la estructurta de la muestra problema, se encuentra un anillo aromático. Por lo tanto, el aminoácido puede ser la fenilalanina, tirosina o triptófano. Cuando En la prueba de Hopkins-Cole, dió positiva para la muetra problema, se pudo determinar que el aminoácido es triptófano. Esto se debe a que esta prueba da positiva específicamente para el aminoácido triptófano ya que en la prueba, se evidencia la presencia del anillo indolico, indicando que se ha degradado el aminoácido triptófano. La prueba de Ehrlich dio positiva con el triptófano ya que éste contienen un anillo nitrogendo (fig 1.). Pero con la muestra problema, dió negativa, indicando una contradicción. Esto se puede deber a que al ser la última prueba que se realizara, tuvo más probabilidad de que ésta fuera contaminada o que los materiales utilizados estuviesen más propensos al ser contaminados con otros reactivos y/o sustancias usadas en la práctica.

3. Las proteínas que dan positivo para la prueba de Hopkins-Cole son las proteínas que contengan el aminoácido triptófano ya que la prueba da positiva indicando un anillo indólico cuando hay presencia de este aminoácido

Preguntas Complementarias: 1.

Conclusiones Existen diferentes pruebas para la identificación de proteínas y aminoácidos que permiten establecer un resultado positivo o negativo de acuerdo a las características y composición de cada una de ellas, evidenciado en coloraciones, presencia de anillos, etc. Se establecieron las características de estas pruebas para la identifición cualitativa de sustancias que pueden contener aminoácidos, proteínas o péptidos. Y cuando se usan varias pruebas en la muestra, se pueden determinar ciertas sustancias en específico El aminoácido de la muestra problema fue el triptófano. Aunque en la prueba de Ehrich haya dado negativo, esto se

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debe a la contaminación de la muestra problema y materiales usados en la práctica. Bibliografía:

http://webdelprofesor.ula.ve/farmacia/gmendez/manuales% 20PDF/EXPERIMENTO%202%20IDENT%20AA%200604.pdf visitado el 01 de Abril de 2011 http://www.cerlabs.com/experiments/10875404480.pdf visitado el 01 de Abril de 2011 http://es.scribd.com/doc/2309987/Proteinas-y-susreacciones visitado el 02 de Abril de 2011 GRANADOS Jairo Enrique, y GARCÍA Anselmo. ”físico química aplicada”. primera edición. Editorial Unisur. Santa fe de Bogotá, Colombia, 1995. págs. 351-377, 383.