Kunitz(LISTO)

Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Departamento de Bioquímica Laboratorio de Métodos de Análisis Determinación de la actividad de enzimas proteolíticas. Método de Kunitz Objetivos: •

Determinar la actividad enzimática de la tripsina en base a una curva de actividad enzimática.

•

Conocer la relación entre la actividad enzimática de la tripsina y su actividad específica para obtener las unidades específicas para tripsina

•

Comparar unidades específicas de tripsina de cada proteasa.

Introducción Las enzimas son catalizadores biológicos con funciones selectivas y de gran eficiencia. Las enzimas tanto de organismos sencillos como complejos, catalizan reacciones de rutas metabólicas vitales. Una de sus funciones principales es acelerar dichas reacciones, reduce en gran parte la energía necesaria para efectuar la reacción. Las enzimas son muy específicas para cada sustrato sobre el cual actúan y su grado de especificidad varia dependiendo de ello. Las enzimas proteolíticas son responsables de la coagulación de la sangre. Hay enzimas proteolíticas en las células fagocíticas de la sangre que se encargan de hidrolizar las proteínas extrañas. Las enzimas proteolíticas pertenecen a uno de los más importante grupos de enzimas en el proceso industrial de alimentos. Son usadas en la producción de quesos, ablandamiento de carne y la modificación de propiedades de las proteínas de cereales en el pan y para la manufactura de cereales. La reacción de catálisis mas común realizada por estas enzimas es la hidrólisis de enlaces peptidicos de una proteína.

La enzima proteolítica papaína (EC 3.4.22.2) pertenece al grupo de las sulfhidril proteasas y fue encontrada por primera vez en la papaya.

Resultados: 1. Curva de actividad enzimática Tabla 1. Actividad enzimática de la tripsina

Tubo

Concentración de Tripsina (mg)

A280 Problema

Testigo

A280 corregida

T1 Y 1

0.04

0.211

0.062

0.149

T2 Y 2

0.08

0.346

0.063

0.283

T3 Y 3

0.12

0.464

0.062

0.402

T4 Y 4

0.16

0.535

0.062

0.473

T5 Y 5

0.20

0.593

0.066

0.527

PROBLEMAS TI Y I

Bromelaína 1:10

0.705

0.204

0.501

TII Y II

Bromelaína 1:20

0.436

0.110

0.326

TIII Y III

Papaína

0.346

0.108

0.238

Ecuación de la recta

Donde:

2. Calculo de Unidades Trípticas Las Unidad Tríptica se define como la cantidad de enzima necesaria para aumentar una unidad de absorbancia a 280 nm por minuto de digestión, bajo las condiciones experimentales descritas.

3. Curva de actividad enzimática especifica Si existen 0.11825 UT en 1 mg: Determinar UT en 0.04 mg

Tabla 2. Curva de actividad enzimática especifica para la digestión de caseína por tripsina

Tubo 1 2 3 4 5

Unidades Trípticas 0.0047 0.0095 0.0142 0.0189 0.0237

A280 corregida 0.149 0.283 0.402 0.473 0.527

Ecuación de la recta

Ecuación empírica

La absorbancia que presento 1 ml de la muestra Bromelaína a una dilución de 1:20 se encuentra en un intervalo casi lineal de la recta de la curva de actividad enzimática, por lo que se determinara unidades trípticas de bromelaína a esta concentración. Para ello:

Despejando UT de la ecuación empírica:

Unidades Trípticas de Bromelaína A280 corregida de bromelaína 1:20=0.326 Sustituyendo en UT

UT por gramo de piña:

Unidades Trípticas de Papaína A280 corregida de papaína=0.238 Sustituyendo en UT

UT por gramo de ablandador

Preguntas adicionales a) Defina actividad enzimática y actividad enzimática especifica Actividad enzimática: Capacidad de la enzima para inducir una reacción química determinada. A menudo esta reacción se mide de forma indirecta Actividad enzimática específica: Es la relación entre la actividad enzimática y la cantidad de proteína b) Escriba la clasificación de las proteasa, en función de su mecanismo de acción y diga en que grupo se ubican las determinadas en la práctica. Existe una división de enzimas proteolíticas en cuatro grupos con base en su mecanismo de acción: i) Serina proteasas: estas proteasas tienen en común la característica de ser inhibidas por el diisopropilfosforofluoridato (DFP) que reacciona con el grupo hidroxilo de un residuo serilo específico en el sitio activo de la enzima. ii) Sulfhidrilo proteasas: este grupo tiene la habilidad de hidrolizar los enlaces peptidicos de proteínas y la inhibición por reactivos con grupo sulfhidrilo.

iii) Metal proteasas: Las enzimas pertenecientes a este grupo son inhibidas por un agente metal-quelante. iv) Acido proteasas: el nombre de este grupo indica que el pH óptimo de las enzimas es muy acido, en un rango de 2 a 4, y esto causa que los grupos no participen en el sitio activo. La tripsina pertenece al grupo de las serina proteasas; la papaína y la bromelaína se encuentran en el grupo de las sulfhidrilo proteasas c) ¿Para que se adiciona cisteína en las muestras de piña, y de ablandador? El mecanismo usado para romper un enlace péptidico implica utilizar un residuo del péptido que contenga Cisteína y Treonina o una molécula de agua, de tal forma que sea posible atacar al grupo carbonilo del péptido. Una forma de hacer nucleófilos es mediante una triada catalítica, en donde un residuo de histidina es usado para activar la serina, cisteína o treonina como nucleófilo. d) ¿Cuál es la especificidad de enlace de la tripsina, la bromelaína y la papaína? Tripsina La especificidad de sustrato de la tripsina es la Lisina y la Arginina Bromelaína y Papaína La especificidad de sustrato es Serina, Cisteína y Treonina.

Discusión. El uso de los tubos testigos tiene como función principal evidenciar la presencia de sustancias extrañas que absorban a 280 nm y que se encuentren presentes antes y después de la hidrólisis de la caseína. Estas sustancias afectan la lectura de absorbancia, debido a que después de realizar la hidrólisis en los tubos problema, la solución absorberá como si esta tuviera una cantidad de proteína mayor a la adicionada. Por lo tanto debe obtenerse una absorbancia corregida, siendo esta la diferencia entre la absorbancia del problema y la absorbancia del testigo, lo anterior con la finalidad de obtener resultados experimentales mas confiables. Con el fin de comparar la actividad enzimática de cada proteasa, se obtiene unidades específicas de la tripsina (unidades trípticas). La actividad enzimática específica por miligramo de muestra de la tripsina es de 0.11825 UT, las actividades específicas de bromelaína y papaína por gramo de muestra es de 0.3073 UT y 0.1283 UT respectivamente. Cabe resaltar que se necesita menor cantidad de papaína para hidrolizar la proteína en

cuestión, en comparación a la tripsina. Ambas tienen UT muy parecidas, sin embargo la cantidad de tripsina que se evalúa es para un miligramo de muestra, la cantidad de papaína necesitada es por gramo de muestra. Por último la cantidad de bromelaína para realizar la reacción es mayor a la cantidad necesitada de papaína. La cantidad de tripsina es mayor a la cantidad de bromelaína:

Esto explica la utilización de la papaína en los ablandadores de carne. Conclusión. •

La actividad enzimática de la tripsina es de 0.11825 UT por miligramo

•

La actividad enzimática de la bromelaína es de 0.3073 UT por gramo

•

La actividad enzimática de la papaína es de 0.1283 UT por gramo

•

La cantidad de enzima mínima necesaria por minuto de digestión para aumentar una unidad de absorbancia corresponde a la papaína.

Referencia bibliográfica Berg, J. Stryer, L. 2008. “Bioquímica”. 6° Edición. Editorial Reverte. España. Pag. 67 Whitaker, J. 1972. “Principles of Enzymology for the Food Sciences”. Editorial Marcel Dekker, Inc. New York, U.S.A. pp. 511-512, 515-517, 526537 Horton, H. Moran, L. 2008. “Principios de Bioquímica”. 4° Edición. Editorial Pearson Educación de México. México. pp 129-130