La Replicación de ADN en Escherichia Coli ( Traducido)

La replicación de ADN en Escherichia coli

BY MATTHEW MESELSON AND FRANKLIN W. STAHL GATES AND CRELLIN LABORATORIES OF CHEMISTRY, t AND NORMAN W. CHURCH LABORATORY OF CHEMICAL BIOLOGY, CALIFORNIA INSTITUTE OF TECHNOLOGY, PASADENA, CALIFORNIA

Communicated by Max Delbrick, May 14, 1958

Introduction.-Estudios de la transformación bacteriana y bacteriaphage infection indican fuertemente que el ácido desoxirribonucleico (ADN) pueden portar y transmitir tario heredi información y puede dirigir su propia replicación. Las hipótesis para el mecanismo de la replicación del ADN difieren en las predicciones que toman en relación con la distribución distribución entre moléculas de progenie de átomos derivados de moléculas parentales. Marcadores radioisotópicos se han empleado en los experimentos que influyen en la distribución de los átomos ción parentales entre moléculas de progenie en varios organismos. Nosotros anticipa que una etiqueta que imparte a la molécula de ADN una mayor densidad podría permitir un análisis de esta distribución mediante técnicas de sedimentación. Para este final, se desarrolló un método para la detección de pequeñas diferencias de densidad entre los

La figura 1. Fotografías de absorción ultravioleta mostrando sucesiva etapas en las bandas de ADN a partir de E. coli. Una alícuota de lisado bacteriano que contiene aproximadamente 108 células lisadas se centrifugó a 31.410 rpm en una solución de CsCl como s e describe en el texto. Distancia desde el eje de rotación aumenta hacia la derecha. El número al lado de cada fotografía le da el t iempo transcurrido después de llegar a 31.410 rpm.

macromoléculas. '0 Mediante el uso de este método, hemos observado la distribución del isótopo de nitrógeno pesada N15 entre moléculas de ADN tras la transferencia de un N ", la población bacteriana uniformemente 5 marcado con crecimiento exponencial a un medio de crecimiento que contiene el isótopo de nitrógeno ordinaria N'4. Densidad-centrifugación en gradiente de -. Una pequeña cantidad de ADN en una solución concentrada de cloruro de cesio se centrifugó hasta equilibrio se a cercó estrechamente. Los procesos opuestos de la sedimentación y difusión entonces han producido un gradiente de concentración estable del cloruro de cesio. Los gradientes de concentración y de presión dan lugar a un aumento continuo de la densidad a lo largo de la dirección de la fuerza centrífuga. Las macromoléculas de ADN presente en este gradiente de densidad son impulsados por el campo centrífugo en la región donde la densidad de la solución es igual a su propia densidad de flotación. ' Esta tendencia de concentración se opone por difusión, con el resultado de que en el equilibrio una sola especie de ADN se distribuye en una banda cuya anchura está inversamente relacionada con el peso molecular de la especie (fig. 1). Si varias especies de densidad diferentes de ADN están presentes, cada una formará una banda en la posición donde la densidad de la solución de CsCl es igual a la densidad de flotación de esa especie. En esta forma de ADN marcada con nitrógeno pesado (N15) puede ser

La figura. 2-a: La resolución de ADN N14 de N "1 de ADN por centrifugación de densidad-gradtient. Una mezcla de N'4 y N "1 lisados bacterianos, cada uno conteniendo aproximadamente 10" células lisadas, se centrifugó en una solución de CsCl como se describe en el texto La fotografía fue tomada después de 24 hounrs de centrifugación a 44.770 rpm b:.. Un trazado microdensitómetro que muestra la distribución de ADN en la región de las dos bandas de. Fig. 2a. La separación entre los picos corresponde a una diferencia en la densidad de flotación de 0.014 g. cm.

resuelto a partir de ADN no marcado. La Figura 2 muestra las dos bandas formadas como resultado de la centrifugación de una mezcla de c antidades aproximadamente iguales de N14 y N15-ADN coli Escherichia. En este papel referencia se hará con el peso molecular aparente de las muestras de ADN se determina por medio de gradiente de densidad de centrifugación. Una discusión se ha dado "'de las consideraciones en las que dichas determinaciones se basan, así como de varias fuentes posibles de error. Experimental.-Escherichia coli B fue aumentado a 360 C. con aireación en un medio que contiene glucosa sales de cloruro de amonio como única fuente de nitrógeno. "El crecimiento de las bacterias) la población fue seguido por el recuento de células microscópicas y por ensayos de colonias (Fig. 3). Las bacterias marcadas uniformemente con N "5 fueron preparados por células lavadas en crecimiento durante 14 generaciones (a un título de 2 X 108/ml) en medio que contiene 100, ug / ml de N'5H4Cl del 96,5 ciento de pureza isotópica por. Un cambio brusco de a continuación, se llevó a cabo medio N14 añadiendo al cultivo en crecimiento de un exceso de diez veces de N14H4Cl, junto con ribosides de adenina y uracilo en el experimento 1 y ribosides de adenina, guanina, uracilo, citosina y en el experimento 2, para dar una concentración de L 10 g / ml de cada ribósido. Durante el crecimiento posterior del título bacteriana se mantuvo entre

La figura. 3.-El crecimiento de las poblaciones bacterianas primero en N15 y N14 en el medio. Los valores de las ordenadas dan los títulos reales de los cultivos hasta el momento de la adición de N'4. A partir de entonces, durante el período en que se están retirando muestras para la densidad de gradiente de centrifugación, el título real se mantuvo entre 1 y 2 X 108 por adiciones de medio fresco. Los valores de las ordenadas durante este último período se han corregido para los retiros y adiciones. Durante el período de muestreo para la densidad de gradiente de centrifugación, el tiempo de generación era 0,81 horas en el Experimento 1 y 0,85 horas en el Experimento 2.

1 y 2 X 108/ml por adiciones apropiadas de mediano contiene ribosides N14 frescas. Las muestras que contienen alrededor de 4 X 109 bacterias se retiraron de la cultura justo antes de la adición de N14 y después a intervalos de varias generaciones. Cada muestra fue inmediatamente refrigerada y centrifugada en el frío durante 5 minutos a 1800 x g. Después de la resuspensión en 0,40 ml. de una solución fría 0,01 M en NaCl y 0,01 Min. etilendiamina tetra-acetato (EDTA) a pH 6, las células se lisaron por la adición de 0,10 ml. de 15 por ciento de dodecil-sulfato de sodio y se almacena en el frío.

La figura4-a : Fotografías de absorción ultravioleta que muestran las bandas de ADN que resultan en gradientes de densidad centrifugación de lisados de bacterias en la muestra a diversos tiempos después de la adición de un exceso de sustratos NI4 a un Ni creciente "cultura de la etiqueta. Cada  fotografía fue tomada después de 20 horas de centrifugación a 44.770 rpm en las condiciones descritas en el texto. La densidad de la Solución de CsCl aumenta hacia la derecha. Regiones de igual densidad ocupan la misma posición horizontal en cada fotografía. El tiempo de muestreo se mide desde el momento de la adición de Ni4 en unidades del tiempo de generación. Los tiempos de generación para los Experimentos 1 y 2 se estimaron a partir las mediciones de crecimiento bacteriano presentan en la figura. 3. 6 trazados micro densitómetro de la Bandas de ADN se muestran en las fotografías adyacentes. El desplazamiento de la pluma mi crodensitómetro arriba la línea de base es directamente proporcional a la concentración de ADN. El grado de etiquetado de un especies de ADN corresponde a la posición relativa de su banda de entre las bandas de

marcado totalmente y ADN no marcado se muestra en el marco más inferior, que sirve como referencia de densidad. Una prueba de la conclusión de que el ADN en la banda de densidad intermedia sólo está etiquetada medio-es proporcionada por el marco que muestra la mezcla de generaciones 0 y 1,9. Cuando se toma en cuenta la relación cantidades de ADN en los tres picos, el  pico de densidad intermedia se encuentra para ser centrado en 50 ± [2 por ciento de la distancia entre el N "y NI," picos. Para gradiente de densidad de centrifugación, 0.010 MNL. del lisado dodecil sulfato se añadió a 0,70 ml. de solución de CsCl tamponada a pH 8,5 con 0,01 M de tris (hidroximetil) aminometano. La densidad de la solución resultante fue de 1,71 g. cm.-3 Esto se centrifugó a 140.000 x g. (44.770 rpm) en un modelo Spinco E ultracentrífuga a 250 durante 20 horas, momento en el que el ADN había alcanzado esencialmente equilibrio de sedimentación. Las bandas de ADN fueron entonces encontraron en la región de densidad de 1,71 g. cm.-3, está aislado del resto de los componentes macromoleculares de lisado bacteriano. Fotografías de absorción ultravioleta tomadas durante el curso de cada centrifugación fueron escaneados con un densitómetro de grabación (Fig. 4 ). La densidad de flotación de una molécula de ADN puede esperarse que varíe directamente con la fracción de etiqueta N15 que contiene. El gradiente de densidad es constante en la región entre las bandas de ADN totalmente etiqueta y etiqueta. Por lo tanto, el grado de etiquetado de una especie parcialmente la etiqueta de ADN se puede determinar directamente a partir de la posición relativa de su banda de entre la banda de ADN totalmente marcado y la banda de ADN no marcado. El error en este procedimiento para la determinación del grado de etiquetado se estima en alrededor del 2 por ciento. Resultados -. Figura 4 muestra los resultados de la centrifugación en gradiente de densidad de lisados de bacterias en la muestra a diversos tiempos después de la adición de un exceso de sustratos N'4-que contienen a un N1 creciente "marcado cultura Se puede ver en la Figura 4. que el ADN, hasta que ha transcurrido el tiempo de generación en generación, las moléculas se acumulan halflabeled, mientras que el ADN marcado se agote completamente. Uno tiempo de generación después de la adición de N 14, éstos-media etiquetados o se observan moléculas "híbridos" por sí solo. Posteriormente, sólo la etiqueta media- y se encontró ADN completo sin etiqueta. Cuando hayan transcurrido dos tiempos de generación después de la adición de N'4, media etiqueta y sin etiqueta de ADN se encu entran presentes en cantidades iguales. . Discusión -. Estos resultados permiten las siguientes conclusiones que se pueden extraer en relación con la replicación del ADN en las condiciones del presente experimento. 1. El nitrógeno de una molécula de ADN se divide por igual entre dos subunidades que permanecen intactas a través de muchas generaciones. La observación de que los padres de nitrógeno se encuentra sólo en moléculas de medio marcado en todo momento después del paso de un tiempo de generación demuestra la existencia en cada molécula de ADN de dos subunidades que contienen cantidades iguales de nitrógeno. El hallazgo de que en la segunda generación de moléculas de media etiqueta y etiqueta son encontrado en cantidades iguales muestra que el número de sobrevivir subunidades de los padres es dos veces el número de moléculas parentales inicialmente presente. Es decir, las subunidades se conservan.

2. Followinq replicación, subunidad de los padres.

cada

molécula

hija

ha

recibido

una

El hallazgo de que todas las moléculas de ADN son el tiempo-medio marcado una generación después de la adición de N'4 muestra que cada molécula hija recibe una subunidad parental ". 4 Si las subunidades de los padres se habían separado de cualquier otro modo entre las moléculas hijas, no se habría encontrado en la primera generación de algunos totalmente etiquetados y algunas moléculas de ADN sin etiqueta, que representan a esas hijas que recibieron dos o no hay subunidades de los padres, respectivamente. 3. Los resultados acto replicativa en una duplicación molecular. Esta declaración es un corolario de conclusiones 1 y 2 anteriores, de acuerdo con whicheach molécula de los padres le transmite a la progenie de dos subunidades de moléculas y cada molécula de progenie recibe sólo una subunidad de los padres. De ello se desprende que cada uno individuales resultados acto reproductivo moleculares en una duplicación del número de moléculas que entran en ese acto. Las conclusiones anteriores se representan esquemáticamente en la figura 5.El de Watson-Crick Model.-Una estructura molecular de ADN ha sido propuesto por Watson y Crick.15 Se ha sometido a refinement'6 preliminar sin alteración de sus características principales y está apoyado por físico y estudios de química. "7 La estructura consta de dos cadenas de polinucleótidos enrolla helicoidalmente alrededor de un eje común. La base de nitrógeno (adenina, guanina, timina, o citosina) en cada nivel

La figura. recogidas en nitrógeno de subunidades.

5.-representación esquemática de las conclusiones el texto de los datos presentados en la figura. 4. El cada molécula de ADN se divide por igual entre dos Después de la duplicación, cada molécula hija recibe

uno de estos. Las subunidades duplicaciones sucesivas.

se

conservan

a

través

de

en una cadena es hidrógeno unido a la base en el mismo nivel en la otra cadena. Requisitos estructurales permiten la aparición de sólo la base de enlaces de hidrógeno pares de adenina-timina y guanina-citosina, dando como resultado una complementariedad detallada entre las dos cadenas. Esto sugirió a Watson y Crick "8 una hipótesis definida y estructuralmente plausible para la duplicación de la molécula de ADN. De acuerdo con esta idea, las dos cadenas se separan, la exposición de los sitios de enlace de hidrógeno de las bases. Entonces, de acuerdo con las restricciones de emparejamiento de bases, cada cadena sirve como plantilla para la síntesis de su complemento. Por consiguiente, cada molécula hija contiene una de las cadenas parentales emparejados con una cadena recién sintetizada (fig. 6). Los resultados del presente experimento concuerdan exactamente con las expectativas del modelo de Watson y Crick para la duplicación del ADN. Sin embargo, se debe enfatizar que no se ha demostrado que las subunidades moleculares que se encuentran en el presente experimento son cadenas de polinucleótidos individuales o incluso de que las moléculas de ADN estudiaron aquí corresponden a las moléculas de ADN individuales que poseen la estructura propuesta por Watson y Crick. Sin embargo, alguna información se ha obtenido de las moléculas y sus subunidades; que se resume a continuación.

La figura. 6 -. Ilustración del mecanismo de duplicación de ADN  propuesto por Watson y Crick. Cada molécula hija contiene una de las cadenas de los padres (negros) se combina con una cadena nueva (blanco). Al continuar la duplicación, las dos cadenas originales

matrices permanecen intactos, por lo que siempre se dos moléculas, cada una con una cadena de los padres.

encontrarán

Las moléculas de ADN derivadas de E. coli mediante lisis inducida detergente tienen una densidad de flotación en CsCl de 1,71 gm. cm-3, en la región de densidades encontrados para el ADN del bacteriófago T2 y T4, y para el ADN de ternera-timo y de esperma de salmón purificada. La solución altamente viscosa y elástica de ADN N14 se preparó a partir de un lisado de dodecil sulfato de E. coli por el método de Simmons19 seguido por desproteinización con cloroformo. La purificación adicional se llevó a cabo mediante dos ciclos de centrifugación gradiente de densidad preparativa en solución de CsCl. Este ADN bacteriano purificado era encontrado que tienen la misma densidad de flotación y el peso molecular aparente, 7 X 106, como el ADN de los lisados bacterianos (Figs. 7, 8). Es Denaturation. ha encontrado calor que el ADN de E. coli se diferencia importante a partir de ADN de esperma de salmón purificada en su comportamiento a la desnaturalización por calor. La exposición a temperaturas elevadas se conoce para provocar un colapso abrupto de la molécula de ADN nativa relativamente rígido y extendido y para poner a disposición para la titulación ácidobase de una gran fracción de los grupos funcionales que se presumen bloqueado por la formación de enlaces de hidrógeno en la estructura nativa. 19, 20, 21, 22 Rice y Doty22 han informado de que este colapso no va acompañada de una reducción en el peso molecular determinado a partir de dispersión de luz. Estos resultados han sido corroborados por gradiente de densidad de centrifugación de DNA.23 de esperma de salmón Cuando este material es

La figura. 7.-microdensitómetro trazado de una fotografía que muestra la absorción en el ultravioleta densidad óptica en la región de una banda de N14 de E. coli ADN en el equilibrio. Sobre 2 fg. de ADN purificada como se describe en el texto se centrifugó a 31.410 rpm a 250 en 7,75 molar de CsCl a pH 8,4. El gradiente de densidad es esencialmente constante en la región de la banda y es 0,057 gm./cm.4. La posición del máximo indica una densidad de flotación de 1,71 gm. cm -. 'En este trazado la densidad óptica por encima de la línea de base es directamente  proporcional a la concentración de ADN en elgiratoria celular centrífuga. La concentración de ADN en el máximo es de aproximadamente 50, g. / Ml.

La figura. 8.-El cuadrado de la anchura de la banda de la figura. 7 trazan en función del logaritmo de la concentración relativa de ADN. Las divisiones a lo largo de la abscisa par tieron intervalos de 1 mm.2. En la ausencia de heterogeneidad densidad, la pendiente en cualquier punto de una gráfica de este tipo es directamente proporcional al peso molecular promedio en peso de la ADN situado en la posición correspondiente en la banda. La linealidad de este gráfico indica monodispersidad del ADN en bandas. El valor de la pendiente corresponde a un peso molecular aparente de la sal de Cs-ADN de 9,4 X 10., correspondiente a un peso molecular de 7,1 X 10. para la sal de sodio. mantenido a 1000 durante 30 minutos, ya sea en las condiciones empleadas por Rice y Doty o en el medio de centrifugación en CsCl, se produce un aumento de la densidad de 0,014 g. cm.r3 sin cambio en el peso molecular aparente. Se obtienen los mismos resultados si el ADN de esperma de salmón se trata previamente a pH 6 con EDTA y dodecil sulfato de sodio. Junto con el aumento de la densidad, de calentamiento provoca una fuerte reducción en el tiempo requerido para la formación de la banda en el gradiente de CsCl. En el ausencia de un aumento en el peso molecular, la disminución en el tiempo de bandas debe ser ascribed10 a un aumento en el coeficiente de difusión, lo que indica una extensa colapso de la estructura nativa.

La figura. 9.-La disociación de las subunidades de ADN de E. coli a la desnaturalización por calor. Cada curva suave conecta los puntos obtenidos por microdensitometría de una fotografía de absorción ultravioleta tomada después de 20 horas de centrifugación en solución de CsCl a 44.770 rpm. La densidad de la línea de base se ha eliminado mediante sustracción. A:. Una mezcla de N1 "lisados bacterianos calentadas y no calentadas lisado climatizada único que da una banda en la posición indicada lisado no climatizada esta en este experimento, para la comparación. Calefacción ha traído consigo un aumento de la densidad de 0,016 g. cm. -3 Y una reducción de alrededor de la mitad en el peso molecular aparente de la ADN. B: lisado climatizada de bacterias N16 cultivados para una generación en medio de crecimiento N14. Antes de desnaturalización por calor, el ADN híbrido contenida en este formas de lisado sólo una banda, como puede verse en la figura. . 4 C:. Una mezcla de N14 calienta y se calienta N "lisados bacterianos La diferencia de densidad es 0,015 g cm.. Se observan La disminución en el tiempo de bandas y un aumento de la densidad cerca de la que se encuentra tras el calentamiento de ADN de esperma de salmón (fig. 9, a) cuando un lisado bacteriano que contiene N marcado uniformemente "5 o ADN N14 de E. coli se mantiene a 100 ° C . durante 30 minutos en el medio de centrifugación en CsCl, pero el peso molecular aparente Ofthe ADN bacteriano caliente se reduce a aproximadamente la mitad que el del material no calentado. ADN marcado mitad contenida en un lisado de detergente de células de E. coli N'5 cultivadas para una generación en medio N14 se calentó a 1000 C durante 30 minutos en el medio de

centrifugación en CsCl. Resultados de este tratamiento en la pérdida del material de medio marcado original y en la aparición de cantidades iguales de dos especies nuevas de densidad, cada uno con aproximadamente la mitad del peso molecular aparente inicial (fig. 9, b). La diferencia de densidad entre las dos especies es 0.015 gm. cm. -, Cerca del mínimo de la producida por el etiquetado N'6 del ADN sin calefacción. Este comportamiento sugiere que el calentamiento de la molécula híbrida produce la disociación de la subunidad NI5-que contiene de la subunidad N'4. Esta posibilidad fue probada por un examen gradiente de densidad de una mezcla de N'5 ADN climatizada y ADN N14 climatizada (fig. 9, C). La estrecha semejanza entre los productos de ADN de calentamiento híbrido (Fig. 9 B) y la mezcla de productos obtenidos a partir de calentar N14 y ADN N'5 por separado (Fig. 9, C) conduce a la conclusión de que los dos subunidades moleculares de hecho han disociado tras el calentamiento. Puesto que el peso molecular aparente de las subunidades así obtenidos se encontró que cerca de la mitad de la molécula intacta, se puede concluir también que las subunidades de la molécula de ADN que se conservan en la duplicación son estructuras individuales, continuas. El esquema para la duplicación del ADN propuesto por Delbrfick24 está gobernado por lo tanto fuera. Para recapitular, tanto de esperma de salmón y ADN de E. coli se calentó bajo condiciones similares colapso y someterse a un aumento de densidad similar, pero el ADN de salmón conserva su peso molecular inicial, mientras que el ADN bacteriano se disocia en las dos subunidades que se conservan durante la duplicación. Estos resultados permiten a dos interpretaciones diferentes. Por un lado, si suponemos que el ADN de salmón contiene subunidades análogas a las que se encuentran en el ADN de E. coli, entonces debemos suponer que las subunidades de ADN de salmón están unidos entre sí con más fuerza que los de la ADN bacteriano. Por otro lado, si se supone que las moléculas de ADN de salmón no contienen estas subunidades, entonces debemos conceder que la molécula de ADN bacteriano es una estructura más compleja de lo que es la molécula de ADN de salmón. La última interpretación cuestiona la suficiencia del modelo de ADN de Watson y Crick para explicar la distribución observada de los átomos de nitrógeno de los padres entre la progenie moléculas. Conclusion.-La estructura de ADN propuesto por Watson y Crick dio a luz una serie de propuestas sobre cómo esta molécula podría replicar. Estas propuestas hacen predicciones específicas sobre la distribución de los átomos de los padres entre las moléculas de progenie. Los resultados presentados aquí dan una respuesta detallada a la pregunta de esta distribución y al mismo tiempo dirigir nuestra atención a otros problemas cuya solución debe ser el siguiente paso en el avance hacia una completa comprensión de la base molecular de la duplicación del ADN. ¿Cuáles son las estructuras moleculares de las subunidades de ADN de E. coli que se transmiten intactas a cada molécula hija? ¿Cuál es la relación de estas subunidades entre sí en una molécula de ADN? ¿Cuál es el mecanismo de la síntesis y la disociación de las subunidades in vi vo? Resumen.-mediante centrifugación en gradiente de densidad, hemos podido observar la distribución de N'5 entre las moléculas de ADN de la bacteria después de la transferencia de un crecimiento exponencial de la población de E. coli N'5 sustituido de manera uniforme a medio N'4. Nos encontramos con que el nitrógeno de una molécula de ADN se divide en partes iguales entre dos subunidades físicamente continuos; que, después de la duplicación, cada molécula hija recibe uno de estos; y que las subunidades se conservan a través de muchas duplicaciones.