KHM dan KBM fix

Tanggal Praktikum

8 Mei 2014

Praktikum

Uji Kadar Hambat Minimum & Kadar Bunuh Minimum

Tujuan Praktikum



Menetukan Kadar Hambat Minimum (KHM dari suatu antibiotik secara dilusi



Menetukan Kadar Bunuh Minimum (KBM) dari suatu antibiotik secara dilusi

Kelompok

1 (satu)

Nama Anggota

1.

Ade Muchlas Wijayanto

2.

Dewi kartika sari

3.  Neni maulina wijayati 4.

Petrisia putri romadhon

5.

Risa anggraini

6.

Yohana rafiqah

Dasar Teori ☺

Antibiotik 

Antibiotika adalah segolongan senyawa, baik alami maupun sintetik, yang mempunyai efek menekan atau menghentikan suatu proses biokimia di dalam organisme, khususnya dalam proses infeksi oleh bakteri. Penggunaan antibiotika khususnya berkaitan dengan pengobatan penyakit infeksi, meskipun dalam bioteknologi dan rekayasa genetika juga digunakan sebagai alat seleksi terhadap mutan atau transforman. Berdasarkan sifat toksisitas selektif, ada antibiotic yang bersifat menghambat  pertumbuhan mikroba, dikenal sebagai aktivitas bakteriostatik, dan ada yang bersifat membunuh mikroba, dikenal sebagai aktivitas bakterisid. Kadar minimal yang diperlukan untuk menghambat pertumbuhan mikroba atau membunuhnya masingmasing dikenal sebagai Kadar Hambat Mikroba (KHM) dan Kadar Bunuh Mikroba (KBM). Antimikroba tertentu aktivitasnya dapat meningkat dari bakteriostatik menjadi  bakterisid bila kadar antimikrobanya ditingkatkan ditingkatkan melebihi KHM. Suatu zat antimikroba yang ideal memiliki toksisitas selektif. Istilah ini berarti  bahwa suatu obat berbahaya bagi parasit tetapi tidak membahayakan inang. Umumnya toksisitas selektif lebih bersifat relatif dan bukan absolut, ini berarti bahwa suatu obat

yang pada konsentrasi tertentu dapat ditoleransi oleh inang namun dapat merusak  parasit. Aktivitas mikroba dapat dikendalikan dengan mengatur faktor-faktor lingkungan yang meliputi faktor biotik (makhluk hidup dan mencakup adanya asosiasi atau kehidupan bersama antara mikroorganisme dapat dalam bentuk simbiose, sinergisme, antibiose, dan sintropisme) dan abiotik (temperatur, kelembaban, pH, radiasi,  penghancuran secara mekanik). Antibiotika yang ideal sebagai obat harus memenuhi syarat-syarat berikut: 1. Mempunyai

kemampuan

untuk

mematikan

atau

menghambat

pertumbuhan

mikroorganisme yang luas (broad spectrum antibiotik). 2. Tidak menimbulkan terjadinya resistensi dari mikroorganisme pathogen. 3. Tidak menimbulkan pengaruh samping (side effect) yang buruk pada host, seperti reaksi alergi, kerusakan syaraf, iritasi lambung, dan sebagainya. 4. Tidak mengganggu keseimbangan flora yang normal dari host seperti flora usus atau flora kulit.

☺

Mekanisme kerja antibiotik 

Pemusnahan mikroba dengan antibiotika yang bersifat bakteriostatik masih tergantung dari keanggupan reaksi daya tahan tubuh hospes. Peranan lamanya kontak antara mikroba dengan antimikroba dalam kadar efektif juga sangat menentukan untuk mendapatkan efek, khususnya pada tuberkolostatik. Berdasarkan mekanisme kerjanya, antibiotika dibagi dalam lima kelompok : 1. Yang mengganggu metabolism sel mikroba. 2. Yang menghambat sintesis dinding sel mikroba. 3. Yang mengganggu permeabilitas membrane sel mikroba. 4. Yang menghambat sintesis protein sel mikroba. 5. Yang menghambat sintesis atau merusak asam nukleat sel mikroba. ☺

Resistensi

Secara garis besar kuman dapat menjadi resisten terhadap suatu antibiotika melalui 3 mekanisme : 1. Obat tidak dapat mencapai tempat kerjanya didalam sel mikroba. Pada kuman Gram negatif molekul antibiotika yang kecil dan polar dapat menembus dinding luar dan masuk kedalam sel melalui lubang-lubang kecil yang disebut porin. Bila porin menghilang atau mengalami mutasi maka masuknya antibiotika ini akan terhambat.

Mekanisme lain adalah kuman mengurangi mekanisme transfor aktif yang memasukan antibiotika kedalam sel. Mekanisme lain adalah mkroba mengaktifkan  pompa efluks untuk membuang membuang keluar antibiotic dalam sel. 2. Inaktivasi obat : mekanisme ini sering mengakibatkan terjadinya resistensi terhadap golongan aminoglikosida dan beta laktam karena mikroba mampu membuat enzim yang merusak kedua golongan antibiotika tersebut. 3. Mikroba mengubah tempat ikatan antibiotika : mekanisme ini terlihat pada

S.aureus

yang rsisten terhadap metisilin. Kuman ini mengubah penicillin binding proteinnya sehingga afinitasnya menurun terhadap metisilin dan antibiotika beta laktam yang lain. ☺

Metode Dilusi

Cara ini digunakan untuk menetukan kadar hambat minimum (KHM) dan kadar  bunuh minimum (KBM) dari dari obat antibiotik. Prinsip dari metode ini ialah menggunakan satu seri tabung reaksi yang diisi media cair dan sejumlah tertentu selmikroba yang diuji. Setelah itu, masing-masing tabung diuji dengan obat yang telah diencerkan secara serial. Seri tabung diinokulasi pada suhu 36±1 oC selama 18-24 jam dan diiamati terjadi kekeruhan pada tabung konsentrasi terendah obat, pada tabung yang ditunjukkan dengan tidak adanya pertumbuhan koloni mikroba adalah KBM dari obat terhadap bakteri uji. Uji kepekaan cara dilusi agkr memakan waktu dan penggunaannya dibatasi pada keadaan tertentu saja. Uji kepekaan cara dilusi cair adalah bahwa uji ini member hasil kuantitatif yang menunjukkan jumlah antibakteri yang dibutuhkan untuk mematikan bakteri. Untuk KHM sendiri, merupakan konsentrasi konsentrasi

minimal dari satu zat yang yang akan

menghambat pertumbuhan suatu mikroorganisme. KHM ini digunakan oleh laboratorium doagnostik terutama untuk kosistensi resistansi, yang paling sering digunakan sebagai alat  penelitian untuk menentukan aktivitas in-vitro antimikroba baru. baru. Kadar Hambat Minimum atau lebih lebih dikenal dengan MIC (Minimal Inhibitory Concentration) adalah konsentrasi terendah dari antimikroba yang dapat menghambat  petumbuhan mikroba tertentu. Nilai MIC adalah spesifik untuk tiap-tiap kombinasi dari antibiotic dan sentivitas dari mikroba terhadap antimikroba. Nilai MIC berlawanan dengan sentivitas mikroba yang diuji. Semakin rendah nilai MIC dari sebuah antimikroba, sensitivitas dari bakteri akan semakin besar. MIC dari sebuah antibiotik terhadap spesies

mikroba adalah adalah

rat-rata KHM terhadap seluruh strain dari spesies tertentu. Strain dari

 beberapa spesies mikroba adalah sangat berbeda dalam hal sensitivitasnya. Metode uji antimikroba yang sering digunnakan adalah metode difusi lempeng agar. Uji ini dilakukan  pada permukaan medium padat. Mikroba ditumbuhkan pada permukaan medium dan kertas saring yang dibentuk cakram yang telah mengandung mikroba. Setelah inkubasi, diameter zona penghambatan diukur. Diameter zona penghambatan merupakan pengukuran KHM secara tidak langsung dari antibiotic terhadap mikroba. Sensitivitas klinik dari mikroba kemudian ditentukan dari tabel klasifikasi (Jawestz, et al. 1996).

☺

Kadar Hambat Minimal (KHM) antibiotik 

Penentuan kepekaan mikroba terhadap suatu antibiotika atau khemoterapeutik dipakai untuk menentukan pengobatan terbaik terhadap penyakit yang disebabkan oleh suatu mikroba tersebut pada manusia atau hewan. Ada dua metode untuk menentukan kadar hambat minimal suatu antibiotika yaitu : 1. Metode Difusi Pada metode ini zat antibiotika berdifusi pada lempeng agar yang telah diinokulasi dengan  bakteri. Dasar pengamatannya adalah terbentuk zona hambat disekeliling cakram atau silinder yang berisi antibiotika. Metode ini dipengaruhi oleh faktor fisik dan kimia, selain antara obat dan organisme. o

Cara parit Pada medium agar yang telah diinokulasi dengan baktei dibuat parit kemudian

diisi dengan zat antibiotika dan diinkubasi pada suhu dan jangka waktu sesuai dengan  jenis bakteri uji. Pengamatan dilakukan atas ada atau tidaknya hambatan disekeliling  parit. o

Cara silinder Pada medium agar yang telah diinokulasi dengan bakteri dibuat lubang diletakan

silinder kemudian diisi dengan zat antibakteri, setelah itu diinkubasi pada suhu dan  jangka waktu yang sesuai dengan jenis bakteri uji. Pengamatan dilakukan atas dasra ada atau tidaknya hambatan disekeliling silinder. o

Cara cakram

Kertas cakram yang mengandung zat antibakteri diletakan diatas lempeng, setelah diinkubasi pada suhu dan jangka waktu yang sesuai dengan bakteri uji. Pengamatan dilakukan berdasarkan ada tidaknya hambatan disekeliling cakram

2. Metode dilusi Metode ini menggunakan antibakteri yang turun secar bertahap, baik dengan media cair atau  padat kemudian media diinokulasi bakteri uji dan dieramkan. Dasar pengamatannya adalah dengan melihat tumbuh atau tidaknya bakteri. o

Cara pengenceran tabung (Metode Kirby-Bauer) Pada metode ini zat yang akan diuji kepekaan antibakterinya diencerkan secar

serial

dengan

pengenceran

kelipatan

dua

dalam

medium

cair,

kemudian

diinokulasikan dengan bakteri uji, inkubasi pada suhu 37°C selama 18-21 jm ( untuk  bakteri) dan 1-2 minggu (untuk jamur). Aktivitas antibakteri ditentukan sebagai konsentrasi terendah yang masih dapat menghambat pertumbuhan bakteri. o

Cara penapisan lempeng Pada metode ini zat yang akan diuji antibakterinya diencerkan secara serial

dengan pengenceran kelipatan dua dalam medium agar pada suhu 40-50°C, kemudian dituang dalam cawan petri. Setelah lempeng agar membeku ditanam inokulum bakteri dan diinkubasi pada suhu dan jangka waktu yang sesuai dengan pertumbuhan bakteri uji. Kadar hambat minimum zat antibakteri yang diuji, ditentukan sebagai konsentrasi terendah yang masih dapat menghambat pertumbuhan bakteri. o

Turbiditas Pada metode ini pengamatann aktivitas didasarkan atas kekeruhan yang terjadi

 pada medium pembenihan. Pertumbuhan bakteri juga dapat ditentukan dari perubahan yang terjadi sebelum dan sesudah inkubasi, yang dilakukan dengan mengukur serapannya secara spektrofotometer. Adanya pertumbuhan bakteri ditandai dengan  peningkatan jumlah sel bakteri, yang mengakibatkan meningkatnya kekeruhan. Kekeruhan yang terjadi umumnya berbanding lurus dengan ser apan. Cara Lain Pengujian KHM

1. Pembuatan Lapisan Dasar ( Base Layer) Siapkan cawan petri steril, setiap cawan diisi 10ml base layer, usahakan merata memenuhi seluruh permukaan petri. Biarkan membeku. mem beku. 2. Pembuatan Lapisan Pembenihan

Siapkan 6 tabung reaksi masing-masing tabung dengan 4ml lapisan pembenihan cair, ratakan sehingga menutupi lapisan base layer. Tunggu sampai mengeras 1ml suspense kuman dari pengenceran 1000x, ratakan dengan menggunakan spatel drugalsky. 3. Pemasangan Silinder (Cakram Kertas) Letakkan silinder glass atau kertas cakram, diatas permukaan agar dengan jarak satu sama lin ± 20-35mm. Inkubasi 24 jam suhu 37C hitung diameter zona bening yang terbentuk dengan menggunakan jangka sorong.

☺

Penetuan Kadar Bunuh Minimum (KBM)

KBM ditentukan dengan cara mengambil suspense dengan menggunakan ose dari tabung-tabung digunakan untuk menetukan nilai KHM dan menyebarkannya pada lempeng agar Muller-Hinton secara sektoral. Lempeng tersebut di inkubasi di inkubator selama 24 jam  pada suhu 37oC. Konsetrasi terendah yang tidak menunjukkan pertumbuhan bakteri adalah nilai KBM. KBM merupakan kadar minimal yang diperlukan antibiotika untuk membunuh mikroba.

Alat dan Bahan Alat :

Bahan :

Spektrofotometer

Aquades

Tabung reaksi

Media Lactose Broth (LB)

Rak tabung reaksi

Media Eosin Methilene Blue (EMB)

Botol semprot

NaCl steril

Beaker glass

Ampisillin

Erlenmeyer

Bakteri Escherichia coli

Cawan petri

Aquades steril

Pipet nikrom

Alkohol

Lampu spirtus Kaki tiga Kasa asbes

1)

Prosedur Kadar Hambat Minimum

a. Diambil 1 ose biakan E. Coli  b. Disuspensikan dengan NaCl 0,9% (50 ml) ke dalam erlenmeyer c. Diuji konsentrasi dengan spektrofotometer dengan A= 580 nm hingga diperoleh 25% T d. Pembuatan larutan stok antibiotik 500 mg/1 tablet dalam/2 tablet untuk satu kelas dalam 30 mL aquades steril

AB 3,5 m

AB 3,15 ml

AB 2,8 ml

AB 2,45

AB 2,1 ml

e.

3,5 mL 3,85 mL 4,2 mL 4,45 mL 4,9 mL media Media yang digunakan yaitu media lactose broth f. Masing-masing tabung diisi dengan 1 ml suspensi bakteri

kontrol

g. Diinkubasi 1 x 24 jam pada suhu 37 oC, lakukan pengamatan kekeruhan.  NB: jika keruh maka antibiotik tsb tidak dapat menghambat bakteri E. Coli dan sebaliknya 2)

Prosedur Kadar Bunuh Minimum

Diambil 1 mL suspensi KHM dengan menggunakan pipet, ditanam pada media EMB dengan metode pour plate

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5 

kontrol

-

Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 oC

-

Diamati pada konsentrasi berapa antibiotik mampu membunuh mikroorganisme (KBM), dilihat apakah ada koloni yang tumbuh atau tidak. Mulai dari konsentrasi 10-1 sampai dengan konsentrasi 10 -5 -  NB: semakin sedikit bakteri yang tumbuh, maka semakin besar daya bunuh antibiotik terhadap bakteri E. Coli