Kurkumin Merupakan Senyawa Polifenol Yang Dapat Ditemukan Pada Temulawak

Kurkumin merupakan senyawa polifenol yang dapat ditemukan pada temulawak, temugiring dan kunyit. Kurkumin (diferuloylmethane) adalah senyawa aktif yang ditemukan pada kunir, berupa polifenol dengan rumus kimia C21H20O6. Kurkumin memiliki dua bentuk tautomer: keton dan enol. Struktur keton lebih dominan dalam bentuk padat, sedangkan struktur enol ditemukan dalam bentuk cairan. Senyawa turunan kurkumindisebut kurkuminoid, yang hanya terdapat dua macam, yaitu desmetoksikurkumin dan bisdesmetoksikurkumin,

sedangkan in

vivo,

kurkumin

akan

berubah

menjadi senyawa metabolit berupa dihidrokurkumin atau tetrahidrokurkumin sebelum kemudian dikonversi menjadi senyawakonjugasi monoglukoronida (Aggarwal dan Shishodia, 2006).

Gambar 2.4 Struktur curcumin (Katsuyama et al., 2007)

Gambar 2.5 Biosintesis kurkumin dari fenialanin (Kita et. al., 2008).

Kurkumin mempunyai efek yang poten sebagai antiinflamasi, antioksidan dan antikanker. Kurkumin yang dikonsumsi secara oral mempunyai kadar yang rendah dalam plasma dan jaringan, hal ini dikarenakan absorbsi yang jelek, metabolisme yang cepat dan eliminasi sistemik yang cepat (Preetha et al., 2007). Mekanisme aksi dari kurkumin adalah dengan menginduksi apoptosis sel, mengaktivasi penghambatan nuclear factor kappa B (NFκB), serta menurunkan kadar dari sitokin proinflamasi (IL-6, IL-8, and TNFα) (Bisht et al., 2007). Studi terkini yang dilakukan oleh Song et al. (2011), kurkumin dapat menghambat proliferasi dan menginduksi apoptosis pada sel K1 (sel kanker tiroid kapiler) tergantung dosis. Dengan konsentrasi kurkumin yang meningkat, kelangsungan hidup sel menurun secara signifikan dan apoptosis terus meningkat. Pada

penelitian ini, digambarkan bahwa kurkumin memicu pembentukan ROS sangat cepat dan signifikan dalam sel K1, yang dapat segera dideteksi hanya 5 menit setelah terapi obat, menyebabkan sinyal apoptosis. Temuan ini menguatkan kesimpulan yang serupa yang diperoleh oleh Hosseinzadeh et al. (2011) yang baru-baru melaporkan bahwa curcumin meingkatkan apoptosis dengan doxorubicin melalui generasi ROS. Oleh karena itu, hasil ini mendukung hipotesis bahwa curcumin mengarah ke pembentukan yang cepat dari ROS dan ini dapat memainkan peran penting dalam induksi apoptosis pada sel K1. ROS, yang sebagian besar diproduksi di mitokondria, jika berlebihan, dapat menyebabkan serangan radikal bebas dari membran fosfolipid dan mengakibatkan hilangnya potensial membran mitokondria, yang melepaskan apoptosis-inducing faktor yang mengaktifkan jalur caspase dan menyebabkan kondensasi inti (Thayyullathil et al., 2008). Di sinilah menariknya, ROS yang dihasilkan oleh mitokondria (melalui proses fosforilasi oksidatif), ternyata menargetkan juga pada dirinya sendiri (mitokondria).

Gambar 2.6 Mekanisme antikanker kurkumin (Anonim, 2010)

Kromatografi kolom bertujuan untuk mengisolasi komponen kurkumin dari campurannya. Pada kromatogarfi kolom digunakan kolom dengan adsorben sillika gel karena kolom yang dibentuk dengan silika gel memiliki tekstur dan struktur yang lebih kompak dan teratur. Silika gel memadat dalam bentuk tetrahedral raksasa, sehingga ikatannya kuat dan rapat. Dengan demikian, adsorben silika gel mampu menghasilkan proses pemisahan yang lebih optimal.

Silica gel ada 2 macam: 1. GF245, dengan G melambangkan gypsum (CaSO4), F melambangkan floroscene, dan angka 245 menunjukkan besarnya panjang gelombang yaitu, 245 nm. Silika jenis ini sering digunakan pada kromatografi lapis tipis (TLC). 2. H, dengan tanpa adanya gypsum dan floroscene. Silika jenis ini biasa digunakan pada kromatografi kolom. Silica gel dapat membentuk ikatan hidrogen di permukaannya, karena pada permukaannya terikat gugus hidroksil. Oleh karenanya, silica gel sifatnya sangat polar. Sementara itu, fasa gerak yang digunakan (dalam percobaan ini, CH 2Cl2 : CH3OH = 99 : 1) sifatnya non-polar. Maka pada saat campuran dimasukkan, senyawasenyawa yang semakin polar akan semakin lama tertahan di fasa stasioner, dan senyawa-senyawa yang semakin tidak (kurang) polar akan terbawa keluar kolom lebih cepat. Kromatografi kolom dilihat dari jenis fasa diam dan fasa geraknya dapat dibedakan : a. Kromatografi fase normal Kromatografi dengan kolom konvensional dimana fase diamnya “normal” bersifat polar, misalnya silica gel, sedangkan fase geraknya bersifat non polar. b. Kromatografi fas terbalik Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat non polar, sedangkan fase geraknya bersifat polar; kebalikan dari fase normal. Dalam proses pemisahan dengan kromatografi kolom, adsorben silika gel harus senantiasa basah karena, jika dibiarkan kering, kolom yang terbentuk dari silika gel bisa retak, sehingga proses pemisahan zat tidak berjalan optimal. Selain itu, kondisi yang senantiasa basah berperan untuk memudahkan proses elusi (larutan melewati kolom) dalam kolom. Senyawa kurkumin dapat mengalami penurunan dengan lepasnya gugus – OCH3 dalam setiap penurunan. Kurkumin akan mengalami dua kali penurunan, dimana turunan pertamanya adalah demetoksi kurkumin dan turunan keduanya adalah bis-demetoksi kurkumin. Kurkumin akan terelusi paling akhir (berada paling bawah) karena sifatnya yang polar. Perlu diingat bahwa penurunan ini tak mungkin terjadi dengan hanya dengan melakukan kromatografi, tp ada perlakuan khususnya. Ketika senyawa kurkumin telah mengalami degradasi, akan menjadi senyawa demetoksi kurkumin (terdapat pada bagian tengah) yang lebih polar dari

kurkumin. Karena telah kehilangan sebuah gugus –OCH3. Senyawa ini merupakan turunan kedua dari senyawa kurkumin. Karena tidak lagi mengandung gugus –OCH3, maka senyawa ini merupakan senyawa yang bersifat paling polar dari antara ketiga jenis senyawa kurkumin. Dengan begitu, senyawa ini akan terelusi terlebih dahulu (berada pada lapisan yang paling atas) karena fasa diam yang digunakan (silica gel) bersifat polar. Apabila kita menggunakan kromatografi lapis tipis, dapat diperoleh dengan adanya 3 titik – titik pada pelat TLC. Hal ini menunjukkan adanya 3 komponen utama yang terkandung dalam senyawa kurkumin yang di-refluksi. Adapun 3 komponen utama tersebut adalah senyawa-senyawa kurkuminoid yaitu kurkumin (diferuloylmethane), demetoksikurkumin (hydroxycinnamoyl feruloylmethane) & bis-demetoksikurkumin (dihydroxydicinnamoyl methane). Setelah daerah dari noda yang terpisah telah dideteksi, maka perlu mengidentifikasi tiap individu dari senyawa. Metoda identifikasi yang paling mudah adalah berdasarkan pada kedudukan dari noda relatif terhadap permukaan pelarut, menggunakan harga Rf. Harga Rf merupakan parameter karakteristik kromatografi lapis tipis. Harga ini merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu senyawa pada kromatogram dan pada kondisi konstan merupakan besaran karakteristik dan reprodusibel.

INDUKSI KURKUMINOID DALAM KALUS TEMULAWAK (Curcuma xanthorrhiza, Roxb) DENGAN TEKNIK KULTUR JARINGAN Curcuminoid Induction in Temulawak (Curcuma xanthorrhiza, Roxb) Callus with Tissue Cullture Technique Yudi Rinanto1)2) dan Titik Sunarni2)Maria Monika Ani Batha3) 1). Kopertis wilayah VII, dpk. Stiper Jember 2). Fakultas Farmasi Universitas Setia Budi Surakarta 3). Mahasiswa Fakultas Farmasi Universitas Setia Budi Surakarta

Abstrak

Tanaman temulawak (Curcuma xanthorrhiza, Roxb) mengandung metabolit sekunder kurkuminoid dalam jumlah sedikit dan tersimpan didalam rimpang.Penelitian dilakukan untuk mengetahui pengaruh penambahan senyawa prekursor pembentuk kurkuminoid ke dalam media tanam dengan teknik kultur jarinan. Eksplan ditanam dalam media dasar Murashige-Skoog (MS) menggunakan berbagai konsentrasi prekursor fenilalanin dan natrium asetat masing-masing dengan konsentrasi 0 mg/l, 2 mg/l dan 4 mg/l. Analisa kurkumin dilakukan setelah terjadi pembentukan kalus selama masa inkubasi kurang lebih 8 minggu, selanjutnya dilakukan analisa kualitatif dan kuantitatif terhadap kurkuminoid. Analisa kualitatif dilakukan dengan reaksi warna dan secara KLT dengan fase diam silika gel GF254 dan larutan pengembang (fase gerak) CHCl3:etanol 96%:asam asetat glasial (94:5:1). Kromatogram yang dihasilkan diamati di bawah sinar UV 254 nm dan 366 nm, dilanjutkan dengan uji kuantitatif menggunakan KLT Densitometer. Data luas area kurkuminoid standar dibuat kurva baku dan selanjutnya berat kurkuminoid dalam kalus diperoleh dengan memasukkan ke dalam persamaan garis kurva baku kurkuminoid standar. Berdasarkan hasil percobaan disimpulkan bahwa, penambahan fenilalanin dengan konsentrasi 4 mg/l menghasilkan kadar kurkuminoid kalus temulawak yang paling baik yaitu kurkumin 0,8861% dan desmetoksikurkumin 0,3307%, sedangkan natrium asetat 2 mg/l paling baik untuk menginduksi pembentukan kurkuminoid kalus temulawak dengan kadar kurkumin 0,7514% dan desmetoksikurkumin 0,3898%. Kadar tersebut relatif tinggi jika dibandingkan dengan kadar kalus pada media tanpa prekursor maupun tunas asal. Kata kunci : temulawak, kalus, kurkuminoid, fenilalanin, natrium asetat. Abstract Temulawak (Curcuma xanhtorrhiza Roxb) is plant produce curcuminoid as secondary metabolite and accumulated in rhizome . The experiment was done to know precursor ability to curcuminoid induction in temulawak callus using tissue culture technique. The explants was planted in Murashige Skoog (MS) medium using various concentrations of phenylalanine and sodium acetate as precursor with concentration 0 mg/l, 2 mg/l, 4 mg/l and 2 mg/l and 4 mg/l respectively.

Analysis of curcuminoid was done after callus formation and after 8 weeks incubation. The qualitative analysis was done by color reaction and by TLC (Tine Layer Chromatography) with silica gel GF254 as stationary phase and CHCl3 : ethanol 96% : glacial acetic acid (94:5:1) as mobile phase. Chromatogram was observed under UV lamp 254 nm and 366 nm, continued by quantitative analysis using Densitometer TLC to compared between the area of standard curcuminoid with the area of callus, bud and temulawak rhizome. Base on the result of the experiment, it was concluded that addition 4 mg/l phenylalanine yielded the best curcuminoid content that were curcumin 0.8861% and desmethoxycurcumin 0.3307%. While the best sodium acetate concentration to induce curcuminoid performing in callus was 2 mg/l with curcumin and desmethoxycurcumin content 0.7514% , 0.3898% respectively. Keywords: Temulawak (Curcuma xanhtorrhiza Roxb),callus, curcuminoid, precursor, phenylalanine, sodium acetate. Pendahuluan Tanaman temulawak (Curcuma xanthorrhiza, Roxb) merupakan salah satu tanaman yang mengandung kurkuminoid. Tanaman ini adalah tanaman asli Indonesia dan termasuk salah satu jenis temu-temuan yang paling banyak digunakan sebagai obat-obatan (Indrayanto, 1987), bahan pangan, pewarna, bahan baku industri (kosmetika), maupun dibuat makanan / minuman segar (Dalimartha, 2000). Rimpang temulawak mengandung fraksi pati, kurkuminoid, dan minyak atsiri (3-12%) (Rukmana, 1995). Fraksi kurkuminoid terdiri dari kurkumin dan desmetoksi kurkumin (Afifah dkk, 2005;Dalimartha, 2000). Kurkuminoid termasuk salah satu senyawa metabolit sekunder yang memiliki aktifitas biologi sebagai antihepatotoksik, antiinflamasi dan antioksidan (Tonnesen, 1986). Kebanyakan metabolit sekunder termasuk kurkuminoid diperoleh secara komersial dengan mengisolasi dari tanaman (Cahyono, 1998). Produksi senyawa metabolit sekunder dengan teknik kultur jaringan tanaman sangat dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain genetik dan media tumbuh (Strett, 1977; Untung dan Fatimah, 2003). Penambahan zat pengatur tumbuh ke dalam media tumbuh juga diperlukan (Hendaryono dan Wijayani, 1994; Untung dan Fatimah, 2003). Auksin dikenal sebagai hormon yang mampu berperan menginduksi terjadinya kalus (Tomes dkk, 1982; Untung dan Fatimah, 2003).

Prekursor adalah senyawa yang berperan penting dalam biosintesis metabolit sekunder yaitu dengan merangsang pembentukan metabolit sekunder di dalam tanaman. Fenilalanin dan natrium asetat berperan sebagai prekursor dari kurkuminoid, dimana aktivitas keduanya merupakan tahap penentu untuk sintesa kurkuminoid. Metabolit sekunder di dalam tanaman hanya terdapat dalam jumlah yang kecil, oleh karena itu pembentukan metabolit sekunder perlu dirangsang dengan penambahan prekursor ke dalam media kultur. Berdasarkan hal tersebut di atas maka perlu dilakukan penelitian dengan tujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian prekursor terhadap pembentukan kurkuminoid dalam kalus temulawak yang ditumbuhkan pada media dasar MS. Bahan dan Metode 2.1. Bahan 2.1.1.Bahan tanaman. Eksplan yang digunakan adalah bagian pangkal dan tengah dari tunas yang tumbuh pada rimpang tanaman temulawak (Curcuma xanthorrhiza, Roxb). 2.1.2.Media Tumbuh. Media dasar yang digunakan adalah Murashige Skoog (MS) dengan penambahan zat pengatur tumbuh Naftalen Asam Asetat (NAA) dan Furfuril Amino Purin (FAP) dengan konsentrasi yang sama (3:3 mg/l). Prekursor fenilalanin (F) dan natrium asetat (N) diberikan dalam jumlah berturut-turut 0 mg/l, 2 mg/l dan 4 mg/l. 2.1.3.Bahan kimia untuk sterilisasi antara lain Dithane 430F, alkohol 70%, Bayclin® (Na hipoklorit), detergent, Tween 80 dan aquadest steril. 2.1.4.Bahan kimia untuk analisa kurkuminoid secara KLT (kromatografi lapis tipis) antara lain metanol, etanol 96%, kloroform, asam asetat glasial, heksana, etil asetat, pelat silika gel GF254 dan kurkuminoid standart. Bahan untuk analisa dengan reaksi warna adalah larutan NaOH 5% dan pereaksi asam sulfat pekat: alkohol 95% (1:1). 2.2.Alat Alat yang digunakan meliputi antara lain botol kultur dan alat-alat gelas, pipet tetes, syringe, indikator pH stick, aluminium foil. Autoklaf pinset,

skalpel, cawan petri, LAF, dan cawan petri, UV iluminator, KLT densitometer (TLC Scanner CS-930). 2.3.Pengamatan : Pengamatan dilakukan terhadap beberapa parameter antara lain : 3.1.Waktu eksplan membentuk kalus, dilakukan dengan cara mencatat pada hari ke berapa setiap eksplan yang dikulturkan mulai membentuk kalus. 3.2.Prosentase keberhasilan pertumbuhan kalus, dilakukan dengan cara menghitung jumlah eksplan yang berhasil membentuk kalus dibagi dengan jumlah seluruh eksplan yang ditanam. 3.3.Pemanenan kalus dilakukan setelah kalus yang terbentuk siap untuk dipanen, ditunjukkan dengan eksplan yang telah ditumbuhi kalus secara menyeluruh. 2.4.Analisa kurkuminoid Pembuatan larutan cuplikan dilakukan terhadap kalus, tunas dan rimpang temulawak dengan cara kalus, tunas dan rimpang temulawak dikeringkan dalam oven pada suhu kurang lebih 50ºC, kemudian ditumbuk sampai menjadi serbuk halus. Serbuk kering ditambah metanol (p.a) dengan perbandingan 1:10 (b/v), digojok dengan alat bantu shaker pada kecepatan 80 rpm selama 24 jam, dilakukan berulang sampai hasil saringan menjadi tidak berwarna. Filtrat yang dihasilkan dikumpulkan dan diuapkan metanolnya sehingga diperoleh ekstrak kering disebut sebagai ekstrak metanolik. Ekstrak metanolik yang diperoleh lalu ditimbang dan dilarutkan dengan 10 ml metanol (p.a) Serbuk kurkuminoid standart ditimbang sebanyak 50 mg kemudian ditambah metanol (p.a) ke dalam labu takar 10 ml sehingga diperoleh kurkuminoid standart 5000 mg/l, larutan dipipet sebanyak 1 ml ditambah metanol (p.a) ke dalam labu takar 100 ml hingga didapat larutan stok 50 mg/l. 2.5.Analisa kualitatif Uji pendahuluan dilakukan dengan menggunakan reaksi warna. Ekstrak ditambah dengan NaOH 5% dan pereaksi asam sulfat pekat : alkohol 95% adanya kurkuminoid ditunjukkan dengan warna merah dan merah jingga (Wagner, 1985).

Pelat yang digunakan adalah silika gel GF254(fase diam). Larutan kurkuminoid standart, ekstrak kalus, tunas dan rimpang temulawak ditotolkan masing-masing sebanyak 1 µl pada pelat dengan menggunakan mikropipet pada jarak 1,5 cm dari bawah, samping kiri dan kanan pelat. Jarak antar totolan adalah 1,5 cm. Selama penotolan, noda pada pelat dikeringkan dengan cara diangin-anginkanperlahan-lahan, selanjutnya pelat dikembangkan dalam bejana kromatografi yang jenuh dengan larutan pengembang kloroform : etanol 96% : asam asetat glasial (94:5:1) sebagai fase gerak (Wagner dkk, 1984). Pengembangan juga dilakukan pada larutan pengembang lain yaitu etanol 96% : CHCl3(7:3) dan heksana : etil asetat (1:1) (Wagner dkk, 1984). Pelat dibiarkan agar totolan bergerak mengikuti gerak larutan pengembang. Pengembangan dihentikan setelah mencapai jarak pengembang 7,5 cm. Pelat diamati di bawah sinar UV 254 nm dan bercak diidentifikasi dengan membandingkan warna dan nilai hRf bercak kalus, tunas dan rimpang temulawak dengan hRf kurkuminoid pembanding. Larutan pengembang dengan pemisahan terbaik selanjutnya digunakan untuk identifikasi semua kalus. 2.6.Analisa kuantitatif Kurva baku kurkuminoid dibuat dari larutan standart dengan konsentrasi 50 mg/l yang ditotolkan sebanyak 1, 2, 4, 8, 16 µl pada fase diam silika gel GF254, kemudian dikembangkan dalam larutan pengembang yang mampu memberikan pemisahan terbaik pada tahap identifikasi kualitatif. Bercak dideteksi dengan KLT densitometer dan hasil deteksi (luas area) dan berat (µg) per µl penotolan dimasukkan ke dalam persamaan regresi linier kurva baku. Penetapan kadar kurkuminoid dalam ekstrak kalus dilakukan dengan menotolkan larutan uji 16 µl kemudian dikembangkan dengan larutan pengembang yang memberikan pemisahan terbaik pada tahap uji kualitatif. Bercak dideteksi dengan alat KLT densitometer. Luas area dari hasil deteksi dimasukkan ke dalam persamaan regresi linier kurva baku kurkuminoid. Kromatografi larutan uji dilakukan 3 kali replikasi dengan menggunakan fase diam dan larutan pengembang (fase gerak) yang sama. Hasil dan Pembahasan Eksplan temulawak banyak mengandung senyawa fenol, sehingga diperlukan optimalisasi metode strerilisasi yang optimal. Cara sterilisasi yang memberikan hasil terbaik dilakukan dengan perendalam dalam bahan-bahan sebagai berikut : Detergen ( 5 menit), aquadest steril (10 menit), Dithane 430F (30 menit), Bayclin 30 %dan tween 80(10 menit), Bayclin 15 %dan tween 80 (5 menit) dan alkohol 70 % (1 menit).

Prosentase keberhasilan pertumbuhan kalus

Penentuan prosentase keberhasilan dilakukan dengan menghitung jumlah eksplan yang berhasil membentuk kalus dibagi dengan jumlah keseluruhan eksplan yang ditanam dikalikan 100%.Prosentase keberhasilan kultur tunas rimpang temulawak ditunjukkan pada tabel 1. Tabel 1. Pengaruh Penambahan Prekursor ke Dalam Media Tumbuh Terhadap Prosentase pertumbuhan kalus temulawak (%). Jenis Perlakuan

Pertumbuhan kalus

(Pemberian Prekursor)

(%)

1

Kontrol (Tanpa Prekursor)

60

2.

FA2NA0 FA4NA0 FA0NA2 FA2NA2 FA4NA2 FA0NA4 FA2NA4 FA4NA4

60

No.

3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

60 40 80 40 80 80 80

Keterangan: (berlaku untuk tabel yang lain) MS0 : Medium MS tanpa penambahan hormon dan prekursor FA2NA0 : Medium MS dengan penambahan fenilalanin 2 mg/l dan natrium asetat 0 mg/l FA4NA0 : Medium MS dengan penambahan fenilalanin 4 mg/l dan natrium asetat 0 mg/l FA0NA2 : Medium MS dengan penambahan fenilalanin 0 mg/l dan natrium asetat 2 mg/l FA2NA2 : Medium MS dengan penambahan fenilalanin 2 mg/l dan natrium asetat 2 mg/l FA4NA2 : Medium MS dengan penambahan fenilalanin 4 mg/l dan natrium asetat 2 mg/l FA0NA4 : Medium MS dengan penambahan fenilalanin 0 mg/l dan natrium asetat 4 mg/l

FA2NA4 : Medium MS dengan penambahan fenilalanin 2 mg/l dan natrium asetat 4 mg/l FA4NA4 : Medium MS dengan penambahan fenilalanin 4 mg/l dan natrium asetat 4 mg/l Pertumbuhan eksplan yang baik ditandai dengan tidak terjadinya browning, tidak terkontaminasi jamur ataupun bakteri baik pada eksplan maupun pada medium. Prosentase keberhasilan pertumbuhan kalus temulawak tidak dipengaruhi oleh perlakuan pemberian prekursor. Hal ini terlihat pada tabel 1 bahwa media MS tanpa penambahan prekursor (kontrol) menghasilkan prosentase kerberhasilan pertumbuhan kalus yang hampir sama dengan media dengan penambahan prekursor. Bahkan media MS tanpa penambahan prekursor memberikan prosen keberhasilan lebih baik jika dibandingkan dengan penambahan FA0NA2 dan FA4NA2. Waktu eksplan membentuk kalus

Pembentukan kalus diawali oleh terbentuknya masa bergerombol berwarna bening disekitar daerah irisan pada eksplan. Waktu pembentukan kalus ditunjukkan pada tabel 2. Tabel 2.Pengaruh Penambahan Prekursor ke Dalam Media Tumbuh Terhadap Waktu Pembentukan Kalus (hari) No.

Jenis Perlakuan (Pemberian Prekursor)

Waktu Pembentukan kalus (hari)

1

Kontrol (Tanpa Prekursor)

28,5

2.

FA2NA0 FA4NA0 FA0NA2 FA2NA2 FA4NA2 FA0NA4 FA2NA4 FA4NA4

26,2

3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

26,4 25,8 24,9 25,1 26,5 26,0 26,0

Pada tabel 2 terlihat bahwa pemberian prekursor cenderung mempercepat waktu induksi kalus dibanding kontrol (MS0). Pemberian prekursor FA2NA2 menghasilkan pengaruh terhadap waktu pembentukan kalus temulawak tercepat (24,9 hari).

Pemanenan kalus Pemanenan dilakukan setelah kalus siap untuk dipanen yang ditandai oleh terbentuknya masa berwarna bening transparan yang bergerombol di sekitar eksplan secara penuh. Pemanenan kalus pada penelitian ini dilakukan setelah kalus berumur kurang lebih 8 minggu. Hasil penimbangan kalus dapat dilihat pada tabel 3.

Tabel 3. Hasil penimbangan kalus Berat kalus ( gram ) Basah Kering

Jenis perlakuan MS0

3,980

0,343

FA 0 mg/l dan NA 0 mg/l

0,972

0,096

FA 2 mg/l dan NA 0 mg/l

1,090

0,107

FA 4 mg/l dan NA 0 mg/l

0,720

0,067

FA 0 mg/l dan NA 2 mg/l

0,550

0,053

FA 2 mg/l dan NA 2 mg/l

1,680

0,164

FA 4 mg/l dan NA 2 mg/l

0,230

0,023

FA 0 mg/l dan NA 4 mg/l

1,650

0,163

FA 2 mg/l dan NA 4 mg/l

1,830

0,180

FA 4 mg/l dan NA 4 mg/l

1,890

0,191

Pemberian prekursor berpengaruh terhadap berat basah kalus. Kalus pada medium tanpa penambahan prekursor (MS0) mempunyai berat yang lebih besar dibandingkan dengan kalus pada medium lainnya. Berat terkecil terjadi pada kalus yang ditanam di medium dengan penambahan fenilalanin 4 mg/l dan natrium asetat 2 mg/l. Analisa kualitatif kurkuminoid Uji pendahuluan dilakukan untuk memastikan kandungan kurkuminoid pada rimpang, tunas, dan kalus temulawak yang diperoleh. Semua kalus yang diperoleh pada tabel 3 diektraksi dengan methanol (MeOH). Hal serupa dilakukan juga terhadap rimpang dan tunas temulawak dengan data penimbangan seperti terlihat pada tabel 4. Tabel 4. Hasil penimbangan rimpang dan tunas temulawak Macam

Berat (gram) Basah Kering

RA

20,132

1,400

TA

10,616

1,400

Keterangan : RA : Rimpang temulawak TA :Tunas rimpang temulawak Analisa kadar kurkuminoid dalam tunas dan rimpang temulawak diperlukan untuk membandingkan kadar kurkuminoid yang terkandung dalam kalus. Semua bahan pada tabel 3 dan 4 diekstrakdengan MeOH. Uji kualitatif dilakukan melalui reaksi warna dan KLT. Hasil uji reaksi warna senyawa kurkuminoid pada ekstrak kalus, tunas dan rimpang temulawak. Berdasarkan reaksi warna menunjukkan bahwa di dalam tunas, rimpang dan semua kalus temulawak yang diteliti mengandung kurkuminoid (Data tidak ditampilkan). Analisa secara KLT dilakukan terhadap semua kalus yang mempunyai pertumbuhan dan hasil yang maksimal. Langkah awal KLT dilakukan terhadap kurva standar, satu jenis kalus, rimpang dan tunas temulawak dengan menggunakan fase diam silika gel GF254 dan dikembangkan dengan 3 jenis larutan pengembang yaitu: 1. CHCl3 : etanol 96% : asam asetat glasial (94:5:1), 2. Etanol 96% : CHCl3 (7:3), dan 3. Heksana : etil asetat (1:1). Penggunaan 3 larutan pengembang yang berbeda ini dimaksudkan untuk mempertegas hasil identifikasi. Kromatogram hasil KLT terlihat pada gambar 1.

hRf

(a)

(b)

larutan pengembang a, b, dan c

Gambar 1. Kromatog (c) ram pada fase diam silika gel GF254 dengan

Keterangan :

S : Ekstrak kurkuminoid standart K : Ekstrak kalus rimpang temulawak TA : Ekstrak tunas temulawak RA : Ekstrak rimpang temulawak (a) : Larutan pengembang CHCl3 : etanol 96% : asam asetat glasial (94:5:1) (b) : Larutan pengembang etanol 96% : CHCl3 (7:3) (c) : Larutan pengembang heksana : etil asetat (1:1) B1 : Bercak I (Kurkumin) B2 : Bercak II (Desmetoksikurkumin) B3 : Bercak III (Bisdesmetoksikurkumin) Profil kromatogram pada gambar 1 menunjukkan hasil pemisahan ketiga jenis larutan pengembang. Pemisahan paling baik ditunjukkan oleh larutan pengembang (1) CHCl3 : etanol 96% : asam asetat glasial (94:5:1) karena larutan pengembang ini mampu memisahkan komponen-komponen kurkuminoid. Bercak kurkuminoid standart memperlihatkan pemisahan yang menghasilkan 3 bercak karena komponen kurkuminoid standart yang digunakan terdiri atas kurkumin, desmetoksikurkumin dan bisdesmetoksikurkumin. Pemisahan bercak pada kalus, tunas dan rimpang temulawak hanya menghasilkan 2 bercak yang menunjukkan komponen kurkumin dan desmetoksikurkumin. Kromatogram pada larutan pengembang etanol 96% : CHCl3 (7:3) dan larutan pengembang heksana : etil asetat (1:1) tidak menunjukkan pemisahan komponen-komponen kurkuminoid karena hanya menghasilkan 1 bercak. Hasil pemisahan menunjukkan adanya kurkuminoid dalam kalus, tunas dan rimpang temulawak, karena memiliki nilai hRf yang sama dengan nilai hRf kurkuminoid standart (Data tidak ditampilkan). Berdasarkan sifat kepolaran komponen-komponen kurkuminoid pada larutan pengembang CHCl3 : etanol 96% : asam asetat glasial (94:5:1) menunjukkan bahwa bercak yang muncul pada hRf 50 merupakan

desmetoksi kurkumin dan bercak yang muncul pada hRf 60 merupakan kurkumin. Bercak bisdesmetoksikurkumin pada kurkuminoid standart muncul pada hRf 40 dan tidak terdapat pada kalus, tunas, dan rimpang temulawak. Hal ini sesuai dengan yang dilaporkan oleh Stahl (1985) bahwa kurkuminoid pada kalus dan rimpang temulawak hanya mengandung kurkumin dan desmetoksikurkumin. Analisa selanjutnya dilakukan terhadap seluruh kalus menggunakan larutan pengembang CHCl3 : etanol 96% : asam asetat glasial (94:5:1) yang menunjukkan hasil pemisahan paling baik.

Gambar 2. Kromatogram ekstrak kalus, tunas dan rimpang temulawak pada fase diam silika gel GF254 dengan larutan pengembang CHCl3 : etanol 96%: asam asetat glasial (94:5:1) Keterangan :B1 : Bercak (Desmetoksikurkumin)

1

(Kurkumin)

B2

:

Bercak

2

Penegasan selanjutnya ditunjukkan oleh data KLT pada fase diam silika gel GF254 dengan larutan pengembang CHCl3 : etanol 96% : asam asetat glasial (94:5:1) di bawah sinar UV 254 nm dan 366 nm. Hasil pengujian menunjukkan seluruh sampel dengan volume penotolan 16 µl menghasilkan warna bercak dan nilai hRF yang sama dengan standart kurkuminoid, yaitu warna bercak kuning secara visual, kuning kecoklatan pada UV 254 nm dan coklat pada UV 366 nm. (Data tidak ditampilkan) Hasil pengujian menunjukkan bahwa semua kalus yang diperiksa mengandung senyawa kurkuminoid seperti pada tunas dan rimpang temulawak, hal ini terlihat dari warna bercak yang sama dengan standart kurkuminid baik warna bercak maupun nilai hRf.

Profil kromatogram ketiga replikasi menghasilkan 2 bercak (gambar 2) meskipun nilai hRf sedikit berbeda, sehingga berdasarkan hasil identifikasi awal (gambar 1) bercak 1 adalah kurkumin dan bercak 2 adalah desmetoksikurkumin (Stahl, 1985). Analisa kuantitatif kurkuminoid Larutan kurkuminoid standart sebanyak 1, 2, 4, 8, dan 16 µl ditotolkan pada pelat silika gel GF254sebagai kurva baku dan dikembangkan dalam larutan pengembang CHCl3 : etanol 96% : asam asetat glasial (94:5:1). Pengembangan dihentikan setelah terjadi pemisahan sempurna. Profil kromatogram seperti pada gambar 3.

Gambar 3. Kromatogram kurkuminoid standart pada fase diam silika gel GF254 dengan larutan pengembang CHCl3 : etanol 96% : asam asetat glasial (94:5:1) Keterangan : (Berlaku untuk tabel yang lain) SA : Larutan kurkuminoid standart volume bercak 1 µ SB : Larutan kurkuminoid standart volume bercak 2 µl SC : Larutan kurkuminoid standart volume bercak 4 µl SD : Larutan kurkuminoid standart volume bercak 8 µl SE : Larutan kurkuminoid standart volume bercak 16 µl B1 : Bercak 1 (Kurkumin)

B2 : Bercak 2 (Desmetoksikurkumin) B3 : Bercak 3 (Bisdesmetoksikurkumin) Pada gambar 3 menunjukkan ada 3 bercak yang merupakan komponenkomponen kurkuminoid standart yang terdiri atas kurkumin (bercak 1, hRf 90), desmetoksikurkumin (bercak 2, hRf 60) dan bisdesmetoksikurkumin (bercak 3, hRf 40). Penentuan kadar kurkuminoid pada pelat KLT, didahului dengan penentuan panjang gelombang maksimum kurkuminoid. Hasil yang didapat menunjukkan panjang gelombang maksimum kurkuminoid adalah 368 nm. Luas area dan kadar tiap penotolan dari bercak kurkuminoid standart digunakan untuk membuat persamaan regresi linier.Hasil perhitungan persamaan regresi adalah sebagai berikut : 1. Ulangan I : Y = 563,58 + 1835,77 X 2. Ulangan II: Y = 520,99 + 1592,26 X Persamaan regresi linier yang diperoleh digunakan untuk menentukan kadar kurkuminoid kalus, tunas dan rimpang temulawak dengan memasukkan nilai luas area yang diperoleh ke dalam persamaan garis. Stahl (1985) mengatakan bahwa kurkuminoid kalus dan rimpang temulawak menghasilkan 2 bercak pada kromatogram, sedangkan kurkuminoid standart yang digunakan menghasilkan 3 bercak. Berdasarkan hal tersebut persamaan regresi linier yang digunakan untuk perhitungan hanya persamaan yang diperoleh dari hasil deteksi luas area pada bercak 1 dan 2. Penetapan kadar kurkuminoid kalus temulawak.

Kadar kurkuminoid dihitung terhadap ekstrak kering dan kalus kering. Hasil perhitungan kadar (%) kurkuminoid dapat dilihat pada grafik 3 dan 4.

Grafik 1. Hubung an antara pemberian prekursor ke dalam media terhadap kadar kurkuminoi d ekstrak kalus segar.

Grafik 2. Hubung an antara pemberian prekursor ke dalam media terhadap Kadar kurkuminoi d kalus kering Hasil penelitian menunjukkan bahwa dalam waktu 8 minggu terhitung dari hari pertama pembentukan kalus, eksplan dengan penambahan prekursor dalam berbagai konsentrasi, menghasilkan kurkuminoid dalam ekstrak dan kalus dengan kadar yang berbeda dari kadar kurkuminoid tunas tanaman asalnya. Grafik 1 dan 2 terlihat bahwa kandungan kurkumin lebih besar jika dibandingkan kandungan desmetoksikurkumin baik pada kalus, tunas dan rimpang untuk semua kombinasi perlakuan, kecuali perlakuan FA2 NA4.

Kalus dalam media MS0 memiliki berat yang paling besar daripada perlakuan lainnya tetapi kadar kurkuminoidnya paling kecil. Berat kalus mencerminkan kualitas pertumbuhan. Metabolit terbanyak yang dialokasikan untuk pertumbuhan berasal dari metabolisme primer. Kalus dengan berat yang lebih besar menunjukkan akumulasi metabolit primer yang lebih banyak tetapi kandungan metabolit sekundernya lebih sedikit. Hal ini dikarenakan hasil metabolisme sel lebih diutamakan ke arah sintesa metabolit primer. Kadar kurkuminoid rimpang temulawak (RA) lebih tinggi daripada kurkuminoid tunas temulawak (TA) karena rimpang temulawak sudah mengalami pertumbuhan yang maksimal sehingga sintesis kurkuminoid rimpang temulawak telah maksimal, sedangkan tunas temulawak baru mengalami awal pertumbuhan sehingga kurkuminoid yang disintesis masih dalam jumlah yang kecil. Kadar kurkuminoid ekstrak lebih besar dibanding kadar kurkuminoid rimpang, tunas dan kalus temulawak. Hal ini menunjukkan bahwa kadar kurkuminoid ekstrak tidak sama dengan kadar kurkuminoid tunas, rimpang dan kalus temulawak. Hasil penelitian menunjukkan bahwa penambahan fenilalanin ke dalam medium tanpa penambahan natrium asetat mampu menginduksi sintesis kurkuminoid. Meskipun kadar kurkuminoid yang dihasilkan lebih sedikit, ternyata penambahan natrium asetat tanpa fenilalanin juga mampu meningkatkan kadar kurkuminoid temulawak. Sedangkan natrium asetat berpengaruh terhadap sintesa desmetoksikurkumin. Penambahan fenilalanin dan natrium asetat sebagai prekursor secara bersama-sama mampu menginduksi sintesis kurkuminoid kalus temulawak. BAB V. KESIMPULAN Berdasarkan hasil penelitian dan pembahasan dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut: 1. Penambahan fenilalanin dan natrium asetat dengan berbagai konsentrasi ke dalam medium MS mampu menginduksi sintesa kurkuminoid dalam kalus temulawak. 2. Penambahan fenilalanin sebanyak 4 mg/l ke dalam media tumbuh mampu menghasilkan kurkumin terbanyak yaitu 0,8861% dan desmetoksikurkumin 0,3307%, sedangkan penambahan natrium asetat 2 mg/l ke dalam media tumbuh menghasilkan kadar kurkumin sebanyak 0,7514% dan desmetoksikurkumin 0,3898%.

3. Fenilalanin berpengaruh terhadap sintesa kurkumin, sedangkan natrium asetat berpengaruh terhadap sintesa desmetoksikurkumin.

DAFTAR PUSTAKA Afifah, E., 2003, Khasiat dan Manfaat Temulawak: Rimpang Penyembuh Aneka Penyakit, Agro Media Pustaka, Jakarta, 7-13. Andria, A., 2000, Minyak Atsiri Tumbuhan Tropika Indonesia, ITB, Bandung. Backer, C.A., 1968, Flora of Java, N.V.P Noordorf, Groningen, Netherland. Cahyono, B., 1998, Tembakau Budidaya dan Analisis Usaha Tani, Kanisius, Yogyakarta. Dalimartha, S., 2000, Atlas Tumbuhan ObatIndonesia, Jilid II, Trubus Agri Widya, Jakarta, 182-186. Dodds, J.H., dan Robert, L.W., 1982, Experiment Culture, Cambridge University Press,London.

in

Plant

Tissue

Gamborg, O.L., dan Shyluk, J.P., 1981, Nutrition and Media Characteristics of Plant Cell and Tissue Culture, in Thorpe, A.T., (Ed.), Plant Tissue Culture, Academic Press, New York. Gunawan, L.W., 1995, Teknik Kultur in vitro dalam Holtikultura, Penebar Swadaya, Jakarta. Harjanto, I., 2005, Info Sehat: Lawan Hepatitis dengan Temulawak, (online), (http://www.mail-archive.com,diakses 1 Juli 2006). Harmita, I.G.A.K., 2005,Buku Pegangan Kuliah Kromatografi, Jakarta, 101104. Hendaryono, D.P.S., dan Wijayani, A., 1994, Teknik Kultur Jaringan, Kanisius, Yogyakarta. Indrayanto, G., dan Rahman, A., 1990, Prospek Bioteknologi Sel Tanaman untuk Produksi Bahan Obat Nabati secara in vitro, Medika Jurnal Kedokteran dan Farmasi, Jakarta. Indrayanto, G., 1987, Produksi Metabolit Sekunder dengan Teknik Kultur Jaringan Tanaman, Seminar Nasional, Metabolit Sekunder, Pusat Antar Universitas, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, 9-11.

Kristiana, L., dan Maryani, H., 2004, Analisa Standar Pengobatan Obat Tradisional di Laboratorium P4OT yang Menggunakan Temulawak, dalam Prosiding Seminar Nasional XXV Tanaman Obat Tradisional, Depkes RI, Jakarta. Martin, L., 1984, Secondary Metabolism In Microorganism, Plants, and Animals, Springer,Tokyo. Nugroho, A., dan Sugito, N., 2004, Pedoman Pelaksanaan Teknik Kultur Jaringan, Penebar Swadaya, Jakarta, 4-5, 11-13. Rukmana, R., 1995, Temulawak, Tanaman Rempah dan Obat, Kanisius, Yogyakarta, 11-17. Sastrohamidjojo, H., 1985, Kromatografi, Liberty, Yogyakarta, 26-34. Seabrook, J.E.A., 1982, Laboratory Culture, in Staba, E.J.(Ed), Plant Tissue Culture as a Sources of Biochemical, CRC Press Inc. Boca Raton, Florida. Stahl, E., 1985, Analisis Obat secara Kromatografi diterjemahkan oleh Padmawinata, K., ITB, Bandung.

dan

Mikroskopi,

Street, H.E., 1977, Recent Advence in The Production of Medical Substances by Plant Cell Culture, New York, 3-6. Suryowinoto, M., 1987, Pemuliaan Tanaman secara in vitro, Kanisius, Yogyakarta. Syamsuhidayat, S.S., Hutapea, J.R. 1991, Inventaris Tanaman Obat Indonesia, Jilid I, Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Tomes, D.T., B.E. Ellis, P.M. Harney, K.S. Kasha and R.L. Petenson, 1982, Aplication of Plant Cell and Tissue Culture to Agriculture and industry, The University of Guleph, Canada. Tonnesen, H.H., 1986, Chemistry, Stability and Analysis Curcumin, Institute of PharmacyUniversity of Oslo, Oslo, Norway.

of

Trevor, R., 1991, Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, Edisi keenam, ITB, Bandung. Untung, S., Fatimah, N., 2003, Kultur Jaringan Tanaman, Universitas Muhammadiyah Malang, Malang.

Wagner, H., Bladt, S., Zgainski E.M., diterjemahkan oleh Scott, A., Tokyo.

1984, Plant

Drug

Analysis,

Wattimena, G.A., 1991, Bioteknologi tanaman, PAU Bioteknologi, IPB, Bogor. Wetherel, D.F., 1982, Pengantar Propagasi Tanaman secara in vitro, diterjemahkan oleh Koensoemardiyah, Avery Publishing Group Inc., Wayne, New Jersey.