LA1 LA 2.pdf

OQGP G17 C0501 (799)

LA 1 Screening Reagent / LA 2 Conrmation Reagent LA 1 [REAGENT] / LA 2 [REAGENT] Simplied Dilute Russell’s Viper Venom Test (DRVVT) for detection of Lupus Anticoagulants

Quality Control

tion of Lupus Anticoagulants (LA) in one-stage clotting tests.

Each laboratory should determine its own acceptable control values and normal range. LA Control High ( [REF] OQWD) and LA Control Low ( [REF] OQWE) are distributed by Siemens for use in quality control of LA 1 Screening Reagent and LA 2 Conrmation Reagent assays. Quality control plasma must be tested at the same time as patient samples.

LA 1 Screening Reagent

Results

Intended Use

LA 1 Screening Reagent and LA 2 Conrmation Reagent are simplied DRVVT reagents for detec -

Simplied DRVV reagent to screen for the presence of Lupus Anticoagulants. LA 2 Conrmation Reagent

Phospholipid-rich DRVV reagent for the specic correction of Lupus Anticoagulants.

Summary and Explanation

LAs are autoantibodies against negatively charged phospholipids or complexes of phospholipids with either beta-2-glycoprotein 1 or clotting factors such as prothrombin. They occur in various clinical conditions, especially autoimmune diseases 1 and are now considered to be a signicant risk factor in patients with otherwise unexplained thrombosis and are often present in women who have recurrent fetal loss 5. LA have traditionally been detected detected using phospholipid responsive clot ting tests, such as the activated partial thromboplastin time (APTT), kaolin clotting time (KCT) and DRVVT2 where they have an anticoagulant effect. The DRVV time rst became popular following the publication by Thiagarajan et al. in 1986 6. This method has been standardized and simplied 7. According to Petri 8 et al., thrombosis in SLE patients is more closely linked with LA detectable by DRVVT than with anticardiolipin antibodies detected by enzyme linked immunosorbent assays (ELISA) 5. This observation was recently extended by Galli and Bevers 9  who showed that the LA subtype with most effect on DRVVT tests is beta2-glycoprotein 1 dependent and different to the prothrombin-requiring LA subtype having more prolonging effect on KCT tests.

If the LA 1 Screening Reagent clotting time is within the normal range, no further testing for LA may be necessary. If the LA 1 Screening Reagent clotting time result is more than 2 SD longer than the mean of normal plasma (ideally n ≥ 20), the result should be considered abnormal and investigated further. (See gure 1) The nal result is best expressed as a ratio of the clotting tim es of LA 1 Screening Reagent divided by LA 2 Conrmation Reagent. LA 1 Screening Reagent clotting time LA Ratio = ––––––––––––––– –––––––––––––––––––––––––––––– ––––––––––––––––– –– LA 2 Conrmation Reagent clotting time Figure 1

Test Principle

1. Russell’s viper venom present in LA 1 Screening Reagent initiate plasma clotting by directly activating factor X. LA antibodies prolong the LA 1 Screening Reagent clotting time. 2. LA 2 Conrmation Reagent is similar to LA 1 Screening Reagent Reagent but contains a high phospholi pid concentration. The extra phospholipid counteracts the LA antibody and largely corrects the clot time3. 3. DRVV test ”bypass” factor VII of the extrinsic pathway and the contact and antihemophilic fac tors of the intrinsic pathway. Therefore LA 1 Screening Reagent is more specic for LA than APTTs as they are not affected by contact factor abnormalities or by factor VIII deciencies or antibodies6. There have been a number of tests developed based on phospholipid correction 4 however none have been as convenient to use as LA 2 Conrmation Reagent subsequent to LA 1 Screening Reagent. 4. Mixing tests may be useful to exclude factor II, V and X deciencies, which may prolong LA 1 Screening Reagent and LA 2 Conrmation Reagent results. Mixing normal plasma with test plasma replenishes any factors decient in the test plasma. If the mixing test is still prolonged, it indicates that an inhibitor (such as LA) is present in the test plasma. A circulating inhibitor is usually indicated by a prolonged clotting time result that is not corrected by mixing patient plasma with normal plasma 3,10.

Reagent Composition

LA 1 Screening Reagent and LA 2 Conrmation Reagent contain Russell’s viper venom, phospholi pids, antiheparin agents, calcium, buffers, stabilizers, sodium azide and dyes. Warnings and precautions For in-vitro diagnostic use only.

When disposing of azide, always ush with large volumes of water to avoid the possibility of an explosive residue forming in metal plumbing. Preparation for use

Reconstitute with the volume of distilled water stated on the vial. Mix well by inversion to ensure complete re-suspension of the lyophilized material. Storage instructions

The lyophilized reagents are stable at least until the expiry date stated on the vial label when stored at +2 to +8 °C. Following reconstitution reagents can be stored for 8 hours at +37 °C, 24 hours at +20 to +25 °C, 48 hrs at +2 to +8 °C and 1 month at -20 °C. Indications of instability / deterioration

If there is no evidence of vacuum when the v ial is opened and/or the reagent does not appear dry it should be returned to Siemens Healthcare Diagnostics.

Specimen Collection and Preparation

Collect and process blood in accordance with NCCLS Standard H21-A3: Collection, Transport and Processing of Blood Specimens for Coagulation Testing and General Performance of Coagulation Assays; Approved Guideline - 3 rd Edition (1998). Separated plasma should be stored at +2 to +8 °C and tested within 4 hours of collection. If the samples are to be frozen before testing, the plasma must double spun to remove platelets (to below 10 x 10 9 /L)10 prior to freezing as these can shorten the LA 1 Screening Reagent clotting time.

Test Procedure

1. Pre-warm a slight excess of LA 1 Screening Reagent or LA 2 Conrmation Reagent at 37 ± 1 °C in a reagent reservoir, allowing for 200 µL per test. 2. Dispense 200 µL of test plasma into a glass test tube and warm for 1 minute at +37 °C. 3. Add 200 µL of pre-warmed reagent to the plasma and time from the moment of reagent addition addition to a clotting end point. 4. Repeat for duplicate test values and report the average of these as the result. Automated method

Protocols for Siemens analyzers are available on request. LA 1 Screening Reagent and LA 2 Conrmation Reagent tests should be carried out using equal volumes of test plasma and reagent as in most thrombin time protocols. However, observation or acquisition times should be extended to 120 seconds. Materials provided LA 1 [REAGENT], [REF] OQGP with

10 x l 2 mL LA 1 [REAGENT], LA 1 Screening Reagent LA 2 [REAGENT], [REF] OQGR with

10 x l 1 mL LA 2 [REAGENT], LA 2 Conrmation Reagent Materials required but not provided

10 mm x 75 mm glass test tubes Pipette to deliver 200 µL, 1 mL, 2 mL or 5 mL Water bath, stop watch Puried water, USP or equivalent LA Control High ( [REF] OQWD) LA Control Low ( [REF] OQWE) OQGP G17 C0501 (799)

1

1

Mixing tests

If results are borderline, mixing studies may be used to correct for hidden defects in the sample and clarify the presence of LA. These tests should be carried out on a 50:50 mixture of test plasma and normal plasma (Siemens Control Plasma N should not be used for mixing studies) using the standard test procedure. TABLE 1: Combination of mixing and conrmatory tests LA 1

Patitien Pa entt Plas Plasma ma MixMixPatient + Normal N N ABN ABN ABN N ABN ABN ABN ABN

LA 2

Patitien Pa entt Plasma Plasma MixMixPatient + Normal N N N N ABN N ABN N ABN ABN

Diagnosis

LA not detected

LA present Factor decient/OAT LA + Factor decient Other inhibitor

Calculating a normalized ratio may be useful to correct for differences in instrument/reagent com binations. Normalization uses the mean clot times of normal plasma tested with LA 1 Screening Reagent and LA 2 Conrmation Reagent in the users own laboratory. This may improve discrimina tion between normal and low positive LA samples. patient LA 1 Screening Reagent mean normal LA 2 Conrmation Reagent Normalized Ratio = mean ––––––––––––––––––––––––––––––– ––––––––––––––– –––––––––––––––––––––––––––––––– ––––––––––––––––– normal LA 1 –––––––––––––––– Screening Reagent x –––––––––––––––– patient LA 2 Conrmation Reagent – The ow chart in gure 1 can also be used to interpret normalized ratios.

Limitations of the Procedure

Samples containing clots and those with abnormal hematocrits should be discarded. Jaundiced, lipemic and hemolysed specimens should be tested by manual techniques as some photo-electric instruments give false results. Commercially available normal quality control plasmas with unspecied levels of citrate and plate lets are not recommended for use in mixing studies. For comparative studies LA 1 Screening Reagent and LA 2 Conrmation Reagent tests should be performed at the same time. At least 2 screening tests based on different assay principles should be performed. performed. Additionally a mixing study for the verication of the presence of a coagulation inhibitor and a conrmation test for the documentation of phospholipid dependency should be performed 10. Heparin levels up to 1 unit/mL have no effect due to the presence of a neutralizing agent in both LA 1 Screening Reagent and LA 2 Conrmation Reagent. Results of this test should always be interpreted in conjunction with the patient’s medical history, clinical presentation and other ndings.

Expected Values

Normal ranges for LA 1 Screening Reagent of 31 - 44 seconds and for LA 2 Conrmation Reagent of 30 - 38 seconds were obtained using a manual tilt-tube method with samples coll ected from 26 healthy individuals aged 18 to 55 years. The ratio of LA 1 / LA 2 was in the range 0.8 - 1.2. These results should be used as a guide only. LA 1 Screening

If ratio ––––––––––––– is greater than 2.0, LA is strongly present, LA 2 Conrm LA 1 Screening

If ratio ––––––––––––– is between 1.5 and 2.0, LA is moderately present, LA 2 Conrm LA 1 Screening

If ratio ––––––––––––– is between 1.2 and 1.5, LA is weakly present, LA 2 Conrm Each laboratory should determine its own normal range for both manual and automated methods to overcome differences in sample collection and instrumentation.

Specic Performance Characteristics

Intra-laboratory and inter-laboratory precision studies were performed using both manual tilt-tube and automated methods. These studies gave coefcient of variation less than 3.5 % on normal plasmas and less than 5 % for abnormal samples. Specicity Studies were performed on known plasma samples. A positive ratio for LA 1 Screening Reagent/LA 2 Conrmation Reagent of greater than 1.2 was found in known*: LA plasma90 % (26/29) Heparinized plasma12 % (1/8) OAT patient plasma0 % (0/7) Factor decient plasma- 0 % (0/5) Normal plasma2 % (1/60) * N.B. “known” LA identication with APTT + KCT mixing studies.

Reagenzien Zusammensetzung

Screening-Reagenz LA 1 und Bestätigungsreagenz LA 2 enthalten das Gift der Russell Viper, Phospholipide, Antiheparin-Wirkstoffe, Calcium, Pufferlösung, Stabilisatoren, Natriumazid und Farbstoffe. Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen

Nur zur in-vitro  diagnostischen Anwendung. Bei Entsorgung ins Abwasser mit viel Wasser nachspülen, um die Bildung explosiver Stoffe in Metall-Abussrohren zu verhindern. Vorbereitung der Reagenzien

Den Inhalt des Fläschchens mit der auf dem Etikett angegebenen Menge destilliertem Wasser auösen. Den Inhalt durch Umschütteln sorgfältig mischen, um vollständige Resuspendierung des lyophilisierten Materials zu gewährleisten. Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen

Bibliography

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Edition October 2008

Screening-Reagenz LA 1 / Bestätigungsreagenz LA 2 LA 1 [REAGENT] / LA 2 [REAGENT] Vereinfachtes “Dilute Russell’s Viper Venom Time” (DRVVT, Schlangengiftaktivator)Reagenz zum Nachweis von Lupus Anticoagulans

Anwendungsbereich

Screening-Reagenz LA 1 und Bestätigungsreagenz LA 2 sind vereinfachte DRVVT-Reagenzien zum Nachweis von Lupus Anticoagulans (LA) in einstugen Gerinnungstests. Screening-Reagenz LA 1

Vereinfachtes DRVV-Reagenz zum Screening auf Lupus Anticoagulans. Bestätigungsreagenz LA 2

Phospholipidreiches DRVV-Reagenz für die spezische K orrektur von Lupus Anticoagulans.

Diagnostische Bedeutung

Bei Lupus Anticoagulans (LA) handelt es sich um Auto-Antikörper gegen negativ geladene Phos pholipide oder Komplexe von Phospholipiden mit entweder Beta-2-Glykoprotein 1 oder Gerinnungs faktoren wie Prothrombin. Sie treten bei verschiedenen klinischen Zuständen, insbesondere jedoch bei Autoimmunerkrankungen auf 1. Darüber hinaus wird LA heute als signikanter Risikofaktor für Patienten mit anderweitig nicht zu erklärenden Thrombosen angesehen und ist häug bei Frauen mit wiederholten Fehlgeburten nachzuweisen 5. LA wird üblicherweise mit phospholipid-empnd lichen Gerinnungstests wie APTT (activated partial thromboplastin time), KCT (kaolin clotting time), und DRVVT 2 nachgewiesen, bei denen es gerinnungshemmend wirkt. Die DRVV-Zeit begann sich nach der Publikation von Thiagarajan et al. im Jahre 1986 durchzuset zen6. Diese Methode wurde vereinfacht und standardisiert 7. Nach Petri 8 et al. ist bei ThrombosePatienten mit systemischem Lupus erythematodes die Wahrscheinlichkeit höher, LA mit DRVVT nachzuweisen mit einem Enzymimmunoassay (ELISA) 5  für Antikardiolipin-Antikörper . Diese Beobachtung wurde kürzlich durch Galli und Bevers 9 erweitert, die gezeigt haben, dass der LASubtypus mit der größten Wirkung auf DRVVT-Tests auf Beta-2-Glykoprotein 1 angewiesen ist und sich vom Prothrombin-abhängigen LA-Subtypus unterscheidet, der sich eher verlängernd auf KCT-Tests auswirkt.

Wenn die gefriergetrockneten Reagenzien bei +2 bis +8 °C aufbewahrt werden, sind sie mindes tens bis zu dem auf dem Flaschenetikett aufgedruckten Datum haltbar. Nach Rekonstitution können die Reagenzien bei +37 °C 8 Stunden, bei +20 bis +25 °C 24 Stunden, bei +2 bis +8 °C 48 Stunden und bei -20 °C einen Monat lang gelagert werden. Anzeichen für Instabilität und Verfall

Wenn beim Öffnen des Fläschchens keine deutlichen Anzeichen von Vakuum festzustellen sind und/oder wenn das Reagenz nicht trocken wirkt, sollte dieses an Siemens Healthcare Diagnostics zurückgesendet werden.

Probenabnahme und -vorbereitung

Das Blut ist gemäß dem NCCLS-Standard H21-A3 über Abnahme, Transport und V erarbeitung von Blutproben für Gerinnungstests und die Allgemeine Durchführung von Gerinnungsassays - aner kannte Richtlinie - 3.Ausgabe (1998), abzunehmen und zu verarbeiten. Abgetrenntes Plasma ist bei +2 bis +8 °C z u lagern und innerhalb von 4 Stunden nach Entnahme zur Testung einzusetzen. Wenn die Proben vor der Austestung eingefroren werden sollen, muss das Plasma vor dem Einfrie ren zweimal zentrifugiert werden, um Blutplättchen (auf weniger als 10 x 10 9 /l)10 zu entfernen, denn diese können sonst die Gerinnungszeit des S creening Reagenz‘ LA 1 verkürzen.

Testdurchführung

1. In einem Reagenzglas, das mindestens 200 µl pro Test aufnehmen kann, etwas mehr als die benötigte Menge Screening-Reagenz LA 1 und/oder Bestätigungsreagenz LA 2 bei +37 °C ± 1 °C vorwärmen. 2. 200 µl Patientenplasma in ein Glasgefäß geben und 1 Minute bei +37 °C inkubieren. 3. 200 µl vorgewärmtes Screening-Reagenz LA 1 oder Bestätigungsreagenz LA 2 zum Plasma geben und die Zeit von der Zugabe des Reagenzes bis zum Abschluss der Gerinnungsreaktion messen. 4. Test für Doppelbestimmung wiederholen und Mittelwert der Testresultate bilden. Automatisierte Methode

Testvorschriften für Siemens-Analysatoren stehen auf Anfrage zur Verfügung. Die Tests mit Screening-Reagenz LA 1 und Bestätigungsreagenz LA 2 sollten, wie auch in den meisten Thrombin-Zeit-Protokollen, unter Verwendung gleicher Volumina an Testplasma und Reagenz ausgeführt werden. Die Messwertaufnahme- bzw. Auswertezeit sollte jedoch auf 120 Sekun den ausgedehnt werden. Inhalt der Handelspackung LA 1 [REAGENT], [REF] OQGP mit

10 x l 2 ml LA 1 [REAGENT], Screening-Reagenz LA 1 LA 2 [REAGENT], [REF] OQGR mit

10 x l 1 ml LA 2 [REAGENT], Bestätigungsreagenz LA 2 Zusätzlich benötigte Materialien

10 mm x 75 mm Reagenzgefäße, Pipette für 200 µl, 1 ml, 2 ml oder 5 ml Wasserbad, Stoppuhr destilliertes Wasser (USP oder vergleichbare Reinheit) LA Kontrolle Hoch ( [REF] OQWD) LA Kontrolle Niedrig ( [REF] OQWE) Qualitätskontrolle

Jedes Labor sollte seine eigenen Vertrauensbereiche der Kontrollen und einen Normalbereich festlegen. LA Kontrolle Hoch ( [REF]  OQWD) und LA Kontrolle Niedrig ( [REF]  OQWE) werden von Siemens zur Qualitätskontrolle von Screening-Reagenz LA 1 und Bestätigungsreagenz LA 2 geliefert. Die Bestim mungen der Kontrollplasmen und Patientenproben müssen gleichzeitig durchgeführt werden.

Ergebnisse

Wenn die LA 1-Gerinnungszeit im Normalbereich liegt, ist möglicherweise keine weitere Testung auf LA notwendig. Wenn die LA 1-Gerinnungszeit über 2 SD oder etwa 20 % länger als der Mittelwert des Normalplasmas (idealerweise n ≥ 20) ist, sollte das Ergebnis als nicht normal betrachtet werden und weiter untersucht werden (siehe Abbildung 1). Das Endergebnis lässt sich am besten als Verhältnis (Ratio) zwischen der Gerinnungszeit des Screening-Reagenz LA 1 und der Gerinnungszeit des Bestätigungsreagenz LA 2 ausdrücken. Gerinnungszeit Screening-Reagenz LA 1 LA Ratio = –––––––––––––––––––––––––––––––––– Gerinnungszeit Bestätigungsreagenz LA 2 Abbildung 1

Prinzip der Methode

1. Das im Screening-Reagenz LA 1 enthaltene Gift der Russel Viper löst die Plasmagerinnung durch direkte Aktivierung des Faktor X aus. Die LA-Antikörper verlängern die Gerinnungszeit des Screening-Reagenz’ LA 1. 2. Das Bestätigungsreagenz LA 2 ähnelt dem Screening-Reagenz LA1, enthält aber eine höhere Konzentration an Phospholipiden. Diese zusätzlichen Phospholipide wirken dem LA-Antikörper entgegen und korrigieren so weitestgehend die Gerinnungszeit 3. 3. Der DRVVT-Test umgeht Faktor VII des extrinsischen Systems der Blutgerinnung sowie die Kontakt- und antihämophilen Faktoren des intrinsischen Systems. Deshalb ist das ScreeningReagenz LA 1 für den spezischen Nachweis von LA besser geeignet als APTT-Tests, denn es wird weder durch Kontaktfaktor-Anomalien noch durch einen Faktor-VIII-Mangel oder An tikörper beeinusst 6. Es wurden eine Reihe von Tests auf Basis der Phospholipid-Korrektur 4 entwickelt, es hat sich allerdings keiner als annähernd so geeignet erwiesen, wie der Einsatz des Bestätigungs-Reagenz‘ LA 2 im Anschluss an das Screening-Reagenz LA 1. 4. Um einen Mangel an den Faktoren II, V und X auszuschließen, der das Testergebnis mit dem Screening-Reagenz LA 1 und dem Bestätigungsreagenz LA 2 verlängern würde, können auch Plasmatauschversuche nützlich sein. Durch Mischen von normal em Plasma mit Testplasma werden die im Testplasma fehlenden Faktoren wieder zugeführt. Wenn der Plasmatauschversuch noch immer zu verlängerten Testzeiten führt, ist dies ein Hinweis darauf, dass sich im Testplasma ein Inhibitor (wie LA) bendet. Normalerweise weist eine verlängerte Gerinnungszeit, die auch durch Mischen von Patientenplasma mit normalem Plasma nicht korrigiert wird, auf einen zirkulierenden Inhibitor hin3, 10.

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2

1

Plasmatauschversuch

LA 1 Réactif de dépistage

Um versteckte Fehlergebisse der Probe zu korrigieren und um die Präsenz von LA zu klären, können bei grenzwertigen Ergebnissen Plasmatauschversuche durchgeführt werden. Bei diesen Tests, die wie der normale Standardtest durchzuführen sind, sollte das Verhältnis zwischen der Plasmaprobe und dem normalen Plasma 50:50 betragen (für Plasmatauschversuche sollte nicht Siemens Control Plasma N verwendet werden).

Réactif dRVV simplié pour le dépistage des anticoagulants lupiques.

Tabelle 1: Kombination von Plasmatauschversuchen und Bestätigungstests LA 1

LA 2

plasma N

Mischung Patient + Normal N

plasma N

Mischung Patient + Normal N

ABN ABN ABN ABN

ABN N ABN ABN

N ABN ABN ABN

N N N ABN

Patienten-

Patienten-

Diagnose

Kein Nachweis von LA Nachweis von LA Faktormangel/OAT LA + Faktormangel Sonstiger Inhibitor

Zum Ausgleich der A bweichungen bei verschiedenen Kombinationen von Reagenzien bzw. Gerä ten kann die Berechnung einer normalisierten Verhältniszahl sinnvoll sein. Bei der Normalisierung werden die mittleren Gerinnungszeiten des im Labor des Anwenders mit Screening-Reagenz LA 1 und Bestätigungsreagenz LA 2 getesteten Normalplasmas verwendet. Das kann die Unterschei dung zwischen normalen und schwach positiven LA- Proben erleichtern. Normalisierte Ratio =

Screening-Reagenz LA 1 Patient mittlere Normalzeit Bestätigungsreagenz LA2 ––––––––––––––––––––––––––––––– x –––––––––––––––––––––––––––––––––– mittlere Normalzeit Screening Reagenz LA 1 Bestätigungsreagenz LA 2 Patient

Zur Interpretation normalisierter Verhältniszahlen kann das Flussdiagramm in Abbildung 1 eben falls herangezogen werden.

Einschränkungen der Testdurchführung

Proben mit bereits vorhandenen Gerinnseln und abnormen Hämatokritwerten sollten verworfen werden. Hepatische, lipämische und hämolytische Proben sollten mit manuellen Verfahren getestet werden, da einige photometrische Instrumente falsche Resultate liefern. Die Verwendung von kommerziell erhältlichen Kontrollplasmen, die keine Angabe zu Citrat- und Plättchenkonzentrationen machen, ist nicht zu empfehlen. Bei Vergleichsprüfungen sollten die Tests mit Screening-Reagenz LA 1 und Bestätigungsreagenz LA 2 jeweils zur gleichen Zeit durchgeführt werden. Es sollten mindestens 2 auf unterschiedlichen Testprinzipien basierende Screening-Tests durchgeführt werden. Darüber hinaus sollte ein Plasmatauschversuch zur Verikation des Vorhandenseins eines Gerinnungshemmers und ein Bestätigungstest zur Dokumentation der Phospholipid-Abhän gigkeit durchgeführt werden 10. Heparin-Konzentrationen bis 1 Einheit/ml haben keine Auswirkungen, denn sowohl ScreeningReagenz LA 1 als auch Bestätigungsreagenz LA 2 enthalten entsprechende Neutralisatoren. Resultate dieses Tests sollten stets in Verbindung mit der Vorgeschichte des Patienten, dem kli nischen Bild und anderen Untersuchungsergebnissen interpretiert werden.

Erwartete Werte

Mit Proben von 26 gesunden Personen im Alter zwischen 18 und 55 Jahren wurden bei Anwendung einer manuellen Methode für das Screening-Reagenz LA 1 ein Normalbereich von 31 - 44 Sekunden und für das Bestätigungsreagenz LA 2 ein Normalbereich von 30 - 38 Sekunden gefunden. Die Ratio von LA 1 : LA 2 bewegte sich im Bereich zwischen 0,8 und 1,2. Diese Ergebnisse bieten lediglich einen Anhaltspunkt. Screening LA 1

Ist das Verhältnis –––––––––––––– größer als 2,0, dann ist LA stark ausgeprägt. Bestätigung LA 2

Réactif dRVV riche en phospholipides, pour la correction spécique des anticoagulants lupiques.

Intérêt diagnostique

Les anticoagulants lupiques (LA) sont des auto-anticorps dirigés contre des phospholipides char gés négativement ou des complexes de phospholipides contenant soit de la beta-2-glycoprotéine 1, soit un facteur de la coagulation comme la prothrombine. Ils apparaissent dans différents ta bleaux cliniques, et plus particulièrement dans les maladies auto-immunes 1. Par ailleurs, les LA sont aujourd’hui considérés comme un facteur de risque signicatif chez les patients souffrant de thromboses inexpliquées, et sont fréquemment mis en évidence chez les femmes ayant eu des avortements répétés 5. Les LA sont généralement mis en évidence à l’aide de tests de coagulation sensibles aux phospholipides où ils agissent en tant qu’inhibiteur de la coagulation, comme le TCA (Temps de Céphaline avec Activateur), le TCK (Temps de Céphaline Kaolin), ou le dRVVT 2. Le dRVVT a commencé à être utilisé après la publication de Thiagarajan et al. en 1986 6. Cette méthode a été standardisée et simpliée 7. Selon Petri 8 et al., la probabilité, chez les patients throm botiques souffrant d’un Lupus érythémateux systémique, est plus élevée de révéler des LA avec le dRVVT que des anticorps anti-cardiolipine avec un test immunoenzymatique (ELISA) 5. Cette observation a récemment été élargie par Galli et Bevers 9, qui ont montré que le sous-type des LA ayant le plus d’effet sur le dRVVT est beta-2-glycoprotéine 1 dépendant, et différent du sous-type LA prothrombine dépendant qui a un effet d’allongement plus marqué sur le TCA.

Principe de la méthode

1. Le venin de vipère Russell contenu dans le Réactif de dépistage LA 1 déclenche la coagulation du plasma par activation directe du Facteur X. Les anticorps anti-LA allongent le temps de coagulation du Réactif de dépistage LA 1. 2. Le Réactif de conrmation LA 2 ressemble au Réactif de dépistage LA 1, mais sa concentration en phospholipides est augmentée. Ces phospholipides supplémentaires contrecarrent l’action des anticorps anti-LA et corrigent ainsi largement le temps de coagulation 3. 3. Le dRVVT contourne le Facteur VII de la voie extrinsèque de la coagulation ainsi que les fac teurs de la phase contact et les facteurs anti-hémophiliques de la voie intrinsèque. Aussi le Réactif de dépistage LA 1 est-il plus adapté pour la mise en évidence spécique des LA que le TCA, car il n’est inuencé ni par des anomalies des facteurs de la phase contact, ni par un décit en Facteur VIII, ni par des anticorps 6. Une série de tests basés sur la correction par les phospholipides 4 ont été mis au point. Aucun ne s’est cependant révélé aussi simple d’utilisation que le Réactif de dépistage LA 1, suivi du Réactif de conrmation LA 2. 4. Pour exclure un décit en Facteur II, V ou X , qui pourrait allonger le résultat obtenu avec le Réactif de dépistage LA 1 et le Réactif de conrmation LA 2, il peut être util e d’effectuer un test de mélange. Pour cela, mélanger le plasma testé avec un plasma témoin, de façon à réintroduire les facteurs manquants dans le plasma testé. Si le mélange donne toujours un temps allongé, cela signie que le plasma testé contient un inhibiteur de la coagulation (par ex. des LA). Nor malement, un temps de coagulation allongé qui ne se corrige pas par le test de mélange prouve la présence d’un inhibiteur circulant 3, 10.

Réactifs Composition

Le Réactif de dépistage LA 1 et le Réactif de conrmation LA 2 contiennent du venin de vipère Russell, des phospholipides, des agents anti-hépariniques, du calcium, une solution tampon, des stabilisateurs, de l’azide de sodium, et des colorants. Mises en garde et précautions d’emploi

Les réactifs sont réservés à un usage de diagnostic in-vitro . En cas d’évacuation dans l’évier, rincer avec un grand volume d’eau pour éviter tout mélange explosif dans les canalisations métalliques. Préparation des réactifs

Reconstituer le contenu d’un acon avec le volume d’eau distillée indiqué sur l’étiquette. Bien mé langer en agitant avec précaution an d’assurer une parfaite reconstitution du lyophilisat. Stabilité et conditions de conservation

Screening LA 1

Ist das Verhältnis –––––––––––––– zwischen 1,5 und 2,0, dann ist LA mäßig ausgeprägt. Bestätigung LA 2 Ist das Verhältnis

LA 2 Réactif de conrmation

Screening LA 1

–––––––––––––– zwischen 1,2 und 1,5, dann ist LA schwach ausgeprägt. Bestätigung LA 2

Les réactifs lyophilisés conservés à +2/+8 °C peuvent être utilisés jusqu’à la date indiquée sur l’étiquette du acon. Une fois reconstitués, ils se conservent 8 heures à +37 °C, 24 heures à +20/+25 °C, 48 heures à +2/+8 °C et un mois à -20 °C. Signes d’instabilité et de détérioration

Jedes Labor sollte seinen eigenen Normalbereich sowohl für manuelle als auch automatisierte Testmethoden bestimmen, um Unterschiede bei Probennahme und Geräten auszugleichen.

Si, à l’ouverture du acon, on observe une absence de v ide, et/ou si le réactif ne paraît pas l yophi lisé, le retourner à Siemens Healthcare Diagnostics.

Leistungsmerkmale des Tests

Prélèvement et préparation des échantillons

Intra- und Interlaboratoriumsstudien zur Präzision wurden sowohl mit manuellen (tilt tube) als auch automatisierten Methoden durchgeführt. Diese Prüfungen ergaben Variationskoefzienten von weniger als 3,5 % bei normalen Plasmen und weniger als 5 % bei abnormen Proben. Untersuchungen zur Spezität wurden an bekannten Plasmaproben durchgeführt. Bei folgenden Plasmen* wurde zwischen S creening-Reagenz LA 1 und Bestätigungsreagenz LA 2 eine positive Ratio von größer als 1,2 gefunden: LA-Plasma 90 % (26/29) heparinisiertes Plasma 12 % (1/8) Plasma von OAT-Patienten 0 % (0/7) Plasma mit Faktormangel 0 % (0/5) Normalplasma 2 % (1/60) * Bei diesen Plasmen wurde LA in APTT+KCT-Plasmatauschversuchen nachgewiesen.

Literatur

Siehe englische Packungsbeilage.

Prélever et préparer les échantillons selon le NCCLS H21-A3 « Prélèvement, transport et prépara tion des échantillons sanguins pour tests de coagulation », ainsi que selon la procédure générale pour tests de coagulation, directive validée, 3 ème  édition (1998). Conserver le plasma séparé à +2/+8 °C, et le tester dans les 4 heures qui suivent le prélèvement. Si les plasmas doivent être congelés avant leur utilisation dans le test, les centrifuger deux fois pour éliminer les plaquettes sanguines (le taux doit être inférieur à 10 x 10 9 /l)10 car celles-ci peuvent raccourcir le temps de coagulation du Réactif de dépistage LA 1.

Réalisation du test

1. Dans un acon pour réactif pouvant contenir au moins 200 µl par test, préchauffer à +37 ± 1 °C un peu plus que la quantité nécessaire de Réactif de dépistage LA 1 et/ou de Réactif de conr mation LA 2. 2. Distribuer 200 µl de plasma de patient dans un tube à essai en verre, et laisser incuber 1 minute à +37 °C. 3. Ajouter au plasma 200 µl de Réactif de dépistage LA 1 ou de Réactif de conrmation LA 2 préchauffé, et mesurer le temps écoulé depuis l’addition du Réactif jusqu’à l a n de la réaction de coagulation. 4. Répéter la mesure pour un dosage en double, et calculer la moyenne des résultats obtenus. Méthode automatisée

Ausgabe Oktober 2008

LA 1 Réactif de dépistage /  LA 2 Réactif de conrmation LA 1 [REAGENT] / LA 2 [REAGENT] Test simplié de mesure du Temps de Venin de Vipère Russell dilué (dRVVT, activateur de venin de serpent), pour le dépistage des anticoagulants lupiques

Domaine d’utilisation

Les réactifs LA 1 de dépistage et LA 2 de conrmation sont des réactifs dRVVT simpliés, qui permettent la mise en évidence d’anticoagulants lupiques (LA) dans des tests de coagulation en une étape. OQGP G17 C0501 (799)

3

Les protocoles de test sur les automates Siemens sont disponibles sur demande. Les tests utilisant le Réactif de dépistage LA 1 et le Réactif de conrmation LA 2 doivent, comme la plupart des tests de mesure du temps de thrombine, être effectués avec un volume égal de plasma de patient et de réactif. Cependant, le temps de lecture ou d’exploitation doit être porté à 120 secondes. Conditionnements LA 1 [REAGENT], [REF] OQGP contenant

10 x l 2 ml LA 1 [REAGENT], LA 1 Réactif de dépistage LA 2 [REAGENT], [REF] OQGR contenant

10 x l 1 ml LA 2 [REAGENT], LA 2 Réactif de conrmation Matériel nécessaire

Tubes à essai en verre de 10 mm x 75 mm Pipette pour distribuer 200 µl, 1 ml, 2 ml ou 5 ml Bain-marie, chronomètre Eau distillée (USP ou de pureté équivalente) LA Contrôle Elevé ( [REF] OQWD) LA Contrôle Bas ( [REF] OQWE)

Contrôle de qualité

Il est recommandé à chaque laboratoire de déterminer ses propres domaines de conance pour les contrôles et son propre domaine normal. Le LA Contrôle Elevé ( [REF] OQWD) et le LA Contrôle Bas ( [REF] OQWE) sont proposés par Sie mens pour le contrôle de qualité du Réactif de dépistage LA 1 et du Réactif de conrmation LA 2.

Résultats

Si le temps de coagulation de LA 1 est trouvé à l’intérieur du domaine normal, il n’est éventuel lement pas nécessaire d’effectuer un autre test de LA. Si le temps de coagulation de LA 1 est supérieur à 2 DS ou allongé d’environ 20 % par rapport à la valeur moyenne d’un plasma normal (idéalement n ≥ 20), le résultat doit être considéré comm e anormal, et des tests complémentaires doivent être effectués (cf. Schéma 1). Le mieux est d’exprimer le résultat nal en ratio : temps de coagulation du Réactif de dépistage LA 1/temps de coagulation du Réactif de conrmation LA 2.

Temps de coagulation du Réactif de dépistage LA 1

Ratio LA = –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

Temps de coagulation du Réactif de conrmation LA 2

Schéma 1

Chaque laboratoire doit déterminer son propre domaine normal, aussi bien pour la méthode ma nuelle que pour les méthodes avec automates, pour corriger les variations dues au prélèvement des échantillons et à l’automate utilisé.

Caractéristiques du test

Des études de précision intra et inter-laboratoires ont été effectuées, en méthode manuelle (retour nement du tube) et sur automates. Les coefcients de variation obtenus étaient inférieurs à 3,5 % pour les plasmas normaux, et inférieurs à 5 % pour les échantillons anormaux. Des études de spécicité ont été effectuées sur des échantillons plasmatiques connus. Un ratio positif entre Réactif de dépistage LA 1 et Réactif de conrmation LA 2 supérieur à 1,2 a été trouvé sur les plasmas connus suivants : Plasmas LA positifs 90 % (26/29) Plasmas héparinés 12 % (1/8) Plasmas de patients sous AVK 0 % (0/7) Plasmas avec facteur décient 0 % (0/5) Plasmas normaux 2 % (1/60) * l’identication des LA s’est faite par TCA + TCK sur plasma mélangé

Littérature Cf. texte anglais.

Edition Octobre 2008

LA 1 Reagente di screening / LA 2 Reagente di conferma LA 1 [REAGENT] / LA 2 [REAGENT]

1

Reagente semplicato per il tempo di Veleno di Vipera Russell Diluito (DRVVT) per l’identicazione degli Anticoagulanti Lupus

Test de mélange

En cas de résultat douteux, effectuer un test de mélange pour corriger l’éventuel faux résultat ob tenu et clarier la présence de LA. Pour cela, mélanger à parts égales le plasma du malade avec un plasma normal dit plasma témoin, et tester le mélange selon la procédure normale du test (comme plasma témoin, ne pas utiliser le Siemens Plasma de contrôle N). Tableau 1 : Combinaisons des tests de mélange et des tests de conrmation LA 1

LA 2

Plasma du malade N

Mélange malade + témoin N

Plasma du malade N

Mélange malade + témoin N

ABN

ABN

N

N

Diagnostic

N

ABN

N

ABN

ABN

ABN

N

ABN

ABN

ABN

ABN

Pas de mise en évidence de LA Mise en évidence Facteur décient/   AVK LA + facteur décient Autre inhibiteur

An de corriger les variations de résultats obtenus selon les réactifs et l’appareil utilisés, il est recommandé de calculer un ratio normalisé. Pour cela, utiliser les temps de coagulation moyens obtenus dans le laboratoire avec le Réactif de dépistage LA 1 et le Réactif de conrmation LA 2 sur un plasma normal. Ceci peut faciliter la différenciation entre des échantillons normaux et des échantillons faiblement positifs en LA. Ratio normalisé =

 

Il Reagente di screening LA 1 e il Reagente di conferma LA 2 sono reagenti DRVVT per l’identi cazione degli anticoagulanti lupici (LA) nei test di coagulazione ad una fase. LA 1 Reagente di screening

Reagente DRVV semplicato per lo screening degli anticoagulanti lupici. LA2 Reagente di Conferma

Reagente DRVV ricco di fosfolipidi per la correzione specica degli anticoagulanti lupici.

de LA

ABN

Uso previsto

Temps du malade avec Réactif de dépistage LA 1 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Temps moyen du témoin avec Réactif de dépistage LA 1 X Temps moyen du témoin avec Réactif de conrmation LA 2 –––––––––––––––––––––––––––––––––––– Temps du malade avec Réactif de de conrmation LA 2

Pour l’interprétation du ratio normalisé ont peut également suivre le diagramme représenté selon le schéma 1.

Limites de réalisation du test

Ne pas utiliser d’échantillons ayant déjà coagulés ou avec un hématocrite anormal. Les échan tillons hépatiques, lipémiques ou hémolytiques doivent être testés en méthode manuelle, car cer tains appareils photométriques fournissent des résultats erronés. Il n’est pas recommandé d’utiliser des plasmas de contrôle du commerce dont les concentrations en citrate et en plaquettes ne sont pas précisées. Les tests effectués dans le cadre d’études comparatives avec les Réactifs de dépistage LA 1 et de conrmation LA 2 doivent être effectués simultanément. Effectuer au moins 2 tests de dépistage basés sur des principes de test différents. Par ailleurs, effectuer un test de mélange pour vérier la présence d’un inhibiteur de la coagulation, et un test de conrmation pour vérier la sensibilité aux phospholipides 10. Les concentrations d’héparine jusqu’à 1 unité/ml n’ont pas d’inuence sur les tests, c ar aussi bien le Réactif de dépistage LA 1 que le Réactif de conrmation LA 2 contiennent un neutralisateur correspondant. Les résultats de ce test doivent toujours être interprétés en rapport avec les antécédents médicaux du patient, les signes cliniques et autres constatations.

Valeurs attendues

Signicato diagnostico

Gli anticoagulanti lupici (LA) sono degli autoanticorpi diretti contro i fosfolipidi con carica negativa o i complessi di fosfolipidi con beta-2-glicoproteina 1 o fattori della coagulazione, quali la protrombina. Essi si riscontrano in varie condizioni cliniche, specialmente nelle malattie autoimmuni . Inoltre gli LA sono da considerarsi come un fattore di rischio signicativo nei pazienti con inspiegabili trombosi e sono spesso presenti in donne con aborti ricorrenti . Normalmente gli LA vengono individuati attraverso test coagulativi sensibili ai fosfolipidi, come l’aPTT (Tempo di Tromboplastina Parziale attivato), tempo di coagulazione con caolino (KCT) e DRVVT , dove hanno un effetto anticoagulante. Il tempo di DRVV divenne popolare in seguito alla pubblicazione di Thiagarajan et al. nel 1986 6. Questo metodo è stato standardizzato e semplicato 7. Secondo Petri 8 et al., la trombosi nei pazienti SLE è maggiormente collegata agli LA identicabili con DRVVT che con gli anticorpi anti-cardioli pina identicati da test immunoenzimatico (ELISA) 5. Questa osservazione è stata recentemente spiegata da Gall e Bevers 9, i quali hanno dimostrato che il sottotipo LA con m aggiore effetto sui test DRVVT è dipendente dalla beta-2-glicoproteina, e diverso dal sottotipo LA richiedente protrombina, che ha un effetto prolungato sui test K CT. 1

5

2

Principio del metodo

1. Il veleno di vipera Russell, presente nel Reagente di screening LA 1 attiva direttamente il fattore X, provocando la coagulazione del plasma. Gli anticorpi LA allungano il tempo di coagulazione del Reagente di screening LA 1. 2. Il Reagente di conferma LA 2 è simile al Reagente di screening LA 1, ma contiene un’alta concentrazione di fosfolipidi. Questi fosfolipidi aggiuntivi agiscono conto gli anticorpi LA e cor reggono ampiamente il tempo di coagulazione 3. 3. Il test DRVV “aggira” il fattore VII del sistema estrinseco della coagulazione così come i fattori antiemolici e di contatto del sistema intrinseco. Pertanto, il Reagente di screening LA 1 è m olto più specico per gli LA del test aPTT, poiché non è inuenzato né da anomalie del fattore di contatto, né da decit del fattore VIII o anticorpi 6. Sono stati sviluppati una serie di test sulla base della correzione con fosfolipidi 4, ma nessuno è risultato così appropriato come l’impiego del Reagente di conferma LA 2 dopo il Reagente di screening LA 1. 4. E’ possibile utilizzare un test di miscelazione del plasma per escludere un decit di fattore II, V e X che provocherebbero un allungamento dei risultati del Reagente di screening LA 1 e del Reagente di conferma LA 2. Miscelando il plasma normale con il plasma in esame, si ripristinano i fattori mancanti nel plasma in esame. Se il risultato del test di miscelazione risulta ancora allungato, signica che un inibitore (come LA) è presente nel plasma in esame. Un tempo di coagulazione allungato, che non può essere corretto miscelando il plasma di paziente con plasma normale, indica la presenza di un inibitore circolante 3,10.

Reagenti Composizione

Il Reagente di screening LA 1 e il Reagente di conferma LA 2 c ontengono veleno di vipera Russell, fosfolipidi, agenti anti-eparina, calcio, tamponi, stabilizzanti, sodio azide e colorante. Avvertenze e precauzioni

Solo per uso diagnostico in-vitro . Nell’eliminare il reagente attraverso lo scarico, far scorrere molta acqua per prevenire la formazione di residui esplosivi nelle tubature di metallo.

Les échantillons de 26 sujets sains âgés de 18 à 55 ans testés en méthode manuelle ont donné un domaine normal compris entre 31 et 44 secondes avec le Réactif de dépistage LA 1, et un domaine normal compris entre 30 et 38 secondes avec le Réactif de conrmation LA 2. Le ratio LA 1/LA 2 s’étend sur un domaine compris entre 0,8 et 1,2. Ces valeurs ne sont données qu’à titre indicatif.

Preparazione del reagente

Dépistage LA1 Si le ratio –––––––––––––– est supérieur à 2,0, la présence de LA est fortement marquée Conrmation LA 2

I reagenti liolizzati, conservati a +2/+8 °C, sono stabili no alla data di scadenza indicata sull’eti chetta. I reagenti ricostituiti possono essere conservati per 8 ore a +37 °C, 24 ore a +20/+25 °C, 48 ore a +2/+8 °C e 1 mese a -20 °C.

Dépistage LA1 Si le ratio –––––––––––––– est compris entre 1,5 et 2,0, la présence de LA est moyenne Conrmation LA 2 Dépistage LA1 Si le ratio –––––––––––––– est compris entre 1,2 et 1,5, la présence de LA est faible Conrmation LA 2 OQGP G17 C0501 (799)

4

Ricostituire con la quantità d’acqua distillata indicata sull’etichetta. Mescolare bene mediante capo volgimento per assicurare una completa risospensione del materiale liolizzato. Conservazione e stabilità

Indice di instabilità / deterioramento

Se, aprendo il acone, non si osserva presenza di vuoto e/o il reagente non appare secco, deve essere restituito a Siemens Healthcare Diagnostics.

Raccolta e preparazione dei campioni

Il sangue deve essere prelevato e lavorato secondo lo standard NCCLS H21-A3: raccolta, trasporto e lavorazione dei campioni di sangue per test coagulativi e esecuzione generale dei metodi coa gulativi, linee guida approvate - 3 a edizione (1998). Il plasma separato deve essere conservato a +2/+8 °C e analizzato entro 4 ore dal prelievo. Se il campione va congelato, il plasma deve essere centrifugato una seconda volta per rimuovere le piastrine (inferiori a 10 x 10 9 /l)10, in quanto potrebbero accorciare il tempo di coagulazione del Reagente di screening LA 1.

Esecuzione del test

1. Preriscaldare a +37 ± 1 °C poco più della quantità necessaria di Reagente di screening LA 1 e/o Reagente di conferma LA 2, calcolando 200 µl per test 2. Dispensare 200 µl del plasma in esame in una provetta di vetro e riscaldare per 1 minuto a +37 °C. 3. Aggiungere 200 µl del reagente di screening preriscaldato al plasma e cronometrare il tempo, dal momento dell’aggiunta del reagente no alla conclusione della reazione di coagulazione. 4. Ripetere il test per una determinazione in doppio e riportare il valore medio dei risultati del test. Metodo automatico

Sono disponibili, su richiesta, i protocolli per gli analizzatori Siemens. I test con il Reagente di screening LA 1 ed il Reagente di conferma LA 2 devono essere eseguiti con la stessa quantità di plasma e reagente, come in molti protocolli per il tempo di trombina. Tuttavia, i tempi di lettura e interpretazione dei dati devono essere portati a 120 secondi. Materiali forniti LA 1 [REAGENT], [REF] OQGP con

10 x l 2 mL LA 1 [REAGENT], LA 1 Reagente di screening

10

Valori attesi

Con campioni di 26 individui sani di età compresa tra 18 e 55 anni e utilizz ando un metodo manua le in provetta (tilt-tube), sono stati ottenuti intervalli normali di 31 - 44 secondi per il Reagente di screening LA1 e di 30 - 38 secondi per il Reagente di conferma LA 2. La ratio LA1/LA2 oscillava tra 0,8 e 1,2. Questi risultati devono intendersi solo come riferimento Screening LA 1

Se la ratio ––––––––––––– è maggiore di 2,0: forte presenza di LA Conferma LA2 Screening LA 1

10 x l 1 mL LA 2 [REAGENT], LA2 Reagente di Conferma

Screening LA 1

Se la ratio ––––––––––––– è compresa tra 1,2 e 1,5: debole presenza di LA Conferma LA 2

Materiale necessario ma non fornito

Provette di vetro 10 mm x 75 mm Pipette da 200 µl, 1 ml, 2 ml o 5 ml Bagnomaria, cronometro Acqua depurata, USP o equivalente LA Controllo Alto ([REF] OQWD) LA Controllo Basso ([REF] OQWE)

Ogni laboratorio dovrebbe stabile il proprio intervallo normale, sia per il metodo manuale che per quello automatico, per poter bilanciare le differenze nel prelievo dei campioni e nella strumentazione.

Caratteristiche speciche del test

Controllo qualità

Ogni laboratorio dovrebbe stabilire i propri valori di accettabilità dei controlli ed un proprio intervallo normale. LA Controllo Alto ([REF] OQWD) e LA Controllo Basso ([REF] OQWE) sono distribuiti da Siemens e servono per il controllo qualità del Reagente di screening LA 1 e del Reagente di conferma LA 2. Il plasma di controllo e i campioni dei pazienti devono essere analizzati simultaneamente.

Risultati

Se il tempo di coagulazione con LA 1 rientra nell’intervallo normale, non è necessario eseguire altri test. Se il tempo di coagulazione con LA 1 è superiore a 2 DS o ca. il 20 % più lungo del valore medio del plasma normale (n ≥ 20), il risultato deve essere considerato anomalo e sottoposto a ulteriori indagini (vedere gura 1). Il risultato nale può essere espresso meglio come rapporto (ratio) tra il tempo di coagulazione del Reagente di screening LA 1 e il tempo di coagulazione del Reagente di conferma LA 2. =

Campioni che contengono coaguli e quelli con valori di ematocrito anormali devono essere elimi nati. I campioni itterici, lipemici e emolitici dovrebbero essere analizzati con tecniche manuali, in quanto alcuni strumenti fotometrici danno falsi risultati. Si raccomanda di non utilizzare i plasmi di controllo commercializzati senza indicazione della con centrazione di citrato e piastrine. Per gli studi comparativi, i test con il Reagente di screening LA 1 e il Reagente di conferma LA 2 dovrebbero essere eseguiti in simultanea. Eseguire almeno 2 test di screening basati su principi analitici differenti. Eseguire, inoltre, una prova di miscelazione del plasma per vericare la presenza di inibitore della coagulazione, e un test di conferma per documentare la dipendenza dei fosfolipidi . Concentrazioni di eparina no a 1 unità/ml non hanno alcun effetto, per la presenza di un agente neutralizzante sia nel Reagente di screening LA 1 che nel Reagente di conferma LA 2. I risultati di questo test devono essere sempre interpretati alla luce della anamnesi del paziente, della presentazione clinica e valutando contestualmente l’esito di altri accertamenti.

Se la ratio ––––––––––––– è compresa tra 1,5 e 2,0: moderata presenza di LA Conferma LA 2

LA 2 [REAGENT], [REF] OQGR con

Ratio LA

Limitazioni della esecuzione del test

Tempo di coagulazione Reagente di screening LA 1 Tempo di coagulazione Reagente di conferma LA 2

Studi di precisione intra- ed inter-laboratori sono stati realizzati tanto con il metodo manuale in provetta (tilt-tube) quanto con il metodo automatico. Questi studi hanno dato un coefciente di variazione inferiore al 3,5 % su plasma normale e inferiore al 5 % per i campioni anormali. Studi di specicità sono stati effettuati su campioni di plasma noti. Per i seguenti plasmi* e stata riscontrata una ratio positiva maggiore di 1,2, tra il Reagente di screening LA 1 e il Reagente di conferma LA 2: Plasma LA 90 % (26/29) Plasma eparinato 12 % (1/8) Plasma di paziente TAO 0 % (0/7) Plasma carente di fattore 0 % (0/5) Plasma normale 2 % (1/60) * Per questi plasmi gli LA sono stati identicati con APTT + prove di miscelazione KCT.

Bibliograa Vedi testo Inglese.

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

Figura 1 Edizione Ottobre 2008

Reactivo de screening LA 1/ Reactivo de conrmación LA 2 LA 1 [REAGENT] / LA 2 [REAGENT] Reactivo para el tiempo de veneno de víbora de Russell diluido, ("Dilute Russell’s Viper Venom Time" reagent), simplicado, para la detección del anticoagulante lúpico.

Campos de aplicación

1

El reactivo de screening LA 1 y el reactivo de conrmación LA 2 son reactivos simplicados, del reactivo DRVVT para la detección del anticoagulante lúpico (LA), en un test de coagulación de una etapa.

Test di miscelazione

Se i risultati si trovano ai limiti, è possibile eseguire prove di miscelazione del plasma per corregge re i difetti nascosti del campione e chiarir e la presenza degli LA. In questo test, da eseguire come un normale test standard, il rapporto tra campione di plasma e plasma normale dovrebbe essere 50:50 (non utilizzare il Plasma di controllo della Siemens per le prove di miscelazione del plasma). Tabella 1: Combinazione di test di miscelazione e di conferma LA 1

Plasma di paziente N ABN ABN ABN ABN

LA 2

Miscela paziente + Normale N ABN N ABN ABN

Plasma di paziente N N ABN ABN ABN

Miscela paziente + Normale N N N N ABN

Diagnosi

LA non identicati LA identicati Decit fattore/TAO LA + Decit fattore Altro inibitore

Il calcolo di una ratio normalizzata può essere utile per correggere le differenze delle varie combinazioni reagenti/strumenti. Nella normalità, si usano i tempi di coagulazione medi del plasma normale ana lizzato con il Reagente di screening LA 1 e Reagente di conferma LA 2 nel laboratorio dell’utilizzatore. Ciò può facilitare la differenziazione tra i campioni LA normali e quelli leggermente positivi.

Ratio normalizzata =

Reagente di screening LA 1 del paziente –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Tempo normale medio Reagente di screening LA 1 X

 

Tempo normale medio Reagente di conferma LA 2 Reagente di conferma LA 2 del paziente

––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

Il diagramma della gura 1 può essere utilizzato anche per interpretare le ratio normalizzate. OQGP G17 C0501 (799)

5

Reactivo de screening LA 1

Reactivo DRVV simplicado para el screening del anticoagulante lúpico. Reactivo de conrmación LA 2

Reactivo DRVV rico en fosfolípidos para la corrección especíca del anticoagulante lúpico.

Signicado diagnóstico

Los anticoagulantes lúpicos (LA) son autoanticuerpos, los cuales están dirigido contra fosfolípidos cargados negativamente o contra los complejos de fosfolípidos, ya sea con beta-2-glicoproteína 1 o con factores de la coagulación como la protrombina. Ellos aparecen en diferentes estadios clí  nicos, especialmente en enfermedades autoinmunes 1. Además, el LA es visto hoy como un factor de riesgo signicante para pacientes con diferentes trombosis inexplicables y se puede reconocer frecuentemente en mujeres con abortos repetidos 5. El LA se detecta normalmente por medio de ensayos de coagulación sensibles a los fosfolípidos, tales como, APTT (tiempo de tromboplastina parcial activado), KCT (tiempo de coagulación con caolín) y el DRVVT 2, en los cuales actúa como inhibidor de la coagulación. El test DRVVT comenzó a conocerse después de la publicación de Thiagarajan et al. en el año 19866. Este método ha sido estandarizado y simplicado 7. Según Petri et al 8. en trombosis de pacientes con lupus eritematoso sistémico, es mucho mayor la posibilidad de detectar LA con DRVVT que el anticuerpo anticardiolipina con un ensayo inmunoenzimático (ELISA) 5. Estas observaciones fueron extendidas recientemente por Galli y Bevers 9, quienes demostraron que el subtipo de LA con más efecto sobre el test DRVVT es el dependiente de la beta-2-glicoproteína 1 y se diferencia del subtipo de LA dependiente de la protrombina, el cual tiene un fuerte efecto en la prolongación del test KCT.

Principio del método

1. El veneno de víbora de Russell contenido en el reactivo de screening LA 1 desencadena la coagulación del plasma mediante la activación directa del factor X. El anticuerpo LA prolonga el tiempo de coagulación del reactivo de screening LA 1. 2. El reactivo de conrmación LA 2 es similar al reactivo de screening LA 1, pero contiene una mayor concentración de fosfolípidos. Estos fosfolípidos adici onales actúan en contra de el an ticuerpo LA y de esta manera corrigen casi completamente el tiempo de coagulación 3.

3. El test DRVVT evita (bypass) el factor VII del sistema extrínseco de la coagulación y los factores de contacto y antihemofílicos del sistema intrínseco. Por esta razón, el reactivo de screening LA 1 es más apropiado para el reconocimiento especíco de LA, que el test del TTPA, ya que no va a estar inuenciado ni por anomalías de los factores de contacto ni por deciencia en el factor VIII o anticuerpos 6. Se han desarrollado una gran serie de ensayos basados en la corrección de los fosfolípidos4, sin embargo ninguno de ellos ha sido tan apropiado para usar como el reactivo de conrmación LA 2 a continuación del reactivo de screening LA 1. 4. Para descartar una deciencia en los factores II, V o X, la cual podría prolongar los resultados del ensayo con el reactivo de s creening LA 1 y el reactivo de conrmación LA 2, puede ser de utilidad realizar ensayos con mezclas de plasmas. Mediante la mezcla de un plasma normal con un plasma test, se van a agregar al plasma test los factores faltantes. Si el test mezclado todavía produce tiempos prolongado, esto está indicando, que en el plasma test se encuentra un inhibidor (como LA). Normalmente un tiempo de coagulación prolongado, el cual tampoco se pueda corregir mediante la mezcla de plasmas de pacientes con plasmas normales, indica un inhibidor circular 3, 10.

Figura 1

Reactivos Composición

El reactivo de screening LA 1 y el reactivo de conrmación LA 2 contienen veneno de víbora de Russell, fosfolípidos, agentes anti-heparínicos, calcio, solución tampón, estabilizadores, azida sódica y colorantes. Advertencias y medidas de seguridad:

Sólo para ser utilizado en diagnósticos in-vitro . Cuando se retira la azida sódica, se debe purgar la cañería con suciente cantidad de agua, para evitar la posibilidad de formación de materiales explosivos en la tubería metálica. Preparación de los reactivos

Disolver el contenido de los frascos en la c antidad de agua dest. indicada en las etiquetas. Mezclar bien por inversión para asegurar la completa resuspensión del material liolizado. Estabilidad y almacenaje

Los reactivos liolizados almacenados a una temperatura entre +2 y +8 °C pueden ser usados, por lo menos, hasta la fecha indicada en la etiqueta. Después de la reconstitución los reactivos pueden ser almacenados 8 horas a +37 °C, 24 horas entre +20 y +25 °C, 48 horas entre +2 y +8 °C y 1 mes a -20 °C. Indicaciones de inestabilidad y deterioración

Si al abrir el frasco no es evidente la existencia de vacío y/o el reactivo no parece seco, éste se debe devolver a Siemens Healthcare Diagnostics.

Toma de las muestras y preparación

La sangre se debe tomar y procesar de acuerdo con el NCCLS-Standard H 21 - A3: Toma, trans porte y procesamiento de muestras de sangre para los test de coagulación y la ejecución general de los ensayos de la coagulación- Normas aprobadas - 3 a Edición (1998). El plasma separado debe ser almacenado entre +2 y +8 °C y usado para el test dentro de las 4 horas siguientes a la toma. Si las muestras van a ser congeladas antes de usarlas, el plasma debe ser centrifugado 2 veces antes de congelarse, para remover las plaquetas de sangre (por debajo de 10 x 10 9 /l)10, ya que estas pueden llega a acortar el tiempo de coagulación del reactivo de screening LA1.

Procedimiento

1. Pre-calentar a 37 ± 1 °C, en un tubo de ensayo que pueda contener por lo menos 200 µl por test, un poco más de la cantidad necesaria del reactivo de screening LA 1 y/o del reactivo de conrmación LA 2. 2. Agregar en un tubo de ensayo de vidrio 200 µl de plasma de paciente e incubar 1 minuto a +37 °C. 3. Añadir al plasma 200 µl del reactivo de screening LA 1 o del reactivo de conrmación LA 2, pre-calentados, y medir el tiempo desde la adición del reactivo hasta el nal de la reacción de coagulación. 4. Repetir por duplicado el test y reportar el promedio de estos como el resultado. Método automático

Los protocolos para los analizadores Siemens están disponibles a petición. Los test con el reactivo de screening LA 1 y con el reactivo de conrmación LA 2, como en la mayoría de los protocolos para el tiempo de trombina, deben efectuarse usando el mismo volumen de plasma test y de reactivo. Sin embargo, el tiempo de la toma de la medida o de valoración debe ser prolongado a 120 segundos. Contenido del envase comercial: LA 1 [REAGENT], [REF] OQGP con

10 x l 2 ml LA 1 [REAGENT], LA 1 Reagente di screening LA 2 [REAGENT], [REF] OQGR con

10 x l 1 ml LA 2 [REAGENT], LA2 Reagente di Conferma Materiales adicionales necesarios

Tubos de ensayo 10 mm x 75 mm, Pipetas de 200 µl, 1 ml, 2 ml o 5 ml. Baño de agua, Cronómetro, Agua destilada (USP o de pureza equivalente), LA control alto ( [REF] OQWD) LA control bajo ( [REF] OQWE) Control de calidad

Cada laboratorio debe establecer sus propios rango de conanza para los controles y su propio rango normal. El LA control alto ( [REF] OQWD) y el LA control bajo ( [REF] OQWE) son suministrados por Sie mens, para ser usados en el control de calidad del reactivo de screening LA 1 y del reactivo de conrmación LA 2. Las determinaciones de los plasmas de control y de las muestras de pacientes deben efectuarse al mismo tiempo.

Test de mezclas

Para corregir errores escondidos en la muestra y para aclarar l a presencia de LA en muestras con resultados limítrofe, se pueden realizar estudios de mezclas de plasmas. En estos test, los cuales van a ser realizados como los test estándar, la relación entre la muestra de plasma y el plasma normal debe ser de 50:50 (para estos estudios de mezclas de plasmas no se debe utiliz ar el plasma control N de Siemens) Tabla 1: Combinación del test de mezclas y de conrmación LA 1

Plasma de paciente N ABN ABN ABN ABN

Mezcla Paciente + normal N ABN N ABN ABN

Plasma de paciente N N ABN ABN ABN

LA 2

Diagnóstico

Mezcla Paciente + normal N N N N ABN

LA presente Factor deciente/OAT LA + factor deciente Otro inhibidor

LA no detectado

Para corregir las desviaciones en diferentes combinaciones de reactivos o de aparatos puede ser de gran utilidad calcular un radio normalizado. Para la normalización se van a tomar los valores promedios del tiempo de coagulación de plasmas normales chequeados en el laboratorio del usua rio con los reactivos de screening LA 1 y de conrmación LA 2. Esto puede facilitar la diferenciación entre muestras normales y muestras con LA positivo bajo. Radio normalizado =

Paciente reactivo de screening LA 1 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Tiempo promedio normal reactivo de screening LA 1 x Tiempo promedio normal reactivo de conrmación LA 2 ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Paciente reactivo de conrmación LA 2

Para la interpretación de los radios normalizados se puede usar también el diagrama de ujos de la Fig. 1

Limitaciones del Procedimiento Muestras que ya se encuentran coaguladas y con valores de hematócrito anormales deben ser descartadas. Muestras hepáticas, lipémicas y hemóliticas deben medirse por un método manual, ya que algunos instrumentos fotométricos producen resultados falsos. No se recomienda el uso de plasmas de control comerciales disponibles, que no presenten datos sobre la concentración de citrato y de plaquetas. Para estudios comparativos, los test con el reactivo de screening LA 1 y con el de conrmación LA 2 deben ser efectuados al mismo tiempo. Se deben realizar por lo menos 2 test de screening basados en principios diferentes. Además, se debe realizar un test de mezclas para vericar la existencia de un inhibidor de la coagulación y un test de conrmación para documentar la dependencia de fosfolípidos 10. Concentraciones de heparina hasta de 1 unidad/ml no tiene ninguna inuencia, ya que tanto el reactivo de screening LA 1 como el de conrmación LA 2 contienen los correspondientes neu tralizadores. Los resultados de esta prueba deberán interpretarse siempre de acuerdo con la historia clínica del paciente, la sintomatologia clínica y otras observaciones.

Valores esperados

Con muestras de 26 personas sanas, en edades entre 18 y 55 años y utilizando un método manual se encontró un rango normal para el reactivo de screening LA 1 de 31 - 44 segundos y para el reactivo de conrmación LA 2 de 30 - 38 segundos. El radio LA 1/LA 2 se encontró en un rango entre 0,8 y 1,2. Estos resultados deben ser tomados solamente como una guía. Screening LA1

Si el radio ––––––––––––––– es más grande que 2,0, la presencia del LA es fuerte Conrmación LA2 Screening LA1

Resultados

Si el tiempo de coagulación con LA 1 se encuentra en el rango normal, no es necesario realizar otro test para LA. Si el tiempo de coagulación con LA 1 está por encima de 2 S D o es aproximadamente 20 % más largo que el valor promedio del plasma normal (de manera ideal n ≥ 20), el resultado se debe considerar como anormal y se debe continuar investigando (ver Fig. 1). El resultado se puede expresar mejor como la relación (radio) entre el tiempo de coagulación con LA 1 y el tiempo de coagulación con LA 2. Radio LA =

1

Tiempo de coagulación del reactivo de screening LA1 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– Tiempo de coagulación del reactivo de conrmación LA 2

Si el radio ––––––––––––––– está entre 1,5 y 2,0, la presencia del LA es moderada Conrmación LA2 Screening LA1

Si el radio ––––––––––––––– está entre 1,2 y 1,5, la presencia del LA es débil Conrmación LA2 Cada laboratorio debe determinar su propio rango normal, tanto para el test manual como para los test automáticos, con el n de compensar las diferencias por la toma de muestra y por los aparatos.

Características del test

Estudios de precisión inter e intra laboratorios fueron realizados tanto manualmente (tubo tilt), como con métodos automáticos. Estos estudios dieron coecientes de variación menores al 3,5 % para plasmas normales y menores del 5 % para plasmas anormales. Los estudios de especicidad fueron realizados con muestras de plasmas conocidos. Para los siguientes plasmas conocidos* se encontró entre el reactivo de screening LA 1 y el de conrmación LA 2 un radio positivo mayor de 1,2: Plasma LA 90 % (26/29) Plasma heparinizado 12 % (1/8) Plasma de pacientes OAT 0 % (0/7) Plasma con factor deciente 0 % (0/5) Plasma normal 2 % (1/60) * Para estos plasmas la identicación del LA se hizo con estudios mixtos APTT + KCT

Literatura

Ver boletín informativo en Inglés OQGP G17 C0501 (799)

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4. Repetir o teste para determinações duplas e formar o valor médio dos resultados do teste. Método automatizado Edición Octubre 2008

Reagente de rastreio LA 1 /  Reagente de conrmação LA 2 LA 1 [REAGENT] / LA 2 [REAGENT] Reagente simplicado ”Dilute Russell’s Viper Venom Time” (DRVVT, activador de veneno de víbora) para detecção do anticoagulante lúpico

Campo de aplicação

O reagente de rastreio LA 1 e o reagente de conrmação LA 2 são reagentes DRVVT simplicados para detecção do anticoagulante lúpico (LA) em testes de coagulação de um s ó estágio.

A pedido, são disponibilizadas os protocolos de teste para os analisadores da Siemens. Tal como para a maioria dos protocolos para o tempo de trombina, os testes com o reagente de rastreio LA 1 e o reagente de conrmação LA 2 deverão ser executados utilizando os mesmos volumes de plasma de teste e reagente. Contudo, o tempo de registo e de interpretação do valor medido deverá ser ampliado em aprox. 120 segundos. Conteúdo da embalagem comercial LA 1 [REAGENT], [REF] OQGP com

10 x l 2 ml LA 1 [REAGENT], Reagente de rastreio LA 1 LA 2 [REAGENT], [REF] OQGR com

10 x l 1 ml LA 2 [REAGENT], Reagente de conrmação LA 2 Outros materiais necessários

Tubos de ensaio com 10 mm x 75 mm, Pipeta para 200 µl, 1 ml, 2 ml ou 5 ml Banho-maria, cronógrafo Água destilada (pureza USP ou similar) Controlo LA eleva do ([REF] OQWD) Controlo LA baixo ([REF] OQWE) Controlo de qualidade

Reagente DRVV rico em fosfolípidos para a correcção especíca do anticoagulante lúpico.

Cada laboratório deverá determinar os intervalos de conança próprios dos seus controlos e um intervalo normal. O controlo LA elevado ( [REF] OQWD) e o controlo LA baixo ( [REF] OQWE) são fornecidos pela Siemens para o controlo de qualidade do reagente de rastreio LA 1 e do reagente de conrmação LA 2. As determinações dos plasmas de controlo e das amostras do paciente têm de ser executadas em simultâneo.

Signicado diagnóstico

Resultados

Reagente de rastreio LA 1

Reagente simplicado DRVV para o rastreio de anticoagulante lúpico. Reagente de conrmação LA 2

O anticoagulante lúpico (LA) é constituído por autoanticorpos contra os fosfolípidos carregados negativamente ou complexos de fosfolípidos com beta-2-glicoproteína 1 ou factores de coagulação como a protrombina. Ocorre em várias situações clínicas, especialmente nas doenças autoimunes. Além disso, o LA é considerado actualmente um factor de risco signicativo para os pacientes com tromboses de etiologia desconhecida e é detectado, frequen temente, em mulheres com aborto recorrente. O LA é detectado, habitualmente, com testes de coagulação sensíveis aos fosfolípidos, como o APTT (tempo de tromboplastina parcial activado), o KCT (kaolin clotting time), e o DRVVT , onde possui um efeito inibidor da coagulação. O tempo DRVV tornou-se popular após a publicação de Thiagarajan et al. no ano de 19866. Este método foi simplicado e padronizado . Segundo Petri8 et al., nos pacientes com trombose com lúpus eritematoso sistémico a probabilidade de detectar LA com DRVVT é maior com um ensaio imunoenzimático (ELISA) para os anticorpos anticardiolipina. Esta observação foi alargada recentemente por Galli e Bevers  que mostraram que o subtipo de LA com o maior efeito sobre os testes DRVVT precisa da beta-2-glicoproteína 1 e se distingue do subtipo LA dependente da protrombina, que possui um efeito mais prolongado sobre os testes KCT. 1

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Se o tempo de coagulação LA 1 se situar no intervalo normal, eventualmente não serão neces sários mais testes de LA. Se o tempo de coagulação de LA 1 for superior a 2 SD ou aprox. 20 % mais prolongado que o valor médio do plasma normal (idealmente n ≥ 20), o resultado deverá ser considerado como anormal e a análise deverá continuar (veja a gura 1). A melhor forma de exprimir o resultado nal é a relação (ratio) entre o tempo de coagulação do reagente de rastreio LA 1 e o reagente de conrmação LA 2. tempo de coagulação do reagente de rastreio LA 1

Ratio LA = –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

tempo de coagulação do reagente de conrmação LA 2

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Figura 1

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Princípio metodológico

1. O veneno da víbora de Russel presente no reagente de rastreio LA 1 provoca a coagulação do plasma através da activação directa do factor X. Os anticorpos LA prolongam o tempo de coagulação do reagente de rastreio LA 1. 2. O reagente de conrmação LA 2 é semelhante ao reagente de rastreio LA 1, mas contém uma concentração de fosfolípidos superior. Estes fosfolípidos adicionais reagem contra o anticorpo LA corrigindo, assim, largamente, o tempo de coagulação 3. 3. O teste DRVVT ilude o factor VII do sistema extrínseco da coagulação do sangue e os factores de contacto e antihemofílicos do sistema intrínseco. Por isso, o reagente de rastreio LA 1 é mais adequado para a detecção especíca de LA do que os testes AP TT, uma vez que não é afec tado pelas anomalias do factor de contacto, nem pela deciência de factor VII ou anticorpos 6. Foi desenvolvida uma série de testes com base na correcção de fosfolípidos 4, mas nenhum se mostrou, de longe, tão adequado como a utilização do reagente de conrmação LA 2, a seguir ao reagente de rastreio LA 1. 4. Para excluir a deciência de factores II, V e X que prolongaria o resultado do teste com o reagente de rastreio LA 1 e o reagente de conrmação LA 2, também podem ser úteis testes de reposição de plasma. Misturando o plasma normal com o plasma de teste, os factores em falta são novamente aportados. Se o teste de reposição de plasma continuar a originar tempos de teste prolongados, isso indica a presença de um inibidor (como o LA) no plasma de teste. Normalmente, um tempo de coagulação prolongado que também não foi corrigido misturando o plasma do paciente com o plasma normal, indicia um inibidor circulante 3, 10. 1

Reagentes Composição

O reagente de rastreio LA 1 e o reagente de conrmação LA 2 contêm o veneno da víbora de Russell, fosfolípidos, agentes antiheparínicos, cálcio, solução tamponada, estabilizadores, azida de sódio e corantes. Advertências e medidas de precaução

Só para uso diagnóstico in-vitro . Em caso de eliminação no esgoto, lavar com água abundante para evitar a formação de substân cias explosivas nos canos de esgoto metálicos.

Teste de reposição de plasma

Para corrigir os resultados incorrectos da amostra e claricar a presença de LA, nos casos em que os resultados são duvidosos, podem ser executados testes de reposição de plasma. Nestes testes, que deverão ser executados como o teste standard normal, a relação entre a amostra de plasma e o plasma normal deverá ser de 50:50 ( para os testes de reposição de plasma não deve ser utilizado o plasma de controlo N da Siemens). Tabela 1: Combinação dos testes de reposição de plasma com os testes de conrmação LA 1

Preparação dos reagentes

Dissolver o conteúdo do frasquinho com a quantidade de água destilada indicada no rótulo. Mis turar o conteúdo agitando cuidadosamente, para garantir a ressuspensão integral do material liolizado.

Mistura patiente + normal N

Plasma do paciente N

Mistura patiente + normal N

Se os reagentes liolizados forem conservados entre + 2 e + 8 °C, são estáveis, no mínimo, até à data impressa no rótulo do frasco. Após reconstituição, os reagentes podem ser conservados durante 8 horas à temperatura de + 37 °C, 24 horas entre + 20 e + 25 °C, 48 horas entre + 2 e + 8 °C e um mês a -20 °C.

ABN ABN

ABN N

N ABN

N N

Indícios de instabilidade e caducidade

ABN

ABN

ABN

N

ABN

ABN

ABN

ABN

Estabilidade e condições de conservação

O sangue deverá ser colhido e processado em conformidade com a norma H21-A3 NCCLS sobre a colheita, o transporte e o processamento de amostras de sangue para testes de coagulação e a directiva geral aprovada para a realização de ensaios de coagulação - 3ª edição (1998). O plasma separado deverá ser conservado entre + 2 e + 8 °C e utilizado no teste num período de tempo de 4 horas após a colheita. Se as amostras tiverem de ser congeladas antes da realização do teste, antes de ser congelado, o plasma tem de ser centrifugado duas vezes, para remover as plaquetas sanguíneas (inferiores a 10 x 10 9 /l)10, já que estas, caso contrário, podem encurtar o tempo de coagulação do reagente de rastreio LA 1.

Procedimento

OQGP G17 C0501 (799)

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Detecção de LA Deciência de factor/OAT LA + deciência de factor Outro inibidor

Para compensar os desvios das diferentes combinações de reagentes ou aparelhos, pode ser útil calcular um ratio normalizado. Para a normalização são usados os tempos médios de coagulação do plasma normal testado no laboratório do utilizador com o reagente de rastreio LA 1 e o rea gente de conrmação LA 2. Isso pode facilitar a diferenciação entre as amostras LA normais e as amostras fraco-positivas. Ratio normalizado =

reagente de rastreio LA 1 paciente –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– tempo médio normal do reagente de rastreio LA 1 x

 

1. Aquecer, previamente, num tubo de ensaio com uma capacidade mínima de 200 µl por teste, um pouco mais do que a quantidade necessária de reagente de rastreio LA 1 e/ou reagente de conrmação LA 2, à temperatura de +37 °C ± 1 °C . 2. Introduzir 200 µl de plasma do paciente num tubo de ensaio de vidro e incubar durante 1 minuto a +37 °C. 3. Adicionar ao plasma os 200 µl de reagente de rastreio LA 1 ou reagente de conrmação LA 2 pré-aquecidos e medir o tempo desde a adição do reagente, até à conclusão da reacção de coagulação.

Sem detecção de LA

Se, ao abrir o frasquinho, não se constatarem sinais claros de vácuo e/ou se o reagente não tiver o aspecto de seco, deverá ser devolvido à Siemens Healthcare Diagnostics.

Colheita e preparação da amostra

Diagnóstico

LA 2

Plasma do paciente N

tempo médio normal do reagente de conrmação LA 2 –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– reagente de conrmação LA 2 do paciente

Para a interpretação dos ratios, também pode ser usado o uxograma na gura 1.

Limites de execução do teste

As amostras com coágulos já existentes e valores de hematócritos anormais devem ser rejeitadas. As amostras hepáticas, lipémicas e hemolíticas devem ser testadas com métodos manuais, já que alguns instrumentos fotométricos fornecem resultados errados.

A utilização de plasmas de controlo adquiríveis no comércio, sem indicação da concentração de citrato e de plaquetas, não é aconselhável. Em caso de análises comparativas, os testes com o reagente de rastreio LA 1 e o reagente de conrmação LA 2 devem ser executados ao mesmo tempo. Deverão ser realizados, no mínimo, 2 testes de rastreio, baseados em 2 princípios de teste dife rentes. Além disso, deverá ser executado um teste de reposição de plasma para a vericação da existência de um inibidor de coagulação e um teste de conrmação para documentar a depen dência fosfolípida 10. As concentrações de heparina até 1 unidade/ml não têm quaisquer efeitos, já que tanto o reagente de rastreio LA 1, como o reagente de conrmação LA 2 contêm neutralizadores adequados. Os resultados deste teste devem sempre ser interpretados em conjunto com o histórico médico do doente, estado clínico e outros dados de interesse.

Valores expectáveis

Com amostras de 26 pessoas saudáveis com a idade entre 18 e 55 anos, obteve-se um intervalo normal de 31 - 44 segundos para o reagente de rastreio LA 1 e um intervalo normal de 30 - 48 segundos para o reagente de conrmação LA 2, utilizando um método manual. O ratio LA 1 : LA 2 andou no intervalo entre 0,8 e 1,2. Estes resultados constituem apenas um ponto de referência. rastreio LA 1 Se a relação –––––––––––––– for superior a 2,0, a presença de LA é forte conrmação LA 2 rastreio LA 1 Se a relação –––––––––––––– se situar entre 1,5 e 2,0, a presença de LA é moderada conrmação LA 2 rastreio LA 1 Se a relação –––––––––––––– se situar entre 1,2 e 1,5, a presença de LA é fraca conrmação LA 2 Cada laboratório deverá determinar o seu intervalo normal próprio para os m étodos de teste auto máticos e manuais, para compensar as diferenças da colheita de amostras e dos aparelhos.

Características de performance do teste

Estudos de precisão intra e inter-laboratoriais foram executados com o método manual (tilt tube) e com o método automatizado. Estas análises forneceram coecientes de variação inferiores a 3,5 % nos plasmas normais e inferiores a 5 % nas amostras anormais. Os estudos de especicidade foram executados com amostras de plasma conhecido. Nos plasmas* seguintes, entre o reagente de rastreio LA 1 e o reagente de conrmação LA 2 obteve-se um ratio positivo superior a 1,2: Plasma LA 90 % (26/29) Plasma heparinizado 12 % (1/8) Plasma de pacientes OAT 0 % (0/7) Plasma com deciência de factor 0 % (0/5) Plasma normal 2 % (1/60) * Nestes plasmas, o LA foi detectado com os testes de reposição de plasma APTT+KCT.

Bibliograa

Veja o prospecto da embalagem em inglês.

Edição Outubro 2008

 © 2008 Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH. All rights reserved. OQGP G17 C0501 (799)

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