Javier Buceta Fernández; Elka Koroutcheva; Juan Manuel Pastor Temas de Biofísica

TEMAS DE BIOFÍSICA

CUADERNOS DE LA UNED

Javier Buceta Fernández Elka Koroutcheva Juan Manuel Pastor

TEMAS DE BIOFÍSICA

UNIVERSIDAD NACIONAL DE EDUCACIÓN A DISTANCIA

CUADERNOS DE LA UNED (35275CU01A01) TEMAS DE BIOFÍSICA

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Prefacio

El presente libro, “Temas de Biof´ısica”, nace fruto de lo que pensamos es una necesidad. En la literatura existe una multitud de excelentes libros, tratados y art´ıculos sobre esta disciplina y afines como la Biolog´ıa Matem´ atica. Algunos de ellos, est´an referenciados en la bibliograf´ıa y han sido, en mayor o menor medida y de forma m´as o menos consciente, fuente de inspiraci´on para algunas de las secciones que se recogen aqu´ı. Sin embargo, el nacimiento de nuevas titulaciones como las Ciencias Medioambientales pensamos que hace necesario presentar un enfoque original que, seg´ un nuestro criterio, no estaba recogido en un u ´nico manual. Tal y como queda reflejado en sus planes de estudio, el alumnado de estas titulaciones es heterog´eneo. De este modo, intentar incorporar un enfoque demasiado matem´atico y riguroso puede complicar excesivamente la lectura y estudio para algunos de ellos. Por otro lado, una presentaci´ on demasiado descriptiva y generalista restar´ıa inter´es a aquellos alumnos con una inclinaci´ on m´as formal. Hemos intentado, esperamos que con ´exito, buscar un compromiso entre ambos extremos y presentar a lo largo de los cap´ıtulos tanto aspectos m´as formales, como aquellos m´as generalistas y descriptivos. As´ı, nuestro inter´es ha sido dar una base muy amplia de conocimientos f´ısicos fundamentales y m´as formales relacionados con temas como la Termodin´amica, la cin´etica enzim´atica y los fen´omenos de transporte a trav´es de las membranas. Tambi´en hemos querido dar una visi´ on global de la importancia que tienen los biopol´ımeros como base de la organizaci´ on de cualquier organismo vivo y destacar, en su relaci´on con el medio ambiente, los efectos de las vibraciones, del sonido y de las radiaciones sobre el medio centr´andonos en la interacci´on con la materia

ii y en las aplicaciones m´edicas. Finalmente, hemos intentado dar una amplia imagen del campo de las t´ecnicas e instrumentaci´on e incidir en su utilidad en lo que respecta a la medici´ on, el registro y el an´alisis de los datos. A lo largo de los cap´ıtulos, y con el fin de aclarar y afianzar algunos de los conceptos introducidos, presentamos una serie de problemas resueltos. M´ as concretamente, el libro se encuentra estructurado en 6 temas. Un primer tema de Termodin´ amica, que por su extensi´ on se ha dividido en dos cap´ıtulos, trata de los conceptos e ideas b´asicas de esta disciplina que sirven para establecer los principios energ´eticos o reglas b´ asicas sobre las que la Evoluci´ on ha ido creando los sistemas biol´ogicos tan complejos que conocemos. En un segundo tema se da paso al estudio de los “ladrillos” biol´ ogicos: los biopol´ımeros. Adem´as, este tema se centra tambi´en unas prote´ınas muy especiales desde el punto de vista de la cin´etica de las reacciones bioqu´ımicas, las enzimas, con explicaci´on de los fen´ omenos competitivos y cooperativos. El tercer tema trata del transporte de iones a trav´es de membranas y de los potenciales establecidos entre el interior y el exterior de las mismas. Se explica el potencial de la membrana, se dan unas nociones b´ asicas de electrofisiolog´ıa y se introduce el potencial de acci´on. El siguiente tema trata de la biof´ısica de los seres vivos. Dentro de este ep´ıgrafe tan general se centra, fundamentalmente, en las propiedades de los fluidos biol´ogicos y en el movimiento de los seres vivos en el seno de distintos fluidos: la nataci´ on y el vuelo. Adem´as se explican los conceptos b´asicos de la biomec´anica del cuerpo humano y de la biof´ısica de las vibraciones y el sonido. El siguiente cap´ıtulo trata del tema de las radiaciones. Comienza con una introducci´ on a las propiedades de las radiaciones, sus tipos y sus aplicaciones desde el punto de vista anal´ıtico (la espectroscop´ıa). A continuaci´ on se explican las interacciones de la radiaci´on con la materia y sus efectos biol´ogicos. Tambi´en se habla de la radiactividad, los conceptos b´ asicos y sus efectos. Finalmente, se comentan las aplicaciones m´edicas de la radiaci´ on ionizante. El u ´ltimo tema trata de las t´ecnicas e instrumentaci´on fisico-qu´ımicas. Se explican los conceptos y principios b´asicos en los que se fundamentan algunos de los m´etodos de an´ alisis m´ as importantes Se comentan las caracter´ısticas b´asicas que hay que conocer de todo equipo de medici´ on y, por u ´ltimo, se explican los par´ametros m´as importantes relacionados con la obtenci´ on de im´ agenes. Los contenidos elegidos suponen una muestra introductoria de un campo en constante desarrollo y referimos al lector a la bibliograf´ıa complementaria ofrecida para profundizar y/o descubrir nuevas facetas y problemas donde la F´ısica y la Biolog´ıa se dan la mano. De cualquier modo, dado el amplio car´ acter de los temas tratados, esperamos que el libro sea un buen manual para los

iii alumnos de las licenciaturas de Ciencias Medioambientales en particular, y, en general, tanto para los licenciados provenientes de diferentes campos como la F´ısica, la Qu´ımica o la Biolog´ıa, como para cualquier especialista interesado en aspectos diversos de la Biof´ısica. Esperamos haberlo conseguido. Los autores queremos agradecer a F.J. de la Rubia su propuesta de escribir el libro y el apoyo constante que nos ha brindado. J.B. quiere agradecer a A. Falomir, F. Sagu´es, R. Reigada y J.M.R. Parrondo la lectura cr´ıtica y las sugerencias y puntualizaciones ofrecidas sobre los cap´ıtulos de Termodin´ amica y de Biopol´ımeros y Cin´etica Enzim´ atica de los cuales ha sido responsable. E.K. agradece en el mismo sentido la labor de A. V´ azquez, R. Ogallar y K. Koroutchev en relaci´on a los cap´ıtulos sobre Fen´omenos de Transporte en Membranas y Biof´ısica de los Cuerpos Vivos, y a J.J. S´anchez por el apoyo inform´ atico. Finalmente, J.M.P. agradece a J. Pastor su colaboraci´on en el desarrollo de algunas figuras. Los autores, Septiembre de 2006.

´Indice general

1. Termodin´ amica I 1.1. Conceptos Fundamentales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2. Ecuaci´on de Estado del Gas Ideal . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3. El Primer Principio de la Termodin´ amica . . . . . . . . . . . . 1.3.1. Capacidad Calor´ıfica y Calor Espec´ıfico . . . . . . . . . 1.3.2. Aplicaci´ on del Primer Principio a un Gas Ideal . . . . . 1.3.3. Variaci´ on de la Temperatura Atmosf´erica con la Altura 1.4. El Segundo Principio de la Termodin´ amica . . . . . . . . . . . 1.4.1. M´ aquinas Reversibles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.4.2. El Ciclo de Carnot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.4.3. Entrop´ıa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1 3 7 10 12 13 18 20 21 25 28

2. Termodin´ amica II 39 2.1. Potenciales Termodin´amicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 2.1.1. Condiciones de Equilibrio y Espontaneidad . . . . . . . 41 2.2. Disoluciones Dilu´ıdas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 2.3. Equilibrio Qu´ımico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 2.3.1. La Hidr´ olisis del ATP: el Estado Biol´ogico Est´andar . . 62 2.4. Termodin´ amica de No Equilibrio . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 2.4.1. Flujos Acoplados: el Teorema de Onsager . . . . . . . . 66 2.4.2. Producci´ on de Entrop´ıa . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68 2.4.3. Minimizaci´on de la Producci´ on Entr´ opica: Teorema de Prigogine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71

vi

´INDICE GENERAL

3. Biopol´ımeros y Cin´ etica Enzim´ atica 3.1. Del ADN a las Prote´ınas . . . . . . . . . . . . . . 3.1.1. Transcripci´ on Gen´etica . . . . . . . . . . 3.1.2. Traducci´on Gen´etica . . . . . . . . . . . . 3.2. S´ıntesis de Biopol´ımeros . . . . . . . . . . . . . . 3.3. Filamentos Prote´ınicos . . . . . . . . . . . . . . . 3.4. Pol´ımeros Globulares . . . . . . . . . . . . . . . . 3.5. Elasticidad y Biopol´ımeros . . . . . . . . . . . . . 3.6. La Teor´ıa de Michaelis-Menten . . . . . . . . . . 3.6.1. La Hip´ otesis del Estado Cuasiestacionario 3.7. Fen´omenos Competitivos . . . . . . . . . . . . . . 3.8. Fen´omenos Cooperativos . . . . . . . . . . . . . . 3.8.1. El D´ımero Cooperativo . . . . . . . . . .

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4. Fen´ omenos de Transporte: Membranas 4.1. Difusi´ on Pura a Trav´es de Membranas . . . . . . . . . . 4.1.1. Potencial del Equilibrio de Nernst . . . . . . . . 4.1.2. Ecuaci´on de Nernst-Planck . . . . . . . . . . . . 4.1.3. Teor´ıa de Campo Constante . . . . . . . . . . . . 4.2. Difusi´ on I´ onica a Trav´es de la Membrana . . . . . . . . 4.2.1. Potenciales de Gibbs-Donnan . . . . . . . . . . . 4.2.2. Creaci´on de Potenciales de Difusi´ on . . . . . . . 4.2.3. Ecuaci´on de Goldman-Hodgkin-Katz . . . . . . . 4.3. Nociones B´asicas de la Electrofisiolog´ıa . . . . . . . . . . 4.3.1. Propiedades El´ectricas de las Membranas: Fuerza tromotriz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.2. Potencial de Membrana y Circuito Equivalente . 4.4. Potencial de Acci´ on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.4.1. T´ecnica de Pinzamiento de Voltaje . . . . . . . . 4.4.2. Modelo de Hodgkin y Huxley . . . . . . . . . . . 4.4.3. Din´amica del Modelo de Hodgkin y Huxley (HH) 4.4.4. Teor´ıa del Cable . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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5. Biof´ısica de los Cuerpos Vivos 5.1. Fluidos Biol´ ogicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.1. Propiedades B´asicas de los Fluidos . . . . . . . . . . 5.1.2. Fluidos Biol´ ogicos: Caracter´ısticas de su Viscosidad 5.1.3. Circulaci´ on Sangu´ınea . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2. Biomec´anica del Cuerpo Humano . . . . . . . . . . . . . . .

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75 76 77 78 81 83 85 91 95 99 102 106 113 117 119 119 123 124 128 128 130 133 135 135 138 140 140 141 145 147 153 153 153 154 156 161

´INDICE GENERAL 5.3. Movimiento en Fluidos: Nataci´on y 5.4. Sonido y Biof´ısica de la Audici´ on . 5.4.1. Vibraciones . . . . . . . . . 5.4.2. Sonido . . . . . . . . . . . . 5.4.3. Mecanismos de la Audici´ on

vii Vuelo . . . . . . . . . . . . . . . .

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6. Radiaci´ on 6.1. Propiedades de la Radiaci´on Electromagn´etica . . . . . . . . . 6.1.1. Propiedades de Onda . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.2. Propiedades de Part´ıcula . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.3. Espectro Electromagn´etico . . . . . . . . . . . . . . . . 6.2. Espectroscop´ıa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.2.1. Absorci´on de Radiaci´on . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.2.2. Espectro de Absorci´ on de Radiaci´on. Ley de Beer . . . . 6.2.3. Equipos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.2.4. Componentes B´asicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.2.5. Espectroscop´ıa de Absorci´on Molecular . . . . . . . . . 6.2.6. Espectroscop´ıa de Fluorescencia Molecular . . . . . . . 6.2.7. Espectroscop´ıa de Infrarrojo . . . . . . . . . . . . . . . . 6.2.8. Resonancia Magn´etica Nuclear . . . . . . . . . . . . . . 6.3. Interacci´on de la Radiaci´on con la Materia . . . . . . . . . . . . ´ 6.3.1. Efectos de la Interacci´ on de los Fotones con los Atomos y Mol´eculas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.3.2. Efectos Fotobiol´ogicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.4. Radiactividad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.4.1. Tipos de Radiaciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.4.2. Actividad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.4.3. Detectores de Radiactividad . . . . . . . . . . . . . . . . 6.5. Radiaciones Ionizantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.5.1. Radiodosimetr´ıa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.5.2. Coeficiente de Atenuaci´on . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.5.3. Radioqu´ımica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.5.4. Exposici´on a Radiaci´on Ionizante . . . . . . . . . . . . . 6.6. Aplicaciones M´edicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.6.1. Determinaciones Cuantitativas . . . . . . . . . . . . . . 6.6.2. Diagn´ ostico por Im´agenes . . . . . . . . . . . . . . . . .

181 181 182 184 184 187 188 192 196 198 204 206 206 208 215 215 218 225 225 226 230 232 232 234 235 237 239 239 241

viii

´INDICE GENERAL

7. T´ ecnicas e Instrumentaci´ on 7.1. Fundamentos F´ısicos . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.1.1. Coloides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.1.2. Difusi´on y Sedimentaci´ on . . . . . . . . . . 7.1.3. Viscosidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.1.4. Ley de Fick . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.1.5. Sedimentaci´ on y Centrifugaci´ on . . . . . . . 7.2. T´ecnicas de Separaci´on y An´ alisis . . . . . . . . . . 7.2.1. Centrifugaci´ on y Ultracentrifugaci´on . . . . 7.2.2. Electroforesis . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.2.3. Cromatograf´ıa . . . . . . . . . . . . . . . . 7.2.4. Espectrometr´ıa de Masas . . . . . . . . . . 7.3. Instrumentacion de Medici´on y Registro . . . . . . 7.3.1. Caracter´ısticas B´asicas . . . . . . . . . . . . 7.3.2. Instrumentaci´ on Electr´ onica . . . . . . . . . 7.4. Obtencion de Im´agenes . . . . . . . . . . . . . . . ´ 7.4.1. Caracter´ısticas de los Instrumentos Opticos ´ 7.4.2. Microscopio Optico . . . . . . . . . . . . . . 7.4.3. Microscopio Electr´onico . . . . . . . . . . .

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253 253 254 259 261 264 265 267 267 269 272 283 292 292 297 302 303 308 314

CAP´ITULO

1

Termodin´amica y Procesos Biol´ogicos I

Las c´elulas que conforman todo organismo vivo son las encargadas de proporcionar el material y la energ´ıa requeridas para mantener su actividad. Esto se consigue mediante un complejo entramado de reacciones qu´ımicas de las cuales es posible hacer una clasificaci´on en t´erminos de sus objetivos. Hablamos as´ı de redes catab´olicas y anab´olicas. Las primeras tienen por misi´on transformar el alimento en mol´eculas fundamentales o formas de energ´ıa u ´tiles para la c´elula. Las segundas utilizan esas mismas mol´eculas fundamentales y la energ´ıa para sintetizar otras mol´eculas necesarias para el funcionamiento de la maquinaria celular. Gen´ericamente, al conjunto de redes catab´olicas y anab´ olicas se le conoce como metabolismo celular. En lo que respecta al almacenamiento energ´etico, todos los organismos almacenan la energ´ıa en los enlaces qu´ımicos de mol´eculas org´anicas. Estas mol´eculas se construyen mediante las rutas metab´olicas utilizando como materia prima las mol´eculas producidas por otros organismos, es decir, mol´eculas que proceden de la alimentaci´ on. En el origen de esta cadena se sit´ uan las especies vegetales que obtienen su energ´ıa de la luz1 mediante la fotos´ıntesis transformando la radiaci´ on electromagn´etica en energ´ıa almacenada en los enlaces qu´ımicos de ciertas mol´eculas (principalmente az´ ucares). Por otro lado, en lo que respecta al m´etodo controlado de extracci´ on de la energ´ıa acumulada en los enlaces qu´ımicos, tanto en las especies animales como en las vegetales, es mediante los procesos de oxidaci´on y reducci´on. Gen´ericamente, la oxida1

Algunas bacterias tambi´en son capaces de obtener energ´ıa de la luz.

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´ CAP´ITULO 1. TERMODINAMICA I

ci´on/reducci´ on consiste en eliminar/a˜ nadir electrones a una especie qu´ımica. La energ´ıa liberada mediante los procesos de oxidaci´ on-reducci´ on de macromol´eculas org´anicas se almacena en los enlaces qu´ımicos de otras mol´eculas, m´as peque˜ nas, que sirven como portadoras de energ´ıa y desempe˜ nan el papel de “divisa” energ´etica dentro de la “econom´ıa” metab´olica. La divisa energ´etica m´as com´ un, que no la u ´nica, es la adenosina trifosfato, m´as conocida como ATP. El ATP se produce a partir de la glic´ olisis: una cadena de reacciones qu´ımicas que degrada la glucosa. El ATP se sintetiza mediante una reacci´on de fosforilaci´ on en la cual un grupo fosfato se a˜ nade a una mol´ecula de ADP (adenosina difosfato). Esta reacci´ on “cuesta” energ´ıa, una energ´ıa que se almacena en el enlace qu´ımico del ATP. Por cada mol´ecula de glucosa la glic´olisis produce de forma neta dos mol´eculas de ATP. Entonces, cuando las c´elulas necesitan energ´ıa la pueden conseguir del ATP de una forma controlada a trav´es de la hidr´ olisis. La hidr´ olisis libera por un lado la energ´ıa contenida en el enlace qu´ımico y por otro los productos de la reacci´on, ADP y un grupo fosfato, que quedan disponibles para almacenar energ´ıa en forma de ATP al volver a combinarse. La importancia de este proceso de reciclado se hace evidente al constatar que mantener en funcionamiento el cuerpo humano se estima que “cuesta” unas 1026 mol´eculas de ATP por d´ıa (unos 150 kilos de ATP). La reacci´on de la glic´olisis no requiere de ox´ıgeno libre, lo cual hace posible entender la aparici´on de la vida sobre la Tierra hace unos 1800 millones de a˜ nos cuando en la atm´ osfera no se encontraba tal especie. En presencia de ox´ıgeno la fosforilaci´ on oxidativa puede oxidar el piruvato (residuo de la glic´ olisis) lo cual permite a las c´elulas potenciar su producci´on de ATP por cada mol´ecula de glucosa m´as de 10 veces. Este proceso se lleva a cabo en las mitocondrias de las c´elulas. Cuando un organismo (aer´ obico) realiza un esfuerzo elevado, el ox´ıgeno se puede agotar localmente en las c´elulas musculares. Como resultado el piruvato no se oxida y se degrada en etanol o lactato. El lactato se convierte en a´cido l´ actico que cristaliza en forma de agujas en las fibras musculares lo cual causa las conocidas agujetas. Con esta breve excursi´on a trav´es del metabolismo, hemos querido ilustrar la importancia de los procesos energ´eticos como fuente de vida. Sin embargo, los objetivos de este cap´ıtulo y el siguiente no son analizar los detalles de las rutas y reacciones metab´olicas (algo fundamentalmente estudiado por la Bioqu´ımica), sino el presentar los principios que rigen las transformaciones energ´eticas: las reglas del juego. En particular, este primer cap´ıtulo sobre Termodin´ amica est´a dedicado a presentar los conceptos fundamentales de la Termodin´ amica cl´asica, de equilibrio.

1.1. CONCEPTOS FUNDAMENTALES

1.1.

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Conceptos Fundamentales: Sistema, Estado y Proceso Termodin´ amico

Hasta el momento hemos utilizado libremente la palabra energ´ıa, pero ¿qu´e es la energ´ıa? La energ´ıa no es algo tangible en el sentido que lo es una c´elula: nadie ha visto “la energ´ıa”. As´ı, llamamos energ´ıa a la potencialidad o capacidad para realizar trabajo (o transmitir calor) y por tanto el uso que hemos hecho en los p´arrafos anteriores constituye un u ´ til abuso del concepto. Por lo tanto, m´ as que referirnos a la energ´ıa, deber´ıamos hablar de transformaci´on de la misma. La Termodin´ amica es la disciplina que se dedica al estudio de las transformaciones energ´eticas. Hist´oricamente, la Termodin´amica se construy´o como rama aplicada de la F´ısica a ra´ız de la Revoluci´ on Industrial. Poco a poco, atrajo a investigadores que forjaron los cimientos te´ oricos que daban soporte a los descubrimientos existentes sobre la m´aquina de vapor. La Termodin´ amica se basa en algunos principios que resumen nuestra experiencia cotidiana relativa al comportamiento de las transformaciones energ´eticas. Hay una rama de la Termodin´ amica, la Estad´ıstica, basada en la Teor´ıa Cin´etica, que fundamenta estos principios en la naturaleza at´omica de la materia: un nivel de detalle que no consideraremos aqu´ı salvo en contadas excepciones. En su versi´ on m´ as simple la Termodin´amica cl´asica postula dos Leyes o Principios. Anecd´oticamente, la Segunda Ley se postul´o antes que la Primera. No obstante, antes de enunciar dichas leyes es necesario introducir algunos conceptos para fijar la nomenclatura a utilizar. Llamamos sistema a aquella regi´ on del espacio (y su contenido) que centra nuestro inter´es de estudio: una c´elula, un motor, etc´etera. La definici´ on de sistema implica la existencia de una frontera que separa el sistema del “resto”.˙ Al “resto” lo denominaremos entorno o medio. La frontera puede ser en general deformable y permeable tanto a energ´ıa como a masa. En funci´on de los flujos que se produzcan entre el sistema y su entorno a trav´es de la frontera, hablamos de sistemas abiertos (se intercambia materia y energ´ıa con el entorno), cerrados (intercambian energ´ıa) y aislados (sin intercambio de materia ni de energ´ıa). Llamamos variables de estado a aquel conjunto de variables que determinan el estado (energ´etico) de nuestro sistema. Igual que en Mec´anica la posici´on y la velocidad de una part´ıcula definen su estado mec´anico, en Termodin´amica una serie de variables determinan el estado termodin´amico. La presi´on, la temperatura y el volumen son variables de estado. Dependiendo del sistema en cuesti´on, las variables termodin´ amicas no son independientes, por ejemplo la

´ CAP´ITULO 1. TERMODINAMICA I

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presi´ on y volumen de un gas ideal en un sistema cerrado. Las variables termodin´ amicas tienen un sentido macrosc´opico y quedan por tanto bien definidas cuando contamos con un elevado n´ umero de mol´eculas dentro del sistema en cuesti´on. Por tanto, no tiene sentido hablar de la presi´ on de una mol´ecula. Podemos distinguir entre variables extensivas e intensivas. Hablamos de variables extensivas cuando dependen del tama˜ no del sistema, por ejemplo, el volumen. Por el contrario, hablamos de variables intensivas cuando estas no dependen de ´el, por ejemplo, la temperatura. Un proceso termodin´ amico es aqu´el que hace variar en el tiempo una o varias de las variables de estado. Cuando cambian algunas variables de estado pero la presi´ on permanece constante hablamos de procesos isobaros, si la temperatura permanece constante isotermos, si el volumen permanece constante isocoros, y si no hay transferencia de calor adiab´aticos. A aquellas funciones de las variables de estado tales que su variaci´on no depende del camino utilizado sino simplemente de los estados inicial y final, se las conoce como funciones de estado. Matem´aticamente esto implica que si el conjunto {x} = (x1 , x2 , . . . , xn ) constituye las variables de estado e y ({x}) es una funci´ on de estado, entonces 

b

dy = y (b) − y (a) ,

a

y decimos que y ({x}) tiene una diferencial exacta: la variaci´ on de y entre los estados a y b no depende de la trayectoria utilizada para ir de a a b. La diferencia de altura entre dos puntos de la Tierra es un ejemplo de diferencial exacta: vayamos por el camino que vayamos de un lugar a otro la diferencia de alturas entre ellos ser´a siempre la misma. La diferencial nos indica la variaci´ on infinitesimal producida en la funci´ on debida una variaci´ on infinitesimal de las variables independientes. As´ı, para calcular la diferencial de una funci´ on debemos identificar previamente las variables independientes de las que depende. Tomemos por ejemplo la relaci´on de dependencias indicada en la figura 1.1. La dependencia u ´ltima es en las variables x1 y x2 que son las variables independientes del ejemplo. Para calcular la diferencial de f utilizamos la regla de la cadena que podemos implementar utilizando la siguiente receta: exploramos todos los caminos posibles hasta llegar a x1 y x2 , por cada paso intermedio (flechas en la figura 1.1) aparecer´a una derivada parcial de la funci´ on que se sit´ ua en el origen de la flecha respecto de la variable o funci´ on que aparece al final de la flecha; adem´ as los caminos

1.1. CONCEPTOS FUNDAMENTALES

f

5

g

x1

h

x1

x1

x2

x2 Figura 1.1: Representaci´on esquem´atica de las dependencias de una funci´on f . El diagrama nos indica que f depende de h, g, x1 y x2 . A su vez g depende de x1 y h depende de x1 y x2 . se suman. Es decir,       ∂g ∂h ∂f ∂f dx1 + dx1 + df = ∂g ∂x1 ∂h ∂x1        ∂h ∂f ∂f ∂f dx2 + dx1 + dx2 = + ∂h ∂x2 ∂x1 ∂x2          ∂g ∂h ∂f ∂f ∂f + + dx1 + = ∂g ∂x1 ∂h ∂x1 ∂x1       ∂h ∂f ∂f + dx2 , + ∂h ∂x2 ∂x2 es la variaci´on infinitesimal producida en la funci´ on f debido a una variaci´ on infinitesimal en x1 y x2 . La derivadas parciales indican la diferenciaci´on de la funci´ on en cuesti´on respecto de la variable   indicada tomando como constantes indica la derivada de f respecto de el resto de variables. Por ejemplo, ∂f ∂g g tomando h, x1 y x2 como constantes. Aunque en el ejemplo no lo hayamos hecho, en general indicaremos las variables a tomar como constantes mediante sub´ındices en la derivada parcial. En general, dada una diferencial, df ({x}) = F1 (x1 , x2 , . . . , xn ) dx1 + . . . + Fn (x1 , x2 , . . . , xn ) dxn , ´esta ser´a exacta si se verifica:  Fi (x1 , x2 , . . . , xn ) =

∂f ({x}) ∂xi

 . xj=i

´ CAP´ITULO 1. TERMODINAMICA I

6

Donde el sub´ındice xj=i indica que al implementar la derivada tomaremos como constantes todas las xj con j diferente de i. Adem´as, se debe cumplir el llamado teorema de Schwartz que establece que puesto que,  2    2 ∂ f ({x}) ∂ f ({x}) = ∂xi ∂xk xj=i ,xj=k ∂xk ∂xi xj=k ,xj=i entonces,



∂Fi ∂xk



 = xj=k

∂Fk ∂xi

 . xj=i

Problema. ¿Es la siguiente diferencial exacta?

df = 2x1 x2 dx1 + x21 + 1 dx2 . Soluci´ on. Como vemos, F1 = 2x1 x2 ,

F2 = x21 + 1 . De donde, ∂F2 ∂F1 = = 2x1 . ∂x2 ∂x1 La diferencial verifica entonces el teorema de Schwartz y podemos afirmar que es exacta.

Dado un sistema, cuando el conjunto de variables que determinan su estado energ´etico no var´ıa con el tiempo y son uniformes, decimos que se encuentra en amica cl´asica es la Terun estado de equilibrio termodin´amico2 . La Termodin´ modin´ amica de los estados de equilibrio; asume que los procesos que conectan estados intermedios son cuasiest´aticos: se realizan lo suficientemente despacio como para que en cada instante el sistema est´e acomodado al equilibrio 2 El equilibrio termodin´ amico implica el equilibrio mec´ anico (P constante e uniforme) y t´ermico (T constante e uniforme).

´ DE ESTADO DEL GAS IDEAL 1.2. ECUACION

7

termodin´amico correspondiente. Podemos adem´as diferenciar entre procesos reversibles e irreversibles. En los primeros es posible invertir una transformaci´on resultante de modificar infinitesimalmente las variables termodin´amicas, en los segundos no. Todo proceso reversible es cuasiest´atico pero un proceso cuasiest´atico no tiene porque ser reversible. Los procesos cuasiest´aticos y reversibles son idealizaciones que resultan u ´tiles tal y como lo son en Mec´anica las poleas y cuerdas sin peso.

1.2.

Ecuaci´ on de Estado del Gas Ideal

Tal y como hemos mencionado, la Termodin´amica debe su desarrollo a la m´aquina de vapor. De este modo, es habitual que la manera de presentar esta disciplina sea a trav´es de las transformaciones que sufren los gases. Aqu´ı tomaremos tambi´en ese modo de introducir esta disciplina. Supongamos entonces un gas que llamaremos ideal. Un gas ideal es una extrapolaci´on de c´ omo se comportan los gases en el l´ımite de presi´on nula. Todos los gases a baja presi´on (y/o alta temperatura) se comportan (casi) idealmente. Trabajando en ese r´egimen de condiciones, R. Boyle descubri´ o que en una situaci´on de equilibrio, un gas a temperatura constante verifica que, vP = C1 , donde v = V /n es el llamado volumen molar siendo V el volumen ocupado por el gas, n las moles de gas y C1 una constante. Recordamos aqu´ı, que un mol es el n´ umero de Avogadro de elementos en cuesti´on, siendo el n´ umero de 23 Avogadro NA = 6,022 · 10 . El peso molecular de una substancia est´ a definido como el peso en gramos de un mol de la substancia. Por ejemplo, un mol de ´atomos de carbono tiene una masa de 12 gramos. Posteriormente, J. L. Gay-Lussac descubri´o que si lo que se mantiene constante es la presi´on, entonces los gases ideales verifican en equilibrio que, v = C2 , T siento T la temperatura y C2 otra constante. Por u ´ltimo, J. W. Gibbs deriv´ o una sencilla regla, la regla de las fases, que establece lo siguiente: dadas s especies qu´ımicamente independientes en equiumero de variables intensivas librio que se presentan en p fases3 , entonces, el n´ 3 En el caso general de un sistema heterog´eneo, denominamos fase a cada parte homog´enea y separable del sistema.

´ CAP´ITULO 1. TERMODINAMICA I

8

independientes, m, que determinan el estado de equilibrio del sistema es, m = 2 + s − p.

Problema. Las prote´ınas tienen tama˜ nos t´ıpicos del orden de 1nm (1nm = 10−9 m) y masas de 10kDa (el Dalton es una unidad est´andar de masa en Qu´ımica y Biolog´ıa y equivale a la masa de un a´tomo de hidr´ ogeno: 1Da = 1,67 · 10−27 kg). Ciertos resultados experimentales muestran que 0,5 moles de una prote´ına pesan 213g. ¿Es esta prote´ına m´ as o menos masiva que una prote´ına t´ıpica? Soluci´ on. El peso en Daltons de los 0,5 moles de prote´ına es, 213g ×

1Da = 1,28 · 1026 Da. 1,67 · 10−24 g

De este modo el peso de una prote´ına es, 1mol Da kDa 1,28 · 1026 Da × = 212 = 0,212 . 23 0,5mol 6,022 · 10 prot. prot. prot. As´ı pues se trata de una prote´ına con menos masa que una prote´ına t´ıpica.

En el caso de un gas ideal s = p = 1 y por tanto m = 2. Notemos que el volumen molar es una funci´ on de estado ya que verifica que, 

b

dv = v (b) − v (a) .

a

Entonces, P y T deben ser variables de estado y v = v (P, T ) debe verificar que,     ∂v dv dP + dT , dv = dP T ∂T P para poseer una diferencial exacta. De acuerdo con las leyes experimentales

´ DE ESTADO DEL GAS IDEAL 1.2. ECUACION

9

de Boyle y Gay-Lussac,  C1 v dv =− 2 =− , dP T P P   v ∂v = C2 = , ∂T P T 

de donde, dP dT dv =− + . v P T Integrando ambos miembros obtenemos finalmente la ecuaci´on de estado de un gas ideal4 , P V = nRT , (1.1) donde R es la llamada constante de los gases que puede ser determinada experimentalmente: R = 8,31J · K −1 · mol−1 ≈ 2cal · K −1 · mol−1 . Si un gas verifica (1.1) entonces se le denomina ideal.

Problema. Se dispone de 12g de un gas ideal con peso molecular (56g/mol). El gas se encuentra en un contenedor de 100cm3 a 105 P a de presi´on, ¿a qu´e temperatura se encuentra el gas? Soluci´ on. Calculamos primero los moles de gas de los que disponemos, 12g ×

1mol = 0,21moles. 56g

Utilizando la ley de los gases ideales, −6

3

105 P a × 100cm3 × 10cmm PV 3 = = 5,7K. T = −1 nR 0,21mol × 8,31J · K · mol−1

4

La integral, Z

b a

dx b = ln x|ba = ln b − ln a = ln , x a

aparece de forma habitual en Termodin´ amica.

10

1.3.

´ CAP´ITULO 1. TERMODINAMICA I

El Primer Principio de la Termodin´ amica

El principio de la conservaci´ on de la energ´ıa establece que la energ´ıa a trav´es de sus transformaciones ni se crea ni se destruye: la energ´ıa se conserva. El Primer Principio de la Termodin´ amica no es m´as que el principio de conservaci´on de la energ´ıa aplicado a sistemas termodin´amicos. Si denominamos U a la energ´ıa de un sistema, la llamada energ´ıa interna, el Primer Principio de la Termodin´amica establece que la variaci´on de energ´ıa del sistema m´ as la variaci´on de la energ´ıa del entorno debe ser cero. Es decir si hemos quitado una cierta cantidad de energ´ıa al entorno y la hemos transferido al sistema, el sistema debe aumentar su energ´ıa en esa misma cantidad, lo mismo es cierto para cuando el sistema transfiere energ´ıa al entorno. Es importante hacer notar que el Primer Principio no hace referencia al tipo de procesos o transformaciones: la energ´ıa del conjunto sistema m´as entorno siempre se conserva. Las formas habituales de transferir energ´ıa entre el sistema y el entorno son mediante el calor y/o el trabajo. Debemos aclarar que el calor y el trabajo no constituyen en s´ı mismos formas de energ´ıa sino que dan nombre a maneras de transferir la misma: los sistemas no almacenan calor o trabajo sino que transfieren energ´ıas entre ellos y su entorno mediante esos procedimientos. Cuando calentamos (enfriamos) un objeto lo que hacemos es transferir energ´ıa utilizando el hecho de que se encuentra a un temperatura menor (mayor) que el objeto que transfiere. De igual modo, cuando un sistema realiza un trabajo transfiere energ´ıa a su entorno mediante este procedimiento. Teniendo en cuenta estas formas de transferencia energ´etica (puede haber m´as), el Primer Principio de la Termodin´ amica se suele expresar como, ΔU = W + Q.

(1.2)

Donde W y Q representan las energ´ıas transferidas entre el sistema y su entorno mediante trabajo y calor respectivamente. Tomaremos el siguiente criterio de signos para el calor y el trabajo. Puesto que al calentar un sistema le estamos transfiriendo energ´ıa, debe aumentar la energ´ıa interna y por tanto en ese caso Q > 0 (procesos endot´ermicos). Por el contrario, si es el sistema quien transfiere energ´ıa al entorno en forma de calor Q < 0 (procesos exot´ermicos). En cuanto al trabajo, si el entorno realiza un trabajo sobre el sistema entonces ´este aumenta su energ´ıa, W > 0, mientras que si es el sistema el que realiza un trabajo sobre el entorno, lo hace a consta de disminuir su energ´ıa y por tanto W < 0. En ciertas ocasiones, especialmente las relacionadas con m´aquinas t´ermicas, es conveniente referirse al trabajo desde el punto de vista del entorno como receptor de la energ´ıa que en forma de trabajo se transfiere

´ 1.3. EL PRIMER PRINCIPIO DE LA TERMODINAMICA

11

otese que Wu´til = −W y que por tanto desde el sistema: trabajo u ´til, Wu´til . N´ el Primer Principio en t´erminos de Wu´til se escribe como, ΔU = Q − Wu´til . Un gran n´ umero de tratados de Termodin´ amica adquieren este punto de vista “egoista” en lo referente a expresar el Primer Principio5 . Notemos que mientras que la energ´ıa interna es una funci´ on de estado, el calor y el trabajo no lo son, ya que la cantidad de energ´ıa que se transfiere entre el sistema y el entorno depende no s´olo de los estados inicial y final sino del tipo de proceso que conecta esos estados. De este modo, en un ciclo ΔU = 0: puesto que el estado inicial y final son el mismo, tambi´en lo ser´a su energ´ıa y de este modo W = −Q, es decir, en un ciclo la energ´ıa transferida del sistema al entorno en forma de trabajo es igual a la energ´ıa transferida del entorno al sistema en forma de calor. Con el fin de recordar esta diferencia entre magnitudes que poseen diferenciales exactas, como la energ´ıa interna, y las que no, como el calor y trabajo, utilizaremos s´ımbolos diferentes (d y δ respectivamente) al referirnos a una variaci´on infinitesimal. As´ı, escribimos el Primer Principio en forma diferencial como: dU = δW + δQ.

Problema. Debido a una transformaci´ on termodin´ amica, la energ´ıa interna de un sistema var´ıa en −2cal. Si durante esa transformaci´ on se transfieren al sistema 3J de energ´ıa en forma de calor, ¿cu´ al, y en qu´e sentido, ha sido la energ´ıa transferida en forma de trabajo? Soluci´ on. Puesto que, ΔU = −2cal = −2cal ×

1J = −0,48J, 4,18cal

aplicando el Primer Principio, W = ΔU − Q = −0,48J − 3J = −3,48J, es decir, el sistema ha transferido 3,48J de energ´ıa al entorno en forma de trabajo. 5

En algunos tratados de Termodin´ amica, especialmente los orientados desde el punto de vista de la Ingenier´ıa, el concepto de trabajo u ´til se aplica al realizado sobre el entorno siempre y cuando ´este no provenga de un proceso de expansi´ on: trabajo no hidrost´ atico.

´ CAP´ITULO 1. TERMODINAMICA I

12

1.3.1.

Capacidad Calor´ıfica y Calor Espec´ıfico

De acuerdo con el concepto de calor, cuando transferimos una cantidad diferencial de energ´ıa en forma de calor entre un sistema y su entorno se produce una variaci´ on en la temperatura de forma que, δQ = CdT . A la constante de proporcionalidad se le llama capacidad calor´ıfica y mide lo “sensible” que es un sistema a variar su temperatura cuando le transferimos energ´ıa mediante calor. Si tenemos dos materiales, dado el mismo aporte de energ´ıa en forma de calor, al material con una C m´as elevada le costar´a m´as modificar su temperatura una determinada cantidad que al material con una C inferior. Cuando dicha transferencia se realiza a presi´ on constante o a volumen constante hablamos de capacidad calor´ıfica a presi´ on constante o a volumen constante,     δQ δQ , CV = . CP = dT P dT V Llamamos calor espec´ıfico a la capacidad calor´ıfica por unidad de masa. Si la unidad de masa elegida es el mol hablamos de calores molares, cX , donde X representa P o V : cX = CX /n. La Teor´ıa Cin´etica de gases permite estimar los valores de los calores molares a presi´on y volumen constante arrojando el sorprendente resultado de que dependen exclusivamente de la atomicidad del gas en cuesti´on. As´ı, se encuentra que para gases monoat´omicos, 5 3 cP = R, cV = R. 2 2 En cuanto a los gases diat´omicos, 7 5 cP = R, cV = R. 2 2 N´otese que con independencia de la atomicidad del gas se verifica la llamada relaci´on de Mayer, (1.3) cP − cV = R. Como veremos, en algunas ocasiones es u ´ til expresar resultados en t´erminos atico. del cociente adimensional γ = cP /cV denominado coeficiente adiab´

´ 1.3. EL PRIMER PRINCIPIO DE LA TERMODINAMICA a)

13

b) Entorno

P

Isocora

Isobara

Sistema

Isote rma Adiab atica

V

Figura 1.2: a) Un pist´on constituye un sistema modelo en numerosas situaciones termodin´amicas. Al ´embolo se le supone ideal de forma que no hay rozamiento cuando ´este se desplaza permitiendo cambios de volumen en el sistema. b) Representaci´on esquem´atica de las transformaciones termodin´amicas t´ıpicas que sufre un gas ideal. El ´area contenida debajo de cada una de las curvas es la energ´ıa transferida entre el entorno y el sistema en forma de trabajo (trabajo u ´til). Dependiendo del signo de la transformaci´ on esta energ´ıa ser´a positiva o negativa (ver texto). N´otese que s´olo en el caso de una transformaci´on isocora el trabajo es nulo al no variar el volumen.

1.3.2.

Aplicaci´ on del Primer Principio a un Gas Ideal

Con el fin de ilustrar el manejo del Primer Principio, calcularemos los valores de la energ´ıa interna, el trabajo y el calor para algunas transformaciones t´ıpicas. Nuestro punto de partida es un gas ideal dentro de un pist´on que supondremos tambi´en ideal, sin rozamiento (Fig. 1.2a). Recordemos primeramente que la definici´on de trabajo es, → → − δW = F · d− r, → − donde F representa la fuerza total que act´ ua sobre el sistema. La fuerza → − → − → − ejercida sobre el gas es F = P S = −P S n , donde P es la presi´on, S es → la superficie del pist´ on, y − n un vector unitario perpendicular a S. Entonces, el trabajo realizado se puede expresar como, δW = −P dV y el trabajo total realizado en una transformaci´on es,  b P dV , (1.4) W =− a

si Va < Vb (expansi´on) entonces W < 0 mientras que si Va > Vb (compresi´on) entonces W > 0 puesto que el sistema gana energ´ıa.

´ CAP´ITULO 1. TERMODINAMICA I

14

Problema. La capacidad calor´ıfica molar de la urea, CO (N H2 ), es de 93,14J · K −1 · mol−1 . Si aportamos 4cal de energ´ıa en forma de calor a 2 moles de urea ¿cu´antos grados aumenta su temperatura? Por otro lado, el benceno, C6 H6 , tiene una capacidad calor´ıfica molar de 136,1J · K −1 · mol−1 . Para producir un incremento de temperatura equivalente al generado en la urea ¿cu´ anta energ´ıa en calor´ıas deberemos aportar a 3 moles de benceno en forma de calor? Soluci´ on. El incremento de temperatura producido en la urea es, 1J 4cal × 4,18cal Q = 5 · 10−3 K. = ΔT = C 2mol × 93,14J · K −1 · mol−1

Para generar el mismo incremento de temperatura en la muestra de benceno deberemos aportar, Q = CΔT = 3mol × 136,1J · K −1 · mol−1 × 5 · 10−3 K = 2,1J = 4,18cal = 8,8cal. = 2,1J × 1J

Transformaci´ on isocora. En el caso de una transformaci´on isocora W = 0 on trivial del Primer Principio arroja puesto que Va = Vb y una aplicaci´ como resultado que dU = δQ. Es decir, toda la variaci´ on de la energ´ıa interna del sistema se debe a la transferencia de energ´ıa entre el sistema y su entorno mediante calor. Por tanto podemos expresar CV como,     δQ dU = , (1.5) CV = dT V dT V o lo que es lo mismo, dU = CV dT ,  b CV dT . ΔU = a

Puesto que para un gas ideal CV es una constante, este resultado nos indica que la variaci´on de su energ´ıa interna es proporcional a la variaci´ on de

´ CAP´ITULO 1. TERMODINAMICA I

16

Substituyendo esta ultima expresi´on en (1.6) y recordando de nuevo la relaci´on de Mayer (1.3), obtenemos que, V P = −γ , dP dV la integraci´ on de esta ecuaci´on proporciona el siguiente resultado, P V γ = constante.

(1.8)

En particular, en una transformaci´ on adiab´atica se debe cumplir que γ γ Pa Va = Pb Vb . As´ı pues, podemos eliminar una de las variables que figuran en (1.7), por ejemplo, Pa , y reescribir el trabajo de un proceso adiab´ atico como,   cV Pb Vb − Vbγ /Vaγ−1 . W = R Podemos resumir los resultados obtenidos en la siguiente tabla,

Isocora Adiab´ atica Isoterma Isobara

W 0 cV Pb (Vb −Vbγ /Vaγ−1 ) R −nRTa ln (Vb /Va )

−Pa (Vb − Va )

Q

ΔU

cV Va (Pb −Pa ) R

cV Va (Pb −Pa ) R cV Pb (Vb −Vbγ /Vaγ−1 ) R

0 nRTa ln (Vb /Va ) cP Pa (Vb −Va ) R

0 cV Pa (Vb −Va ) R

De un modo intencionado hemos escrito W , Q y ΔU en terminos de P y V . Alternativamente, pod´ıamos haber elegido P y T o P y V en virtud de la ecuaci´ on (1.1). El motivo de nuestra elecci´on es el siguiente. Es u ´ til realizar representaciones gr´aficas de las transformaciones termodin´amicas y uno de los sistemas de representaci´on m´as habituales es el de Clapeyron o diagrama P − V (de Presi´on-Volumen). La figura 1.2b muestra, de acuerdo con las ecuaciones (1.1) y (1.8), transformaciones isotermas, isobaras, isocoras y adiab´aticas de un gas ideal en un diagrama P − V . N´ otese que si comparamos en un diagrama P − V una isoterma con una adiab´ atica, la primera se corresponde con P ∝ 1/V mientras que la segunda con P ∝ 1/V γ . Puesto que γ > 1, la pendiente en el caso de una transformaci´ on adiab´atica es m´as negativa que en el caso de la isoterma.

´ 1.3. EL PRIMER PRINCIPIO DE LA TERMODINAMICA

17

Problema. 5 moles de un gas ideal monoat´omico se encuentran a 35◦ C. Una compresi´on isobara a 106 P a enfr´ıa el gas hasta reducir su temperatura a 15◦ C. En ese momento, se somete el gas a una transfomaci´on isocora hasta que su presi´on se eleva al doble. ¿cu´al es el trabajo realizado por el gas?, ¿cu´ anta energ´ıa se transfiere en forma de calor entre el sistema y el entorno?, ¿cu´ anto var´ıa la energ´ıa interna del gas? Soluci´ on. Primeramente calculamos el volumen que ocupa el gas en la situaci´ on inicial, V1 =

nRT1 5mol × 8,31J · K −1 · mol−1 × 308K = 1,3 · 10−2 m3 . = P1 106 P a

La transformaci´on isobara reduce el volumen del gas a, V2 =

nRT2 5mol × 8,31J · K −1 · mol−1 × 288K = 1,2 · 10−2 m3 . = P1 106 P a

Durante este proceso el trabajo y calor transferidos son, W1→2 = −P1 (V2 − V1 ) = 106 P a × 10−3 m3 = 103 J, 5 cP P1 (V2 − V1 ) = − × 106 P a × 10−3 m3 = −2,5 · 103 J. Q1→2 = R 2 De donde la variaci´on de energ´ıa interna es, ΔU1→2 = W1→2 + Q1→2 = −1,5 · 103 J. La subsecuente transformaci´on isocora eleva la presi´on a 2 · 106 P a y no produce trabajo. La energ´ıa transferida en forma de calor es, Q2→3 =

3 cV V2 (P3 − P2 ) = × 1,2 · 10−2 m3 × 106 P a = 4,1 · 104 J. R 2

Esta energ´ıa es tambi´en lo que ha variado la energ´ıa interna del gas. De este modo, en el conjunto de las dos transformaciones, W = W1→2 = 103 J. Q = Q1→2 + Q2→3 = 3,8 · 104 J. ΔU = ΔU1→2 + ΔU2→3 = 3,9 · 104 J.

18

´ CAP´ITULO 1. TERMODINAMICA I

Otro elemento u ´ til de los diagramas P − V es que de acuerdo con la ecuaci´on (1.4), la cantidad de energ´ıa transferida entre sistema y entorno mediante el trabajo es el ´area definida por la curva que representa una transformaci´ on. El signo del trabajo depende del sentido de la transformaci´ on. En un diagrama P − V , un ciclo est´a representado por una trayectoria cerrada tal que el estado inicial y el final son los mismos y por tanto ΔU = 0. Llamaremos m´aquina t´ermica a aquel dispositivo que se comporte de manera c´ıclica. Si el ciclo se recorre en sentido antihorario el ´area encerrada ser´a negativa y por tanto el trabajo ser´ a positivo de acuerdo con el criterio de signos utilizado: se transfiere energ´ıa del entorno al sistema en forma de trabajo, W > 0, y puesto que ΔU = 0, entonces Q < 0 (se transfiere energ´ıa del sistema al entorno en forma de calor). Por el contrario, si el ciclo se recorre en sentido horario, ser´a el sistema el que transfiera energ´ıa en forma de trabajo al entorno a costa de que el entorno transfiera energ´ıa al sistema en forma de calor.

1.3.3.

Variaci´ on de la Temperatura Atmosf´ erica con la Altura

Es un hecho comprobado que los organismos responden y se adaptan a las condiciones del medio. Por ejemplo, la temperatura del entorno condiciona el metabolismo celular produciendo fen´omenos como la hibernaci´on. A nivel evolutivo, esta adecuaci´on produce nuevas especies m´as adaptadas al entorno y explica en parte porqu´e para una misma localizaci´ on geogr´afica las especies que encontramos a nivel del mar son diferentes a las que podemos encontrar en cotas de altura m´as elevadas donde la temperatura es menor. Pero ¿por qu´e y c´omo depende la temperatura atmosf´erica de la altura condicionando de este modo la vida? Suponiendo que en el r´egimen de presiones y temperaturas de inter´es el aire se comporta como un gas ideal y puesto que en las partes altas de la atm´osfera la presi´on es menor, una aplicaci´ on trivial de la ecuaci´ on (1.1) nos dice que a menor presi´on mayor volumen, es decir, el aire en las partes altas de la atm´osfera se expande. El aire es un mal conductor del calor y entonces podemos asumir que ese proceso de expansi´on mientras disminuye la presi´on se realiza de forma adiab´ atica. De este modo, se debe verificar que la cantidad P V γ es constante. Puesto que P V = nRT , encontramos que durante la expansi´ on adiab´ atica sufrida por el aire de la atm´ osfera T ∝ V 1−γ . Como γ > 1, la temperatura del aire debe disminuir a medida que la altura aumenta. Podemos estimar dicha variaci´ on del siguiente modo. La variaci´ on de la presi´on con la altura, h, es ΔP = −gρΔh, donde g es la gravedad y ρ la densidad del aire.

´ 1.3. EL PRIMER PRINCIPIO DE LA TERMODINAMICA

19

Una variaci´ on infinitesimal de presi´on la podemos expresar entonces como dP = −gρdh. Por otro lado, ρ = m/V que podemos expresar en funci´ on de P y de T aplicando la ecuaci´ on de estado de un gas ideal, es decir, ρ = mP/ (nRT ) = M P/RT donde M es la masa de un mol de aire. As´ı, dP = −

gM P dh. RT

(1.9)

Hasta este momento no hemos utilizado en el c´alculo el hecho de que el proceso en cuesti´on sea adiab´atico; utilizando (1.8) obtenemos que,   nRT γ = P 1−γ T γ = constante, PV γ = P P o lo que es lo mismo, P

1−γ γ

T = constante,

de donde aplicando la diferencial,   1−2γ 1−γ 1−γ P γ T dP + P γ dT = 0, γ es decir,

γ − 1 dP dT = . T γ P

Combinando esta u ´ ltima ecuaci´ on con (1.9) llegamos a la ecuaci´on diferencial que relaciona T con h, 1 − γ gM dT = . dh γ R Suponiendo el aire como un gas diat´ omico compuesto en un 80 % por nitr´ogeno y un 20 % de ox´ıgeno, γ = 7/5 y M = 0,2 · MO2 + 0,8 · MH2  3 · 10−2 kg/mol. Adem´as g  10m/s2 de donde, dT  −10−2 K/m = −10K/km. dh Es decir la temperatura disminuye aproximadamente 10 grados (Kelvin o Celsius) por kil´ometro lo cual explica las bajas temperaturas que se registran a medida que nos acercamos a las capas altas de la atm´osfera. De cualquier modo, esa estimaci´on sobrevalora la disminuci´ on t´ermica. El principal motivo es que el aire, seg´ un disminuye su temperatura, se aleja del comportamiento ideal que le hemos supuesto.

20

1.4.

´ CAP´ITULO 1. TERMODINAMICA I

El Segundo Principio de la Termodin´ amica

El Primer Principio de la Termodin´ amica establece la imposibilidad de sacar energ´ıa de donde no la hay: la energ´ıa, recordemos, se transforma pero no se crea ni se destruye. Esta restricci´on elimina la posibilidad de dise˜ nar una m´aquina t´ermica que cree energ´ıa, los llamados perpetuum mobile (m´ovil perpetuo) de primera especie. Ahora bien, el Primer Principio no establece ninguna limitaci´ on en cuanto a c´ omo pueden ser las transformaciones de la energ´ıa con tal de que ´esta se conserve. Podemos ciertamente transferir energ´ıa a un sistema en forma de trabajo, por ejemplo, frot´andolo, y como resultado transferir energ´ıa en forma de calor del sistema al entorno. Hasta aqu´ı no hay ning´ un problema. Imaginemos ahora la siguiente situaci´ on. De acuerdo con el Primer Principio es posible transferir energ´ıa de un entorno a un sistema en forma de calor, Q > 0, y utilizar esa energ´ıa recibida para transferir energ´ıa del sistema al entorno en forma de trabajo, W < 0. Por ejemplo, una masa en reposo en el suelo podr´ıa recojer energ´ıa de su entorno y utilizar el aumento de su energ´ıa interna para elevarse. Si ahora la masa cae regresando a la posici´on inicial, podr´ıamos utilizar la disminuci´on de su energ´ıa potencial acumulada para realizar trabajo u ´til. De esta manera, c´ıclicamente, podr´ıamos utilizar la energ´ıa transferida en forma de calor del entorno para realizar trabajo. Sin embargo, la experiencia nos dice que este tipo de procesos no ocurren. El Segundo Principio de la Termodin´ amica pone de manifiesto esta asimetr´ıa de la naturaleza y elimina la posibilidad de construir m´aquinas t´ermicas que nieguen esa asimetria, los llamados perpetuum mobile de segunda especie. Existen varios enunciados del Segundo Principio, todos ellos equivalentes aunque no sea a primera vista evidente. El enunciado de Kelvin establece que: Dado un sistema y su entorno, es imposible realizar una transformaci´ on termodin´ amica cuyo u ´nico resultado final sea la transferencia de energ´ıa en forma de calor desde el entorno al sistema y transferir integramente en forma de trabajo esa energ´ıa desde el sistema al entorno. Una palabra clave en el enunciado es “´ unico”. Pensemos por ejemplo en un gas ideal contenido en un ´embolo tal que nuestro sistema y su entorno se encuentren a la misma temperatura. El gas puede ciertamente expandirse de una manera isoterma. Puesto que su temperatura no var´ıa, tampoco lo hace su energ´ıa interna y de este modo W = −Q. Es decir se transfiere energ´ıa del entorno al sistema en forma de calor y ´este se utiliza para realizar una transferencia de energ´ıa del sistema al entorno en forma de trabajo. Aparentemente

´ 1.4. EL SEGUNDO PRINCIPIO DE LA TERMODINAMICA

21

este resultado estar´ıa en contradicci´ on con el enunciado de Kelvin. Sin embargo, el resultado de la transformaci´ on no es u ´nicamente esa transformaci´on de calor en trabajo, algo m´as ha cambiado: el volumen ocupado por el gas ha aumentado. Por tanto, el estado final y el inicial son diferentes, la transformaci´ on es ciertamente posible, y no est´a en contradicci´on con el Segundo Principio. Otro enunciado alternativo del Segundo Principio es el de Clausius: Dado un sistema y su entorno tales que la temperatura del primero sea mayor (menor) que la del segundo, es imposible realizar una transformaci´ on termodin´ amica cuyo u ´nico resultado final sea la transferencia de energ´ıa en forma de calor desde el entorno al sistema (desde el sistema al entorno). Es decir, que por ejemplo ocurra que el sistema se caliente m´as a costa de enfriar m´ as el entorno. N´otese que de nuevo el enunciado habla de resultados netos: “´ unico resultado final”.

1.4.1.

M´ aquinas Reversibles

De acuerdo con los enunciados de Kelvin y Clausius en una m´ aquina t´ermica son necesarios, al menos, dos focos t´ermicos a diferentes temperaturas e intercambiando energ´ıa en forma de calor con nuestro sistema para poder ˙ obtener “trabajo” del “calor”Imaginemos entonces dos focos t´ermicos a temperaturas T1 y T2 donde T2 > T1 . Podemos transferir una energ´ıa Q2 > 0 del foco caliente, T2 , al sistema, despu´es transferir una parte de esa energ´ıa al entorno en forma de trabajo, W < 0, y otra parte, Q1 < 0, podemos transferirla al foco t´ermico fr´ıo T1 en forma de calor (Fig. 1.3). El sistema puede realizar c´ıclicamente esta tarea volviendo al final de cada ciclo al estado inicial (m´aquina t´ermica) y por tanto ΔU = 0. Entonces, de acuerdo con el Primer Principio, en cada ciclo se verifica que, ΔU = 0 = − |W | + Q2 − |Q1 | , es decir, la energ´ıa recibida por el entorno en forma de trabajo por cada ciclo es, Wu´til = |W | = Q2 − |Q1 | . Podemos definir el rendimiento como el cociente entre la energ´ıa que recibe el entorno del sistema en forma de trabajo (trabajo u ´til) y la energ´ıa recibida

´ CAP´ITULO 1. TERMODINAMICA I

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T2 Q2 ! 0 Sistema

W 0

Q1  0

T1

Figura 1.3: Para poder obtener trabajo del calor de manera c´ıclica son al menos necesarios dos focos t´ermicos con los cuales intercambiar energ´ıa. En esta representaci´ on esquem´atica, el sistema toma energ´ıa del foco t´ermico caliente, T2 , que utiliza para, por un lado transferir energ´ıa en forma de trabajo al entorno, y por otro devolver parte al foco t´ermico frio, T1 .

por el sistema del entorno en forma de calor, −W Wu´til = = Q2 Q2 |Q1 | Q2 − |Q1 | =1− . = Q2 Q2

η=

Puesto que |Q1 | < Q2 , el rendimiento de una m´aquina t´ermica es siempre menor que la unidad: no podemos transformar todo el calor en trabajo. Ahora bien ¿cu´al es la mejor m´aquina t´ermica? Como mostraremos a continuaci´on, la mejor m´aquina t´ermica es aquella que funciona en condiciones reversibles. Para demostrarlo realizemos el siguiente experimento. Tomemos un gas ideal contenido en un cilindro de paredes adiab´ aticas con un ´embolo. Supongamos adem´as que el ´embolo est´a perfectamente lubricado de forma que no ejerce ning´ un rozamiento. Encima del ´embolo podemos poner una masa m hasta que se alcance una situaci´on de equilibrio (Fig. 1.4). El objetivo del experimento es elucidar bajo qu´e condiciones se puede elevar la masa m lo m´aximo posible, es decir, c´omo podemos utilizar la energ´ıa interna contenida en el gas de un modo o´ptimo para producir una transferencia m´axima de energ´ıa del sistema al entorno en forma de trabajo. Puesto que la situaci´on descrita es de equilibrio, es evidente que el ´embolo no se mover´a hasta retirar la masa. Si deslizamos ´esta hacia un lado, el ´embolo subir´ a de golpe y encontrar´ a una nueva posici´ on de equilibrio. Sin embargo, este procedimiento no ha elevado en absoluto la masa. Si dividimos la masa m en dos pedazos

´ 1.4. EL SEGUNDO PRINCIPIO DE LA TERMODINAMICA

23

con masas m/2 podr´ıamos deslizar primero una mitad, esperar que el ´embolo suba y encuentre una nueva situaci´ on de equilibrio y entonces deslizar la otra mitad. Esta manera de proceder es claramente mejor que la anterior porque al menos hemos sabido como utilizar la energ´ıa interna del gas para elevar una parte de la masa.

Problema. Una m´ aquina t´ermica intercambia energ´ıa con dos focos. Al cabo de 5 ciclos el foco caliente ha proporcionado 10cal de energ´ıa mientras que el foco fr´ıo ha recibido en 2 ciclos 2cal. ¿Cu´ al es el rendimiento del ciclo?, ¿cu´al es el trabajo u ´til producido en 7 ciclos? Soluci´ on. En un ciclo la energ´ıa intercambiada con cada foco es, Foco caliente:

2cal 10cal = 2cal, Foco frio: = 1cal. 5 2

De este modo el rendimiento es, η=

2cal − 1cal Q2 − |Q1 | = 0,5 = 50 %. = Q2 2cal

El trabajo u ´til por ciclo es, Wu´til = ηQ2 = 0,5 × 2cal = 1cal. As´ı pues, en 7 ciclos genera 7 calor´ıas de trabajo u ´til (transferidas del sistema al entorno).

Claramente podemos hacerlo a´ un mejor si dividimos la masa en pedazos con masas m/4, e incluso mejor si los pedazos son de m/8, y as´ı sucesivamente. En el l´ımite, vemos que la mejor manera de proceder para aprovechar de manera ´optima la energ´ıa interna contenida en el gas, para transferir el m´ aximo de energ´ıa en forma de trabajo del sistema al entorno, es retirar diferenciales (pedazos infinitesimales) de masa. Tambi´en es f´acil ver que s´ olo en esta situaci´on el proceso es reversible. En la primera experiencia, cuando ten´ıamos la masa m sin dividir, si quisi´eramos ir marcha atr´as despu´es de haber deslizado la masa, tenemos que aportar energ´ıa a la masa o al gas, porque el ´embolo est´a arriba

´ CAP´ITULO 1. TERMODINAMICA I

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m

m

A

m

m 2

m 2

m

B

m 2

m 2 m m 2 2

m m

m

m

Figura 1.4: A: La mejor manera de aprovechar la energ´ıa interna acumulada para realizar trabajo es mediante transformaciones reversibles. Seg´un se divida la masa en pedazos cada vez m´as peque˜nos, seremos capaces de realizar m´as trabajo u ´til. En el l´ımite en que las divisiones son infinitesimales, el trabajo obtenido es m´aximo y el proceso reversible. B: Ejemplo de una expansi´ on y compresi´on irreversible. No debemos confundir el hecho de que el gas recupere su estado inicial con que el proceso sea reversible. El concepto de reversibilidad involucra tambi´en a las masas.

y la masa abajo. La situaci´on es entonces no reversible. Sin embargo, en el l´ımite de divisiones infinitesimales, el u ´ ltimo “trocito” quedar´a a la altura del ´embolo que habr´ a ido subiendo poco a poco a medida que hemos ido retirando pedazos infinitesimales de masa. As´ı, sin aportar energ´ıa extra podemos deslizarlo sobre el ´embolo que bajar´ a un poco, lo suficiente como para poner otro nuevo trocito de masa diferencial y as´ı suces´ıvamente hasta volver a la situaci´on inicial. No debe confundirnos que el proceso sea c´ıclico en lo que respecta al ´embolo con que el proceso reversible. La figura 1.4 muestra un ejemplo de proceso que devuelve el ´embolo a la posici´on inicial y que sin embargo es no reversible tal y como evidencian las posiciones iniciales y finales de las masas. Los resultados de estos experimentos son extrapolables y podemos concluir que la mejor m´aquina t´ermica ser´a aquella que trabaje en condiciones reversibles. No obstante, hay muchas m´aquinas t´ermicas, de hecho infinitas, que pueden trabajar en condiciones reversibles entre dos focos t´ermicos T1 y T2 , ¿cu´al de ellas es la mejor?; en el caso de los gases, ¿es mejor un gas monoat´omico o diat´ omico?, ¿qu´e ciclos proporcionan una mayor eficiencia? Para dar respuesta a estas preguntas estudiaremos a continuaci´on una m´ aquina t´ermica concreta

´ 1.4. EL SEGUNDO PRINCIPIO DE LA TERMODINAMICA

P

P2

P1'

25

2

1'

P2'

2' W 0

P1

1 V2 V1'

V2' V1

V

Figura 1.5: El ciclo de Carnot. El ciclo se realiza reversiblemente en cuatro etapas dos de ellas isot´ermicas y otras dos adiab´aticas.

mediante la cual podemos comparar otras m´aquinas: la basada en el ciclo de Carnot.

1.4.2.

El Ciclo de Carnot

Supongamos entonces una m´ aquina ideal, sin rozamiento, donde todas las transformaciones sean reversibles. Un ejemplo de esta idealizaci´on es el llamado ciclo de Carnot. En la figura 1.5 encontramos una representaci´ on de este ciclo en un diagrama P − V . Disponemos de un gas ideal dentro de un cilindro con un ´embolo tal que el sistema puede intercambiar energ´ıa con dos focos on inicial es tal que t´ermicos T1 y T2 donde T2 > T1 . Imaginemos que la situaci´ el gas se encuentra a una presi´on P1 ocupando un volumen V1 y a temperatura T1 . Primeramente sometemos al gas a una compresi´on isot´ermica hasta que ocupa un volumen V1 a presi´ on P1 . Durante esta transformaci´on 1 → 1 la energ´ıa interna del gas no cambia al no variar su temperatura, T1 , y de acuerdo con el Primer Principio Q1 = Q1→1 = −W1→1 = nRT1 ln (V1 /V1 ) < 0 es la energ´ıa transferida del sistema al foco t´ermico que se encuentra a temperatura on T1 en forma de calor. En segundo lugar, realizamos una nueva compresi´ del gas, pero esta vez de forma adiab´ atica, hasta el punto 2. Durante este

´ CAP´ITULO 1. TERMODINAMICA I

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proceso elevamos la temperatura del gas hasta T2 transfiriendo energ´ıa del entorno al sistema en forma de trabajo. La cantidad de energ´ıa transferida es W1 →2 = CV (T2 − T1 ) > 0. El siguiente paso es una expansi´on isot´ermica desde 2 hasta el punto 2 , transfiriendo energ´ıa del foco t´ermico a temperatura T2 al sistema en forma de calor. La energ´ıa transferida es Q2 = Q2→2 = on adiab´atica −W2→2 = nRT2 ln (V2 /V2 ) > 0. Finalmente, una nueva expansi´ hasta el punto 1 devuelve el sistema a su punto inicial. Durante este u ´ ltimo proceso el sistema transfiere una energ´ıa W2 →1 = CV (T1 − T2 ) = −W1 →2 < 0 al entorno en forma de trabajo. El rendimiento de la m´aquina t´ermica es, −W1→1 − W2→2 − W1 →2 − W2 →1 Wu´til =  Q2→2 Q2→2 nRT1 ln (V1 /V1 ) + nRT2 ln (V2 /V2 ) = = nRT2 ln (V2 /V2 ) |Q1 | nRT1 ln (V1 /V1 ) =1− =1+ . nRT2 ln (V2 /V2 ) Q2

η=

Ahora bien, durante la compresi´ on adiab´atica 1 → 2 se verifica que P1 V1γ = P2 V2γ pero P1 V1 = nRT1 y P2 V2 = nRT2 de donde, = T2 V2γ−1 . T1 V1γ−1 

(1.10)

Operando de igual modo, durante la expansi´ on adiab´atica 2 → 1 encontramos que, . (1.11) T1 V1γ−1 = T2 V2γ−1  Dividiendo (1.11) entre (1.10), V1 /V1 = V2 /V2 . Es decir, el rendimiento de la m´aquina t´ermica es, η =1− y por tanto,

T1 |Q1 | =1− , Q2 T2

(1.12)

Q2 |Q1 | = . (1.13) T1 T2 Sorprendentemente, el rendimiento no depende del tipo de gas que estemos utilizando ni de ning´ un otro detalle, salvo de las temperaturas de los focos con los cuales el sistema intercambia energ´ıa en forma de calor.

´ 1.4. EL SEGUNDO PRINCIPIO DE LA TERMODINAMICA

27

T2 Q2' ! 0

Q2  0 Sistema 2

W 0

Sistema 1

W ' W  0

Q1  0

Q1 ! 0

T1 Figura 1.6: No es posible construir una m´aquina t´ermica que supere el rendimiento del ciclo de Carnot o en general que supere el rendimiento de una m´aquina reversible cualquiera ya que violar´ıa en Segundo Principio de la Termodin´amica. Ahora que disponemos de un ejemplo de m´ aquina t´ermica reversible podemos intentar dar respuesta a las preguntas que quedaron pendientes en la secci´on anterior respecto a qu´e m´aquina t´ermica reversible es la que produce mayor rendimiento. De este modo, tal vez podr´ıamos dise˜ nar otra m´ aquina que mejorase el rendimiento del ciclo de Carnot trabajando en las misma condiciones. Recordamos que con esto u ´ ltimo queremos decir que intercambie energ´ıa con los mismos focos t´ermicos a temperaturas T1 y T2 . Imaginemos entonces que existe una m´ aquina que toma una cantidad Q2 > Q2 > 0 del foco t´ermico caliente y devuelve una cantidad Q1 < 0 al foco fr´ıo. En particular elijamos que Q1 = Q1 y entonces el trabajo W  < 0 realizado sobre el entorno por ciclo ser´ıa,   Wu´ til = W   = Q2 − |Q1 | > |W | , y su rendimiento, η´= 1 −

|Q1 | > η. Q2

Si esa m´aquina existiese, podr´ıamos tomar una cantidad W > 0 de la energ´ıa cedida al entorno en forma de trabajo y a´ un as´ı habr´ıamos transferido al en´til. Ahora bien, con esa torno una energ´ıa |W  | − |W | en forma de trabajo u energ´ıa W podr´ıamos poner a funcionar una m´ aquina de Carnot en sentido inverso (recordemos que es reversible) de forma que transfiri´endole W > 0 aquina transen forma de trabajo y absorbiendo Q1 > 0 del foco fr´ıo, la m´ firiese una energ´ıa Q2 < 0 al foco caliente (Fig. 1.6). Si ´esta fuese la situaci´ on, la energ´ıa que el sistema en su conjunto absorbe del foco caliente

´ CAP´ITULO 1. TERMODINAMICA I

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despu´es de cada ciclo ser´ıa Q2 − |Q2 | > 0 mientras que la energ´ıa cedida por el conjunto al foco fr´ıo despu´es de cada ciclo ser´ıa − |Q1 | + Q1 = 0. Adem´as, la energ´ıa transferida en forma de trabajo al entorno por ciclo ser´ıa  |W  | − |W | = (Q2 − |Q1 |) − (|Q2 | − Q1 ) = Q2 − |Q2 |. Es decir, habr´ıamos dise˜ nado una m´ aquina que absorbiendo energ´ıa de un u ´nico foco (n´otese que de forma neta el foco fr´ıo no entrega ni recibe energ´ıa) en forma de calor la convierte integramente en trabajo u ´ til. Este resultado est´a en desacuerdo con el enunciado de Kelvin del Segundo Principio y por tanto conclu´ımos que tal m´aquina no se puede dise˜ nar. Esta argumentaci´on se puede demostrar rigurosamente y podemos afirmar en virtud del Segundo Principio que, Dadas dos m´ aquinas t´ermicas que intercambian energ´ıa con dos focos t´ermicos a temperaturas T1 y T2 tales que la primera recibe una energ´ıa en forma de calor Q2 y la segunda Q2 y devuelven respectivamente unas energ´ıas en forma de calor Q1 y Q1 , entonces, 1. Si la primera m´ aquina es reversible y la segunda no, entonces el rendimiento de la primera es superior y por tanto, 

Q Q1 > 1 . Q2 Q2 2. Si ambas m´ aquinas son reversibles, entonces sus rendimientos son iguales y por tanto,  Q1 Q1 = . Q2 Q2 Es decir, si una m´aquina es reversible, no importa lo complicado de sus transformaciones o de sus componentes o de cualquiera de sus propiedades, si intercambia energ´ıa con dos focos t´ermicos T1 y T2 , su rendimiento vendr´a da´ do por (1.12). Esta es una propiedad de las leyes termodin´ amicas, y por tanto de la naturaleza, y no del dise˜ no de la m´ aquina en particular. El ciclo de Carnot es un ejemplo de m´aquina reversible pero cualquier otro ciclo realizado de forma reversible proporcionar´ a el mismo rendimiento si est´a sujeto a las mismas condiciones. Adem´as, cualquier otra m´aquina no reversible tendr´ a menos rendimiento.

1.4.3.

Entrop´ıa

De acuerdo con la discusi´ on anterior, ver la ecuaci´ on (1.13), en una m´ aquina reversible podemos definir una cantidad, S = Q/T , que llamaremos entrop´ıa

´ 1.4. EL SEGUNDO PRINCIPIO DE LA TERMODINAMICA

29

tal que ΔS = 0 en un ciclo. Imaginemos ahora que tenemos una transformaci´on reversible cualquiera entre dos estados a y b. Podemos definir la cantidad dS = δQ/T de forma que mediante transformaciones reversibles recorramos la trayectoria con m´ aquinas de Carnot que operen entre las temperaturas que se dan a lo largo de la trayectoria y una temperatura de referencia, siendo entonces δQ las cantidades diferenciales de energ´ıa transferidas mediante el calor entre el ba˜ no t´ermico a temperatura T y el sistema. De este modo podemos definir que la variaci´ on de S en la trayectoria reversible a → b es,  b δQ , ΔS = a T y en un ciclo reversible se verifica que, δQ = 0. ΔS = T Por otro lado, para un proceso irreversible a → b es f´acil demostrar (en virtud de que es imposible obtener m´as rendimiento que el de una m´aquina reversible) que  b δQ . ΔS > a T N´otese que la expresi´on anterior no indica el valor del incremento de la entrop´ıa, simplemente se afirma que su valor ser´a superior al que se hubiese obtenido si la transformaci´ on hubiese sido reversible. Es interesante considerar no s´ olo la variaci´on de entrop´ıa del sistema, sino del conjunto entorno+sistema, es decir, la variaci´ on de entrop´ıa del universo dada una transformaci´ on. Tomemos, por ejemplo, el ciclo de Carnot como prototipo de ciclo reversible. En este caso, la variaci´on de entrop´ıa del sistema es, Q2 |Q1 | − = 0, ΔSsistema = T2 T1 mientras que la variaci´on de entrop´ıa del entorno es, ΔSentorno = −

|Q2 | Q1 + = 0. T2 T1

De este modo, ΔSuniverso = 0. Notemos que esta u ´ ltima condici´ on se verifica aunque el proceso no sea c´ıclico. De este modo encontramos una definici´on alternativa de transformaci´ on reversible: en una transformaci´ on reversible la variaci´ on de la entrop´ıa del universo

´ CAP´ITULO 1. TERMODINAMICA I

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es nula. Del mismo modo se puede demostrar f´acilmente que: en una transformaci´ on irreversible la variaci´ on de la entrop´ıa del universo es positiva. En el mundo real todos los procesos son irreversibles y de este modo la entrop´ıa define una flecha termodin´ amica del tiempo: el tiempo avanza en el sentido que aumenta la entrop´ıa del universo. Llegados a este punto, podemos resumir de forma concisa el Primer y Segundo Principio de la Termodin´ amica como, Dada una transformaci´ on cualquiera, la energ´ıa del Universo permanece constante, ΔUuniverso = 0 y la entrop´ıa del Universo no disminuye, ΔSuniverso ≥ 0. Entrop´ıa de un Gas Ideal en una Transformaci´ on Reversible De acuerdo con el Primer Principio de la Termodin´ amica, CV dT = δQ − P dV . o eliminando P , CV dT = δQ − nRT

dV . V

De este modo para un proceso reversible, dS =

dV dT δQ = CV + nR . T T V

Integrando esta u ´ltima expresi´ on, 

Tb Vb + R ln ΔS = Sb − Sa = n cV ln Ta Va

 .

De donde, Si = n (cV ln Ti + R ln Vi + s) , siendo s una constante6 . De forma alternativa, podemos expresar la entrop´ıa on de la concentraci´ on o densidad molar ρ = n/V , Si en funci´ ln

nVb ρa ρb Vb = ln = ln = − ln , Va nVa ρb ρa

de donde, Si = n (cV ln Ti − R ln ρi + s) . 6 La constante aditiva s se puede calcular utilizando argumentos de Mec´ anica Estad´ıstica (f´ ormula de Tetrode-Sackur) o mediante el llamado teorema de Nernst.

´ 1.4. EL SEGUNDO PRINCIPIO DE LA TERMODINAMICA

31

En general, para un gas ideal sometido a un proceso reversible, δQ , dT δQ , dS = T C=

de donde,



b

ΔS = a

CdT . T

Si la capacidad calor´ıfica se puede tomar como constante en el intervalo de temperaturas Ta → Tb , entonces, Si = C ln Ti + si . Entrop´ıa, Orden e Informaci´ on Hasta ahora no hemos tenido en cuenta el caracter at´omico de la materia. Haremos una excepci´on para ahondar un poco m´ as en el significado de la entrop´ıa. Supongamos entonces que disponemos de dos contenedores C1 y C2 que se pueden comunicar con un puerta que de momento dejaremos cerrada. En uno de los contenedores hay un gas mientras que en otro hay vac´ıo. Al abrir la puerta, el gas se expandir´a ocupando ambos contenedores. Puesto que el gas est´a formado por mol´eculas en movimiento no es descabellado pensar que es posible, aunque poco probable, que en alg´ un instante todas las mol´eculas se concentren de nuevo en el primer contenedor C1 . Si esto ocurriese, podr´ıamos cerrar la puerta habiendo completado un ciclo que viola el Segundo Principio. Intentemos estimar lo probable de este proceso. Para ello, imaginemos la siguiente simplicaci´ on de nuestro gas. Una caja con p posibles posiciones que pueden estar libres u ocupadas (Fig. 1.7). Supongamos que el n´ umero de posiciones ocupadas es p/2 y por tanto el n´ umero de huecos es tambi´en p/2. En principio suponemos que no hay configuraciones preferidas y que todas las posibles ordenaciones (microestados) en la caja son equiprobables. Podemos ir pasando configuraci´ on a configuraci´on al azar y preguntarnos cu´ anto tiempo debe transcurrir para observar una configuraci´ on ordenada donde todas las posiciones ocupadas queden a un lado (mitad de la derecha o de la izquierda o de arriba o de abajo) y los huecos en el otro. Este fen´ omeno es el equivalente a ver una violaci´on del Segundo Principio en el gas real. En principio, si uno espera lo suficiente, podremos ver c´omo falla

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´ CAP´ITULO 1. TERMODINAMICA I

Figura 1.7: Una imagen simplicada de un gas: una caja con p posiciones que pueden estar ocupadas o vac´ıas. En cada paso de tiempo reorganizamos aleatoriamente las posiciones. La probabilidad de encontrar una situaci´ on ordenada entre todas las alternativas posibles (microestados) es altamente improbable (ver texto).

el Segundo Principio. Ahora bien, ¿cu´ anto es suficiente tiempo? El n´ umero de posibles microestados de la caja es, p! W = p p . 2 ! 2 ! De todas estas configuraciones, s´olo 4 se corresponden con una situaci´ on ordenada. As´ı, la probabilidad, P (p), de que nos encontremos una de ellas es, p p

! 2 !4 . P (p) = 2 p! Hagamos unos cuantos n´ umeros. A d´ıa de hoy, la computadora m´ as r´ apida de la Tierra es capaz de realizar unas 1014 operaciones por segundo. Si exploramos configuraciones a esa velocidad, el tiempo medio, en a˜ nos, que tendremos que esperar para observar una situaci´ on ordenada es aproximadamente P (p)−1 10−21 . Si comparamos este tiempo con la edad del Universo, que se sunos, el “n´ umero de Universos” que tendr´ıamos pone que es del orden de 1010 a˜ que dejar transcurrir (desde el Big Bang hasta la actualidad) para observar una violaci´ on del Segundo Principio con nuestro experimento idealizado es −1 −31 P (p) 10 . Si p = 1000 esta cantidad es del orden de ¡10267 ! Aunque posible, la violaci´on espontanea del Segundo Principio es altamente improbable. Ni que decir tiene que cuando consideramos una caja con NA posiciones la posibilidad de violaci´ on espontanea del Segundo Principio es a efectos pr´ acticos cero.

´ 1.4. EL SEGUNDO PRINCIPIO DE LA TERMODINAMICA

33

Ahora bien, podr´ıamos intentar construir algun tipo de maquinaria que nos sirviese para que la exploraci´on de configuraciones no sea aleatoria y que pudiesemos descartar as´ı las configuraciones que no sirven para violar el Segundo Principio. Podr´ıamos en nuestro experimento inicial del gas en un recinto con dos contenedores colocar la puerta y cerrarla. Cuando veamos que una mol´ecula de gas se aproxima para entrar en C1 abrimos y una vez en el contenedor cerramos dej´andola atrapada. As´ı, poco a poco, podr´ıamos tener todas nuestras mol´eculas en C1 tal y como deseabamos violando el Segundo Principio. Este experimento versiona el llamado demonio de Maxwell7 . Sin entrar a discutir la posibilidad de construir tal ingenio, realizemos unas breves reflexiones. En primer lugar, notemos que el concepto de disminuci´on de entrop´ıa est´a ligado al concepto de incremento de orden. En nuestro caso la ordenaci´on se realiza en funci´on de la posici´ on de las mol´eculas del gas. En segundo lugar notemos que para realizar dicho ordenamiento selectivo es necesario disponer de informaci´on. En nuestro caso la posici´ on de las mol´eculas. As´ı, es posible demostrar que de construirse tal ingenio el incremento neto de variaci´ on de entrop´ıa en el Universo (el contenedor m´as el demonio) ser´ıa positivo debido a la energ´ıa requerida que debemos proporcionar al demonio con el fin de disponer de la informaci´ on necesaria para realizar el ordenamiento mol´ecular. Ludwig Boltzmann estableci´ o la relaci´on entre la entrop´ıa de un estado i y el n´ umero de microestados (energ´eticos), Si = kB ln Wi ,

(1.14)

umero de microestados del estado i y kB es la llamada consdonde Wi es el n´ tante de Boltzmann que podemos relacionar con dos constantes que ya hemos on (1.14) podemos ver que la visto, R y NA : kB = R/NA . Utilizando la ecuaci´ probabilidad de observar una violaci´ on del Segundo Principio va como e−NA , un n´ umero realmente peque˜ no y que est´a de acuerdo con las estimaciones que hicimos en nuestro experimento simplificado del gas. Del mismo modo, las transiciones entre microestados con mayor probabilidad, espontaneas, son aquellas para las cuales el sistema evoluciona hacia estados que exploran un m´aximo del espacio de configuraciones accesibles, gen´ericamente los estados m´as desordenados, proporci´onando entonces un aumento de entrop´ıa. 7

En la versi´ on original propuesta por Maxwell un ente organizaba las mol´eculas del gas en funci´ on de su velocidad: las m´ as r´ apidas, en relaci´ on a la media, ocupaban progresivamente uno de los contenedores mientras que las lentas ocupaban al otro. De este modo la temperatura de uno de los contenedores aumentaba mientras que el otro se enfriaba; hecho que se pod´ıa utilizar para poner a funcionar una m´ aquina t´ermica que violase el Segundo Principio. Este razonamiento pasa por demostrar la equivalencia entre energ´ıa cin´etica y temperatura utilizando argumentos de Teor´ıa Cin´etica.

34

´ CAP´ITULO 1. TERMODINAMICA I

De acuerdo con esta discusi´on, se hace dif´ıcil entender los procesos evolutivos y de desarrollo que dan lugar a la formaci´ on de seres vivos puesto que se trata de procesos donde aparentemente la entrop´ıa disminuye al ser altamente organizativos. La clave est´a en entender a los seres vivos como sistemas abiertos que intercambian energ´ıa y masa con su entorno. Entonces, el metabolismo no s´ olo proporciona la energ´ıa requerida para que se realizen los procesos biol´ ogicos sino que tambi´en compensa la disminuci´ on de entrop´ıa que se produce en los seres vivos. Los alimentos, entendidos como mol´eculas altamente organizadas, se procesan y son devueltos al entorno en formas degradadas. De esta manera, el balance neto es un aumento de la entrop´ıa del Universo. En el pr´ oximo cap´ıtulo, cuando introduzcamos el concepto de producci´ on entr´ opica, esta compensaci´on entre procesos quedar´ a m´as clara. No obstante, el lector podr´ıa hacer una u ´ltima pregunta u objecci´on. Incluso entendiendo que la entrop´ıa del Universo no disminuya, ¿c´ omo se explica que existan procesos espontaneos cuyo resultado sea una disminuci´ on de entrop´ıa? Para responder a esta pregunta introduciremos en el pr´oximo cap´ıtulo los potenciales termodin´amicos. Equilibrio Termodin´ amico y Mec´ anico: Teor´ıa Cin´ etica Podemos seguir explorando m´as consequencias del car´acter at´omico de la materia y entender de una manera m´as profunda el significado del equilibrio termodin´ amico. As´ı, cuando un sistema se encuentra en equilibrio termodin´ amico necesariamente se debe encontrar en equilibrio mec´anico de forma que las fuerzas netas que actuan sobre ´el son nulas. Volvamos al caso de un gas en un pist´ on. Dada una presi´ on y una temperatura, si el ´embolo no se mueve (macrosc´opicamente) significa que la fuerza que ejerce el gas en el interior del pist´ on sobre el ´embolo se ha igualado a la fuerza que ejerce el gas del entorno sobre ´el. Ahora bien, la fuerza que ejerce el gas sobre el ´embolo se debe a las colisiones de las mol´eculas que lo golpean. Simplifiquemos de manera provisional este problema limit´andonos al caso de que las mol´eculas se mueven s´olo a lo largo del eje x, luego extenderemos el c´alculo a tres dimensiones (Fig. 1.8). La fuerza que ejerce el ´embolo sobre una mol´ecula viene dada por, → − → v x (t) v x (t + Δt) − − − → → , F = m− a x = m l´ım Δt→0 Δt → donde − v x (t) es la velocidad de la mol´ecula que golpea a un tiempo t el ´embolo. Cuando se alcance el equilibrio, si suponemos que el ´embolo es un reflector perfecto (colisi´ on el´astica), la mol´ecula saldr´a despedida despu´es de la colisi´on

´ 1.4. EL SEGUNDO PRINCIPIO DE LA TERMODINAMICA

35

− con la misma velocidad que incidi´ o pero en sentido opuesto: → v x (t + Δt) = → −− v x (t). As´ı, la fuerza que se ejerce sobre el ´atomo es, → → − 2− v x (t) , F = −m l´ım Δt→0 Δt o igualmente, en virtud del principio de acci´ on-reacci´on, → → − 2− v x (t) , F = m l´ım Δt→0 Δt es la fuerza que ejerce la mol´ecula sobre el ´embolo. Sin embargo esa no es la fuerza total que se ejerce sobre el ´embolo puesto que a un tiempo t inciden muchas mol´eculas, todas aquellos que un instante Δt anterior esten a una distancia vx Δt, o menor, del ´embolo. Es decir, las contenidas en el volumen Avx Δt (ver Fig. 1.8). Puesto que N/V es el n´ umero de mol´eculas por unidad de volumen (la densidad), el n´ umero total de mol´eculas incidentes ser´a N Avx Δt/V . No obstante, no todas las mol´eculas incidentes tienen por qu´e ir a la misma velocidad vx y debemos multiplicar esta cantidad por la probabilidad de que vayan precisamente a esa velocidad ρ (vx ) dvx . Lo que es m´as, dos mol´eculas pueden ir a la misma velocidad pero en sentidos opuestos. As´ı, puesto que no hay ning´ un sentido privilegiado para el movimiento de las mol´eculas (si lo hubiese no habr´ıa equilibrio), el n´ umero total de mol´eculas que inciden sobre el ´embolo a un tiempo t es, finalmente, N Avx Δtρ (vx ) dvx / (2V ) y la fuerza que ejercen es,  − N Am 2  2→ v x (t) N Avx Δtρ (vx ) dvx − → − · =→ ex vx , F total = m l´ım Δt→0 Δt 2V V → siendo − e x un vector unitario en la direcci´  on x. Puesto que la presi´on es F/A llegamos al resultado, P V = N m vx2 . Recordamos ahora la simplificaci´on inicial realizada que restring´ıa el movimiento a una dimensi´ on y corregimos la u ´ltima expresi´ on. Como el espacio se supone is´ o tropo y  2  2  no hay ninguna 2  o n privilegiada   para  el movimiento,

 vx =  vy = vz , y como adem´as

direcci´ v 2 = vx2 + vy2 + vz2 , entonces vx2 = v 2 /3. De este modo, PV =

N m 2 2 v = N Ec  , 3 3

donde Ec = mv 2 /2 es la energ´ıa cin´etica. Si comparamos esta expresi´on con la ecuaci´ on de los gases ideales (1.1) obtenemos que N 2 N Ec  = nRT = RT , 3 NA

´ CAP´ITULO 1. TERMODINAMICA I

36 vx 't

N ,V , T

A x  vx  t

 v x  t  't

Figura 1.8: Visi´on microsc´opica de un gas en un pist´on. La Teor´ıa Cin´etica nos permite relacionar la energ´ıa cin´etica media de las mol´eculas del gas con la temperatura del sistema en el equilibrio (ver texto).

es decir, 3 R 3 T = kB T . (1.15) 2 NA 2 As´ı, la temperatura es una medida de la energ´ıa cin´etica media de las mol´eculas. Adem´as, la ecuaci´on (1.15) indica la manera m´as adecuada de definir la escala de temperaturas, la escala absoluta, para la cual el cero absoluto se corresponde con una ausencia total de movimiento molecular8 . En el c´ alculo hemos supuesto de una manera velada la condici´on de equilibrio al imponer que la distribuci´ on de velocidades de los a´tomos no dependa del tiempo. Eso no significa que las velocidades de las mol´eculas individuales no dependan del tiempo ya que en las multiples colisiones (el´asticas) que experimentan entre ellas van cambiando su velocidad. Las mol´eculas “reparten” de este modo su energ´ıa entre el colectivo de forma que la energ´ıa se conserva y se alcanza una distribuci´on de probabilidad estacionaria para las velocidades. Imaginemos ahora que hubiesemos realizado el experimento con mol´eculas de masa m > m. En el equilibrio, a la misma temperatura, se debe verificar que Ec  = Ec . es decir, Ec  =

1  2  1 2  m v = m v . 2 2 8 Esta interpretaci´ on no toma en cuenta los efectos debidos al caracter cu´ antico de la materia.

´ 1.4. EL SEGUNDO PRINCIPIO DE LA TERMODINAMICA De donde,

37

 m  v 2 =  v 2 . m As´ı, a la misma temperatura, un gas formado por mol´eculas m´as/menos masivas ir´ a, en promedio, menos/m´as r´apido que un gas formado por mol´eculas con menos/m´as masa. Del mismo modo se puede argumentar que si el gas est´a constituido por una mezcla de mol´eculas, las que tienen menos masa van, en promedio, m´ as r´ apidas que aquellas con m´as masa. Supongamos ahora el caso de un gas, o de forma m´as general un fluido, en equilibrio a temperatura T que est´a formado por un determinado tipo de mol´eculas y en cuyo seno situamos una part´ıcula coloidal9 . Una vez que el sistema est´a en el equilibrio a temperatura T , la part´ıcula poseer´a la misma energ´ıa cin´etica promedio que el fluido y por tanto se mover´ a con una velocidad promedio menor que las mol´eculas del fluido. Esperamos adem´as un movimiento un tanto err´ atico de la part´ıcula debido a las colisiones aleatorias con las mol´eculas del fluido. Hasta aqu´ı nada nuevo, pero ¿qu´e ocurre si aplicamos una fuerza externa a la part´ıcula? Por ejemplo, la part´ıcula puede estar cargada el´ectricamente y aplicamos un campo el´ectrico. En dicha situaci´on, la part´ıcula se mover´a en el fluido y sufrir´ a de una manera sistem´atica colisiones con las mol´eculas del fluido que se encuentren en la trayectoria de la part´ıcula: fricci´ on. En dichas colisiones la part´ıcula intercambiar´a energ´ıa con las mol´eculas del fluido que aumentar´ an su velocidad, se “calentar´ an”, y la part´ıcula tender´ a a frenarse. Esta transferencia de energ´ıa entre la part´ıcula y las mol´eculas del fluido es lo que se conoce como disipaci´ on. Como vemos, las colisiones aleatorias de las mol´eculas sobre la part´ıcula coloidal tienen dos efectos. Por un lado causan el movimiento err´ atico, fluctuante, a nivel microsc´opico de la part´ıcula, llamado browniano, y por otro son el origen de la fricci´on, y la consequente disipaci´on, a un nivel macrosc´ opico. Puesto que ambos efectos tienen la misma causa uno esperar´ıa poder relacionarlos de alg´ un modo. Esta relaci´on se manifiesta a traves del llamado teorema de fluctuaci´ on-disipaci´ on. Dicho teorema es generalizable a otros sistemas y establece una relaci´ on entre la respuesta de un sistema debido a una perturbaci´on externa y las fluctuaciones internas del sistema en ausencia de la perturbaci´on. En el cap´ıtulo 3 estudiaremos en m´as detale sus consequencias al profundizar sobre el movimiento browniano.

9 En el cap´ıtulo 7 (§ 7.1.1) se presentan las principales caracter´ısticas de las suspensiones coloidales.

CAP´ITULO

2

Termodin´amica y Procesos Biol´ogicos II

En el cap´ıtulo anterior hemos presentado los conceptos fundamentales de la Termodin´ amica cl´asica. En este cap´ıtulo sacaremos provecho a estos conceptos mediante los potenciales termodin´amicos. Adem´as, debido a su importancia en los procesos biol´ogicos, al final del cap´ıtulo presentaremos una introducci´on a la Termodin´ amica de no equilibrio en su versi´on m´ as simple: el r´egimen lineal.

2.1.

Potenciales Termodin´ amicos

Tomemos un sistema puramente mec´anico donde las transferencias de energ´ıa entre el sistema y el entorno en forma de calor sean despreciables. Por ejemplo, soltamos desde cierta altura y en el vac´ıo una masa. De acuerdo con la conservaci´on de la energ´ıa, el Primer Principio, se debe verificar que ΔU = W . En nuestro ejemplo la cantidad de energ´ıa interna ser´ a la energ´ıa potencial debida al potencial gravitatorio y por tanto el trabajo que podemos extraer del sistema est´a limitado por la energ´ıa potencial contenida en el sistema. Adem´as, el sistema evoluciona buscando un equilibrio estable que se corresponde con aquellos estados de m´ınima energ´ıa potencial. Como veremos a continuaci´ on, en sistemas termodin´ amicos hay equivalentes a la energ´ıa potencial de este ejemplo mec´anico. En sistemas termodin´amicos donde las transferencias de calor con el entorno son habituales tenemos en general que W = ΔU − Q. Si el sistema est´a intercambiando energ´ıa con un u ´nico foco t´ermico a temperatura cons-

´ CAP´ITULO 2. TERMODINAMICA II

40

b tante T , entonces, puesto que ΔS ≥ a δQ/T , se verifica que Q ≤ T ΔS y por tanto, W ≥ ΔU − T ΔS. (2.1) Realizando la definici´on, F = U − T S,

(2.2)

obtenemos que W ≥ ΔF , o en forma infinitesimal que δW ≥ dF (δWu´til ≤ −dF ). Por tanto, si el sistema est´a mec´anicamente aislado (por ejemplo, en un proceso a volumen constante) e intercambia energ´ıa en forma de calor con un u ´nico foco t´ermico se verifica para cualquier transformaci´on que dF ≤ 0, o lo que es lo mismo, Fb ≤ Fa . Es decir, F debe disminuir. As´ı, el sistema evolucionar´a espontaneamente hacia un m´ınimo de F y una vez all´ı se encontrar´a en un estado de equilibrio estable puesto que cualquier transformaci´ on contribuir´ a a aumentar su F . A F se le llama potencial termodin´ amico a volumen constante o energ´ıa libre de Helmholtz y da cuenta de la energ´ıa disponible en el sistema para realizar trabajo u ´til en las condiciones mencionadas. La evoluci´ on hacia los m´ınimos de la energ´ıa libre de Helmholtz exige que el sistema est´e mec´anicamente aislado mientras que el sistema intercambia energ´ıa con un u ´nico foco t´ermico a temperatura T . Para muchos sistemas, en particular los biol´ ogicos, estas condiciones son muy restrictivas. Unas condiciones menos exigentes (o m´as habituales) son intercambiar energ´ıa con un foco t´ermico y que la presi´on sea constante. Supongamos entonces que disponemos de un sistema a presi´on constante que intercambia energ´ıa con un foco t´ermico a temperatura T . Podemos proceder como anteriormente y definir un nuevo potencial, G, hacia cuyos m´ınimos evoluciona el sistema tal que dG ≤ 0: el llamado potencial termodin´ amico a presi´ on constante o energ´ıa libre de Gibbs. De acuerdo con la ecuaci´on (2.1), 0 ≥ ΔU − T ΔS + P ΔV . Definiendo, G = U − TS + PV = F + PV ,

(2.3)

en una transformaci´ on isobara e isot´ermica se verificar´a que, Gb ≤ Ga . Es decir, la energ´ıa libre de Gibbs nunca aumenta. Por tanto bajo las condiciones descritas, el sistema evolucionar´a hacia los m´ınimos de este potencial

´ 2.1. POTENCIALES TERMODINAMICOS

41

termodin´amico y una vez alli se encontrar´ a en una situaci´ on de equilibrio estable. En virtud del primer principio ΔU + P ΔV es la cantidad de energ´ıa que en forma de calor se transfiere entre el sistema y su entorno en una transformaci´on a presi´ on constante. A la cantidad H = U +P V se la conoce como entalp´ıa. La energ´ıa libre de Gibbs se puede expresar en t´erminos de H como G = H − T S. N´ otese que si la presi´on es constante dH = δQ y entonces, dS ≥

dH . T

De acuerdo con la nomenclatura introducida en el cap´ıtulo anterior, si dH > 0 la transformaci´ on ser´a endot´ermica mientras que si dH < 0 ser´a exot´ermica. Al igual que existe una relaci´ on directa entre la energ´ıa interna y la capacidad calor´ıfica a volumen constante, podemos relacionar a la entalp´ıa con Cp ,     δQ dH = . (2.4) CP = dT P dT P Haciendo paralelismo con la energ´ıa libre de Helmholtz, se conoce tambi´en a G como entalp´ıa libre. En resumen, en la evoluci´ on hacia el equilibrio, sea F = U − T S o G = H − T S el potencial termodin´ amico relevante, se produce una compensaci´on entre efectos energ´eticos y entr´opicos. En la siguiente secci´on detallaremos las “compesaciones” que pueden ocurrir de manera expontanea.

2.1.1.

Condiciones de Equilibrio y Espontaneidad

De acuerdo con lo explicado hasta el momento sobre los potenciales termodin´ amicos, un sistema en contacto con un u ´ nico ba˜ no t´ermico y que se encuentre a presi´on constante evoluciona espontaneamente hacia los m´ınimos de la energ´ıa libre de Gibbs. Una vez alcanzado un m´ınimo de G el sistema se encuentra en una condici´on de equilibrio estable y de forma espont´anea no evolucionar´ a porque aumentar´ıa su energ´ıa libre. En forma diferencial la energ´ıa libre de Gibbs, G, es, dG = dU − T dS − SdT + P dV + V dP , pero, dU = δQ + δW = T dS − P dV , de donde, dG = −SdT + V dP .

´ CAP´ITULO 2. TERMODINAMICA II

42

O de forma equivalente, puesto que G = H − T S, dG = dH − T dS − SdT . Suponiendo una transformaci´ on a temperatura constante, la condici´on de equilibrio ser´a, dG = dH − T dS = 0. De igual modo, podemos resumir en la siguiente tabla las condiciones para que una transformaci´ on a temperatura constante suceda (dG < 0) o no (dG > 0) de manera espont´anea, dH 0

dS >0 0 dH/dS. imposible.

Que la transformaci´ on sea posible termodin´amicamente, que pueda ocurrir de forma espont´anea, no implica que sea probable. Por ejemplo, en un proceso qu´ımico puede que la energ´ıa requerida para la activaci´ on de la reacci´on sea muy elevada y por tanto la velocidad de reacci´ on sea nula a efectos pr´acticos. Lo que s´ı es cierto es que si es imposible termodin´amicamente entonces no ocurrir´ a de manera espont´ anea1 . Podemos ahora responder a la pregunta que qued´o pendiente en el cap´ıtulo anterior: ¿c´omo se explica que existan procesos espont´ aneos cuyo resultado sea una disminuci´ on de entrop´ıa? La respuesta es sencilla: siempre y cuando la temperatura sea lo suficientemente baja y que el proceso sea exot´ermico el proceso puede ocurrir de forma espont´ anea a pesar de que disminuya la entrop´ıa (del sistema). Sin esta posibilidad la vida nunca hubiese existido sobre la tierra. Se cree que cuando un ave empolla un huevo lo hace para “darle calor”. M´as bien es todo lo contrario, en realidad el ave act´ ua como un termostato para regular la temperatura del huevo y absorber el calor del proceso organizativo morfogen´etico. De esta manera, el proceso exot´ermico junto con el mantenimiento de la temperatura por debajo de cierto umbral hacen posible el desarrollo embrionario que ciertamente disminuye la entrop´ıa del huevo. 1 Recordamos que en cap´ıtulo anterior hemos mostrado que rigurosamente es posible, pero muy improbable, violar el Segundo Principio de manera espont´anea.

2.2. DISOLUCIONES DILU´IDAS

2.2.

43

Disoluciones Dilu´ıdas: Presi´ on Osm´ otica y las Membranas Celulares

Hasta ahora hemos considerado sistemas con un s´olo componente. Sin embargo, la mayor´ıa de sistemas son multicomponentes. El sistema multicomponente m´as sencillo que podemos imaginar es el de dos especies; y dentro de los sistemas con dos especies, el m´as simple es aqu´el donde un gran porcentaje de la composici´ on es de una especie y una peque˜ na parte de la otra especie: las disoluciones dilu´ıdas2 . Llamamos disolvente (solvente) a la especie en mayor´ıa y soluto a la especie en minor´ıa. Entonces, una disoluci´ on dilu´ıda es aquella mezcla para la cual la cantidad de soluto es peque˜ na comparada con la cantidad de disolvente. Si denominamos n0 a los moles de disolvente y n1 a los de soluto disuelto entonces para una disoluci´on dilu´ıda n0 n1 . Dada una temperatura constante T , calculemos F y G para estas disoluciones con en fin de obtener informaci´ on sobre el estado de equilibrio del sistema y sus posibles transformaciones espontaneas. Antes de empezar, debemos introducir las llamadas magnitudes molares parciales. Dadas s especies y una propiedad extensiva del sistema (volumen, energ´ıa interna, etc.) Y ,   s−1 s−1   ∂Y ni = ni yi , Y = ∂ni T,P,nj=i i=0

i=0

donde a las cantidades yi se les llama magnitudes molares parciales. La magnitud molar parcial de una especie en una mezcla no tiene por qu´e coincidir con la magnitud molar de la misma especie en un estado puro (s´ı coinciden en el caso de gases ideales y soluciones dilu´ıdas como las que tratamos). Por ejemplo 1 litro de alcohol junto con 1 litro de agua no dan 2 litros de mezcla sino un volumen inferior (con otra mezcla de especies el volumen puede ser superior). Entonces la energ´ıa interna se puede escribir como, U = n0 u0 + n1 u1 . Y en cuanto al volumen, V = n0 v0 + n1 v1 . 2

En general en los sistemas multicomponente hay que distinguir entre mezclas y disoluciones dependiendo de cu´ ales son las fases de los componentes y si existe o no mayor´ıa de alguno de ellos. Aqu´ı no distinguiremos entre ambas. Adem´as, referimos al lector al cap´ıtulo 7 donde se describen algunas propiedades importantes de ciertas disoluciones y mezclas de inter´es biol´ ogico como los coloides.

´ CAP´ITULO 2. TERMODINAMICA II

44

Solución

Solvente Puro

Figura 2.1: En la figura se representa un sistema mixto disolvente-disoluci´on separado por una membrana semipermeable. El disolvente puede atravesar la membrana mientras que la misma act´ ua como barrera para el soluto. La diferencia de concentracci´ ones establece una diferencia de presi´on a ambos lados, la llamada presi´ on osm´otica (ver texto).

Si consideramos que las transformaciones a las que se somete al sistema son reversibles de forma que dS = dQ/T = (dU + P dV ) /T entonces, dS =

n0 (du0 + P dv0 ) + n1 (du1 + P dv1 ) n0 ds0 + n1 ds1 = . T T

Si integramos esta u ´ ltima ecuaci´ on, obtenemos que, S = n0 s0 + n1 s1 + C, donde C es una constante de integraci´on a determinar que depende de n0 y n1 . El valor de dicha constante, as´ı como los valores de s0 y s1 , se pueden determinar utilizando argumentos de vaporizaci´ on de una mezcla gaseosa (no daremos aqu´ı los detalles), S = n0 s0 + n1 s1 − Rn0 ln

n0 n1 − Rn1 ln . n0 + n1 n0 + n1

As´ı, finalmente, F = n0 u0 + n1 u1 −  − T n0 s0 + n1 s1 − Rn0 ln G = F + P (n0 v0 + n1 v1 ) .

n0 n1 − Rn1 ln n0 + n1 n0 + n1

(2.5)

 ,

(2.6)

2.2. DISOLUCIONES DILU´IDAS

45

Supongamos ahora una membrana semipermeable: una membrana que es permeable al disolvente pero no al soluto. Un ejemplo de membranas semipermeables son las membranas celulares que de forma pasiva permiten la entrada y salida de iones hidratados y peque˜ nas mol´eculas pero bloquean el paso de grandes moleculas. Experimentalmente se observa que cuando una disoluci´on de un determinado solvente est´ a separada del disolvente puro por una membrana semipermeable se establece una diferencia de presi´on. Esta diferencia de presi´ on se llama presi´ on osm´ otica 3 . Para calcular el valor de la presi´on osm´otica haremos uso de la energ´ıa libre F de una disoluci´ on dilu´ıda. En la figura 2.1 representamos de forma simplificada un sistema mixto disoluci´ on-disolvente separados por una membrana semipermeable. Si sometemos a este sistema a una transformaci´ on infinitesimal reversible, y suponiendo la temperatura constante, se debe verificar que δW = dF . Imaginemos entonces que la membrana representada en la figura se puede mover a derecha e izquierda sin rozamiento. En la derecha disponemos de n0 moles de solvente puro mientras que en la izquierda disponemos la disoluci´on con n0 moles de solvente y n1 de soluto. La membrana deja pasar al disolvente pero no al soluto. De este modo habr´a un flujo de disolvente a trav´es de la membrana en ambas direcciones. Cuando ambos flujos se igualan el sistema se encontrar´a en equilibrio4 . Las concentracciones a ambos lados de la membrana son diferentes y por tanto queda establecida una diferencia de presi´ on, Π. En este estado de on, equilibrio, las energ´ıa libres del disolvente puro, Fdisolvente , y de la disoluci´ Fdisoluci´on , son, respectivamente, Fdisolvente = n0 u0 − T n0 s0 , Fdisoluci´on = n0 u0 + n1 u1 − T

 n0 s0 + n1 s1 − Rn0 ln

n0 n1 − Rn1 ln n0 + n1 n0 + n1

 .

Por tanto, la energ´ıa libre total es, F = Fdisolvente + Fdisoluci´on . Imaginemos ahora que una vez alcanzado el equilibrio desplazamos la membrana infinitesimalmente y de forma reversible hacia la derecha, aumentando el volumen de disoluci´on en una cantidad dV en la parte izquierda y disminuyendo consistentemente el de disolvente puro en la misma cantidad en la parte derecha. Durante este proceso una cantidad diferencial de solvente dn0 3

El paso de disolvente y no de soluto a trav´es de una membrana semipermeable (´ osmosis), es la base de la di´ alisis: se permite el paso de peque˜ nas impurezas en disoluci´ on al tiempo que se impide que se “escapen” las macromol´eculas. 4 De momento, y hasta el final del cap´ıtulo, no distinguiremos entre estado de equilibrio y estado estacionario.

´ CAP´ITULO 2. TERMODINAMICA II

46

atravesar´a la membrana de forma que dV = v0 dn0 mientras que el soluto no atraviesa la membrana. Por tanto, la energ´ıa transferida en forma de trabajo es, δW = −ΠdV = −Πv0 dn0 . Por otro lado, la variaci´ on de F en esta transformaci´on es la debida al cambio de moles de disolvente a ambos lados de la membrana, dF =

∂F ∂F ∂F ∂F dn0 + dn0 = dn0 − dn0 ,  ∂n0 ∂n0 ∂n0 ∂n0

donde hemos utilizado que la variaci´on de disolvente dn0 en el lado del disolvente puro debe ser igual (con signo opuesto) que la variaci´ on de disolvente en la parte de la disoluci´on (lo que se pierde en un lado se gana en el otro): dn0 = −dn0 . Implementando la diferencial obtenemos que, dF = −RT

n1 dn0 . n0

Utilizando que en la transformaci´ on reversible se verifica que δW = dF , Πv0 = RT

n1 . n0

on y Puesto que v0 n0 es el volumen ocupado por el disolvente en la disoluci´ que la disoluci´ on es dilu´ıda, n0 n1 , podemos aproximar el volumen de la disoluci´on del siguiente modo (el volumen de disoluci´on es aproximadamente el volumen de disolvente), V = v0 n0 + v1 n1 ≈ v0 n0 , llegando finalmente a, ΠV = n1 RT ,

(2.7)

es decir: ¡la ecuaci´on de los gases ideales! Este resultado se puede expresar con palabras del siguiente modo: La presi´ on osm´ otica que se establece entre una disoluci´ on dilu´ıda y el correspondiente disolvente puro a trav´es de una membrana semipermeable es igual a la presi´ on que ejercer´ıa un gas ideal que se encontrase a la misma temperatura, ocupando el volumen de la disoluci´ on y conteniendo el n´ umero de moles del soluto disuelto en la disoluci´ on.

2.2. DISOLUCIONES DILU´IDAS

47

A la f´ ormula (2.7) se la conoce como relaci´on de Van´t Hoff y tambi´en se suele expresar como, Π = ρsoluto RT , donde ρsoluto es la densidad del soluto.

Problema. Disponemos de 5ml de una disoluci´ on dilu´ıda a 37◦ C separados de disolvente puro por una membrana semipermeable, ¿cu´ antos gramos de soluto son necesarios para establecer una diferencia de presi´on de 1,6 · 105 P a en la membrana? El peso molecular del soluto es de 55g/mol. Soluci´ on. El n´ umero de moles requeridos ser´a, −6

3

1,6 · 105 P a × 5ml × 10 mlm ΠV = = 6,2 · 10−5 moles. n1 = RT 8,31J · K −1 · mol−1 × 310K De donde los gramos de soluto requeridos son, 6,2 · 10−5 moles ×

55g = 3,4 · 10−3 g = 3,4mg. 1mol

Si imaginamos una c´elula como una disoluci´ on de prote´ınas separadas del medio mediante de una membrana semipermeable, podemos utilizar el c´alculo anterior para estimar la presi´on osm´otica que se ejerce sobre la membrana celular. Tomemos el caso de los globulos rojos o hemat´ıes. El di´ ametro de un gl´ obulo rojo es aproximadamente 2R = 10μm, de donde el volumen de la disoluci´on ser´a V = 43 πR3 ≈ 500μm3 . El 30 % de ese volumen est´a ocupado por hemoglobina, es decir 150μm3 . Puesto que el di´ametro de una prote´ına de hemoglobina es aproximadamente 5nm, el volumen de una prote´ına es 5 · on hay unas 3·107 prote´ınas de hemoglobina, 10−7 μm3 y por tanto en la disoluci´ −17 moles de soluto. Suponiendo que la c´elula se encuentra es decir, unos 5 · 10 ◦ a 37 C (310K), la presi´on osm´otica de equilibrio soportada por la membrana es, Π ≈ 250P a. Para mantener la funci´ on e integridad de los gl´ obulos rojos, la disoluci´ on debe mantener la presi´ on osmotica: debe ser isot´ onica. Si la disoluci´ on es

´ CAP´ITULO 2. TERMODINAMICA II

48

demasiado dilu´ıda (hipot´ onica) la presi´on dentro de la membrana celular no puede contener la entrada de soluci´ on y los gl´obulos rojos se hinchan hasta estallar (hemolisis). Por otro lado, si la disoluci´ on es demasiado concentrada (hipert´ onica), los hematies no pueden contener el flujo de solvente hacia el medio, se van encogiendo y mueren. Los t´erminos “demasiado dilu´ıda” o “demasiado concentrada” se refieren a la concentraci´on de iones en disoluci´on ya que en realidad la composici´ on del medio celular, tanto interior como exterior, no es simplemente acuosa. As´ı, la c´elula debe regular cuidadosamente la concentraci´ on de los iones para evitar que la membrana se rompa y la c´elula muera. Para ello es necesario que la c´elula disponga de mecanismos de transporte no s´olo pasivos, sino activos, que puedan modificar la concentraci´on de un determinado i´ on en su interior (a pesar de que la concentraci´ on de ese mismo i´on en el exterior sea mayor). La llamada bomba de N a − K (Sodio-Potasio) es un ejemplo de estos mecanismos de transporte activo. Al final del cap´ıtulo introduciremos algunas nociones de Termodin´ amica de no equilibrio que nos ayudar´ an a entender la Termodin´ amica de estos procesos. Adem´as, referimos al lector al cap´ıtulo 4 que est´a dedicado integramente a los fen´ omenos de transporte activos y pasivos en membranas.

2.3.

Reacciones Qu´ımicas: Potencial Qu´ımico y la Ley de Acci´ on de Masas

Cada subsistema del sistema mixto anteriormente descrito separado por la membrana semipermeable (sea la disoluci´on dilu´ıda o no) es un sistema abierto puesto que intercambia masa con su entorno: el subsistema disolvente puro con el subsistema disoluci´on y viceversa. Hasta ahora hemos considerado sistemas cerrados y no hemos reflejado en el balance energ´etico del Primer Principio los cambios en energ´ıa que se producen al variar la masa. Empezando por el caso monocomponente, y puesto que una variaci´ on en el n´ umero de part´ıculas debe suponer una variaci´ on en la energ´ıa del sistema, podemos expresar la energ´ıa libre de Gibbs en forma diferencial como, dG = −SdT + V dP + μdn, donde,

 μ=

∂G ∂n

 , T,P

(2.8)

2.3. EQUILIBRIO QU´IMICO

49

es el llamado potencial qu´ımico de la especie considerada y mide la variaci´on de la energ´ıa libre respecto del n´ umero de part´ıculas presentes5 . Podemos calcular f´acilmente el valor del potencial qu´ımico para un gas ideal. En una transformaci´ on isot´ermica que involucre n moles de gas,  b  b  b Pb dP = nRT ln . dG = V dP = nRT Gb − Ga = P Pa a a a De este modo, μb − μa = RT ln

Pb . Pa

El estado a inicial es un estado de referencia que designaremos con el super´ındice “0” de forma que, μ = μ0 + RT ln

P . P0

El estado de referencia es un convenio que en general depende del tipo de sistema a tratar. En lo que concierne a los sistemas con los que trataremos aqu´ı, dada la temperatura T , corresponde a una concentraci´on en disoluci´on de 1 mol/l y la presi´ on P 0 de 1 atm. A este estado de referencia le llamamos estado termodin´amico est´andar. As´ı queda fijado el potencial qu´ımico de referencia a esa temperatura μ0 . Puesto que P = nRT /V , el potencial qu´ımico tambi´en se puede expresar en t´erminos de las densidades molares (concentraci´on), μ = μ0 + RT ln

ρ . ρ0

(2.9)

Indicando que el potencial qu´ımico de un gas ideal depende de la cantidad de gas presente en el sistema con respecto a la densidad de referencia. Generalizando al caso multicomponente, si disponemos de una mezcla r especies, la ecuaci´on (2.8) queda como, dG = −SdT + V dP +

r 

μi dni ,

i=1

donde,

 μi =

∂G ∂ni

 .

(2.10)

T,P,nj=i

5 El nombre de potencial qu´ımico tal vez sea un poco desconcertante dada su definici´ on puesto que no involucra nada espec´ıficamente qu´ımico.

50

´ CAP´ITULO 2. TERMODINAMICA II

CH3 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH3

CH3 CH3 CH3 –C –CH CH3 CH3

Figura 2.2: Mediante la isomerizaci´on una molecula puede presentar dos formas de organizaci´on diferentes. En la figura se presenta la isomerizaci´on (de cadena) del heptano. Las propiedades f´ısico-qu´ımicas de los is´omeros son diferentes. La reacci´on se puede dar en ambos sentidos.

Si disponemos de una mezcla de dos especies con moles n1 y n2 en un sistema cerrado que no pueda intercambiar masa con el entorno, se cumplir´a la siguiente ley de conservaci´on, n1 + n2 = n = constante. Adem´as supongamos que entre ambas especies puede haber intercambio de poblaciones. Esto se puede conseguir si, por ejemplo, una especie se puede presentar en dos estados diferentes mediante una isomerizaci´ on (Fig. 2.2). Podemos representar dicha reacci´ on de manera esquem´atica del siguiente modo, S 1  S2 , umero de moles ni . donde Si representa la especie i con un n´ La variaci´on de energ´ıa libre en una transformaci´ on reversible, isobara e isot´ermica ser´a entonces, dG = μS1 dn1 + μS2 dn2 , puesto que dn1 + dn2 = 0, obtenemos que, dG = (μS1 − μS2 ) dn1 .

(2.11)

Es decir, si los potenciales qu´ımicos son iguales, el sistema alcanzar´a el equilibrio, dG = 0. Si estos son diferentes, espont´aneamente se producir´ an

2.3. EQUILIBRIO QU´IMICO

51

transformaciones tal que dG < 0, mientras que las transformaciones con dG > 0 no suceder´ an de forma espont´anea. La siguiente tabla resume, en funci´on de la variaci´ on de la poblaci´on relativa del is´ omero y de la diferencia de potenciales qu´ımicos, la espontaneidad de las reacciones, μ S1 − μ S2 >0 0 0 >0 T2 (Fig. 2.6). Si ambos compartimentos no est´an en contacto y podemos asumir que los procesos son reversibles porque la temperatura de cada uno de los comparti-

´ 2.4. TERMODINAMICA DE NO EQUILIBRIO

69

mentos es ligeramente inferior a T1 y T2 (estamos cercanos al equilibrio), los cambios de entrop´ıa producidos en cada compartimento ser´ an, δQ1 , T1 δQ2 . dS2 = T2 dS1 =

Si ponemos en contacto ambos compartimentos existir´a adem´as una transferencia de energ´ıa (calor) del compartimento 1 al 2 puesto que T1 > T2 y as´ı, δQ1 − δQ1→2 , T1 δQ2 + δQ1→2 . dS2 = T2

dS1 =

Puesto que la entrop´ıa es una variable extensiva, la variaci´on total de entrop´ıa en el sistema global formado por ambos compartimentos ser´ a,     δQ1 δQ2 1 1 + − + δQ1→2 . dS = dS1 + dS2 = T1 T2 T2 T1 El primer t´ermino se debe a la variaci´on externa de la entrop´ıa debido a los entornos, mientras que el segundo es la variaci´on interna debida a la transfeon de entrop´ıa por rencia de energ´ıa entre compartimentos, dSint . La producci´ unidad de tiempo, o velocidad de producci´ on entr´ opica, es entonces,   · δQ1→2 1 1 dSint = S int = − . dt dt T2 T1 Notemos que si T1 > T2 entonces δQ1→2 > 0 y 1/T2 − 1/T1 > 0, de donde la ·

velocidad de producci´ on de entrop´ıa, S int , es positiva: la entrop´ıa crece en el ·

tiempo en una situaci´ on de no equilibrio. En el equilibrio T1 = T2 y S int = 0. Esta ecuaci´on tambi´en pone de manifiesto una importante propiedad: la velocidad de producci´on entr´ opica se puede escribir como el producto de un “flujo” por la “fuerza” que lo causa: ·

S int = JF . ·

(2.21)

Puesto que J = φF entonces S int = φF 2 . De este modo, el coeficiente de transporte debe ser no negativo para que, tal y como hemos mencionado, la

´ CAP´ITULO 2. TERMODINAMICA II

70

velocidad de producci´on de entrop´ıa sea tambi´en no negativa (positiva en una situaci´on de no equilibrio y cero en el equilibrio). La ecuaci´on (2.21) se puede generalizar para el caso en el cual existan no s´olo un flujo y su fuerza complementaria sino un n´ umero n de ellas: por ejemplo flujos de energ´ıa y materia combinados tal y como hemos visto anteriormente. As´ı se obtiene que, n  · S int = Ji Fi  0. (2.22) i=1

Utilizando la ecuaci´ on (2.20) la u ´ltima ecuaci´ on se puede escribir como, ·

S int =

n n  

φij Fj Fi  0,

(2.23)

i=1 j=1

donde el signo igual es s´olo cierto en el equilibrio termodin´amico. Merece la pena destacar que la ecuaci´on (2.22) es v´ alida tambi´en en procesos muy alejados del equilibrio. No ocurre as´ı con la ecuaci´on (2.23) donde hemos supuesto una relaci´ on lineal entre flujos y fuerzas que, tal y como hemos comentado antes, es exclusivamente v´alida en el r´egimen de respuesta lineal. Tomemos a modo de ejemplo el caso de dos fuerzas y dos flujos acoplados. En este caso obtenemos que ·

S int = J1 F1 + J2 F2  0. N´otese que la condici´on de que la producci´ on entr´ opica sea positiva no implica que lo sea cada uno de sus miembros. Por ejemplo, puede darse el caso J2 F2 < 0 y J1 F1 > 0. Esto no viola la positividad de la velocidad de producci´on entr´ opica siempre y cuando J1 F1 > J2 F2 . En sistemas biol´ogicos este tipo de compensaciones entr´opicas son comunes. Por ejemplo, ocurren en el metabolismo, donde diferentes reacciones qu´ımicas de no equilibrio est´ an acopladas entre s´ı. Unas poseen una velocidad de producci´ on entr´ opica negativa mientras que otras generan una positiva tal que el resultado neto est´ a de acuerdo con (2.23). Es el caso de la s´ıntesis de la urea, un proceso altamente organizativo con velocidad de producci´ on entr´ opica negativa que se haya acoplado a reacciones de combusti´on de glucosa altamente desorganizativas, o la fosforilaci´on oxidativa que mencion´abamos al comienzo del cap´ıtulo anterior donde se acoplan la fosforilaci´ on del ADP a la oxidaci´on del piruvato. Un ejemplo fuera de las rutas metab´olicas lo encontramos en el transporte activo en membranas al cual nos referimos anteriormente. All´ı, los flujos de iones son tales que se

´ 2.4. TERMODINAMICA DE NO EQUILIBRIO

71

producen en contra de gradientes de concentraci´ on y de gradientes de potencial el´ectrico (ver cap´ıtulo 4). Es decir, son procesos donde la velocidad de producci´ on entr´ opica es negativa. Sin embargo, estos flujos est´an acoplados a reacciones metab´olicas (combusti´on de ATP principalmente) que de un modo neto generan una velocidad de producci´ on entr´ opica positiva. Esta lucha entre velocidades de producci´on positivas y negativas de entrop´ıas se da constantemente en todo ser vivo. El Segundo Principio implica que inexorablemente la velocidad de producci´on neta debe ser positiva. Tal y como veremos, en algunos casos (aquellos cercanos al equilibrio) la estrategia para combatir este destino es el mal menor: la producci´ on m´ınima de entrop´ıa.

2.4.3.

Minimizaci´ on de la Producci´ on Entr´ opica: Teorema de Prigogine

Hemos comentado que cuando una fuerza es constante al cabo de un tiempo se alcanza un estado estacionario. En el caso de flujos acoplados la situaci´on es similar pero existe adem´as una simplificaci´ on que como veremos tiene importantes implicaciones. As´ı, dadas n fuerzas independientes, si m < n de esas fuerzas son constantes entonces el sistema evoluciona hacia un estado estacionario tal que los correspondientes flujos ser´ an tambi´en constantes. Adem´as, las n − m fuerzas restantes se hacen constantes y los n − m flujos se anulan. Veamos las consequencias de este comportamiento. Particularizando la ecuaci´on (2.23) al caso de dos flujos acoplados encontramos que, ·

S int = φ11 F12 + (φ12 + φ21 ) F1 F2 + φ22 F22  0. Aplicando la relaci´ on de reciprocidad, ·

S int = φ11 F12 + 2φ12 F1 F2 + φ22 F22  0. Para que esta condici´on sea cierta para valores positivos y negativos de Fi (gradientes en un sentido u otro) se debe verificar que φ11  0, que φ22  0 (algo que ya hab´ıamos demostrado) y adem´as que φ11 φ22  φ212 . En general se verifica que φii  0 y φii φjj  φ2ij . Si F1 = F10 es constante, entonces se alcanza un r´egimen estacionario (de no equilibrio) tal que J1 se hace constante (y diferente de cero) y adem´as F2 tambi´en se hace constante y el flujo J2 se anula. En lo que respecta a la

´ CAP´ITULO 2. TERMODINAMICA II

72

Sint  F10 , F2

Sint  F1 , F2

F10

F1

F20

F20

F2

F2 Figura 2.7: Representaci´on gr´afica del teorema de Prigogine. En un estado estacionario de no equilibrio la velocidad de producci´on entr´opica es m´ınima (ver texto). La cruz roja indica el estado estacionario de no equilibrio mientras que la cruz azul indica el estado de equilibrio. producci´ on entr´ opica, ⎛ · ⎞

⎝ ∂ S int ⎠ = 2 φ12 F10 + φ22 F2 = 2J2 , ∂F2 F ⎛ · ⎞ 1 2 ⎝ ∂ S int ⎠ = 2φ22  0. ∂F22 F1

on entr´ opica Por tanto, si J2 = 0 (F2 = F20 = −F10 φ12 /φ22 ) la producci´ ser´a m´ınima. Es decir, la producci´ on entr´ opica en el estado estacionario de no equilibrio es m´ınima. En la figura 2.7 hemos representado este resultado gr´ aficamente. Adem´as, este resultado se puede generalizar para el caso de n fuerzas actuando sobre un sistema y constituye propiamente el teorema de Prigogine: Dadas n fuerzas independientes, si m < n de esas fuerzas son constantes, habr´ a m flujos estacionarios no nulos correspondientes a las fuerzas y la producci´ on de de entrop´ıa ser´ a m´ınima en el estado estacionario de no equilibrio cuando los n − m flujos restantes sean nulos.

´ 2.4. TERMODINAMICA DE NO EQUILIBRIO

73

Aunque el teorema es exclusivamente v´alido para situaciones cercanas al equilibrio, y en general los seres vivos se sit´ uan lejos de ´el, existen numerosos ejemplos que demuestran la aplicabilidad del teorema de Prigogine en los sistemas biol´ ogicos. Por ejemplo, en procesos ligados a la s´ıntesis del ATP.

CAP´ITULO

3

Biopol´ımeros y Cin´etica Enzim´atica

Las c´elulas est´an formadas por macromol´eculas que proporcionan funcionalidad y estructura. En este cap´ıtulo presentaremos un subconjunto de macromol´eculas de especial relevancia: los biopol´ımeros. Por definici´on un pol´ımero est´a formado por la uni´ on de unidades o bloques fundamentales: los mon´ omeros. En la c´elula existen una infinidad de pol´ımeros y proporcionar una descripci´on detallada de sus funciones y propiedades est´ a fuera del alcance de este libro. As´ı, el objetivo es presentar una imagen general que cubra diferentes aspectos relacionados con estas macromol´eculas. De este modo, indicaremos primeramente su importancia biol´ ogica, y proporcionaremos cierto nivel de detalle sobre sus procesos de s´ıntesis. De especial importancia dentro de los biopol´ımeros son las prote´ınas ya que confieren funcionalidad a la c´elula. Gen´ericamente, los conceptos estructura y funci´ on est´an intimamente relacionados en Biolog´ıa y las prote´ınas no son una excepci´on. Si bien no podemos profundizar en los detalles de los procesos de plegamiento de prote´ınas, veremos como un modelo muy simple es capaz de proporcionarnos informaci´on u ´til sobre estos biopol´ımeros. Igualmente, las posibilidades estructurales de los biopol´ımeros est´an condicionadas por su propiedades el´asticas y en este cap´ıtulo repasaremos brevemente la teor´ıa de la elasticidad aplicada a estos sistemas. La segunda mitad del cap´ıtulo est´a relacionada con la cin´etica de una clase especial de biopol´ımeros: las enzimas. Estas macromol´eculas son los catalizadores conocidos m´as potentes y su entendimiento es cr´ıtico para el dise˜ no de f´ armacos o para la s´ıntesis industrial. De

76

´ ´ CAP´ITULO 3. BIOPOL´IMEROS Y CINETICA ENZIMATICA

2nm

DNA

Cromosoma

1400nm

11nm

Nucleosoma

Cromatina

700nm

300nm

30nm

Figura 3.1: El ADN est´a compactado a varios niveles: un cromosoma ocupa en longitud 105 veces menos de lo ocupar´ıa la secuencia de nucle´otidos sin compactar.

este modo, revisaremos la teor´ıa cl´ asica de Michaelis-Menten y los fen´omenos competitivos y cooperativos.

3.1.

Del ADN a las Prote´ınas: Breve Introducci´ on a la Biolog´ıa Molecular

La informaci´ on gen´etica que se transmite de generaci´on en generaci´on, el genoma, est´a almacenada en un biopol´ımero: el ´acido desoxiribonucleico o ADN. Los bloques fundamentales de este pol´ımero son cuatro nucle´otidos (bases): adenina (A), citosina1 (C), guanina (G) y timina (T). Las bases son complementarias de forma que A se une a T mediante dos puentes de hidr´ ogeno y C se une a G mediante tres puentes de hidr´ogeno. De este modo, una secuencia de nucle´ otidos tiene una secuencia complementaria. La complementariedad aporta estructura y estabilidad al ADN al unirse las secuencias mediante los mencionados puentes de hidr´ ogeno (hibridaci´ on) formando una doble cadena que espacialmente tiene estructura de doble h´elice, esta doble h´elice es la que 1 Las citosinas pueden estar metiladas. Si bien esta modificaci´ on puede ser biol´ ogicamente relevante aqu´ı no consideraremos esta distinci´ on qu´ımica entre nucle´ otidos.

3.1. DEL ADN A LAS PROTE´INAS

77

se conoce propiamente como ADN.

Problema. ¿Cu´ al es la secuencia complementaria de ADN de la cadena de nucle´otidos ACTGGGTAC? Soluci´ on. Puesto que las bases est´an emparejadas A-T y C-G la sequencia complementaria es TGACCCATG.

Cada cadena del ADN posee una direccionalidad, al principio de la cadena se le denomina terminaci´ on-5´ mientras que al final se le denomina terminaci´ on3´. Los t´erminos principio y final se refieren a la direcci´ on de lectura de la informaci´ on contenida en la secuencia de nucle´otidos. La redundancia en la informaci´ on de la doble cadena tiene una doble misi´on. Por un lado sirve para corregir mutaciones en las secuencias y por otro sirve para transmitir la informaci´ on gen´etica. Durante la replicaci´on celular el ADN se separa en las dos cadenas complementarias y cada una de ellas sirve como patr´on para generar su complementaria. De este modo se generan dos mol´eculas id´enticas de ADN. El tama˜ no del genoma es enorme. En los seres humanos est´ a formado por billones de nucle´otidos y est´a separado en 23 mol´eculas de ADN. La secuencia de nucle´ otidos que forma el genoma completo ocupar´ıa del orden de 1 metro lo cual supone unas 105 veces la longitud de una c´elula. As´ı, el pol´ımero debe empaquetarse. A intervalos regulares el ADN aparece enrollado una vuelta y media alrededor de unas prote´ınas de aspectos esf´erico llamadas histonas. Al conjunto de una histona y el ADN enrollado alrededor de ella se le conoce como nucleosoma. As´ı mismo, los nucleosomas est´an compactados uno sobre otro formando la cromatina que a su vez est´a compactada formando los cromosomas (Fig. 3.1). Los cromosomas se encuentran dentro del n´ ucleo celular que es donde ocurre el proceso de expresi´on gen´etica o transcripci´on mediante el cual se sintetiza un nuevo biopol´ımero: el ´acido ribonucleico o ARN.

3.1.1.

Transcripci´ on Gen´ etica

La informaci´ on contenida en el genoma est´ a organizada en genes: secuencias de nucle´otidos que codifican prote´ınas. As´ı, durante la transcripci´ on, una

´ ´ CAP´ITULO 3. BIOPOL´IMEROS Y CINETICA ENZIMATICA

78

prote´ına llamada ADN polimerasa “abre” la doble h´elice de ADN en la regi´ on a transcribir. Cada gen posee una regi´on llamada promotor que especifica c´omo se debe transcribir. Los llamados factores de transcripci´on se unen a esa regi´on y, siguiendo sus indicaciones, la prote´ına ARN polimerasa se mueve a lo largo de la secuencia de nucle´ otidos generando una copia de la secuencia complementaria del gen, el ARN mensajero o mARN. No obstante, y a diferencia de la cadena de ADN complementaria, cuando se sintetiza el mARN, en vez de timina (T) se utiliza el uracilo (U), lo cual permite que el mARN sea estructuralmente estable en forma de una cadena sin necesidad de unirse a una complementaria como en el caso del ADN. El proceso de transcripci´on propiamente dicho termina aqu´ı. Como vemos, la transcripci´on no es m´as que una copia de informaci´ on de un biopol´ımero, ADN, a otro, mRNA. El proceso mediante el cual esa informaci´ on se vuelve funcional al ser traducida a otro biopol´ımero, la prote´ına, se conoce como traducci´on. En las c´elulas eucariotas entre la transcripci´ on y la traducci´on hay un paso intermedio de “purificaci´ on” del mARN conocido como splicing. Los genes eucariotas contienen trozos de secuencias que no son u ´tiles para la s´ıntesis de prote´ınas. A estos trozos no u ´ tiles se les llama intrones mientras que a los trozos de secuencias que codifican prote´ınas (´ utiles) se les conoce como exones. Mediante el splicing los intrones son eliminados y s´olo se deja en el mARN la parte codificante del gen2 . Finalmente el mARN abandona el n´ ucleo y es transportado al citosol donde, con el fin de aumentar su estabilidad qu´ımica, se le a˜ nade una “cabeza” qu´ımica en la terminaci´ on-5´ y una secuencia de varios nucle´otidos de adenina no codificantes en la terminaci´ on-3´conocida como poli(A). Una vez en el citosol comienza la fase de traducci´on en prote´ınas.

3.1.2.

Traducci´ on Gen´ etica

Las prote´ınas son el principal constituyente de la masa celular. Mientras que en los ´acidos nucleicos los mon´omeros son nucle´ otidos, en las prote´ınas los mon´omeros son amino´acidos. El n´ umero de amino´ acidos que contiene una acidos para la s´ıntesis prote´ına oscila entre 50 y 104 . Existen 20 tipos de amino´ de prote´ınas. Los amino´acidos comparten un grupo amino y un grupo carboxilo unidos por un enlace covalente conocido como enlace pept´ıdico. Por este motivo 2

Mediante el procedimiento conocido como splicing alternativo el mismo gen puede dar lugar a diferentes prote´ınas utilizando la inclusi´ on-exclusi´ on de exones. De este modo el mismo gen puede dar lugar a una media de ocho prote´ınas diferentes en el genoma humano.

3.1. DEL ADN A LAS PROTE´INAS

79

Figura 3.2: El c´odigo gen´etico. En esta tabla se muestra la correspondencia universal entre codones y amino´acidos que rige la traducci´ on del mARN en prote´ınas. Tomando por ejemplo como primera base (columna izquierda) la adenina, despu´es como segunda base (fila superior) el uracilo y finalmente como tercera base (columna derecha) la guanima, vemos que este triplete (cod´on), AU G, codifica el aminoacido metionina (Met) que es el iniciador de traducci´ on (ver texto).

a las prote´ınas tambi´en se les llama polip´eptidos 3 . El proceso de traducci´on de las prote´ınas funciona del siguiente modo. Una vez en el citosol el mARN es capturado por una compleja maquinaria de traducci´ on: los ribosomas. Problema. ¿Cu´ al es la secuencia complementaria de ARN de la cadena de nucle´otidos ACTGGGTAC? Soluci´ on. Puesto que las bases (nucle´otidos) est´an emparejados A-U y C-G, la secuencia complementaria es UGACCCAUG. Los ribosomas leen el mARN de tres en tres nucle´otidos; a cada conjunto de tres nucle´otidos se le llama cod´ on y el ribosoma traduce los codones al lenguaje de amino´ acidos. El n´ umero de posibles grupos de n elementos, que se 3 Si el pol´ımero est´ a formado por “pocos” amino´ acidos se le llama oligop´eptido o simplemente p´eptido.

80

´ ´ CAP´ITULO 3. BIOPOL´IMEROS Y CINETICA ENZIMATICA

pueden repetir, y que son tomados de m en m, viene dado por nm , as´ı pues hay 43 = 64 posibles codones, sin embargo hemos afirmado que s´olo hay 20 amino´ acidos diferentes. As´ı pues, o bien hay codones que no se corresponden con ning´ un amino´ acido o codones que se corresponden con varios amino´acidos. La soluci´ on pasa por ambas posibilidades: por un lado hay codones que corresponden al mismo amino´acido y por otro hay codones que no se traducen en amino´ acidos sino que se utilizan como se˜ nalizadores del final del proceso de traducci´on. En la figura 3.2 se muestran las correspondencias entre codones y amino´acidos: el c´odigo gen´etico. Como vemos diferentes codones pueden codificar el mismo amino´acido y hay tres codones que sirven de se˜ nalizaci´ on de parada en la traducci´ on. Adem´as existe un cod´ on, AUG, que tiene una doble funci´ on, por un lado sirve para indicar el comienzo de la traducci´ on y al mismo tiempo codifica un amino´acido, la metionina. El c´odigo gen´etico es “universal”: todos los organismos, desde las bacterias hasta los seres humanos, utilizan esta correspondencia entre codones y amino´acidos en la traducci´ on del genoma. El proceso de traducci´on est´a mediado por otro biopol´ımero, el ARN de transferencia o tARN. El tARN consiste b´ asicamente en un amino´acido y una secuencia de las bases (A, C, G y U) donde tres de ellas, un cod´on, constituyen un centro activo. As´ı, el ribosoma que se ha unido al mARN empieza a traducir cuando encuentra el cod´on de iniciaci´ on AUG. Para ello utiliza una mol´ecula de tARN que presenta en el centro activo el cod´ on complementario al de iniciaci´on o anticod´ on, UAC, el cual lleva unido el amino´acido metionina, capturando el amino´ acido y liberando el tARN sin metionina. Posteriormente, el ribosoma “avanza” hasta el pr´oximo cod´on y utiliza el tARN que presente el anticod´on correspondiente para capturar su amino´ acido, el cual une a la metionina. De este modo el ribosoma va construyendo la cadena pept´ıdica hasta que se encuentra con alguno de los codones de fin de traducci´on. Con esa se˜ nal se libera la prote´ına y el mARN. A este flujo de informaci´on entre biopol´ımeros, del ADN al ADN (replicaci´on), del ARN al mARN (transcripci´on) y del mARN a las prote´ınas (traducci´ on) se le conoce como el dogma central de la Biolog´ıa mol´ecular . Una vez que el polip´eptido se libera puede sufrir procesos de modificaci´on al ser qu´ımicamente alterado. Adem´as, las prote´ınas sufren un proceso de plegamiento en funci´on del medio y de las interacciones que ocurren entre mon´ omeros (regidas en parte por las modificaciones qu´ımicas mencionadas). En algunas ocasiones este proceso puede ser dirigido por unas prote´ınas llamadas chaperonas. La estructura espacial del biopol´ımero condiciona su funcionalidad al exponer los llamados centros (sitios) activos: lugares de la prote´ına que sirven para interaccionar con el medio celular y desarrollar as´ı su funci´ on.

3.2. S´INTESIS DE BIOPOL´IMEROS

81

En funci´ on del plegamiento que sufren, se pueden distinguir dos grandes clases de prote´ınas: las filamentosas y las globulares. Problema. Si un ribosoma encontrase la siguiente secuencia de bases en un ARN, GCAUGACGCGUGGGUGAGU, ¿qu´e cadena pept´ıdica le corresponder´ıa de acuerdo con la figura 3.2? Soluci´ on. El ribosoma empezar´ıa a traducir cuando encuentre el cod´on de inicio, AUG, y hasta que se encuentre con alguno de los tres codones de final de traducci´on, UAA, UAG o UGA. As´ı pues, del cod´on de inicio y hasta el cod´ on de paro, podemos separar la secuencia en codones como, ..AUG-ACG-CGU-GGG-UGA, que se corresponde con la cadena pept´ıdica, Met-Thr-Arg-Gly.

3.2.

S´ıntesis de Biopol´ımeros

Restringi´endonos a los biopol´ımeros con enlace covalente (p.e. el ADN), su s´ıntesis (polimerizaci´on) se produce por una reacci´ on de condensaci´ on en la cual los componentes de una mol´ecula de agua se toman de los mon´omeros que se u ´ nen. Por el contrario, la adici´ on de agua, hidr´ olisis, genera la separaci´on de mon´ omeros (Figura 3.3). Las reacciones de condensaci´on son energ´eticamente desfavorables, ΔG > 0, mientras que las de hidr´ olisis son energ´eticamente favorables, ΔG < 0. La forma de obtener la energ´ıa necesaria para la polimerizaci´on proviene, gen´ericamente, de la hidr´olisis del ATP que produce su desfosforilaci´ on y libera la energ´ıa del enlace qu´ımico. on de un mon´ omeDado un pol´ımero formado por n mon´ omeros, Pn , la adici´ on qu´ımica ro, P1 , se puede escribir de un modo simplificado en forma de reacci´ como, Pn + P1

kasociaci´on



kdisociaci´on

Pn+1 ,

82

´ ´ CAP´ITULO 3. BIOPOL´IMEROS Y CINETICA ENZIMATICA

on donde kasociaci´on es la tasa de reacci´on y donde hemos incluido en la descripci´ la reacci´on inversa, substracci´on de un mon´ omero a un pol´ımero Pn+1 , con una umero de mon´ omeros que se unen al pol´ımero tasa de reacci´on kdisociaci´on . El n´ por unidad de tiempo ser´ a proporcional a la concentraci´ on de mon´omeros libres ρP1 . Por otro lado los mon´omeros se disocian del pol´ımero a un ritmo constante kdisociaci´on . En el equilibrio, ρP1 kasociaci´on = kdisociaci´on .

(3.1)

A la concentraci´on de mon´omeros ρP1 tal que se verifica la ecuaci´on (3.1) se le llama concentraci´on cr´ıtica y establece la fase de saturaci´on de crecimiento del biopol´ımero. Dicha concentraci´ on tiene una relaci´ on directa con las constantes de equilibrio de la reacci´on de s´ıntesis ya que, Kequilibrio (T ) = kasociaci´on /kdisociaci´on = (ρP1 )−1 .

(3.2)

Problema. A una temperatura de 37 grados cent´ıgrados se introduce un biopol´ımero en una disoluci´ on compuesta por sus mon´omeros. En ese momento se observa una polimerizaci´on que hace crecer el pol´ımero hasta que la tasa de asociaci´on on es de 4 · 10−4 s−1 . ¿Cu´al es el valor es de 10−2 M −1 · s−1 y la de disociaci´ de la constante de equilibrio a esa temperatura?, ¿cu´al es la concentraci´on cr´ıtica de mon´omeros a esa temperatura? Soluci´ on. Utilizando la ecuaci´ on (3.2), Kequilibrio (T ) =

kasociaci´on 10−2 M −1 · s−1 = = 25M −1 . kdisociaci´on 4 · 10−4 s−1

De donde la concentraci´on cr´ıtica es, ρc =

1 1 = 4 · 10−2 M . = Kequilibrio (T ) 25M −1

Un pol´ımero puede crecer en principio por ambos extremos. As´ı, se habla de polimerizaci´on de cabeza o de cola. En la primera, utilizada en la s´ıntesis de prote´ınas, el enlace reactivo utilizado en la condensaci´on se sit´ ua al final del pol´ımero que crece y debe ser regenerado cada vez que se a˜ nade un mon´ omero.

3.3. FILAMENTOS PROTE´INICOS

83

H 2O

A

H + OH

B

A

B

Figura 3.3: Reacci´on de condensaci´on. Mediante la uni´on de dos mon´omeros se libera una mol´ecula de agua y se produce la uni´ on. Esta reacci´on es termodin´amicamente desfavorable y precisa del aporte energ´etico del ATP para que ocurra. La reacci´on inversa que produce la despolimeraci´on se conoce como hidr´olisis.

En la polimerizaci´ on de cola, utilizada en la s´ıntesis del ADN y el ARN, el enlace reactivo que porta el mon´omero se utiliza para producir la uni´on al pol´ımero que crece directamente. De este modo, y dado que la reacci´on qu´ımica completa es diferente en ambos extremos, habr´a dos concentraciones cr´ıticas de mon´omeros que en general son diferentes. Cuando se alcanza el equilibrio hay un estado estacionario en lo que se refiere a la longitud del pol´ımero, pero es din´amico en el sentido de que, si marcamos un mon´ omero, observaremos que ´este se “desplaza” a lo largo del pol´ımero hasta que es disociado. A este fen´ omeno se le conoce como treadmilling.

3.3.

Filamentos Prote´ınicos

Las c´elulas deben ser capaces de organizar su estructura y componentes internos para adaptarse a su crecimiento, divisi´on, etc´etera. Adem´as, deben ser capaces de cambiar su forma y de moverse en el medio extracelular. Todas estas tareas suponen un conjunto de funciones mec´ anicas que dependen de un intrincado sistema de filamentos conocido como citoesqueleto. El citoesqueleto es, por ejemplo, el encargado de separar los cromosomas durante la mitosis para posteriormente dividir la c´elula en dos y tambi´en de regular el transporte intracelular de substancias necesarias para el funcionamiento celular (Figura 3.4). Podemos distinguir tres principales tipos de filamentos en el citoesqueleto. Los filamentos intermedios tienen un di´ ametro de unos 10 nm y proporcionan a la c´elula la resistencia mec´anica necesaria para soportar las tensiones que se generan al deformarse. Por otro lado, los microt´ ubulos mantienen la posici´ on de diferentes organelos dentro de la c´elula. Adem´as, se encargan del transporte intracelular. Estos filamentos poseen un di´ ametro de unos 25 nan´ ometros. Finalmente, los filamentos de actina, o microfilamentos, son los que se encargan de dar forma a la c´elula y adem´as son necesarios para su movimiento. Su

84

´ ´ CAP´ITULO 3. BIOPOL´IMEROS Y CINETICA ENZIMATICA

Figura 3.4: El citoesqueleto da estructura y funcionalidad a las c´elulas. En la imagen de la izquierda podemos observar el intrincado sistema de filamentos que conforman el citoesqueleto. En la imagen de la derecha se muestra un detalle del mismo. di´ ametro oscila entre los 5 y los 9 nan´ometros. Como vemos, cada uno de ellos posee diferentes propiedades y funciones. Sin embargo todos ellos comparten ciertos principios, entre ellos el nivel de organizaci´ on. Los filamentos que forman el citoesqueleto son agrupaciones de biopol´ımeros cuyos mon´omeros son otros biopol´ımeros: prote´ınas. Es decir, son biopol´ımeros de biopol´ımeros de biopol´ımeros, un perfecto ejemplo de c´omo la complejidad biol´ ogica surge de la cooperaci´on de unidades simples. Este nivel de complejidad se alcanza mediante un compromiso entre funcionalidad y estabilidad. A diferencia con el ADN, el ARN y las prote´ınas, cuyos enlaces entre mon´omeros son enlaces fuertes, en el caso de los filamentos prote´ınicos los mon´omeros est´an unidos por interacciones covalentes d´ebiles. De este modo, se pueden ensamblar y desensamblar r´apidamente lo que hace que los filamentos sean din´amicos y adaptables a sus funciones. El precio que hay que pagar por esta facilidad a la hora de ensamblarse es que una cadena lineal larga es t´ermicamente inestable: no posee la fuerza suficiente como para soportar sin romperse la energ´ıa t´ermica del entorno. La soluci´ on de compromiso es la autoorganizaci´ on. As´ı, los filamentos prote´ınicos que conforman el citoesqueleto se generan uniendo cadenas lineales de biopol´ımeros de prote´ınas: protofilamentos. T´ıpicamente podemos distinguir tres tipos de organizaci´on en los protofilamentos. En el caso de los microfilamentos dos biopol´ımeros de actina se enrollan uno alrededor de otro formando h´elices que, en un nivel de organizaci´ on superior, pueden crear redes bidimensionales o geles tridimensionales. Por otro lado, en los microt´ ubulos los biopol´ımeros de tubulina se unen formando cilindros huecos. Finalmente, en los filamentos intermedios, que est´an constituidos por biopol´ımeros de una familia hetereog´enea de pro-

3.4. POL´IMEROS GLOBULARES

85

y

'L 1 x

r17

17

Figura 3.5: Un caminante aleatorio (punto rojo) en una red bidimensional. En cada salto el caminante salta de un punto de la red a otro contiguo recorriendo una distancia ΔL. El vector r17 indica la distancia recorrida al cabo de 17 saltos.

te´ınas, los protofilamentos se unen formando una “cuerda” de gran resistencia.

3.4.

Pol´ımeros Globulares: El Caminante Aleatorio

Analizando un problema “simple” podemos deducir alguna propiedad interesante de los pol´ımeros globulares en general y de las las prote´ınas globulares en particular. Supongamos entonces una red tridimensional donde tenemos una part´ıcula que va saltando aleatoriamente de un lugar de la red a uno contiguo: un caminante aleatorio. Para simplificar supondremos que inicialmente el → caminante se encuentra en el origen de coordenadas con posici´on − r 0 = (0, 0, 0) y que el espacio es discreto de forma que la distancia que nuestro caminante salta cada vez sea ΔL (Figura 3.5). Bajo estas premisas, al cabo de N saltos la posici´on del caminante ser´a, − → r N = ΔL ·

N 

→ → → (kix − e x + kiy − e y + kiz − e z) ,

i=1

donde, − → e x = (1, 0, 0) , → − e y = (0, 1, 0) , → − e = (0, 0, 1) , z

umeros aleatorios que pueden valer +1 o −1 con probabiliy kix , kiy y kiz son n´ dad 1/2. Evidentemente este resultado no nos dice mucho puesto que al ser un

´ ´ CAP´ITULO 3. BIOPOL´IMEROS Y CINETICA ENZIMATICA

86

→ proceso aleatorio − r N puede ser “cualquier” posici´on, sin embargo podemos

2 , calcular promedios estad´ısticos. Una cantidad interesante de estimar es rN donde · indica la operaci´ on promedio en experimentos, que proporciona informaci´ on sobre lo que se dispersa el caminante en su err´atico paseo. → → 2 , r N = rN Puesto que − rN ·−





2 = rN

ΔL ·

= ΔL · 2

N 

− → → (kix → e x + kiy − e y + kiz − e z)

i=1 N 

→ (kix − ex

+

→ kiy − ey

+

2 

→ kiz − e z) ·

i=1

=  N    y− → → → x− z− kj e x + kj e y + kj e z = j=1

N N    y y 2 x x z z ki kj + ki kj + ki kj . = ΔL · i=1 j=1

Podemos separar la u ´ ltima doble suma en las parejas con j = i y con j = i; de este modo,  N  

2 y 2 2 x 2 z 2 (ki ) + (ki ) + (ki ) + rN = ΔL ·  + ΔL2 ·

i=1 N  

kix kjx +

kiy kjy

+ kiz kjz



 .

i=1 j=i

Independientemente del signo de ki , (ki )2 = 1. Por otro lado las parejas ki kj toman un valor +1 la mitad de los casos (si las k s tienen el mismo signo) y −1 en la otra mitad (si las k s tienen signos opuestos) de forma que en promedio ki kj  = 0. De este modo,

2 rN = ΔL2 · 3N . O lo que es lo mismo, en promedio, la distancia recorrida al cabo de N saltos es,   √ 2 = ΔL 3N . (3.3) rN En el contexto que nos ocupa en este cap´ıtulo, lo relevante de este c´alculo es que lo podemos aplicar para calcular el tama˜ no caracter´ıstico de un biopol´ımero. Para ello imaginemos que el pol´ımero est´a formado por N mon´ omeros y que la distancia del enlace qu´ımico entre mon´omeros es ΔL. En ese caso, si

3.4. POL´IMEROS GLOBULARES

87

asumimos que cada enlace est´a orientado aleatoriante en el espacio, el pol´ımero presentar´ a el aspecto de un ovillo y su tama˜ no caracter´ıstico, la distancia promedio de extremo a extremo, vendr´a dado por la ecuaci´ on (3.3): el tama˜ no caracter´ıstico de un biopol´ımero globular crece con la ra´ız cuadrada del n´ umero de mon´ omeros. Esta aseveraci´ on pasa por una serie de suposiciones. La primera, que los mon´omeros “escogen” aleatoriamente la direcci´on hacia la cual apunta su enlace qu´ımico. Esta suposici´on no es necesariamente cierta ya que que en situaciones de densidad elevadas o si las interacciones entre mon´omeros o con el medio circundante son relevantes existir´a un sesgo en la orientaci´on del enlace. Adem´as, hemos obviado en el c´alculo el hecho de que dos mon´omeros no pueden ocupar el mismo lugar a la vez (algo que si puede ocurrir con nuestro caminante aleatorio al pasar por el mismo lugar en tiempos diferentes) y eso introduce correcciones al c´alculo.

Problema. omeros. ExperimenUn determinado biopol´ımero est´a formado por 102 mon´ talmente se comprueba que dispone de una estructura globular que ocupa un volumen de 200nm3 . ¿En qu´e rango de los siguientes podemos situar la distancia entre mon´omeros? a) (0,01 − 0,1) nm b) (0,1 − 1) nm c) (1 − 10) nm Soluci´ on. Utilizando el dato del volumen podemos calcular el radio del biopol´ımero, V =

4 3 πR , 3

de donde, R = 3,63nm. Utilizando la ecuaci´ on (3.3) podemos estimar la distancia entre mon´ omeros como, R = 0,21nm, ΔL = √ 3N de donde la respuesta correcta ser´ıa b).

´ ´ CAP´ITULO 3. BIOPOL´IMEROS Y CINETICA ENZIMATICA

88

El modelo del caminante aleatorio es tambi´en u ´til para describir el comportamiento de peque˜ nas part´ıculas en suspensi´on en un fluido; el llamado movimiento browniano4 . En el seno del fluido, las mol´eculas est´an en perpetuo movimiento (agitaci´ on t´ermica) y una part´ıcula en suspensi´ on recibe “golpes”continuamente. Como resultado ´esta se mueve aleatoriamente sin direcci´on aparente. En promedio recibir´ a golpes de todas direcciones por igual y por tanto su desplazamiento medio neto ser´a nulo: rN  = 0. Sin embargo, cuanto m´as tiempo transcurre (cuantos da), puede explorar m´as espacio y as saltos

2m´ = ΔL2 3N ). Si entre salto y salto transcuacceder a sitios m´as remotos ( rN rre un tiempo Δt, al cabo de N saltos el tiempo transcurrido sera t = N · Δt, de donde el desplazamiento cuadratico medio en funci´on del tiempo ser´a,

2  ΔL2 · 3t. rt = Δt En el l´ımite continuo tal que ΔL → 0 y Δt → 0, pero de forma que ΔL2 /Δt → constante, hablamos de un proceso difusivo donde la constante es proporcional al coeficiente de difusi´on D. La difusi´ on desempe˜ na un papel relevante en numerosos procesos biol´ogicos tal y como veremos en los sucesivos cap´ıtulos. Teorema de Fluctuaci´ on-Disipaci´ on De acuerdo con la discusi´ on anterior, una part´ıcula inmersa en un fluido experimenta una agitaci´ o n

 perpetua de forma que su dispersi´on aumenta linealmente en el tiempo, rt2 = αt, ¿podemos calcular de alguna manera este coeficiente de proporcionalidad? realizando el experimento 

Evidentemente, on del tiempo: la cuidadosamente podemos medir rt2 y representarlo el funci´ pendiente de esta recta nos dar´a α. Sin embargo, si cambiamos la temperatura del fluido o la part´ıcula deberemos repetir el experimento ya que el coeficiente α depende de la agitaci´on molecular (temperatura) y de otras caracter´ısticas del fluido y de la part´ıcula. ¿De qu´e manera podemos relacionar esta cantidad con las caracter´ısticas del experimento? De momento supondremos que el movimiento de la part´ıcula se realiza exclusivamente en una dimensi´ on espacial. La part´ıcula en el fluido esta sometida a una fuerza de fricci´ on debida al fluido que es proporcional a su velocidad5 , −μv, y a una fuerza aleatoria debida a la 4

El movimiento browniano fue bautizado as´ı en honor de R. Brown, el bot´ anico que al observar el polen descubri´ o el azaroso movimiento de las part´ıculas coloidales en suspensi´ on en un fluido. 5 N´ otese que el coeficiente de fricci´ on se puede medir. Por ejemplo dejando caer una part´ıcula del mismo material pero con m´ as masa en un campo gravitatorio. Es estas con-

3.4. POL´IMEROS GLOBULARES

89

agitaci´ on t´ermica, F , de forma que, ma = −μv + F . O bien, m

dx d2 x + F. = −μ dt2 dt

(3.4)

Multiplicando la ecuaci´ on (3.4) por x, mx

dx d2 x + F x. = −μx 2 dt dt

Notamos ahora que,

x

d2 x dt2 dx2 dt

=

d dt

= 2x

 x

dx dt





2

−

dx dt

=−

μ dx2 + F x. 2 dt

,

dx , dt

de forma que,  m

d dt



dx x dt



 −

dx dt

2 

Si promediamos esta ecuaci´on, encontramos que F x = 0 puesto que la fuerza aleatoria no est´a correlacionada con la posici´on de la part´ıcula y dada una posici´on x existe la misma probabilidad de que la fuerza la empuje a la derecha que a la izquierda con la misma intensidad. Igualmente d (xdx/dt) /dt = d xdx/dt /dt = 0 ya que posici´ on y velocidad de la part´ıcula est´an descorrelacionadas. De este modo,  m

dx dt

2 

μ = 2



dx2 dt

.

diciones las fuerzas aleatorias son despreciables frente a la fuerza gravitatoria, la part´ıcula alcanza una velocidad de caida estacionaria y μ = mg/v.

´ ´ CAP´ITULO 3. BIOPOL´IMEROS Y CINETICA ENZIMATICA

90

Ahora bien6 ,

 m

De este modo,



dx dt

dx2 dt

2  = 2 Ec  = kB T .

=

d 2  2kB T x = , dt μ

de donde,

2  2kB T t. x = μ Al generalizar este resultado a tres dimensiones obtenemos finalmente,

2  6kB T t. rt = μ La importancia de este resultado es much´ısimo mayor de la aparentemente tiene. Tal y como hemos mencionado podemos medir el coeficiente α y tambi´en μ y la temperatura T , de forma que podemos estimar el valor de la constante de Boltzmann kB y ah´ı reside la importancia de este c´alculo puesto que seg´ un hab´ıamos visto en el cap´ıtulo 1, kB = R/NA y R se puede medir en un “simple” experimento termodin´amico. As´ı pues mediante un experimento con un caminante aleatorio podemos estimar el n´ umero de Avogadro y por tanto medir el n´ umero de mol´eculas presentes en una determinada cantidad de masa y estimar su tama˜ no. El c´ alculo realizado es un ejemplo del teorema de fluctuaci´on-disipaci´on sobre el cual hablamos brevemente en el cap´ıtulo 1 y que de un modo m´ as general establece una relaci´on entre la respuesta de un sistema debido a una perturbaci´ on externa y las fluctuaciones internas del sistema en ausencia de la perturbaci´on. 6

Recordamos que de acuerdo con la Teor´ıa Cin´etica (cap´ıtulo 1), Ec  =

3 kB T . 2

Al considerar aqu´ı s´ olo una dimensi´ on espacial, Ec  =

1 kB T . 2

3.5. ELASTICIDAD Y BIOPOL´IMEROS Alargamiento (compresión)

91

'L

Torsión

'I

Doblamiento

'z

Figura 3.6: Deformaciones simples.

3.5.

Elasticidad y Biopol´ımeros

En esta secci´on tomaremos un punto de vista diferente para estudiar algunas propiedades de los biopol´ımeros. Supondremos que tratamos con pol´ımeros con un n´ umero elevado de mon´ omeros de forma que a escalas mucho m´ as grandes que la distancia entre mon´omeros podemos suponer que nuestro biopol´ımero es un continuo, una cuerda, que podemos caracterizar por par´ ametros habituales utilizados en teor´ıa de la elasticidad. Esta imagen es cierta, por ejemplo, para el ADN o filamentos prote´ınicos que a lo largo de esta secci´ on supondremos cilindros de longitud L tal que L a, siendo a el radio. La elasticidad trata de estudiar el comportamiento de sustancias que tienen la propiedad de recuperar su forma y tama˜ no cuando las fuerzas aplicadas que producen deformaciones se eliminan. Gen´ericamente, las deformaciones que podemos aplicar son tres: alargamiento (compresi´on), torsi´ on y doblamiento (Figura 3.6). El alargamiento es la m´as simple de las deformaciones. Al aplicar una fuerza de magnitud F a uno de los extremos, estirando, observaremos que la longitud se incrementa en una cantidad ΔL (la compresi´on es equivalente al alargamiento pero de signo opuesto). Para estiramientos suficientemente peque˜ nos la fuerza es proporcional a la extensi´ on, la llamada ley de Hooke, F ∝ ΔL. Se puede argumentar muy f´acilmente que la extensi´on depende de la longitud L ya que si tuvi´esemos dos cilindros unidos, al aplicar la fuerza cada uno de ellos se alargar´ıa una cantidad ΔL. Por ese motivo, es preferible trabajar con la raz´ on adimensional ΔL/L, conocida como deformaci´ on espec´ıfica. Del mismo modo podemos argumentar que debe existir una dependencia con el ´area del cilindro, o mejor dicho con la secci´on eficaz A = πa2 : para producir

92

´ ´ CAP´ITULO 3. BIOPOL´IMEROS Y CINETICA ENZIMATICA

el mismo alargamiento en un cilindro con m´as secci´on eficaz necesitar´e m´as fuerza. De este modo, llegamos a, F = Y · πa2 ·

ΔL , L

(3.5)

donde Y es una propiedad que depende del material, del pol´ımero, conocida como m´ odulo de Young, y que indica lo f´acil o dif´ıcil que es deformar un material al aplicarle una fuerza. A la fuerza por unidad de area, F/A se le llama esfuerzo. Cuando un material se estira, se observa que se contrae al mismo tiempo a lo largo de las direcciones perpendiculares al estiramiento. La proporci´on que se contrae el radio es proporcional a ΔL/L, ΔL Δa = −σ . a L

(3.6)

El signo menos indica los signos opuestos de ambos efectos: cuando existe un estiramiento del material aparece una compresi´on. A la constante de proporcionalidad, σ, se le llama raz´ on de Poisson. Al igual que cuando aplicamos una fuerza ´esta provoca un estiramiento, cuando aplicamos un torque este genera un desplazamiento angular. Causa y efecto est´an relacionados por la siguiente formula,

τ =χ·

πa4 Δφ · , 2 L

donde Δφ es el angulo de torsi´ on y,

χ=

Y , 2 (1 + σ)

es el m´ odulo de torsi´ on o coeficiente de rigidez. Es tambi´en habitual llamar a la cantidad Δφ/L densidad de torsi´ on.

3.5. ELASTICIDAD Y BIOPOL´IMEROS

93

Problema. Mediante la utilizaci´ on de unas pinzas ´opticasa , una cadena polim´erica es sometida a un esfuerzo de 10pN/nm2 (1pN = 10−12 N ) y la deformaci´on espec´ıfica obtenida es de 10−2 , ¿cu´anto vale el m´odulo de Young del pol´ımero? Si la raz´ on de Poisson es σ = 10−3 y el radio de pol´ımero es de 1nm, ¿cu´al ha sido la variaci´ on de su radio como consecuencia de la fuerza aplicada? Soluci´ on. Despejando Y de la ecuaci´ on (3.5), Y =

F L F ·L = · = 103 pN/nm2 . A · ΔL A ΔL

Por otro lado, utilizando (3.6), la variaci´ on que se genera en el radio es, Δa = −σ · a ·

ΔL = −10−5 nm. L

a

Las pinzas ´ opticas son dispositivos que por medio de luz l´aser atrapan part´ıculas diel´ectricas para su manipulaci´ on.

Si aplicamos al extremo de un cilindro una fuerza de magnitud F en una direcci´on perpendicular mientras el otro extremo queda fijo, se produce un doblamiento de magnitud Δz. La relaci´on entre ambas magnitudes viene dada por, 3πa4 Δz . · F =Y · 4L2 L Puesto que L/a 1 es f´acil ver que la deformaci´ on que sale m´as “barata” en t´erminos de la fuerza que tenemos que aplicar para generar el mismo desplazamiento es precisamente el doblamiento. Tomemos por ejemplo el cociente entre las fuerzas a aplicar para generar un alargamiento y un doblamiento de la misma magnitud en el mismo material, Falargamiento ∼ Fdoblamiento

 2 L

1, a

El mismo resultado obtenemos al comparar la fuerza necesaria para generar una torsi´ on y un doblamiento en los biopol´ımeros. Por este mismo motivo, el doblamiento es la deformaci´on que sale m´as barata energ´eticamente hablando.

94

´ ´ CAP´ITULO 3. BIOPOL´IMEROS Y CINETICA ENZIMATICA

Problema. Dados dos microfilamentos de la misma prote´ına tal que el radio de uno es el doble que el otro, ¿c´omo debe ser su relaci´on de longitudes para que aplicando el mismo torque a uno de ellos se produzca el mismo desplazamiento angular? Soluci´ on. Para el primero de los filamentos, τ1 = χ ·

πa4 Δφ · , 2 L

mientras que para el segundo, τ2 = χ ·

π (2a)4 Δφ ·  . 2 L

Igualando ambas expresiones, τ1 = τ2 , (2a)4 a4 = , L L de donde L = 16L, es decir, el microfilamento debe ser 16 veces m´as largo. Los biopol´ımeros est´an recibiendo un aporte energ´etico constante del medio circundante. La energ´ıa t´ermica proviene de las mol´eculas que rodean el pol´ımero, agua principalmente, que se encuentran en agitaci´on y que constantemente est´an transfieriendo energ´ıa al pol´ımero al chocar con ´el. A temperatura ambiente la energ´ıa t´ermica es 4 · 10−21 J ¿es suficiente esta energ´ıa como para producir una deformaci´ on en el biopol´ımero? Para dar respuesta a esta pregunta definimos la longitud de persistencia de un biopol´ımero de radio a y m´odulo de Young Y como, lp =

Y · a4 . 4 · 10−21 J

El significado de lp es el siguiente. Imaginemos un biopol´ımero como una varilla flexible sometida a golpecitos que la agitan de una manera aleatoria. Si nos fijamos en cualquier punto de la varilla en un instante, ´este estar´a apuntando a una determinada direcci´ on y los puntos “cercanos” estar´an tambi´en apuntando, m´ as o menos, hacia la misma direcci´on. La longitud de persistencia cuantifica el adjetivo “cercano” de la frase anterior. Por tanto, a mayor

3.6. LA TEOR´IA DE MICHAELIS-MENTEN

95

longitud de persistencia m´ as dif´ıcil es doblar el pol´ımero mediante la energ´ıa t´ermica. Por debajo de lp podemos considerar el biopol´ımero como r´ıgido. Dicho de otra manera, el cociente lp /L indica lo r´ıgido de un biopol´ımero respecto de las fluctuaciones t´ermicas. En el caso del ADN la longitud de persistencia es lp  50nm ( L) lo cual indica que el ADN es f´acil de doblar utilizando la energ´ıa t´ermica y explica la facilidad para empaquetarlo de la que hablamos on es la al principio del cap´ıtulo. Otro ejemplo que liga claramente lp y funci´ actina que posee una longitud de persistencia de lp  10μm, es decir, aproximadamente un di´ ametro celular, lo cual explica que mantenga la estructura celular. Problema. La relaci´ on entre el n´ umero de pares de bases, N , y la longitud del ADN, L, se puede estimar mediante la f´ormula, N = L/0,34nm. Por otro lado, cada paso de espiral en la doble h´elice se produce cada 10,5 pares de bases. Estimar con estos datos la densidad de torsi´on acumulada en cada paso de h´elice del ADN. Soluci´ on. En un paso de h´elice el desplazamiento angular es 2π (una vuelta) y eso sucede para 10,5 pares de bases. Por otro lado, la longitud que ocupan esos 10,5 pares es, L = 10,5 · 0,34nm = 3,57nm, de donde la densidad de torsi´ on acumulada en cada paso de h´elice del ADN es, 2π Δφ = = 1,76nm−1 . L 3,57nm En el cap´ıtulo 5 volveremos a hablar de la elasticidad, pero esta vez en un contexto completamente diferente en lo que a la escala se refiere. As´ı, veremos la importancia de los fen´omenos el´asticos en la Biomec´anica del cuerpo humano.

3.6.

Cin´ etica Enzim´ atica: la Teor´ıa de MichaelisMenten

Pr´ acticamente la totalidad de las reacciones qu´ımicas que suceden en la c´elula involucran la actuaci´ on de un biopol´ımero, en particular de prote´ınas

96

´ ´ CAP´ITULO 3. BIOPOL´IMEROS Y CINETICA ENZIMATICA

conocidas como enzimas y que act´ uan c´omo catalizadores. La cat´alisis biol´ ogica presenta dos singularidades respecto de otros procesos catal´ıticos de la Qu´ımica. En primer lugar, en condiciones biol´ogicas est´andar, son excepcionalmente eficientes. En segundo lugar, act´ uan selectivamente mediante su uni´ on con especies moleculares conocidas como ligandos (sustrato) para generar productos. As´ı, un u ´nico biopol´ımero enzim´atico es capaz de transformar entre 3 6 10 y 10 mol´eculas de ligando por minuto. La teor´ıa de Michaelis-Menten describe apropiadamente la mayor´ıa de las reacciones controladas enzim´aticamente. La reacci´on enzim´atica m´as sencilla que podemos imaginar es aquella donde u ´ nicamente interviene un tipo de enzima, E, y un tipo de sustrato, S, reaccionando reversiblemente para dar un compuesto, C, k+1

E + S  C,

(3.7)

k−1

Posteriormente, de forma irreversible7 , el compuesto libera la enzima utilizada como catalizador y el producto, P , k+2

C → E + P.

(3.8)

Habitualmente las cantidades de reactantes y productos se expresan en funci´ on de su concentraci´ on en la disoluci´ on m´ as que en cantidades absolutas. Cuando las concentraciones se expresan en moles por kilogramos de disolvente hablamos de molalidad mientras que cuando nos referimos a moles por litro de disoluci´on hablamos de molaridad. La ventaja de la primera medida frente a la segunda es la siguiente. Tal y como hemos visto en los cap´ıtulos anteriores, el volumen de una disoluci´on depende de la presi´ on y la temperatura y por tanto la molaridad es funci´ on de estas variables termodin´amicas mientras que la molalidad no. Si denotamos con las letras e, s, c y p las concentraciones de las especies indicadas, la ley de acci´on de masas aplicada a (3.7) y (3.8) nos indica que la

7 La Termodin´ amica establece que la reacci´ on E + P → C debe existir. Sin embargo, en la pr´ actica la constante de reacci´ on es tan peque˜ na que podemos despreciarla.

3.6. LA TEOR´IA DE MICHAELIS-MENTEN

97

variaci´on con el tiempo de estas cantidades viene dada por, ds dt de dt dc dt dp dt

= −k+1 e · s + k−1 c,

(3.9)

= −k+1 e · s + (k−1 + k+2 ) c,

(3.10)

= k+1 e · s − (k−1 + k+2 ) c,

(3.11)

= k+2 c.

(3.12)

Adem´as, asumimos que inicialmente s´ olo disponemos de enzima y sustrato, s (t = 0) = s0 , e (t = 0) = e0 , c (t = 0) = 0, p (t = 0) = 0. El conjunto de ecuaciones (3.9-3.12) puede ser simplificado ya que, d (e + c) de dc + = = 0, dt dt dt lo cual implica que la cantidad e (t)+c (t) no var´ıa en el tiempo. Este resultado no debe extra˜ narnos puesto que la cantidad de enzima se encuentra o bien en forma libre, e (t), o en el compuesto, c (t), y as´ı, salvo que haya procesos de degradaci´on o aportemos m´as enzima mientras se forma el producto, la cantidad de enzima disponible es una constante. En particular esta cantidad ser´a igual a la que disponemos en el instante inicial e (t) + c (t) = e0 y de este modo podemos eliminar bien la variable e o la variable c de las ecuaciones (3.9-3.12). Eliminando la variable e (t) = e0 − c (t), el sistema queda reducido a, ds = −k+1 (e0 − c) · s + k−1 c, dt dc = k+1 (e0 − c) · s − (k−1 + k+2 ) c, dt dp = k+2 c. dt

(3.13) (3.14) (3.15)

98

´ ´ CAP´ITULO 3. BIOPOL´IMEROS Y CINETICA ENZIMATICA

Problema. Se disuelven 12g del az´ ucar C12 H22 O11 en 200ml de H2 O (densidad 1g/cm3 ) de forma que la disoluci´ on posee una densidad de 1,022g/cm3 , ¿cu´al es la molalidad y la molaridad de la disoluci´ on? Soluci´ on. Primeramente necesitamos calcular el n´ umero de moles de soluto (az´ ucar). Consultando la tabla peri´ odica encontramos que 1 mol de C12 H22 O11 pesa 342g. De este modo, n´ umero de moles de C12 H22 O11 = 12g ×

1mol = 0,0351moles. 342g

La masa de agua es simplemente (1cm3 = 1ml), masa=densidad × volumen=1g/cm3 × 200cm3 = 200g = 0,2kg, de forma que la molalidad ser´a, molalidad =

0,0351moles  0,18 molal (m). 0,2kg

Por otro lado el volumen de disoluci´ on es, volumen=

200g + 12g masa = = 207,4cm3 = 0,2074l, densidad 1,022g/cm3

y la molaridad es, molaridad =

0,0351moles  0,17 molar (M ). 0,2074l

Examinando (3.7) y (3.8) el resultado que esperamos es que si dejamos transcurrir suficiente tiempo todo el sustrato quede transformado en producto y la enzima quede libre para catalizar nuevas reacciones. Efectivamente, el estado estacionario de las ecuaciones (3.13-3.15) nos indica que, s (t → ∞) = 0, e (t → ∞) = e0 , c (t → ∞) = 0, p (t → ∞) = s0 .

3.6. LA TEOR´IA DE MICHAELIS-MENTEN

99

v0 V

V /2

s0

Km

Figura 3.7: Comportamiento de la velocidad de reacci´on en funci´on de la concentraci´on de sustrato de acuerdo con la ecuaci´on de Michaelis-Menten (3.20). V es la velocidad de reacci´on m´axima.

No obstante, la pregunta relevante en Bioqu´ımica no es tanto cu´al es el estado estacionario sino la din´amica que nos lleva a ´el: la velocidad de reacci´on. Esta informaci´on nos indica lo r´ apida o lenta que transcurre una determinada reacci´on enzim´atica en funci´ on de las concentraciones de enzima y de sustrato en nuestro sistema. Para dar respuesta a esta pregunta debemos resolver el conjunto de ecuaciones diferenciales (3.13-3.15) en funci´ on del tiempo. De hecho basta con resolver las ecuaciones acopladas (3.13) y (3.14) puesto que conocida c (t) la cantidad de producto se obtiene por integraci´ on mediante (3.15),  t

c t dt . p (t) = k+2 0

3.6.1.

La Hip´ otesis del Estado Cuasiestacionario

Para resolver las ecuaciones (3.13) y (3.14) utilizaremos la hip´otesis cuasiestacionaria; para ello adimensionalizaremos por un momento las ecuaciones utilizando las siguientes definiciones, t˜ = k+1 · e0 · t, s˜ =

s s0 ,

c˜ =

c e0 ,

es decir, referimos la concentraci´on de sustrato a su concentraci´ on inicial y la de compuesto a la de enzima disponible, adem´as el tiempo queda referido al tiempo caracter´ıstico asociado a la velocidad de consumo del sustrato. En

100

´ ´ CAP´ITULO 3. BIOPOL´IMEROS Y CINETICA ENZIMATICA

estas unidades las ecuaciones (3.13) y (3.14) son,   k−1 d˜ s = −˜ s + s˜ + c˜, (3.16) k+1 · s0 dt˜   k−1 + k+2 d˜ c = s˜ − s˜ + c˜, (3.17) ε· k+1 · s0 dt˜



sujetas a la condici´ on inicial s˜ t˜ = 0 = 1 y c˜ t˜ = 0 = 0 y donde hemos definido la cantidad ε = e0 /s0 . Tal y como hemos comentado anteriormente, la cat´alisis enzim´atica es altamente eficiente tal y como lo refleja el hecho de que la cantidad de enzima necesaria comparada con la cantidad de sustrato requerida en la reacci´on es muy peque˜ na: proporciones tales que ε ∼ 10−3 son habituales. Puesto que en situaciones biol´ogicas t´ıpicamente ε  1, en el l´ımite podemos suponer que el miembro de la izquierda de (3.17) es nulo. Es otras palabras: en relaci´ on a la escala de tiempos de evoluci´on caracter´ısticos de la reacci´on enzim´atica, la concentraci´ on del complejo C cambia muy lentamente. Tan lentamente que podemos asumir c como constante en el tiempo. Esta es la llamada hip´ otesis del estado cuasiestacionario. Volviendo a las ecuaciones en las unidades originales (3.13) y (3.14), dc  0. dt Despejando entonces c de (3.14)8 , c (t) =

k+1 · e0 · s (t) , k+1 · s (t) + k−1 + k+2

y al substituir en (3.13) obtenemos que, k+2 · k+1 · e0 · s (t) ds =− . dt k+1 · s (t) + k−1 + k+2

(3.18)

Esta u ´ltima ecuaci´ on se puede escribir tambi´en como, ds = −k+2 · c (t) . dt

(3.19)

Comparando (3.19) y (3.15) encontramos que ds/dt = −dp/dt. Es decir, la velocidad a la cual desaparece el sustrato es precisamente la velocidad a la 8 N´ otese que como resultado de la aproximaci´ on realizada c (t = 0) = 0: la soluci´ on obtenida para c (t) no es v´ alida para tiempos iniciales.

3.6. LA TEOR´IA DE MICHAELIS-MENTEN

101

on, y as´ı, cual aparece el producto9 v (t), la velocidad de reacci´ k+2 · k+1 · e0 · s (t) dp = v (t) = . dt k+1 · s (t) + k−1 + k+2 Habitualmente la velocidad de reacci´on se determina en el tiempo inicial10 : v (t = 0) = v0 =

V · s0 , s0 + Km

(3.20)

donde V y Km vienen dadas por, V = k+2 · e0 , k−1 + k+2 . Km = k+1 A la ecuaci´on (3.20) se la llama la ecuaci´ on de Michaelis-Menten y a Km se la conoce como la constante de Michaelis. El comportamiento de la velocidad de reacci´on est´a indicado en la figura 3.7. Como se puede apreciar, seg´ un se va aumentando la concentraci´ on de sustrato, la velocidad tiende a V que es la velocidad m´ axima de reacci´on. As´ı, para grandes concentraciones de sustrato la velocidad de reacci´ on satura y es independiente de s0 . La velocidad de saturaci´ on V depende de la concentraci´on de enzima e0 y adem´as del valor de k+2 . Por ese motivo a la reacci´on (3.8), donde aparece k+2 , se la denomina paso limitante. Por otro lado, la constante Michaelis coincide con el valor de concentraci´ on de sustrato para el cual v0 = V /2. La manera habitual de proceder experimentalmente para calcular los dos par´ ametros relevantes de la ecuaci´on de Michaelis-Menten, V y Km , en procesos de cat´alisis enzim´atica pasa por la llamada representaci´on de LineweaverBurk. Si llamamos a 1/s0 = s!0 y a 1/v0 = v!0 , entonces la ecuaci´on (3.20) se puede escribir como, 1 Km + . v0 = s!0 · ! V V Es decir, el inverso de la velocidad de reacci´ on crece linealmente con el inverso de la concentraci´ on de sustrato. Es m´ as, en esta representaci´on, tal y como mostramos en la figura (3.8), el valor de corte con el eje de las ordenadas es 9

Este resultado s´ olo es cierto en la aproximaci´ on del estado cuasiestacionario. En general, aunque parecidas, estas velocidades son diferentes. 10 A pesar de que la soluci´ on que se obtiene mediante la aproximaci´on del estado cuasiestacionario para c (t) no es v´ alida para tiempo iniciales, la de s (t) que se obtiene por integraci´ on de la ecuaci´ on (3.18) s´ı lo es. Por extensi´ on, lo mismo ocurre para v0 .

102

´ ´ CAP´ITULO 3. BIOPOL´IMEROS Y CINETICA ENZIMATICA

vˆ0

1/ v0

1/V

1/ K m

sˆ0

1/ s0

Figura 3.8: La representaci´on de Lineweaver-Burk de la ecuaci´on de Michaelis-Menten permite obtener de un modo sencillo V y Km mediante una regresi´ on lineal.

1/V y el valor de corte con el eje de las abcisas es −1/Km . De este modo, realizando una regresi´ on lineal de los datos experimentales, podemos obtener V y Km .

3.7.

Fen´ omenos Competitivos

En general, una enzima cataliza una u ´ nica reacci´on. Esta especificidad depende de la complementariedad estructural entre el ligando y el sitio activo de la enzima. A esta complementariedad estructural se la conoce como propiedad est´erica. De este modo, a los ligandos de una enzima que siendo diferentes son estructuramente similares se les llama isost´ericos. Cuando en un sistema hay presencia de ellos, compiten por unirse al sitio activo de la enzima para generar diferentes productos. Este tipo de reacciones enzim´aticas se llaman puramente competitivas. Un ejemplo de este tipo de comportamiento lo podemos observar en la asparaginasa que es capaz de reaccionar con la glutamina para producir glutamato pero tambi´en con el ´acido asparag´ anico para producir aspartato. El caso m´as simple de reacciones enzim´aticas puramente competitivas es el de dos sustratos isost´ericos. Siguiendo el esquema de reacciones presentado anteriormente, (3.7) y (3.8), podemos describir la fenomenolog´ıa enzim´atica

´ 3.7. FENOMENOS COMPETITIVOS

103

mediante las reacciones, k+1

k+2

S1 + E  C1 → E + P1 , k−1 k+3

k+4

S2 + E  C2 → E + P2 . k−3

Implementando la ley de acci´ on de masas para la cin´etica de las concentraciones s1 , s2 , e, c1 , c2 , p1 , p2 encontramos otras tantas ecuaciones diferenciales sujetas a la condici´ on inicial: s1 (t = 0) = s1,0 , s2 (t = 0) = s2,0 , e (t = 0) = e0 , c1 (t = 0) = c2 (t = 0) = 0, p1 (t = 0) = p2 (t = 0) = 0. Este sistema de ecuaciones puede ser simplificado teniendo en cuenta que, al igual que antes, la cantidad de enzima disponible, bien en forma libre, bien en forma de compuesto, se mantiene constante en el tiempo, e (t) + c1 (t) + c2 (t) = e0 . Es m´as, si se verifican las siguientes condiciones, s1,0 k+1 e0  1, ∼ 1, ∼ 1, si,0 k+3 s2,0 entonces podemos volver a implementar la hip´otesis del estado cuasiestacionario y realizar la aproximaci´ on, dc2 dc1 =  0, dt dt lo cual nos permite resolver c1 y c2 en t´erminos de s1 y s2 . En este sistema existen dos velocidades de reacci´on dependiendo del producto, y las ecuaciones de Michaelis-Menten resultan, 

v0p1 v0p2

s1  Km = V1 · 1 + · 1+ s1,0   s2 Km = V2 · 1 + · 1+ s2,0

s2,0 s2 Km s1,0 s1 Km

−1 ,

(3.21)

,

(3.22)

−1

104

´ ´ CAP´ITULO 3. BIOPOL´IMEROS Y CINETICA ENZIMATICA

Problema. La carboxipeptidasa pancre´ atica es una enzima que cataliza el proceso mediante el cual se rompen los residuos de amino´ acidos de un extremo de una cadena pept´ıdica. Utilizando diferentes concentraciones de sustrato se obtienen las siguientes velocidades de reacci´on medidas en los instantes iniciales (mM = milimolar = 10−3 · M ): s0 (mM ) 5 10 20

v0 (mM/s) 0,373 0,518 0,644

Comprobar que los datos verifican la ecuaci´ on de Michaelis-Menten y calcular la velocidad m´ axima de reacci´ on y la constante de Michaelis. Soluci´ on. Si los datos verifican la ecuaci´ on de Michaelis-Menten, en la representaci´ on de Lineweaver-Burk deben estar relacionados linealmente. As´ı pues construimos primeramente la siguiente tabla, s c 0 = 1/s0

“ ” mM −1

0,2 0,1 0,05

v b0 = 1/v0 (s/mM ) 26,824 19,294 15,529

La ecuaci´on de una recta que pasa por dos puntos (x1 , y1 ) y (x2 , y2 ) viene dada por, y − y2 x − x2 = . y2 − y1 x2 − x1

Utilizando los dos primeros puntos de la tabla obtenemos la recta, v!0 = 11,764s/mM + s!0 · 75,3s

que es exactamente la misma recta que se obtiene con cualquier otra combinaci´ on de puntos de la tabla de lo cual podemos concluir que los datos obedecen la ecuaci´ on de Michaelis-Menten. El valor de la velocidad m´ axima de reacci´on lo podemos calcular por el punto de corte con el eje de las ordenadas: v0 (s!0 = 0) = 11,764s/mM , !

de donde V = 1/! v0 (s!0 = 0) = 0,085mM/s. En cuanto a la constante de Michaelis la estimamos mediante el punto de corte con el eje de abcisas: 0 = 11,764s/mM + s!0 (! v0 = 0) · 75,3s

de donde despejando s!0 (! v0 = 0) obtenemos que Km = −1/s!0 (! v0 = 0) = 6,4mM .

´ 3.7. FENOMENOS COMPETITIVOS

105

s1 y K s2 , y las velocidades m´ aximas de donde las constantes de Michaelis, Km m reacci´on, V1 y V2 , son,

V1 = k+2 · e0 , V2 = k+4 · e0 , k−1 + k+2 s1 = , Km k+1 k−3 + k+4 s2 = . Km k+3 s1 y K s2 Experimentalmente la forma de proceder para calcular V1 , V2 , Km m se basa de nuevo en la representaci´on de Lineweaver-Burk. Para cada una de las expresiones de la velocidad de reacci´ on (3.21) y (3.22) la representaci´on de pi pi " v0 = 1/v0 frente a s" i,0 = 1/si,0 es una recta,    1 s2,0 p1 s1 " · 1 + Km · s# , (3.23) v0 = 1,0 · 1 + s2 V1 Km    s1,0 1 p2 s2 " · 1 + Km · s# . (3.24) v0 = 2,0 · 1 + s1 V2 Km pi Sin embargo, en este caso la pendiente de la recta v" i,0 ) depende de la 0 (s" concentraci´ on inicial del sustrato conjugado sj,0. No obstante, el punto de pi (s" = 0) = 1/V no depende de tal corte con el eje de las ordenadas, v" 0

i,0

i

concentraci´ on inicial (ver figura 3.9). El an´ alisis de un conjunto de rectas pi " si v0 (s" i,0 ) para diferentes sj,0 permite calcular entonces Km . No obstante, es necesario realizar la siguiente advertencia. La representaci´on de Lineweaver-Burk proporcionar´ a rectas en el caso de interacci´on puramente competitiva siempre y cuando durante la realizaci´on del experimento pi ıe el valor inicial de la concentraci´ on inicial en el cual medimos v" i,0 ) no var´ 0 (s" del sustrato conjugado sj,0. En el caso representado en la figura (3.9) podemos imaginar que si durante el experimento sj,0 var´ıa desde a hasta c entonces el pi comportamiento de v" (s" ) ya no ser´ıa lineal. Es posible definir el par´ ametro 0

i,0

adimensional,

s

i,j =

Vi · Kmj si , Vj · Km

que permite estimar si la variaci´on en el tiempo de sj,0 es apreciable durante pi a d´ebilmente mientras la medici´on de v" i,0 ): si i,j  1 entonces sj,0 variar´ 0 (s" pi " a lineal. Si por el contrario i,j 1 medimos v0 (s" i,0 ) y su comportamiento ser´

´ ´ CAP´ITULO 3. BIOPOL´IMEROS Y CINETICA ENZIMATICA

106

vˆ0pi

1/ v0pi

s j ,0

c s j ,0 s j ,0

b a

1/ Vi

sˆi ,0

1/ si ,0

Figura 3.9: La representaci´on de Lineweaver-Burk para un sistema puramente competitivo de dos especies de ligandos. Siempre y cuando la concentraci´on inicial del sustrato conjugado, sj,0 , no var´ıe en el tiempo apreciablemente, el an´alisis de un conjunto de rectas para distintos valores de sj,0 permite estimar las constantes de Michaelis y las velocidades de saturaci´ on (ver texto). pi entonces sj,0 variar´ a apreciablemente mientras medimos v" i,0 ) y su compor0 (s" tamiento ser´a no lineal. En este u ´ltimo caso es necesario utilizar la versi´on de la ecuaci´ on de Michaelis-Menten dependiente del tiempo (no mostrada aqu´ı) s1 lo cual complica el procedimiento de c´alculo de las constantes V1 , V2 , Km s 2 y Km . Finalmente, merece la pena hacer notar que si εi,j es grande en un no caso (comportamiento no lineal), entonces j,i es obligatoriamente peque˜ (comportamiento lineal) puesto que j,i = 1/i,j . Este es el caso mencionado anteriormente de la asparaginasa, para la cual asparaganico, glutamina  160 y por tanto glutamina, asparaganico = 1/asparaganico, glutamina  6 · 10−3 .

3.8.

Fen´ omenos Cooperativos

Muchas enzimas son pol´ımeros de prote´ınas donde un mismo motivo de enlaces pept´ıdicos, llamado prot´ omero, se repite. A estas enzimas se las conoce gen´ericamente con el nombre de olig´ omeros. Los olig´ omeros son llamados d´ımeros, tr´ımeros, tetr´ameros, etc´etera cuando el n´ umero de prot´ omeros presentes son dos, tres, cuatro, etc´etera. En algunas enzimas, cada prot´omero contiene un sitio activo y por tanto un sustrato puede unirse a la enzima en varios lugares. Un ejemplo t´ıpico al respecto es la hemoglobina11 . Esta prote´ına se combina con el ox´ıgeno en los pulmones para formar la oxihemoglobina que libera el oxigeno en los diferentes tejidos. La hemoglobina liberada se combina 11

La hemoglobina no es una enzima. Los olig´ omeros no tienen por qu´e ser enzimas.

´ 3.8. FENOMENOS COOPERATIVOS

107

Figura 3.10: Representaci´on de un mol´ecula de hemoglobina. La hemoglobina posee cuatro sitios activos: los grupos hemo (en verde). entonces con el CO2 transport´ andolo a los pulmones. La hemoglobina posee cuatro sitios activos llamados grupos hemo, capaces de combinarse con otras tantas mol´eculas (Figura 3.10). Consideremos entonces una prote´ına formada con n prot´ omeros cada uno de ellos con un centro activo y que supondremos independientes y equivalentes en lo que respecta a su interacci´on con el ligando. Si denominamos S al sustrato y Ci a la prote´ına (enzima) con i sitios a, activos ocupados12 entonces la reacci´on de ocupaci´on de un sitio activo ser´ k+1

S + Ci  Ci+1 ,

(3.25)

k−1

donde i = 0, 1, 2, . . . , n−1. A estas n reacciones deberemos a˜ nadir otras tantas correspondientes a la formaci´on de producto, k+2

Ci+1 → Ci + P .

(3.26)

Adem´as, supondremos que el sustrato es muy abundante y que su concentraci´on var´ıa tan lentamente que podemos tomar su concentracion como constante: s0 . Consideraremos primeramente las ecuaciones cin´eticas que, de acuerdo con la ley de acci´on de masas, se deducen para las reacciones (3.25). Tomemos por ejemplo la ecuaci´ on con i = 0, k+1

S + C0  C1 . k−1

12

En esta notaci´ on C0 = E.

(3.27)

108

´ ´ CAP´ITULO 3. BIOPOL´IMEROS Y CINETICA ENZIMATICA

Problema. Se dispone de una enzima que es capaz de reaccionar con dos sustratos dion ferentes s1 y s2 . Cuando en un experimento se dispone que la concentraci´ inicial de s2 sea nula, se obtiene los siguientes resultados al medir v0p1 variando la concentraci´ on inicial del sustrato s1 , s1,0 (mM ) 5 10 20

p

v0 1 (mM/s) 0,373 0,518 0,644

Por otro lado, utilizando espectrometr´ıa de relajaci´ on qu´ımica, se determina s1 y K s2 . que 2,1 = 40 y que V2 = 1mM/s. Se pide calcular V1 , Km m Soluci´ on. p1 s1,0 ) se debe Puesto que 2,1 = 40 entonces 1,2 = 2,5 · 10−2 , es decir v" 0 (# comportar de manera lineal. Efectivamente si construimos la tabla para representar los datos proporcionados en la representaci´on de Lineweaver-Burk, sd 1,0 = 1/s1,0

“ ” mM −1

0,2 0,1 0,05

p p d v0 1 = 1/v0 1 (s/mM )

26,824 19,294 15,529

comprobamos que ´estos se ajustan a la recta, p1 # v" 1,0 · 75,3s. 0 = 11,764s/mM + s

Si comparamos esta expresi´on con (3.23) para s2,0 = 0, vemos que, 1 = 11,764s/mM , V1 s1 Km = 75,3s. V1 s1 = 6,4mM . Por otro lado, De donde V1 = 0,085mM/s y Km

2,1 = 40 =

s1 V2 · Km s2 . V1 · Km

s2 obtenemos finalmente, Despejando Km s2 = Km

s1 V2 · Km = 1,88mM . V1 · 2,1

´ 3.8. FENOMENOS COOPERATIVOS

109

Podr´ıamos estar tentados de escribir la siguiente ecuaci´on de balance, dc0 = −k+1 · s0 · c0 + k−1 · c1 , dt sin embargo esta ecuaci´on es incorrecta. El motivo es el siguiente. Cuando la enzima posee sus n sitios disponibles, el ligando tiene otras tantas posibilidades independientes de unirse a la enzima. De la misma manera, cuando la enzima posee sus n sitios activos ocupados, el n´ umero de posibilidades independientes de desocupar un sitio son n. As´ı pues, en el paso hacia la derecha de la reacci´on (3.27) debemos tener en cuenta las n posibilidades que posee el sustrato S para reaccionar con C0 y en el paso hacia la izquierda debemos tomar en cuenta que s´olo existe una posibilidad de desocupaci´on del compuesto C1 , es decir, la ecuaci´ on correcta es, dc0 = −k+1 · n · s0 · c0 + k−1 · c1 . dt Del mismo modo, la ecuaci´on de balance para la reacci´on, k+1

S + C1  C2 ,

(3.28)

k−1

es, dc1 = −k+1 · (n − 1) · s0 · c1 + 2 · k−1 · c2 + k+1 · n · s0 · c0 − k−1 · c1 , dt donde los dos u ´ltimos t´erminos provienen de considerar las contribuciones on (3.27). El conjunto de reacciones se puede construir sobre C1 de la reacci´ f´ acilmente con la ayuda del esquema mostrado en la figura 3.11. As´ı, las ecuaciones cin´eticas de balance para (3.25) quedan finalmente, dc0 = −k+1 · n · s0 · c0 + k−1 · c1 , dt dcn = k+1 · s0 · cn−1 − k−1 · n · c1 , dt dcj = k+1 · (n + 1 − j) · s0 · cj−1 + k−1 · (j + 1) · cj+1 − dt − k−1 · j · cj − k+1 · (n − j) · s0 · cj , con j = 1, 2, . . . , n − 1 y con condici´on inicial, c0 (t = 0) = e0 , ci (t = 0) = 0, (i = 1, . . . , n) .

110

´ ´ CAP´ITULO 3. BIOPOL´IMEROS Y CINETICA ENZIMATICA s0

n u k1 u s0

C0

s0

 n  1 u k1 u s0

C1

C2

k1 u s0



Cn 1

2 u k 1

k 1

s0

s0

s0

Cn

n u k1

s0

Figura 3.11: Representaci´on esquem´atica del conjunto de reacciones (3.25). Cada c´ırculo representa el olig´ometro con una determinada ocupaci´on, las l´ıneas conectan posibles estados de ocupaci´on del mismo con tasas de acuerdo con las posibilidades de asosiaci´ on y disociaci´on descritas en el texto.

En este caso existe tambi´en una ley de conservaci´on puesto que la cantidad de enzima, se encuentre en el estado de ocupaci´on que se encuentre, se conserva, n 

cj (t) = e0 .

j=0

No obstante, por conveniencia, esta vez no eliminaremos una de las variables cj de las ecuaciones cin´eticas. La implementaci´on de la hip´ otesis cuasiestacionaria implica, dci = 0. dt Al aplicar esta condici´on para i = n se obtiene, cn =

1 s0 · · cn−1 , n K

(3.29)

otesis para i = n − 1 y utilizando (3.29) donde K = k−1 /k+1 . Aplicando la hip´ obtenemos, s0 2 · · cn−2 . (3.30) cn−1 = n−1 K

´ 3.8. FENOMENOS COOPERATIVOS

111

As´ı, sucesivamente, podemos relacionar ci con ci+1 para i = 0, 1, 2, . . . , n − on 1. Es m´as, podemos combinar estas relaciones para expresar ci en funci´ exclusivamente de c0 ,   n · xj · c0 , (3.31) cj = j donde x = s0 /K, j = 1, 2, . . . , n y el primer t´ermino del miembro de la derecha es el llamado coeficiente binomial13 ,   n n! . = j! · (n − j)! j Recapitulando, la ecuaci´ on (3.31) nos indica c´ omo calcular la concentraci´on de compuesto intermedio correspondiente a la enzima con j sitios activos ocupados en funci´ on de la concentraci´ on de enzima con ning´ un sitio ocupado. La concentraci´on de ligando utilizado en compuestos enzim´aticos interon de ligando utilizado en total medios Cj es j · cj , por tanto la concentraci´ es, n  j · cj j=0

o equivalentemente este n´ umero corresponde a la concentraci´on de sitios activos ocupados de la enzima. Puesto que la concentraci´on de sitios activos totales, ocupados y sin ocupar, no es m´ as que la concentraci´on de enzima umero de sitios activos por enzima, n, la cantidad, disponible, e0 , por el n´ n n j=0 j · cj j=0 j · cj  = , (3.32) Y = n · e0 n · nj=0 cj no es m´as que la fracci´on de sitios activos ocupados. Pero, n  j=0 13

cj =

n    n j=0

j

· xj · c0 = c0 · (x + 1)n ,

La definici´ on del factorial de z es, z! = z · (z − 1) · (z − 2) · . . . · 1

Por definici´ on 0! = 1. El coeficiente binomial aparece de una manera natural en la expansi´on, ! n X n j n−j n (x + y) = x y . j j=0

´ ´ CAP´ITULO 3. BIOPOL´IMEROS Y CINETICA ENZIMATICA

112

y por otro lado,

    n  n n j j · cj = j· · x · c0 = c0 · x · j· · xj−1 = j j j=0 j=0 j=0 ⎡ ⎤   n n   j  n  d ⎣ dx n = c0 · x · · · xj ⎦ = = c0 · x · dx dx j j

n 

n 

j=0

= c0 · x ·

j=0

d [(x + 1)n ] = c0 · x · n · (x + 1)n−1 , dx

de donde,

s0 x = . (3.33) 1+x s0 + K Este resultado nos indica varias cosas. En primer lugar, cuando la concentraci´on inicial de ligando tenga un valor s0 = K, la mitad de los sitios activos estar´an ocupados. En segundo lugar, dicha concentraci´ on inicial no depende en absoluto de la cantidad de sitios activos del olig´omero. De hecho la ecuaci´on (3.33) es la misma que hubi´esemos obtenido en el caso de enzimas con un u ´nico sitio activo tal y como podemos ver particularizando las expresiones (3.31) y (3.32) para j = 1. De cualquier modo estos resultados s´olo son ciertos si k+2 = 0 puesto que hasta ahora hemos obviado la reacci´on (3.26), o lo que es lo mismo, Y =

k+2

Ci + P ← Ci+1 .

(3.34)

Por comparaci´on de (3.34) con (3.25), es trivial ver que al considerar tambi´en (3.34), la forma en que quedan modificadas las ecuaciones de balance de Cj , y por extensi´on el resto de resultados ya obtenidos, se consigue realizando la sustituci´ on, k−1 → k−1 + k+2 . En el caso particular de Y , s0 , s0 + Km la constante de Michaelis. Por otro lado, la ecuaci´ on de balance Y =

siendo Km para P es,

dp = n · k+2 · cn + (n − 1) · k+2 · cn−1 + . . . + k+2 · c1 = dt n  j · cj , = k+2 · j=0

´ 3.8. FENOMENOS COOPERATIVOS

113

pero dp/dt es la velocidad de reacci´ on, de donde, ⎛ ⎞ n n n   j=0 j · cj = j · cj = k+2 · ⎝n · cj ⎠ ·   v = k+2 · n · nj=0 cj j=0 j=0 = k+2 · n · e0 · Y , o equivalentemente, v=

V · s0 , s0 + Km

(3.35)

con, V = k+2 · n · e0 , k−1 + k+2 . Km = k+1 En resumen, al considerar olig´ omeros con n sitios activos independientes y equivalentes, y asumiendo que la cantidad de ligando es tan abundante que la podemos considerar como constante, hemos obtenido exactamente el mismo resultado que si hubi´esemos considerado mon´ omeros (suponiendo la misma concentraci´ on de sitios activos en ambos casos). Este tipo de comportamiento en reacciones enzim´aticas mediadas por olig´omeros se llama no cooperativo. Para que un sistema como el descrito se considere cooperativo los sitios activos no pueden ser considerados independientes: las tasas de asociaci´on y disociaci´on enzima-ligando deben depender de si hay o no sitios activos ocupados. Como veremos, en ese caso el comportamiento de la velocidad de reacci´on se aleja del predicho por la ecuaci´ on de Michaelis-Menten. Si al unirse un ligando la actividad de la enzima aumenta, entonces al ligando se le conoce como activador o efector. En el caso contrario se le llama inhibidor o represor. En este libro no estudiaremos en detalle los modelos cooperativos. No obstante ilustraremos su comportamiento con el modelo cooperativo m´as simple que podemos imaginar: el d´ımero cooperativo.

3.8.1.

El D´ımero Cooperativo

El esquema de reacciones de un d´ımero cooperativo es, k+1

k+2

S + C0  C1 → C0 + P ,

(3.36)

k−1 k+3

k+4

S + C1  C2 → C1 + P . k−3

(3.37)

114

´ ´ CAP´ITULO 3. BIOPOL´IMEROS Y CINETICA ENZIMATICA

N´otese que ahora las tasas de reacci´on son diferentes dependiendo del nivel de ocupaci´on de los sitios activos. La ecuaciones cin´eticas de balance para las concentraciones se pueden resolver aplicando la hip´otesis cuasiestacionaria y el resultado final es que la velocidad de reacci´ on es, v0 =

 +k e0 · s0 · (k+2 · Km +4 · s0 ) ,   Km · Km + Km · s0 + s20

(3.38)

donde, k−1 + k+2 , k+1 k−3 + k+4 = . k+3

Km =  Km

Como podemos observar en la expresi´on (3.38), la velocidad de reacci´on del d´ımero cooperativo va como, v0 ∼ A ·

s20 . B + s20

Las funciones de la forma, f (x) = a ·

xn , b + xn

se llaman funciones de Hill de orden n. Por tanto la ecuaci´ on de MichaelisMenten es una funci´ on de Hill de orden 1. Una aproximaci´on habitual en sistemas cooperativos es suponer la velocidad de reacci´ on de la forma, v0 

V · sn0 . Km + sn0

Este resultado para la velocidad de reacci´ on se puede derivar formalmente de las ecuaciones cin´eticas de balance de un sistema enzim´atico que considere reacciones, k+1

C0 + n · S  Cn . k−1

(3.39)

´ 3.8. FENOMENOS COOPERATIVOS

115

Problema. ¿Qu´e condiciones debe verificar un d´ımero cooperativo para comportarse como un d´ımero no cooperativo? Soluci´ on. Examinando las ecuaciones (3.36) y (3.37) y compar´ andolas con (3.25) y (3.26), podr´ıamos pensar que la soluci´on al problema pasa por las equivalencias, k+4 = k+2 , k+3 = k+1 , k−3 = k−1 , esperando que entonces (3.38) se reduzca a una forma de Michaelis-Menten; es trivial ver que no es as´ı. El motivo est´ a en recordar las posibilidades comentadas anteriormente sobre las opciones que posee el ligando de asociarse/disociarse de un sitio activo dependiendo de la ocupaci´ on del d´ımero. De esta manera, cuando la enzima no posee ning´ un sitio activo ocupado, el sustrato dispone de dos posibilidades de asociaci´ on mientras que cuando el d´ımero dispone de un sitio activo ya ocupado entonces s´olo dispone de una. El mismo argumento se puede repetir, aunque a la inversa, para los procesos de disociaci´on. As´ı, podemos comprobar que el d´ımero se comportar´a de manera no cooperativa si, k+1 = 2 · k+3 , k+4 = 2 · k+2 , k−3 = 2 · k−1 , puesto que entonces la velocidad de reacci´on (3.38) se reduce a la forma de Michaelis-Menten. Es decir, de suponer que los estados intermedios entre el olig´omero con ning´ un sitio activo ocupado y el olig´ omero con sus n sitios activos ocupados se pueden obviar (lo cual es s´olo una buena aproximaci´ on si las reacciones intermedias ocurren muy r´ apidamente). En la figura 3.12 mostramos el comportamiento de la velocidad de reacci´on v0 (s0 ) comparando un sistema no cooperativo y otro cooperativo. Mientras que el primero se comporta seg´ un la ecuaci´ on de Michaelis-Menten, el segundo presenta el aspecto de una fun-

116

´ ´ CAP´ITULO 3. BIOPOL´IMEROS Y CINETICA ENZIMATICA

v0

V

Sistema no cooperativo (Michaelis-Menten) Sistema cooperativo.

s0 Figura 3.12: Velocidad de reacci´on, v0 (s0 ), en un sistema no cooperativo y en uno cooperativo. El primero se comporta seg´ un la ecuaci´ on de Michaelis-Menten mientras que el segundo presenta un comportamiento sigmoide como el que aparece en las funciones de Hill con n > 1. ci´on de Hill con n > 1. De este modo, una manera de discernir si el sistema presenta comportamiento cooperativo es mediante la representaci´on de Lineweaver-Burk: una desviaci´on del comportamiento lineal es indicativo de cooperatividad enzim´ atica. Por otro lado, es posible estimar el grado de cooperatividad, n, mediante la llamada representaci´on de Hill que consiste en representar log (v0 / (V − v0 )) frente a log (s0 ). La curva resultante es una recta de pendiente14 n. Terminamos el cap´ıtulo comentando el llamado efecto alost´erico. Existen enzimas que poseen sitios activos que son diferentes de aquellos responsables de la acci´ on catal´ıtica. Estos sitios activos se conocen como sitios alost´ericos. Entonces, un ligando que se une al sitio alost´erico modifica la actividad del sitio activo catal´ıtico. El efecto alost´erico est´a relacionado con cambios conformacionales en estos biopol´ımeros. Algunos autores realizan la equivalencia entre fen´ omenos cooperativos y alost´ericos. Aqu´ı hemos querido diferenciar entre ambos aunque comparten el hecho de la existencia de una interacci´on indirecta entre sitios activos de la enzima que condiciona su actividad.

14

El ajuste a la funci´ on de Hill est´ a basado en una hip´ otesis que, gen´ericamente, es poco realista: (3.39). Entonces, es posible encontrar valores para n no enteros, e incluso menores que la unidad, en el ajuste. En este u ´ timo caso hablamos de cooperatividad negativa.

CAP´ITULO

4

Fen´omenos de Transporte: Membranas

En este cap´ıtulo presentaremos la difusi´on i´ onica a trav´es de membranas, la cual es fundamental para regular numerosos procesos en los seres vivos. Como sabemos, las membranas son sistemas b´asicos para el funcionamento de las c´elulas vivas y de los organismos. Antes de entrar en los detalles de los procesos de transporte a trav´es de membranas, vamos a recordar algunos aspectos de la estructura y el funcionamiento de estos sistemas. Cada c´elula est´a rodeada por una membrana que controla su contenido qu´ımico y sirve para aislar la c´elula del ambiente, para transportar sustancias y para transmitir mensajes. La membrana celular est´a constituida por l´ıpidos, prote´ınas y gl´ ucidos en proporciones aproximadas de 40 %, 50 % y 10 %, respectivamente. En la membrana de la c´elula eucariota existen tres tipos de l´ıpidos: fosfol´ıpidos, glucol´ıpidos y colesterol. Una parte de estas mol´eculas lip´ıdicas es hidr´ ofila y la otra parte es hidr´ofoba por lo que cuando se encuentran en un medio acuoso se orientan formando una bicapa lip´ıdica (Fig.4.1). La membrana tiene un cierto nivel de fluidez que depende de la temperatura y de su composici´ on. La presencia de l´ıpidos insaturados y de cadena corta favorecen el aumento de la fluidez, mientras que la presencia de colesterol endurece las membranas, reduciendo su fluidez y permeabilidad. Las prote´ınas son los componentes de la membrana que desempe˜ nan las funciones espec´ıficas de transporte y de comunicaci´ on. Pueden girar alrededor de su eje y muchas de ellas pueden desplazarse lateralmente por la membrana.

118

´ CAP´ITULO 4. FENOMENOS DE TRANSPORTE: MEMBRANAS

Figura 4.1: Composici´on de una membrana biol´ogica. Las prote´ınas de membrana pueden ser: - Prote´ınas integrales, que est´an unidas a los l´ıpidos atravesando la bicapa l´ıpidica una o varias veces. Por eso se llaman prote´ınas de transmembrana. - Prote´ınas perif´ericas, que se localizan a un lado u otro de la bicapa lip´ıdica y est´an unidas d´ebilmente a las cabezas polares de los l´ıpidos de la membrana por enlaces de hidr´ ogeno, (Fig.4.1). Por u ´ltimo, los gl´ ucidos, se sit´ uan en la superficie externa de las c´elulas eucariotas. Son oligosac´aridos unidos a los l´ıpidos (formando glucol´ıpidos), o a las prote´ınas (formando glucoprote´ınas). Esta cubierta de gl´ ucidos protege la superficie de las c´elulas de posibles lesiones, permite el deslizamiento de c´elulas en movimiento como, por ejemplo, las c´elulas sangu´ıneas, e interviene en los fen´ omenos de reconocimiento celular, particularmente importantes durante el desarrollo embrionario. Las dos funciones b´asicas de la membrana son el transporte, por un lado, y el reconocimiento y la comunicaci´on por otro lado. Transporte Consiste en el intercambio de materia entre el interior de la c´elula y su ambiente externo. Puede ser: Transporte pasivo: Es un proceso de difusi´ on de sustancias a trav´es de la membrana. Se produce siempre a favor del gradiente y puede manifestarse como difusi´on simple (a trav´es de la bicapa lip´ıdica) o como difusi´on facilitada (a trav´es de canales prote´ınicos). En el caso de difusi´ on simple, a trav´es de

´ PURA A TRAVES ´ DE MEMBRANAS 4.1. DIFUSION

119

la bicapa lip´ıdica se realiza el transporte pasivo de mol´eculas lip´ıdicas, como las hormonas esteroideas, una gran parte de anest´esicos y sustancias apolares como el ox´ıgeno y el nitr´ogeno atmosf´erico. El transporte pasivo a trav´es de canales prote´ınicos da paso a los iones como el N a+ , K + , Cl− , etc. La difusi´ on facilitada, por su parte, permite el transporte de peque˜ nas mol´eculas polares, como los amino´acidos que al no poder atravesar la bicapa lip´ıdica, requieren que las prote´ınas transmembranosas faciliten su paso. Transporte activo: En este proceso tambi´en act´ uan prote´ınas de membrana pero ahora, a diferencia de la difusi´ on facilitada, ´estas requieren energ´ıa, en forma de ATP, para transportar las mol´eculas al otro lado de la membrana. Este tipo de transporte se utiliza cuando se realiza en contra del gradiente electroqu´ımico. Como ejemplos de transporte activo se pueden citar la bomba de N a/K, y la bomba de Ca. En este cap´ıtulo vamos a estudiar con detalle los procesos de difusi´on simple a trav´es de la membrana, discutiendo tambi´en algunos aspectos de la difusi´on facilitada. Reconocimiento y comunicaci´ on Estos procesos se basan en la actuaci´on de las mol´eculas situadas en la parte externa de la membrana como receptoras de sustancias espec´ıficas e implican la presencia de unos receptores espec´ıficos en la membrana celular capaces de ser activados por est´ımulos que vengan del medio extracelular. Los receptores de membrana, ya estimulados, cambian su comportamiento y ´ transforman el est´ımulo extracelular en intracelular. Este act´ ua sobre enzimas o factores intracelulares provocando una respuesta celular como, por ejemplo, la contracci´ on muscular, la secreci´on glandular, la divisi´ on celular, etc.

4.1.

Difusi´ on Pura a Trav´ es de Membranas

En este cap´ıtulo vamos a introducir los conceptos b´ asicos para comprender los procesos f´ısicos que se realizan a trav´es de las membranas. Como punto de partida, vamos a utilizar los fundamentos termodin´ amicos, introducidos en los cap´ıtulos anteriores.

4.1.1.

Potencial del Equilibrio de Nernst

Tal y como hemos visto en el segundo cap´ıtulo sobre Termodin´ amica, si en un sistema existe variaci´ on de masa, entonces la variaci´on de la energ´ıa libre

120

´ CAP´ITULO 4. FENOMENOS DE TRANSPORTE: MEMBRANAS

de Gibbs (2.8) viene dada por: dG = −SdT + V dP +  donde μi =

∂G ∂ni

r 

μi dni ,

(4.1)

i=1

 T,P,nj=i

es el potencial qu´ımico de un tipo de part´ıculas i,

que a continuaci´ on vamos a denominar especie o componente i. Recordamos que este potencial mide la variaci´on de la energ´ıa libre respecto al n´ umero de part´ıculas presentes. En los ejemplos que vamos a estudiar, normalmente vamos a considerar el transporte de cargas. Si una cantidad determinada de cargas (dq) se transporta contra el potencial el´ectrico ψ, el trabajo realizado ser´ a: δWq = ψdq. Teniendo en cuenta que existen otros tipos de trabajo como el trabajo δWP realizado cuando un gas se comprime aplicando una presi´ on P , que conlleva a la disminuci´on de su volumen dV δWP = −P dV y el trabajo que se ejerce transportando materia dn contra el gradiente de concentraci´ on δWn = μdn, el trabajo realizado por el sistema en el caso de r especies transportadas se expresa finalmente con la siguiente ecuaci´on: δW = −P dV +

r 

μi dni + ψdq.

(4.2)

i=1

Usando el Primer Principio de la Termodin´ amica que establece que la energ´ıa interna de un sistema aumenta en dU si se suministra a ´este cierta cantidad de calor δQ = T dS y si se realiza sobre ´este cierta cantidad de trabajo δW , dU = δQ + δW, obtenemos la ecuaci´on fundamental de Gibbs: dU = T dS − P dV +

r  i=1

μi dni + ψdq.

(4.3)

´ PURA A TRAVES ´ DE MEMBRANAS 4.1. DIFUSION

121

Finalmente, usando la relaci´ on entre la energ´ıa interna U y la energ´ıa libre de Gibbs: G = U + P V − T S, la ecuaci´ on (4.3) en el caso de presencia de un potencial el´ectrico ψ es: dG = −SdT + V dP +

r 

μi dni + ψdq.

i=1

Una ampliaci´ on de esta ecuaci´on est´a relacionada con el t´ermino ψdq. La carga el´ectrica por unidad de mol y de carga viene dada por la constante de Faraday F = NA q = 9,65·104 C/mol, donde q es la magnitud de la carga de un electr´on umero de Avogadro. (aproximadamente 1,602 · 1019 Coulombs) y NA es el n´ As´ı, si un determinado i´ on posee una carga z, la carga total de n moles del mismo ser´a q = nzF . A partir de esta relaci´ on, los dos u ´ltimos t´erminos de la ecuaci´ on (4.3), en el caso de que haya m´as de un i´on en la disoluci´ on, se pueden expresar como r  i=1

μi dni + ψ

r  i=1

zi F dni =

r 

(μi + zi F ψ)dni = μ ˜i dni .

i=1

La cantidad μ ˜i = μi + zi F ψ

(4.4)

es el potencial electroqu´ımico, que aparece en la mayor´ıa de los c´alculos electroqu´ımicos. Teniendo en cuenta la dependencia del potencial qu´ımico μ de la concentraci´on a trav´es de la ecuaci´on (2.9), para el potencial electroqu´ımico μ ˜ finalmente obtenemos la siguiente expresi´on: μ ˜ = μ0 + RT ln c + zF ψ,

(4.5)

siendo c la concentraci´ on de la especie considerada. Vamos a considerar ahora un sistema a presi´on y temperatura constantes que est´a separado por una membrana semipermeable y que consiste en dos compartimentos int (interior) y ext (exterior). Vamos a considerar que los potenciales el´ectricos en los dos compartimentos son ψ int y ψ ext , respectivamente (Fig.4.2). De acuerdo con la condici´on del equilibrio, la energ´ıa libre del sistema G no experimenta cambios: (dG)T,P = (dGint )T,P + (dGext )T,P = 0.

(4.6)

122

´ CAP´ITULO 4. FENOMENOS DE TRANSPORTE: MEMBRANAS

Figura 4.2: Representaci´on de un sistema compuesto por dos fases y dividido por una membrana semipermeable.

Supongamos que en los dos compartimentos hay distintos componentes i = 1, 2, ..., como por ejemplo en el caso de una disoluci´on de una sal AB, formada por dos componentes, con concentraciones distintas en las dos fases int y ext. umero de moles de la componente i, intercambiada desde el Si dni es el n´ compartimento ext hacia el compartimento int, entonces de la ecuaci´on (4.6), obtenemos la condici´on de igualdad de los potenciales electroqu´ımicos en los dos compartimentos, (4.4): int ext = μ0i + RT ln cext , μ0i + RT ln cint i + zi F ψ i + zi F ψ ext son las concentraciones del componente i en los dos donde las variables cint i , ci compartimentos (int y ext), respectivamente, y μ0i son los potenciales qu´ımicos en ausencia de potencial el´ectrico. De aqu´ı podemos obtener la ecuaci´ on de Nernst para la diferencia del potencial Δψ a trav´es de la membrana en funci´on de la actividad qu´ımica de la componente permeable en ambos compartimientos y en condiciones de equilibrio termodin´ amico, que se cumple para cada especie i: int zi F (ψ int − ψ ext ) = RT (ln cext i − ln ci ).

La ecuaci´on de Nernst entonces tiene la siguiente forma, v´alida para cada i: Δψ ≡ (ψ int − ψ ext ) =

cext RT ln iint . zi F ci

(4.7)

La ecuaci´on (4.7) puede ser transformada para calcular la diferencia de las concentraciones del i´on permeable i, que se crea entre las dos fases, dada la diferencia de potencial Δψ entre ambas: ext − cint i = ci e

zi F Δψ RT

.

´ PURA A TRAVES ´ DE MEMBRANAS 4.1. DIFUSION

123

La ecuaci´on de Nernst permite por una parte el c´alculo de la distribuci´ on de los iones en funci´ on del potencial el´ectrico y por otra parte, el c´alculo del potencial el´ectrico que se produce como consecuencia de la distribuci´on no uniforme de los iones. Las ecuaciones deducidas en esta secci´on se aplican s´olo en caso de equilibrio termodin´ amico. Esto significa que la ecuaci´on de Nernst no se puede utilizar para calcular el potencial de una c´elula viva. En realidad, el potencial de membrana de una c´elula viva puede ser debido al potencial de difusi´ on o generado por bombas de iones. Por otro lado, en general es bastante frecuente que algunos tipos de iones se distribuyen pas´ıvamente, y por lo tanto est´an realmente en equilibrio. Esto u ´ ltimo permite el estudio bas´andose en una suposici´on bastante sencilla, como la ecuaci´on de Nernst. Como ejemplo de aplicaci´on de esta teor´ıa se puede citar la concentraci´on de cloruro en la mayor´ıa de las c´elulas vivas. Debido a que la permeablidad de membrana es bastante alta y a que no existen bombas de cloruro, su distribuci´ on es pr´ acticamente pasiva y determinada por la existencia del potencial de membrana. Por lo tanto, la ecuaci´on de Nernst permite el c´alculo de la concentraci´ on interna de los iones de cloruro si se conoce la concentraci´ on de cloruro fuera de la membrana y el potencial de membrana. Esta ecuaci´on tambi´en permite el c´alculo del potencial de la membrana de la c´elula, si se conoce la concentraci´ on de cloruro dentro y fuera de la membrana.

4.1.2.

Ecuaci´ on de Nernst-Planck

De los fundamentos de la Termodin´amica, sabemos que el flujo de materia de la especie i a trav´es de una membrana expresa el n´ umero de moles ni que atraviesan la unidad de a´rea A de la membrana en unidad de tiempo y se define i con la expresi´on Ji = A1 dn dt . Multiplicando el numerador y el denominador por la velocidad vi de las part´ıculas y teniendo en cuenta que Avi dt es el volumen de las part´ıculas en el tiempo dt, se obtiene la siguiente expresi´on para el flujo de la especie i a trav´es de la membrana: Ji = ci vi , on de la especie i. denominando ci la concentraci´ Por otra parte, la velocidad que alcanzan las part´ıculas es proporcional a ua sobre ellas vi = ui fi , siendo ui la movilidad. Entonces, la fuerza fi que act´ el flujo a trav´es de la membrana es: Ji = ci ui fi .

124

´ CAP´ITULO 4. FENOMENOS DE TRANSPORTE: MEMBRANAS

En el caso que consideramos, la fuerza depende del gradiente del potencial μ˜i , de donde obtenemos: electroqu´ımico fi = − ddx Ji = −ui ci

dμ˜i . dx

(4.8)

Por otro lado, el potencial electroqu´ımico de la especie i a temperatura y presi´ on constantes, se expresa mediante la ecuaci´on (4.5): μ ˜i = μ0 + zi F ψ + RT ln ci .

(4.9)

Sustituyendo esta u ´ltima relaci´ on en la expresi´ on del flujo, ec.(4.8), obtenemos la siguente ecuaci´on: Ji = −ui ci zi F

dψ dci − ui RT , dx dx

(4.10)

que se denomina ecuaci´ on de Nernst-Planck. Esta ecuaci´ on describe c´omo el flujo de una especie i´ onica a trav´es de una membrana depende del gradiente del potencial y del gradiende de la concentraci´on. Es una ecuaci´on b´ asica para la descripci´on de los procesos de difusi´on pura a trav´es de membranas. En el caso de que en el sistema existan flujos de varias especies distintas, como primera aproximaci´on, despreciando los flujos acoplados, el flujo resultante viene dado por la suma de cada especie por separado, lo que constituye el principio de independencia.

4.1.3.

Teor´ıa de Campo Constante

El modelo de campo constante fue propuesto originalmente por Goldman (1943) y m´as tarde desarollado por Hodgkin y Katz (1949). Es el modelo m´as sencillo para la integraci´ on y el estudio posterior de la ecuaci´on de NernstPlanck. Supongamos un sistema constituido por una membrana de espesor Δx que separa los compartimientos int (interior) y ext (exterior), presentados en la figura 4.3. Fijamos el or´ıgen x = 0 en la interfase entre la membrana y el compartimiento ext. Seg´ un la ecuaci´ on de Nernst-Planck, el flujo total del componente i, Ji (x), a trav´es de la membrana en el punto x en su interior, se da mediante la siguiente expresi´on: Ji (x) = −ui ci (x)zi F

dψ(x) dci (x) − ui RT . dx dx

(4.11)

´ PURA A TRAVES ´ DE MEMBRANAS 4.1. DIFUSION

125

Figura 4.3: Representaci´on de una membrana de espesor Δx que separa dos compartimentos.

int

ext

ext Las variables (ci ≡ cint , ψ ) son las concentraciones y los i , ci ), (ψ ≡ ψ potenciales electrost´aticos en el interior de la membrana, en las interfases con los compartimentos int y ext respectivamente, (Fig.4.3).

Para obtener la expresi´ on del flujo en funci´ on de las concentraciones en los compartimentos que separa la membrana, o la diferencia del potencial a trav´es de la membrana, hay que hacer varias suposiciones: 1) El sistema est´a en estado estacionario y el flujo Ji es constante para todo componente i. 2) La movilidad es constante en el interior de la membrana. 3) El campo el´ectrico a trav´es de la membrana es constante. Esto significa que la derivada del potencial se puede expresar como la variaci´on del potencial int ext Δψ −ψ . en un intervalo Δx: dψ dx = Δx con Δψ = ψ Integrando la ecuaci´ on (4.11) entre los l´ımites x = 0 y x = Δx, con la on lineal de x ( dψ suposici´on anterior de que ψ(x) es una funci´ dx = const.), obtenemos: 1 − ui RT





Δx

dx = 0

cint i cext i

dci Ji + ui zi F Δψ Δx ci

.

126

´ CAP´ITULO 4. FENOMENOS DE TRANSPORTE: MEMBRANAS

De aqu´ı, ext Ji + ui zi F Δψ 1 Δx Δx ci ln . = Δψ int ui RT ui zi F Δψ J + u z F c i i i Δx Δx i

Despejando Ji , finalmente tenemos:   int ezi F Δψ/RT ui zi F Δψ cext − c i i Ji = − . Δx 1 − ezi F Δψ/RT

(4.12)

Esta ecuaci´ on da la forma expl´ıcita del flujo de la especie i a trav´es de la membrana en funci´on de las concentraciones y los potenciales electrost´aticos en el interior de la membrana en la interfase con el exterior. Vamos ahora a relacionar las concentraciones y los potenciales en el interior de la membrana con las mismas cantidades en el exterior. Podemos considerar que la interfase entre la membrana y el medio exterior es tal que cualquier especie disuelta en uno de los medios, se disuelve en la fase contigua. En equilibrio, la relaci´ on entre las concentraciones de la especie i en las dos fases on. viene dada por el coeficiente de reparto βi , definido a continuaci´ Si adem´as suponemos que: 1) El intercambio de iones entre la membrana y el exterior es mucho m´as r´ apido que el proceso de difusi´on a trav´es de la membrana, esto permitir´a trabajar en condiciones de equilibrio en las fases int y ext en todo instante y relacionar las concentraciones en el interior y en el exterior de la membrana a trav´es del coeficiente de reparto. 2) El coeficiente de reparto βi de la componente i es constante e id´entico en las interfases con el interior y el exterior. Entonces: cext cint i i = = βi . int cext c i i

(4.13)

Usando la condici´on de equilibrio en cada una de las interfases, podemos aplicar la ecuaci´on de Nernst (4.7) para cada interfase, con lo que se obtiene el siguiente sistema de ecuaciones: ψ

ext

ψ

− ψ ext = −

int

RT cext i , ln ext zi F ci

− ψ int = −

RT cint ln iint . zi F ci

(4.14)

En consecuencia, tenemos: Δψ ≡ ψ

int

−ψ

ext

= ψ int − ψ ext ≡ Δψ.

(4.15)

´ PURA A TRAVES ´ DE MEMBRANAS 4.1. DIFUSION

127

i RT βi , que tiene el sentido de perAhora, introduciendo el parametro pi = uΔx meabilidad de la membrana a la especie i, y usando las ecuaciones (4.13-4.15), la ecuaci´ on (4.12) se transforma en:

pi zi F Δψ Ji = − RT



int zi F Δψ/RT cext i − ci exp 1 − expzi F Δψ/RT

 .

(4.16)

Esta ecuaci´ on de campo constante se denomina tambi´en ecuaci´ on de flujo de Goldman-Hodgkin-Katz . A partir de ella se puede estudiar la dependencia del flujo de una componente a trav´es de la membrana, de las concentraciones en cada uno de los compartimentos y de la diferencia de potencial existente entre ellos, cuando el sistema est´ a en un estado estacionario. En el caso en el que las concentraciones en el interior y en el exterior de ext = c en la ecuaci´ on (4.16), la membrana sean iguales, sustituyendo cint i i = ci obtenemos la siguiente expresi´on para los flujos:

Ji = −

pi ci zi F Δψ. RT

Esta forma del flujo se puede interpretar, seg´ un la ley de Ohm, como una corriente que atraviesa un conductor el´ectrico. En el caso de ausencia de corriente de la componente i, Ji = 0, de la ecuaci´on (4.16), obtenemos la ecuaci´on de Nernst:

zi F Δψ/RT = cint . cext i i e

int son distintas, cext = cint , Finalmente, cuando las dos concentraciones cext i , ci i i la relaci´on entre el potencial y el flujo no es una recta, sino una curva con mayor pendiente cuando el flujo va desde el compartimento externo al compartimento interno que en el caso contrario. Por consiguiente, la resistencia de la membrana al flujo del interior es menor en el caso en el que hay intercambio de materia ext → int que en el que hay intercambio de materia int → ext.

´ CAP´ITULO 4. FENOMENOS DE TRANSPORTE: MEMBRANAS

128

Problema. A partir de la ecuaci´ on de Goldman-Hodgkin-Katz, (4.16), sabiendo el valor del flujo de la especie, expresar la concentraci´ on de la especie en el compartimento int en el exterior de la membrana en funci´ on de las dem´as variables en el caso de valor peque˜ no de la diferencia del potencial. Soluci´ on. De la ecuaci´on (4.16), cuando Δψ  1, desarrollando la exponencial hasta el primer orden en Δψ, es decir, ex  1 + x, obtenemos int int Ji RT (−zi F Δψ/RT ) = −pi zi F Δψ(cext i − ci − ci zi F Δψ/RT ),

de donde cint i =

4.2.

pi cext i − Ji pi (1 +

zi F Δψ RT )

.

Difusi´ on I´ onica a Trav´ es de la Membrana

En esta secci´on vamos a estudiar los fen´ omenos de difusi´ on i´ onica. Estos procesos son fundamentales para explicar las diferencias de potencial de membrana que aparecen en las c´elulas. El objetivo ser´ a presentar las distintas distribuciones i´onicas que contribuir´an a la generaci´ on de potenciales de membrana. Esto se aplicar´a a lo largo del cap´ıtulo al estudio de modelos de generaci´on del potencial de membranas en los sistemas biof´ısicos. Como punto de partida vamos a introducir el principio de electroneutralidad. Este principio establece que la suma de las cargas positivas es igual a la suma de las cargas negativas en cualquiera de los compartimentos separados por una membrana. Es un principio fundamental y se establece a nivel macrosc´opico. Sin embargo, las membranas biol´ ogicas son capaces de almacenar cargas en las superficies de contacto con algunos medios, actuando como condensadores. No obstante, la magnitud de la carga es despreciable y el principio de la electroneutralidad es exacto en el l´ımite termodin´amico.

4.2.1.

Potenciales de Gibbs-Donnan

Consideramos el sistema de la figura 4.4, donde una membrana separa dos compartimentos en los cuales se introducen sales monovalentes A+ X − y A+ B − de la misma concentraci´on. Supongamos que los iones A+ y B − pueden

´ IONICA ´ ´ DE LA MEMBRANA 4.2. DIFUSION A TRAVES

129

Figura 4.4: Esquema del sistema compuesto por las dos fases. difundir a trav´es de la membrana, mientras que los iones X − se quedan confinados en el compartimento ext. Supongamos tambi´en que no existe potencial el´ectrico externo aplicado sobre el sistema. En el caso de la figura 4.4, el ani´ on B − se dirige hacia la parte exterior de la membrana (parte ext) arrastrando al ani´ on A+ para satisfacer el principio de electroneutralidad. Esto conlleva un aumento de la concentraci´on de A+ en la parte ext y una disminuci´ on en la parte int. Como consecuencia se genera una gradiente de concentraciones de iones A+ , que se opone al flujo del mismo ani´ on. En el equilibrio se alcanza una distribuci´on asim´etrica de los dos iones A+ y B − en ambos lados de la membrana. Esta distribuci´ on asim´etrica genera una diferencia de potencial electrost´ atico entre las dos partes, que se denomina potencial de Gibbs-Donnan. En la parte exterior de la membrana la concentraci´on de A+ es mayor que en la parte interior y se compensa con el potencial electrost´ atico. Lo mismo ocurre con el ani´ on B − , pero de manera opuesta, debido a que su carga es negativa. Aplicando la condici´on del equilibrio de Nernst, para la variable Δψ = ψ int − ψ ext tenemos: cint RT A ln ext Δψ = − F cA y cint RT B ln ext . Δψ = F cB Estas dos expresiones se cumplen si las respectivas razones entre las concentraciones en el interior y en el exterior son iguales, lo que introduce la raz´ on(o

130

´ CAP´ITULO 4. FENOMENOS DE TRANSPORTE: MEMBRANAS

tasa) de Donnan r: cext cint A B = = r. cext cint A B En t´erminos de este par´ametro, el potencial de Gibbs-Donnan tiene la siguiente forma: RT ln r. (4.17) Δψ = − F Si el i´ on indifundible X tiene su propia carga zX y su concentraci´on es cX , se puede demostrar, que la raz´on de Donnan correspondiente es: ( (4.18) r = −R + R2 + 1, X |cX y ceq es la concentraci´on de sal en equilibrio en el compardonde R = |z2c eq timento opuesto al compartimento donde se encuentra el i´ on X. Como se observa, la raz´on de Donnan es una funci´ on no lineal del par´ ametro R, aumentando con la concentraci´ on de los iones X positivos y disminuyendo con la misma para iones negativos. El potencial de Gibbs-Donnan est´a determinando b´ asicamente por la cantidad de componentes cargados de la c´elula no intercambiables, que provocan la distribuci´ on asim´etrica de los dem´as iones. Si el sistema est´a compuesto por iones X d´ebilmente difundibles, entonces aparecer´a un flujo lento que tender´ aa igualar las concentraciones de estos iones en los dos lados de la membrana. El tiempo caracter´ıstico de este proceso es mucho m´as grande que el tiempo caracter´ıstico de difusi´ on de los dem´as iones. Resumiendo, los potenciales de Gibbs-Donnan (4.17) son potenciales de equilibrio y aparecen cuando la presencia de un i´ on indifundible provoca la distribuci´ on asim´etrica de los dem´as iones. Estos potenciales son una aproximaci´on muy buena para el estudio del potencial de membrana en sistemas biol´ ogicos, aunque presentan una simplificaci´ on por no tener en cuenta los cambios en el volumen celular, lo que conllevar´ıa alteraciones de todas las concentraciones intracelulares.

4.2.2.

Creaci´ on de Potenciales de Difusi´ on

Consideramos el siguiente sistema, presentado en la figura 4.5. Supongamos que no existe potencial el´ectrico externo aplicado sobre el sistema y que se ha introducido una sal en el compartimento izquierdo siendo la movilidad del caon B − . Esto conlleva que haya una difusi´on m´ as ti´ on A+ menor que la del ani´ r´ apida del i´ on con mayor movilidad hacia el otro compartimento. Por otro lado, los dos iones difunden con la misma velocidad para no violar el principio de

´ IONICA ´ ´ DE LA MEMBRANA 4.2. DIFUSION A TRAVES

131

Figura 4.5: Representaci´on esquem´atica para la obtenci´on de los potenciales de difusi´on. electroneutralidad. Esto significa que el i´on m´ as rapido difunde m´ as despacio, frenado por el m´ as lento. En el mismo tiempo, el i´ on m´ as lento est´a acelerado por su i´ on opuesto. Como resultado, la difusi´on se realiza mediante una velocidad intermedia a la de los dos iones. Esta difusi´ on crea una diferencia de potencial, que lleva el nombre de potencial de difusi´ on. Usando la ecuaci´on de Nernst-Planck (4.10) para los flujos de los cationes (+) y los aniones (−), podemos obtener la expresi´on del potencial de difusi´ on: J+ = −u+ RT

dc+ dψ − u+ z+ c+ F , dx dx

(4.19)

y dc− dψ − u− z− c− F . (4.20) dx dx Para simplificar el an´ alisis, vamos a considerar el caso de iones monovalentes, z+ = −z− = 1, c+ = c− = c en el exterior de la membrana y c+ = c− = c en su interior. Seg´ un la condici´on de electroneutralidad, tenemos: J− = −u− RT

J+ = J− . De aqu´ı, igualando la parte derecha de las ecuaciones (4.19,4.20) para los flujos de ambos iones, tenemos: u+ RT

dc dψ dc dψ + u+ cF = u− RT − u− cF . dx dx dx dx

132

´ CAP´ITULO 4. FENOMENOS DE TRANSPORTE: MEMBRANAS

Ahora, reorganizando e integrando entre los dos extremos de la membrana, tenemos:  ψ int  cint dc , (u+ + u− )F ext dψ = (u− − u+ )RT ψ cext c lo que nos permite obtener la expresi´on final para la variaci´ on del potencial: Δψ = −

u+ − u− RT cint ln ext . u+ + u − F c

(4.21)

Suponiendo ahora que existe un equilibrio en las interfases y que la membrana es sim´etrica obtenemos, seg´ un hemos visto en la secci´ on anterior, la ecuaci´on final para el potencial de difusi´ on de una sal formada por iones monovalentes: Δψ = −

cint u+ − u− RT ln ext . u+ + u − F c

(4.22)

on Para iones de la misma movilidad, u+ = u− , Δψ = 0 y el potencial de difusi´ es cero. Esto significa que para tener un potencial de difusi´on es necesario que uno de los iones tenga una movilidad distinta que el otro. Problema. Comparar el potencial de difusi´ on antes y despu´es de aumentar la concentraci´ on en el compartimento interior 2 veces. Soluci´ on. Seg´ un la ecuaci´ on (4.22), antes de variar los par´ametros, tenemos: Δψantes =

cint u+ − u− RT ln ext u+ + u− F c

Despu´es de variar la la concentraci´on tenemos: Δψdespues = de donde:

2cint u+ − u− RT ln ext , u+ + u− F c

Δψdespues ln 2 =1+ . int Δψantes ln c /cext

´ IONICA ´ ´ DE LA MEMBRANA 4.2. DIFUSION A TRAVES

4.2.3.

133

Ecuaci´ on de Goldman-Hodgkin-Katz

En una distribuci´ on i´ onica que existe alrededor de la membrana de un ax´on, hay que superar las aproximaciones triviales. Una forma de hacer esto es aplicar la teor´ıa del campo constante, (4.16). La aplicaci´ on de esta teor´ıa a una distribuci´ on de varios aniones y cationes monovalentes, da las siguientes ecuaci´ ones para los flujos: * ) int F Δψ/RT p+ F Δψ cext + − c+ e J+ = − RT 1 − eF Δψ/RT y

) * int −F Δψ/RT p− F Δψ cext − − c− e , J− = RT 1 − e−F Δψ/RT

donde de nuevo los sub´ındices + y − se refieren a los cationes y a los aniones respectivamente y los par´ametros p± son sus permeabilidades. De la condici´ on de electroneutralidad, sumando por separado sobre todos los iones positivos y negativos:   J+ = J− , (4.23) +

−

se obtiene:  +

  ext int   cext c− − cint + − c+ b − /b = , (−p+ ) (p− ) 1−b 1 − 1/b − 

donde el factor b = eF Δψ/RT . Por otro lado, despejando b, tenemos:   ext int + p+ c+ + − p− c−  . b=  int ext + p+ c+ + − p− c−

(4.24)

(4.25)

Comparando las dos expresiones para el factor b, obtenemos finalmente la expresi´on del potencial de la membrana:   int ext RT + p+ c+ + − p− c−  ln  (4.26) Δψ = − ext int . F + p+ c+ + − p− c− La ecuaci´on (4.26) es la famosa ecuaci´ on de Goldman-Hodgkin-Katz (GHK) que expresa el potencial de la membrana en funci´on de las concentraciones y

134

´ CAP´ITULO 4. FENOMENOS DE TRANSPORTE: MEMBRANAS

las permeabilidades de los distintos aniones y cationes monovalentes, que la atraviesan. En un caso concreto de estudio, que es el caso del ax´on de una neurona, el potencial de membrana se debe principialmente a los iones de N a+ , K + y Cl− . La ecuaci´on de GHK entonces se transforma en: Δψ = −

int ext pN a cint RT N a + pK cK + pCl cCl . ln ext int F pN a cext N a + pK cK + pCl cCl

(4.27)

A partir de la ecuaci´ on (4.27) se ve que si la permeabilidad de uno de los iones es mucho mayor que la de los dem´as, los t´erminos correspondientes a los dem´as iones se pueden despreciar y el potencial determinado por la ecuaci´on de GHK se aproxima al potencial de Nernst del i´ on con la mayor permeabilidad. La expresi´on (4.27) es aplicable a la descripci´on del potencial generado por la distribuci´on de iones de N a+ , K + y Cl− en membranas excitables en estado de reposo. En sistemas biol´ogicos reales, la concentraci´ on de estos iones + + se mantiene constante gracias a la bomba N a , K -ATPasa y es interesante ver c´omo esta bomba de iones afecta al potencial de la membrana en medios excitables. Se sabe que la bomba N a+ , K + -ATPasa intercambia 3 iones de N a+ por 2 iones de K + y que el transporte debido al efecto de la bomba compensa la difusi´ on de los iones por el gradiente de concentraci´on. Vamos a ver c´omo se modifica la ecuaci´on de GHK en presencia de la N a+ , K + -ATPasa. Sean J˜N a y J˜K los flujos de los iones de N a+ y K + debidos ˜ a la N a+ , K + -ATPasa y sea d = − JJ˜Na . En nuestro caso, la raz´on es d = K

3/2. En el estado de reposo, la concentraci´on de N a+ en ambos lados de la membrana es constante y por consiguinete JN a = −J˜N a . Usando la condici´on de la electroneutralidad (4.23), JN a + J˜N a + JK + J˜K = JCl

e introduciendo la raz´ on d, teniendo en cuenta que los dos primeros t´erminos se cancelan debido a la concentraci´on constante de N a+ en ambos lados de la membrana, obtenemos la siguiente relaci´on entre los flujos de los distintos iones: 1 JN a + JK = JCl . d Como se observa, el efecto de la N a+ , K + -ATPasa es la presencia del factor 1 on con el caso de ausencia del flujo. Esto se puede interpretar d en comparaci´

´ 4.3. NOCIONES BASICAS DE LA ELECTROFISIOLOG´IA

135

como una reducci´on efectiva del flujo de los iones N a+ . Si ahora sustituimos cada uno de los flujos por su expresi´ on correspondiente de la ecuaci´on de campo constante, y despejando Δψ de la ecuaci´on resultante, obtenemos una expresi´ on an´ aloga a (4.27), donde el t´ermino relacionado con el i´on N a+ est´a modificado por el factor de la raz´ on entre los flujos d: Δψ = −

1 int ext pN a cint RT N a + pK cK + pCl cCl ln d1 . ext ext int F d pN a cN a + pK cK + pCl cCl

(4.28)

La ecuaci´on (4.28) es la ecuaci´on GHK modificada por la presencia de las bombas N a+ , K + -ATPasa. En el caso de d = 1, la ecuaci´on (4.28) se reduce a la ecuaci´on GHK. En esta condici´on se puede demostrar que la ATPasa es capaz de mantener las concentraciones de N a+ y de K + y el potencial de la membrana estacionarios. De aqu´ı se puede afirmar que el papel principal de la N a+ , K + -ATPasa en el funcionamento de la membrana est´a basado en su capacidad de transportar olica. iones de N a+ y K + gracias a la energ´ıa metab´

4.3.

Nociones B´ asicas de la Electrofisiolog´ıa

En los cap´ıtulos anteriores presentamos el estudio de los flujos i´onicos y la generaci´on del potencial de membrana desde el punto de vista termodin´amico, describiendo el movimiento de los iones gracias al gradiente electroqu´ımico. En este cap´ıtulo vamos a presentar los fen´omenos desde el punto de vista de la Electrofisiolog´ıa. Ahora los flujos i´ onicos son considerados como corrientes el´ectricas que atraviesan la membrana y el potencial de la membrana se introduce a partir de un circuito equivalente. Esta teor´ıa cl´ asica tiene su origen en los trabajos pioneros del estudio de la excitabilidad del nervio y del m´ usculo y tuvo su mayor ´exito con el modelo de Hodgkin y Huxley del potencial de acci´ on del ax´on gigante de calamar. Por sus descubrimientos important´ısimos en el campo de la Neurofisiolog´ıa, Hodgkin y Huxley fueron galadordonados en los a˜ nos 60 con el premio m´as prestigioso en el ´ambito de la investigaci´on, el premio Nobel.

4.3.1.

Propiedades El´ ectricas de las Membranas: Fuerza Electromotriz

Consideramos el potencial de la membrana como una fuerza electromotriz que influye sobre el movimiento de los iones a trav´es de la membrana de forma similar a como afecta a las cargas el´ectricas a trav´es de un conductor.

136

´ CAP´ITULO 4. FENOMENOS DE TRANSPORTE: MEMBRANAS

En los experimentos electrofisiol´ ogicos normalmente se mide la corriente que atraviesa la membrana biol´ ogica como respuesta lineal a la diferencia del potencial de sus dos extremos. En analog´ıa con las corrientes a trav´es de un conductor, se puede aplicar la ley de Ohm, que relaciona la diferencia del potencial y la corriente a trav´es de unidad de a´rea de la membrana, caracterizada por su resistencia Rm : E , (4.29) I= Rm siendo E la diferencia de potencial de la membrana e I el flujo de cargas o intensidad de la corriente. Definiendo otro par´ ametro caracter´ıstico de la membrana, su conductancia gm = 1/Rm , la ecuaci´on (4.29) se transforma en: I = gm E.

(4.30)

Como sabemos, la condici´on de electroneutralidad macrosc´opica implica que las membranas tengan la misma concentraci´on de cargas positivas y negativas, en cualquiera de los compartimentos que separa. Esto conlleva a una polarizaci´on de la membrana y como consecuencia su comportamiento efectivo es de un condensador con capacidad espec´ıfica Cm . Esta cantidad se expresa por el n´ umero de cargas por unidad de superficie σ al aplicar una diferencia de potencial E a trav´es de la membrana: σ (4.31) Cm = . E Recordando que la capacidad espec´ıfica de un condensador plano de distancia d entre las placas y de constante diel´ectrica  es  (4.32) C= , d podemos hacer una estimaci´on realista de la capacidad de una membrana. En este caso, una distancia real entre las dos paredes de la membrana es de unos 20 · 10−9 m y la constante diel´ectrica es aproximadamente el doble del vac´ıo. Usando la expresion (4.32), obtenemos una capacidad espec´ıfica de la membrana del orden de 1μF/cm2 . Por otro lado, las membranas, como condensadores cargados, act´ uan como pilas, creando un campo el´ectrico E=

σd σ . = Cm 

Vamos a considerar ahora el circuito presentado en la figura 4.6, que es el circuito m´ınimo para mostrar las propiedades de las membranas. Vamos a

´ 4.3. NOCIONES BASICAS DE LA ELECTROFISIOLOG´IA

137

Figura 4.6: Circuito m´ınimo equivalente para explicar las propiedades de las membranas. estudiar el tiempo de descarga del condensador despu´es de dejar de aplicar una diferencia de potencial E a los extremos del condensador entre los dos puntos que corresponden a los puntos del exterior y del interior de la membrana. En cualquier momento t, la diferencia del potencial entre int y ext es: E(t) =

σ(t) , Cm

(4.33)

donde la variaci´ on de la densidad superficial de carga σ(t) con el tiempo t se debe a la corriente de descarga, IR (t): IR (t) = −IC (t) = −

E(t) dσ(t) ≡ . dt Rm

(4.34)

Combinando las ecuaciones (4.33) y (4.34), obtenemos: E(t) dE(t) . =− dt Rm Cm Reorganizando e integrando la u ´ltima ecuaci´on:  0  E0 1 dE =− dt, E Rm Cm t E finalmente obtenemos la siguiente expresi´on para la variaci´ on del potencial de la membrana (el condensador) con el tiempo: E = E0 e−t/Rm Cm = E0 e−t/τ .

(4.35)

138

´ CAP´ITULO 4. FENOMENOS DE TRANSPORTE: MEMBRANAS

Figura 4.7: El canal de potasio y su circuito equivalente. El par´ ametro τ = Rm Cm es la constante de tiempo de la membrana y es una medida caracter´ıstica. Seg´ un el mayor o menor valor de esta constante, los procesos de carga o descarga se realizan m´as o menos r´apidamente. As´ı cuando t = τ , el condensador se descarga en un factor 1/e.

4.3.2.

Potencial de Membrana y Circuito Equivalente

Los experimentos de Electrofisiolog´ıa realizados en los a˜ nos 40 han demostrado que el comportamiento de las membranas se puede explicar a base de un circuito el´ectrico equivalente por las caracter´ısticas que muestran las membrana como c´elulas excitables. El dise˜ no de un circuito equivalente es relativamente f´ acil. Se basa en la idea de que las corrientes el´ectricas a trav´es de las membranas biol´ogicas se deben esencialmente a los flujos de iones de N a+ , K + y Cl− . Los iones atraviesan la membrana por canales i´onicos espec´ıficos. Esto genera fuerzas electromotrices para cada uno de los iones de tal manera que los canales i´onicos act´ uan como bater´ıas. En el caso de un canal de potasio, que est´a representado en la figura 4.7, se observa c´omo el canal act´ ua como una bater´ıa generando una fuerza electromotriz en el circuito equivalente de la membrana. En la membrana existen al mismo tiempo varios canales a trav´es de los cuales pasan los distintos iones como los de N a+ , K + , Cl− , etc. La fuerza electromotriz resultante corresponde a la de todas las bater´ıas colocadas en paralelo y por consiguiente act´ ua como una u ´nica bater´ıa. En general, los canales i´ onicos son prote´ınas bajo ciertas transiciones con-

´ 4.3. NOCIONES BASICAS DE LA ELECTROFISIOLOG´IA

139

Figura 4.8: El circuito equivalente de una membrana con canales de N a+ , K + y Cl− . formacionales, que pueden provocar la apertura o el cierre de los canales. En consecuencia, la conductancia instant´anea total de la membrana viene dada por la suma de las conductancias individuales de cada uno de los canales que est´an abiertos en este instante. El circuito equivalente de una membrana t´ıpica con canales de N a+ , K + y Cl− est´a formado por cuatro ramas en paralelo, (Fig. 4.8): una que contiene un condensador que representa la capacidad de la membrana, y las otras tres ramas que corresponden a cada una de las tres especies i´onicas. La aproximaci´ on del circuito equivalente permite evaluar el potencial de la membrana generado o la distribuci´ on de los iones de N a+ , K + y Cl− . En el estado de reposo, el potencial de membrana es constante y la carga un el del condensador tambi´en, lo que en consecuencia conlleva IC = 0. Seg´ circuito equivalente, (Fig.4.8), se cumple: IK + IN a + ICl = 0.

(4.36)

Por otra parte, para cada una de las ramas del circuito, aplicando la ley de Ohm, tenemos: IK = gk (E − EK ), IN a = gN a (E − EN a ), ICl = gCl (E − ECl ),

(4.37)

140

´ CAP´ITULO 4. FENOMENOS DE TRANSPORTE: MEMBRANAS

donde E = V int − V ext . A partir de las ecuaciones (4.37) y la ecuaci´on (4.36), para la fuerza electromotriz total E obtenemos: E=

gK EK + gN a EN a + gCl ECl . gK + gN a + gCl

(4.38)

Como se puede observar, la ecuaci´ on (4.38) es similar a la ecuaci´on GHK (4.26), que hemos obtenido en las secciones anteriores bas´andonos en consideraciones termodin´amicas. Esta ecuaci´on permite calcular la fuerza electromotriz del circuito equivalente en funci´on de las conductancias y de las fuerzas electromotrices de cada uno de los iones de N a+ , K + y Cl− . Problema. A partir de la ecuaci´ on para la fuerza electromotriz del circuito equivalente, expresar la conductancia del sodio y discutir su comportamiento cualitativo en funci´ on del potencial E. Soluci´ on. A partir de la ecuaci´ on (4.38), despejamos la conductancia de los iones del sodio: (gK + gCl )E − (gK EK + gCl ECl ) . gN a = EN a − E Es una dependencia de tipo gN a =

b − ac aE − b ≡ −a + , c−E E−c

donde a = (gK + gCl ), b = (gK EK + gCl ECl ), c = EN a . Dependiendo del signo de la diferencia b − ac, gN a puede aumentar con E o disminuir.

4.4.

Potencial de Acci´ on

4.4.1.

T´ ecnica de Pinzamiento de Voltaje

Los primeros experimentos con membranas excitables consist´ıan en la aplicaci´on de corrientes sobre una membrana y la medida de los cambios que ten´ıan lugar en el potencial a lo largo de la membrana. De esta manera, se registr´o, en los a˜ nos 40, el potencial de acci´on en el ax´on gigante de calamar, que fue investigado independientemente por dos grupos, el de Cole y Curtis, y el de Hodgkin y Huxley.

´ 4.4. POTENCIAL DE ACCION

141

Figura 4.9: Representaci´on de la corriente del K + (curva 1) y la corriente m´axima del N a+ (curva 2). (De V´azquez, 1993).

Posteriormente, el avance del estudio del impulso nervioso tuvo lugar con la aparici´ on de la t´ecnica de pinzamiento de voltaje, que fue desarrollada alrededor del a˜ no 1949 por los cient´ıficos Marmont, Cole, Hudgkin, Huxley y Katz. En un experimento de pinzamiento de voltaje, el potencial de membrana var´ıa instant´ aneamente desde el valor de reposo a otro valor distinto, manteni´endose en este u ´ ltimo estado durante varios milisegundos antes de volver a olo en los instantes de salsu valor inicial. La corriente I = Cm dE dt se observa s´ to de potencial. Cuando el potencial se mantiene constante, la u ´ nica corriente que se puede registrar es la corriente i´onica Ii . De este modo se puede estudiar el comportamiento de los distintos canales i´onicos para diferentes valores del voltaje. Hodgkin y Huxley repitieron el salto de voltaje con los experimentos del ax´ on gigante del calamar y construyeron la gr´ afica que representa la corriente axima del del K + (Fig 4.9, curva 1) en el estado estacionario y la corriente m´ N a+ (curva 2). De una manera similar, se pueden determinar los valores de los potenciales en los que las corrientes de N a+ o de K + se anulen, que son los potenciales de equilibrio EN a , EK .

4.4.2.

Modelo de Hodgkin y Huxley

Los experimentos de Hodgkin y Huxley les llevaron a proponer el circuito equivalente de la membrana, presentado en la Fig.4.8, donde las conductancias

142

´ CAP´ITULO 4. FENOMENOS DE TRANSPORTE: MEMBRANAS

Figura 4.10: La dependencia temporal de las conductancias de iones de N a+ y de K + . de cada canal i = N a+ , K + , Cl− son determinadas por la ley de Ohm gi =

Ii . E − Ei

En la figura 4.10 se muestran los resultados para las conductancias correson del tiempo, que han sido pondientes a los iones de N a+ y K + en funci´ construidas a partir de la t´ecnica de pinzamiento. no en estado de repoLas conductancias gN a y gK tienen un valor peque˜ so, lo que significa que la mayor´ıa de los canales est´an cerrados. Cuando se produce una despolarizaci´ on de la membrana, la conductancia gN a aumenta r´ apidamente, alcanza un m´ aximo y luego decrece lentamente. La conductancia del potasio gK , al contrario, aumenta muy lentamente, en comparaci´on con la del sodio y alcanza un valor estacionario. Al regresar al estado de reposo, gK disminuye lentamente. Seg´ un el modelo de Hodgkin y Huxley, la variaci´ on de gN a se debe a la existencia de un proceso de activaci´on r´ apida y una desactivaci´ on lenta. Estos procesos se explicaron en el modelo original en base a unas hipot´eticas part´ıculas que controlan el proceso de activaci´ on y de desactivaci´on. + Considerando el canal de K , Hodgkin y Huxley suponen que el canal posee cuatro part´ıculas, cada una de las cuales puede encontarse en dos estados A y B. El canal est´ a abierto s´olo cuando las cuatro part´ıculas est´an en el estado B. Si αn y βn son las constantes de las transiciones entre los dos estados A y B y si n es la fracci´on de part´ıculas que est´an en el estado B, la variaci´ on de n con el tiempo viene dada por la ecuaci´on: dn = αn (1 − n) − βn n. dt

´ 4.4. POTENCIAL DE ACCION

143

Integrando sobre la fracci´on dentro del intervalo [n0 , n] y sobre el tiempo dentro del intervalo [0, t], obtenemos la siguiente expresi´on para la concentraci´ on de las hipot´eticas part´ıculas que est´an en el estado correspondiente a la apertura del canal: αn αn −[ − n0 ]e−t(αn +βn ) . n(t) = αn + βn αn + βn Esta u ´ltima expresi´ on se puede escribir de manera compacta como: n(t) = n∞ − (n∞ − n0 )e−t/τn ,

(4.39)

donde los parametros n∞ y τn tienen la siguiente forma: τn = (αn + βn )−1 , αn . n∞ = αn + βn

(4.40)

Seg´ un la ecuaci´ on (4.40), n∞ es el valor estacionario de la fracci´on de las ´ ltimo par´ ametro es una part´ıculas n y τn es el tiempo de vida media. El u medida de la din´ amica de saturaci´on del par´ ametro n desde un valor inicial n0 hasta el valor estacionario n∞ . Por otro lado, la conductancia de los iones de K + depende del valor m´aximo de la conductancia g˜K y de la probabilidad de que las cuatro part´ıculas est´en en el mismo estado B. Entonces, gK (t) = g˜K n4 (t), de donde obtenemos la siguiente dependencia temporal de la conductancia del potasio: (4.41) gK (t) = g˜K [n∞ − (n∞ − n0 )e−t/τn ]4 . Finalmente, la intensidad de la corriente debida a los iones de potasio es: IK (t) = g˜K n4 (t)(E − EK ).

(4.42)

En el caso de la conductancia de los iones de sodio, Hodgkin y Huxley asumieron la existencia de tres particulas de tipo m que controlan la activaci´ on y una particula de tipo h, que controla la desactivaci´on. Cada una de las part´ıculas m y h est´an en dos posibles estados A, B y C, D, respectivamente. Sean αm , βm , αh y βh las constantes de las transiciones entre los estados A y B y entre C y D, respectivamente. El canal est´a abierto s´olo cuando las tres particulas m est´an en el estado B y al mismo tiempo la part´ıcula h est´a en el estado D.

144

´ CAP´ITULO 4. FENOMENOS DE TRANSPORTE: MEMBRANAS

De manera an´aloga a la derivaci´ on en el caso anterior, ahora en el caso de + iones de sodio N a , tenemos las siguientes ecuaciones: m(t) = m∞ − (m∞ − m0 )e−t/τm ,

h(t) = h∞ − (h∞ − h0 )e−t/τh , αm , m∞ = αm + βm αh , h∞ = αh + βh τm,h = (αm,h + βm,h )−1 .

(4.43)

Como la conductancia instant´anea del N a+ depende de su m´axima conductancia g˜N a y de la probabilidad de que las tres part´ıculas m est´en en el estado B y la part´ıcula h est´e en el estado D, obtenemos: gN a (t) = g˜N a m3 (t)h(t).

(4.44)

Sustituyendo las ecuaciones (4.43) en la u ´ltima ecuaci´ on, tenemos: gN a (t) = g˜N a [m∞ − (m∞ − m0 )e−t/τm ]3 [h∞ − (h∞ − h0 )e−t/τh ].

(4.45)

Finalmente, la intensidad de la corriente debida a los iones de sodio, tiene la siguiente forma: (4.46) IN a (t) = g˜N a m3 (t)h(t)(E − EN a ). Problema. Discutir el comportamiento de la conductancia del potasio dentro del modelo del Hodkgin y Huxley para largos tiempos de dependencia temporal. Soluci´ on. De la ecuaci´on (4.41), gK (t) = g˜K [n∞ − (n∞ − n0 )e−t/τn ]4 , observamos que el aumento de los pasos del tiempo hace que el segundo t´ermino tenga cada vez menos peso, lo que da los siguientes primeros t´erminos relevantes del desarrollo: g˜K [n4∞ − 4n3∞ (n∞ − n0 )e−t/τn ].

´ 4.4. POTENCIAL DE ACCION

4.4.3.

145

Din´ amica del Modelo de Hodgkin y Huxley (HH)

Durante los experimentos de pinzamiento, que realizaron Hodgkin y Huxley, el potencial de la membrana cambiaba a saltos desde un potencial negativo hasta un potencial E mayor. En cada uno de estos saltos se determinaba la forma de gK (t), que se ajustaba a la ecuaci´on (4.41). De all´ı Hodgkin y Huxley obten´ıan los valores de los par´ametros n∞ , τ∞ para cada valor del potencial E. La determinaci´ on de los par´ ametros m∞ , τ∞ se realiza de manera similar en el caso de canales de sodio, usando la ecuaci´ on (4.45) con la aproximaci´on de que en los primeros pasos del tiempo la funci´on de desactivacion es aproximadamente uno (h ≈ 1). La dependencia de los par´ ametros de desactivaci´on h∞ (E), τh (E) se calcula de manera m´as complicada mediante experimentos por separado para los dos par´ ametros. La variaci´on de los par´ametros del modelo de HH en funci´on del voltaje, est´a presentado finalmente en la figura 4.11. Como se observa, la despolarizaci´on del ax´on aumenta los valores estacionarios de m∞ , n∞ y disminuye el valor estacionario de h∞ . La constante del tiempo τm var´ıa en un intervalo inferior al de variaci´ on de la constante τh y el + proceso de activaci´ on de los canales de N a es varias veces m´as r´apido que el proceso de desactivaci´on. Se observa tambi´en que los par´ ametros m∞ , h∞ tienen un comportamiento complementario, de manera que cuando los canales de N a+ se activan, empieza el proceso de desactivaci´on, lo cual conlleva a que los canales de N a+ se abren s´olo cuando tiene lugar un cambio de voltaje. Finalmente, conociendo todos los par´ametros del modelo de HH, se pueden calcular las corrientes de N a+ y de K + usando las ecuaciones (4.42) ,(4.46), dando lugar al siguiente comportamiento de la corriente total, (Fig.4.12). El comportamiento de las corrientes obtenidas es muy similar al comportamiento experimental, (Fig.4.9), que es el gran reto del modelo de Hodgkin y Huxley. La apertura y el cierre de los canales de sodio y de potasio son procesos que dependen del valor del voltaje. Para que esto tenga lugar, es necesario un movimiento de cargas que corresponde a cambios en el potencial de la membrana. Esto ha sido la idea principal relacionada con la existencia de part´ıculas n, m y h dependientes del voltaje que dan lugar a la corriente de apertura. La corriente de apertura ha sido detectada experimentalmente mucho m´as tarde, en los a˜ nos 70, debido a su peque˜ na magnitud. Esto justifica el estudio de

146

´ CAP´ITULO 4. FENOMENOS DE TRANSPORTE: MEMBRANAS

Figura 4.11: La dependencia de los par´ametros del modelo de HH del potencial de la membrana. (De V´azquez, 1993).

Figura 4.12: La dependencia temporal de la corriente total (l´ınea cont´ınua) obtenida a partir del modelo de HH. (De V´azquez, 1993).

´ 4.4. POTENCIAL DE ACCION

147

Figura 4.13: Representaci´on de las variables a lo largo de un ax´on. los procesos a trav´es de membranas desde el punto de vista del modelo de Hodgkin y Huxley.

4.4.4.

Teor´ıa del Cable

La propagaci´ on del potencial de acci´ on a lo largo del ax´on gigante del calamar fue estudiado por Hodgkin y Huxley usando la teor´ıa del cable. Esta teor´ıa describe la propagaci´ on de las corrientes el´ectricas a trav´es de un cilindro hueco, formado por una membrana. Este modelo, debido a su formulaci´on bastante general, se puede aplicar tambi´en a la investigaci´on de la distribuci´ on de las corrientes y los potenciales en el nervio y en el m´ usculo. Vamos a estudiar la propagaci´on del potencial de acci´on a lo largo de un ax´ on y vamos a suponer que en el punto x = 0 del ax´ on se induce un cambio en el potencial de la membrana. Esta alteraci´on induce corrientes que se propagan a lo largo del ax´ on, presentadas en la figura 4.13. int ext Sean I , I las intensidades totales que atraviesan longitudinalmente el compartimento interior y el exterior, respectivamente. Imaginemos que entre dos puntos, 1 y 2, separados a una distancia Δx, en el compartimento interior un la ley de Ohm, existe una diferencia del potencial Δψ int . Seg´ I int ri Δx = ψ1int − ψ2int ≡ −Δψ int ,

(4.47)

donde ri es la resistencia ax´onica o intracelular por unidad de longitud. Des-

148

´ CAP´ITULO 4. FENOMENOS DE TRANSPORTE: MEMBRANAS

pejando a la corriente I int y expres´andola en forma diferencial, tenemos: I int (x) = −

1 ∂ψ int (x) . ri ∂x

(4.48)

De manera an´aloga, 1 ∂ψ ext (x) , (4.49) re ∂x donde re es la resistencia extracelular por unidad de longitud. Como la corriente que se aleja del lugar, donde se ha generado la perturbaci´ on del potencial en el interior (la l´ınea discont´ınua), es id´entica de magnitud a la corriente que se acerca hacia el mismo lugar en el medio extracelular, tenemos I ext (x) = −

I int = −I ext .

(4.50)

A partir de las ecuaciones (4.48), (4.49) y (4.50) , obtenemos la siguiente expresi´on para el gradiente de potencial: ∂Δψ(x) ∂ψ int (x) ∂ψ ext (x) − = = −(ri + re )I int . ∂x ∂x ∂x

(4.51)

La resistencia del fluido intracelular es mucho m´as elevada que la del fluido extracelular, debido al peque˜ no di´ ametro del ax´on, ri re . Entonces la ecuaci´on (4.51) se simplifica de la siguiente manera: I int (x) = −

1 ∂Δψ(x) . ri ∂x

(4.52)

on. Sea im la corriente transversal que atraviesa la unidad de longitud del ax´ Entonces entre los puntos 1 y 2, representados en la figura 4.13, la diferencia entre las corrientes I1int y I2int en estos puntos es igual al t´ermino im Δx, que en forma diferencial resulta: im = −

∂I int (x) . ∂x

Usando ahora la expresi´ on (4.52) para la corriente I int (x) en el medio intracelular, obtenemos para la expresi´on final de la corriente transversal im : im (x) =

1 ∂ 2 Δψ(x) . ri ∂x2

(4.53)

La ecuaci´on (4.53) es la famosa ecuaci´ on del cable. Esta ecuaci´on permite estudiar la propagaci´ on del potencial de acci´on a lo largo del ax´on, usando el modelo de Hodgkin y Huxley.

´ 4.4. POTENCIAL DE ACCION

149

Figura 4.14: Representaci´on esquem´atica de un elemento ax´onico. Como sabemos de la teor´ıa relacionada con el circuito equivalente de la membrana del ax´ on, la corriente total a trav´es de la membrana se expresa mediante el modelo de Hodgkin y Huxley: I = Cm

dE + g˜N a m3 h(E − EN a ) + g˜K n4 (E − EK ) + g˜L (E − EL ), dt

(4.54)

donde con el u ´ltimo t´ermino tenemos en cuenta la presencia de una corriente de una naturaleza i´onica indeterminada. Para establecer la correspondencia entre las magnitudes de las ecuaciones (4.53) y (4.54), consideramos un elemento ax´onico de longitud l y de radio transversal a, (Fig.4.14). Sean ρ y ri la resistencia espec´ıfica y la resistencia ax´onica respectivamente, que est´an relacionadas entre s´ı como: ρ=R

R πa2 , ri = . l l

(4.55)

Por otro lado, la intensidad de la corriente transversal total que atraviesa un elemento ax´onico de superficie lateral 2πal es I = IT /2πal y por tanto, la corriente por unidad de la longitud ax´ onica es im = IT /l: im = 2πaI.

(4.56)

Introduciendo ahora la relaci´ on Δψ ≡ E y usando las dos ecuaciones (4.55) y (4.56), la ecuaci´ on del cable tiene la siguiente forma: I=

a ∂2E . 2ρ ∂x2

(4.57)

´ 1.3. EL PRIMER PRINCIPIO DE LA TERMODINAMICA

15

la temperatura, ΔU = CV ΔT . Entonces, si T no cambia tampoco lo hace U . Podemos tambi´en expresar ΔU en funci´ on de ΔP = Pb − Pa , ya que Ta = Pa Va / (nR) y Tb = Pb Va / (nR) de donde ΔU = cV Va (Pb − Pa ) /R. El valor del trabajo, calor y energ´ıa interna en otros casos de transformaciones t´ıpicas es el siguiente. Transformaci´ on isobara. En el caso de una transformaci´on isobara (presi´on constante) Pa = Pb y por tanto W = −Pa (Vb − Va ). En cuanto a la energ´ıa interna y al calor, tenemos que para una transformaci´ on isobara un gas ideal verifica que Ta = Pa Va / (nR) y Tb = Pa Vb / (nR) de donde ΔU = cV Pa (Vb − Va ) /R. Puesto que Q = ΔU − W entonces Q = Pa (Vb − Va ) (cV /R + 1). Utilizando la relaci´on de Mayer (1.3) podemos escribir este u ´ ltimo resultado como Q = cP Pa (Vb − Va ) /R. Transformaci´ on isoterma. En el caso de una transformaci´on isoterma, puesto que P = nRT /V al substituir en (1.4) y realizando la integral resulta W = −nRTa ln (Vb /Va ). Adem´as puesto que la temperatura no var´ıa tenemos que ΔU = 0 de donde Q = −W = nRTa ln (Vb /Va ). Transformaci´ on adiab´ atica. Finalmente, una transformaci´ on que aparece a menudo es la transformaci´on adiab´atica para la cual Q = 0. En particular, si la transformaci´ on es infinitesimal, se cumple que δQ = 0 y por tanto dU = δW . Es decir, en este caso toda la variaci´on de la energ´ıa interna del sistema se debe a la transferencia de energ´ıa entre el sistema y su entorno mediante trabajo. As´ı, se verifica que, CV dT = −P dV , y por tanto,  b CV dT = CV (Tb − Ta ) = cV (Pb Vb − Pa Va ) /R. W =

(1.6)

(1.7)

a

No obstante no es necesario conocer P y V de los estados inicial y final para poder calcular el trabajo. Para ello notemos que en la ecuaci´ on (1.6) aparecen las tres variables de estado de un gas ideal, P , V y T . Sin embargo, la ecuaci´on de estado (1.1) nos recuerda que s´ olo dos de ellas son independientes. As´ı pues, podemos eliminar una de ellas, por ejemplo, la temperatura. Puesto que T = P V / (nR), su diferencial ser´a, dT =

1 (P dV + V dP ) . nR

150

´ CAP´ITULO 4. FENOMENOS DE TRANSPORTE: MEMBRANAS

Supongamos ahora que el potencial de acci´ on se propaga a trav´es del ax´on en forma de onda a una velocidad constante v. Entonces: 1 ∂2E ∂2E = 2 2, 2 ∂x v ∂t por lo que la ecuaci´ on del cable es: I=

a ∂2E . 2ρv 2 ∂t2

(4.58)

Introduciendo finalmente la ecuaci´ on (4.58) en la (4.54), obtenemos: dE a ∂2E = Cm gK n4 (E−EK )+˜ gL (E−EL ). (4.59) +˜ gN a m3 h(E−EN a )+˜ 2 2 2ρv ∂t dt La expresi´on (4.59) es la ecuaci´on completa para la propagaci´on del potencial de acci´on, que se obtiene con la teor´ıa del cable usando el modelo de HH. Esta ecuaci´on diferencial permite conocer el perfil del potencial, resolvi´endola num´ericamente. Para encontrar las soluciones hay que tener en cuenta que el valor de la velocidad v no se conoce a priori y que hay que buscar los valores para los cuales la soluci´on converge. Se puede demostrar que existe un valor u ´nico para el cual la soluci´ on de la ecuaci´on (4.59) converge. El perfil del potencial obtenido a partir de la ecuaci´on (4.59) est´a presentado en la figura 4.15. Esta figura se corresponde con una gran precisi´ on a la figura experimental de la propagaci´ on del potencial de acci´on del ax´ on gigante de calamar, que estudiaron Hodgkin y Huxley. Como sabemos, en ausencia de est´ımulos, el potencial de la membrana se mantiene en torno a -70 mV. Ahora, si se introduce una peque˜ na excitaci´on, seg´ un el modelo de Hodgkin y Huxley, la membrana se despolariza y, en consecuencia, los par´ametros m y n aumentan, mientras que el h disminuye. La variaci´on del m es mucho m´as r´ apida que la de n y h y, por tanto, el efecto es un aumento en la conductividad de los canales de N a+ . Se produce entonces el pico del potencial de acci´on. Por otro lado, la variaci´ on de n y h produce on de la conductancia un aumento de la conductancia del K + y una disminuci´ del N a+ , que provocan de nuevo la polarizaci´on de la membrana. Durante un cierto intervalo, la conductividad de los canales de K + es superior a la de los on de la membrana. Finalcanales de N a+ , lo que produce una hiperpolarizaci´ mente, esta hiperpolarizaci´on induce una lenta disminuci´ on de n, que conlleva a una disminuci´ on de la conductancia de gK de los iones de K + y la posterior disminuci´ on hasta el potencial de reposo.

´ 4.4. POTENCIAL DE ACCION

151

Figura 4.15: La dependencia temporal del potencial de la membrana obtenido a partir del modelo de HH y de la teor´ıa del cable. (De V´azquez, 1993).

Despu´es del modelo de Hodgkin y Huxley, que es el pionero de los modelos biof´ısicos sobre c´elulas excitables, han aparecido numerosas publicaciones sobre las c´elulas excitables. Todos estos estudios, que han contribuido enormemente al conocimiento del sistema nervioso, se basan en los flujos a trav´es de la membrana por los canales i´onicos, tal y como fue introducido por primera vez por Hodgkin y Huxley.

CAP´ITULO

5

Biof´ısica de los Cuerpos Vivos

En este cap´ıtulo vamos a estudiar una especialidad de la Biof´ısica llamada Biomec´anica. Esta rama se dedica al estudio de los procesos mec´ anicos como el movimiento de las extremidades, la mec´anica del flujo sangu´ıneo, los mecanorreceptores, etc. Antes de empezar con la explicaci´ on de algunos de estos mecanismos, vamos a recordar brevemente las propiedades b´ asicas de los fluidos.

5.1.

Fluidos Biol´ ogicos

5.1.1.

Propiedades B´ asicas de los Fluidos

Se dice que un flujo es laminar cuando las part´ıculas del fluido se mueven en capas paralelas entre s´ı. Una caracter´ıstica fundamental de los flujos laminares es el gradiente de velocidad, γ , (tambi´en llamada velocidad de corte), que est´a definido por la derivada de la velocidad del flujo v respecto a la coordenada perpendicular a la direcci´ on del flujo: γ =

dv . dz

(5.1)

Este gradiente es m´aximo en la cercan´ıa de la pared y disminuye alej´ andose de ella, seg´ un se observa en la figura 5.1. La fuerza F que mueve una capa de superficie a en el flujo laminar es proporcional al gradiente de velocidad con un coeficiente de proporcionalidad,

154

CAP´ITULO 5. BIOF´ISICA DE LOS CUERPOS VIVOS

Figura 5.1: El gradiente de velocidad de un flujo a lo largo de una superficie horizontal (izquierda) y a lo largo de un tubo (derecha).

η, llamado viscosidad, que aumenta con la concentraci´on de las sustancias disueltas: F = ηγ a. (5.2) La viscosidad se define a partir de la fuerza necesaria para mover una capa de ´area de 1m2 con una velocidad de 1ms−1 a una distancia de 1m desde una superficie paralela. Otra caracter´ıstica de los fluidos es la presi´on de corte τ , que es la fuerza que deforma un cuerpo en un flujo con un gradiente de velocidad determinado: τ = ηγ .

(5.3)

Un fluido se denomina newtoniano cuando su viscosidad η es independiente del gradiente de velocidad γ . En el caso de que exista una dependencia entre las dos magnitudes η y γ , el fluido se denomina no newtoniano. Los fluidos biol´ ogicos como la sangre son, en general, no newtonianos y tienen un comportamiento pseudopl´ astico, donde las c´elulas sangu´ıneas se agregan, orientan y deforman, de forma que la viscosidad del flujo disminuye cuando aumenta el gradiente de la velocidad.

5.1.2.

Fluidos Biol´ ogicos: Caracter´ısticas de su Viscosidad

La viscosidad de los fluidos biol´ ogicos, como la sangre, las secreciones, el linfa, etc., ha sido estudiada intensamente gracias a los experimentos de viscosimetr´ıa. Estos experimentos han demostrado con gran exactitud que el plasma sangu´ıneo se comporta como un fluido newtoniano, mientras que una suspensi´ on de gl´obulos rojos y la propia sangre se comportan como un fluido

´ 5.1. FLUIDOS BIOLOGICOS

155

Figura 5.2: La velocidad relativa en funci´on del gradiente de velocidad de la sangre hunama (l´ınea cont´ınua) y de eritrocitos suspendidos en plasma (l´ınea discont´ınua). (De Lerche y Bmer, 1984).

no newtoniano. Una explicaci´ on satisfactoria de estos procesos complejos es la posible agregaci´on de los eritrocitos en un bajo gradiende de velocidad, que posteriormente se disgregan a mayor gradiente de velocidad, lo que conlleva una disminuci´ on de la viscosidad resultante de la suspensi´ on. Bajo un gradiente de velocidad, los eritrocitos se deforman hasta formar elipsoides. Esta deformaci´on es mayor cuanto mayor es la presi´on de corte τ . Por encima de cierto grado de deformaci´ on, las alteraciones de la membrana se hacen irreversibles. En la figura 5.2, se puede apreciar la viscosidad relativa de una suspensi´ on de gl´obulos rojos, definida como el cociente entre la viscosidad del fluido y la viscosidad del disolvente puro, en funci´on del gradiente de velocidad. Las diferencias entre las dos curvas en la regi´ on de bajo valor del gradiente se deben a la agregaci´ on de los gl´ obulos rojos, mientras que las diferencias en la regi´ on de alto valor del gradiente se deben a la deformaci´ on de la c´elula. En el caso concreto del fluido sinovial, que es de inter´es crucial para la ortopedia, el conocimiento de sus propiedades permite el tratamiento de algunas dolencias o enfermedades. Normalmente, las articulaciones no se desgastan s´olo por el movimiento, o sea, por la presi´ on de corte del l´ıquido sinovial, sino que podr´ıan desgastarse tambi´en por la presi´ on est´ atica. En condiciones normales, el l´ıquido sinovial est´ a dentro de la c´apsula articular y las cargas debidas al peso no pueden provocar su salida debido a la alta viscosidad de ´este, que puede llegar hasta un valor de 40P a · s. En el caso de los movimientos de las articulaciones, se pueden producir presiones de corte de hasta 105 s−1 , lo que disminuye la viscosidad del fluido sinovial hasta 10−2 P a · s. Como consecuencia, se produce una lubrificaci´on muy efectiva de la articulaci´ on.

156

5.1.3.

CAP´ITULO 5. BIOF´ISICA DE LOS CUERPOS VIVOS

Circulaci´ on Sangu´ınea

Vamos a considerar el paso de un flujo laminar a trav´es de un tubo suponiendo la existencia de una capa l´ımite en la que la velocidad del fluido es cero. A partir de esta capa la velocidad del fluido var´ıa desde cero, en las paredes del tubo, hasta la velocidad de la corriente. Este problema se puede estudiar considerando el flujo laminar como un movimiento de cilindros huecos conc´entricos y de distintos radios. Sobre cada cilindro act´ ua una fuerza de v , a la viscosidad del fluido η fricci´ on proporcional al gradiente de velocidad d dr y a su a´rea superficial 2πrl: dv Ff riccion = 2πrlη . dr La fuerza propulsora de este flujo es proporcional a la diferencia de presi´ on 2 ΔP y al a´rea transversal del cilindo πr : Fpropulsora = πr 2 ΔP, siendo igual a la fuerza de fricci´ on en el caso de movimiento estacionario   ´ltima relaci´ on, integrando sobre el radio r Ff riccion = Fpropulsora. De esta u hasta el radio del tubo R, y suponiendo la existencia de una capa l´ımite de l´ıquido atrapado en la pared, v(R) = 0, obtenemos la siguiente ecuaci´on para el valor de la velocidad del flujo laminar, que circula dentro de un tubo, a una distancia r del centro del tubo y en funci´ on de la viscosidad del flujo, de la diferencia de la presi´ on y de la geometr´ıa del tubo: v (r) =

ΔP 2 (R − r 2 ). 4lη

(5.4)

Seg´ un la ecuaci´ on (5.4), la velocidad es m´ axima en el centro del tubo (r = 0) y decrece al alejarse del centro siguiendo un perfil olico. Integrando la  R parab´ funci´ on v (r), a lo largo del todo el recorrido, 0 2πrv(r)dr, obtenemos la ecuaci´ on de Hagen-Poiseuille para el flujo de volumen JV a trav´es del tubo: JV =

πΔP R4 . 8lη

(5.5)

Como se observa en esta expresi´ on, si el radio del tubo cambia bruscamente, el flujo de volumen tambi´en lo har´ a. Esto podr´ıa tener consecuencias, por ejemplo, en la circulaci´ on de la sangre en los vasos sangu´ıneos, donde se aprecian estrechamientos debido a la p´erdida de elasticidad.

´ 5.1. FLUIDOS BIOLOGICOS

157

Sin embargo, hemos comentado que la sangre es un fluido no newtoniano y su viscosidad η depende del gradiente de velocidad γ . Entonces, la derivaci´ on de la ecuaci´ on (5.4) no es aplicable al caso de la sangre, puesto que all´ı hemos supuesto que el fluido es newtoniano. Problema. Calcular cu´ antas veces aumenta el flujo sangu´ıneo si el radio del vaso aumenta al doble. Soluci´ on. Seg´ un la ecuaci´ on de Hagen-Poiseuille, el flujo de volumen a trav´es del tubo, o en este caso, el vaso sagu´ıneo es: JV =

πΔP R4 . 8lη

Si el radio aumenta dos veces, entonces el flujo de volumen aumentar´ a 24 veces, que es un cambio muy brusco y puede tener consecuencias para la circulaci´ on. Por otro lado, la sangre es un fluido no homog´eneo, compuesto por una suspensi´ on de part´ıculas con una concentraci´on m´ axima de los eritrocitos en la zona central de los vasos, que conlleva un aumento de la viscosidad de la sangre en esta regi´on y una disminuci´ on de la misma en la cercan´ıa de la pared. Todo esto da lugar a un cambio del perfil de la velocidad, desde el perfil parab´olico en el caso de un fluido newtoniano, ecuaci´ on (5.4), hasta un perfil m´as plano en el centro del vaso sangu´ıneo y de mayor pendiente en las proximidades de la pared. No hay que olvidar tambi´en, que el di´ ametro de los vasos sangu´ıneos cambia continuamente, lo que conlleva al efecto conocido como “efecto de entrada”, que consiste en un cambio del perfil de la velocidad tras una reducci´on abrupta del radio del vaso, (Fig.5.3). S´ olo despu´es de recorrer una cierta distancia lE , tras el estrechamiento, se establece un nuevo perfil parab´olico de la velocidad. Finalmente, la suposici´ on de que el flujo laminar es un flujo estacionario, en realidad no es correcta, porque el flujo sangu´ıneo se produce por pulsos. propulsora, que hemos usado anteEsto significa, que la condici´on Ff riccion = F riormente, en general no es v´ alida. Sin embargo, esta condici´ on es importante s´olo en el flujo arterial, donde las ondas de pulso card´ıacas quedan parcialmente atenuadas por la elasticidad de las paredes de los vasos sangu´ıneos, pero

158

CAP´ITULO 5. BIOF´ISICA DE LOS CUERPOS VIVOS

Figura 5.3: Representaci´on del perfil de la velocidad tr´as una reducci´on del radio del tubo (vaso).

subsisten como oscilaciones de presi´on y de velocidad de la sangre. Hasta ahora hemos considerado que el flujo sangu´ıneo en los vasos es laminar. Para comentar este comportamiento, hay que recordar el concepto de n´ umero de Reynolds, que es una caracter´ıstica fundamental del flujo. Esta caracter´ıstica depende de la velocidad del flujo v , de la viscosidad η, de la densidad del medio ρ, de la distancia de corriente caracter´ıstica l y se expresa con la siguiente f´ ormula: lvρ . (5.6) Re = η El n´ umero de Reynolds cr´ıtico, que distingue entre un fluido laminar y uno turbulento es del orden Re = 106 para un flujo paralelo a una superficie plana y es del orden Re = 103 en el caso de un flujo en un tubo liso, r´ıgido y cil´ındrico, cuando el radio del tubo se toma como longitud caracter´ıstica. Seg´ un las tablas (Fig. 5.4), en las arterias grandes como las venas, se observan n´ umeros de Reynolds del orden de Re ∼ 103 , mientras que en los capilares Re ∼ 10−3 (r´egimen laminar). Sin embargo, hay que mencionar que en los vasos sangu´ıneos existen distintos factores que ayudan a mantener el car´ acter laminar del flujo por encima del n´ umero cr´ıtico de Reynolds, mientras que en la cercan´ıa de las ramificaciones de los vasos o de las imperfecciones producidas por arterioesclerosis, se pueden producir flujos turbulentos por debajo de estos valores m´ınimos de Reynolds. Vamos a estudiar a continuaci´on los efectos de la gravedad y de la aceleraci´ on sobre la circulaci´on sangu´ınea. En la figura 5.5 observamos el incremento de la presi´ on venosa sangu´ınea manom´etrica de una persona erguida a distintas alturas del cuerpo. Estas diferencias de presi´on se deben sobre todo a la altura por el efecto de la

´ 5.1. FLUIDOS BIOLOGICOS

159

Figura 5.4: Los n´umeros de Reynolds para distintos casos de vasos sangu´ıneos. (De Talbot y Berger, 1974).

Figura 5.5: La presi´on venosa manom´etrica de una persona erguida. (De F.Cuss´o, G.L´ opez y R.Villar, 2004).

160

CAP´ITULO 5. BIOF´ISICA DE LOS CUERPOS VIVOS

gravedad sobre la sangre. Para una densidad de la sangre igual a ρ = 1,06 · 103 kg/m3 , el incremento de la presi´on en los pies, debido a la altura, es: ΔP = ρgh = 1,06 · 103 kg/m3 · 9,8m/s2 · 1,3m ≈ 104mmHg, donde hemos tenido en cuenta que la distancia aproximada medida desde el coraz´on es de 1,30m. De este modo la presi´on manom´etrica total, despu´es de a˜ nadir 100mmHg de presi´on manom´etrica a la altura del coraz´on, es de unos 204mmHg. Sin embargo, la presi´ on real es menor que la calculada debido al paso de la sangre por las arterias y los capilares, siendo la presi´on en los pies de aproximadamente de 110mmHg. El efecto de la gravedad es mucho m´ as pronunciado en el caso de algunos animales muy altos como las jirafas. Para que la sangre que sale del coraz´on, situado aproximadamente a una altura de 2,5m, llege al cerebro, su presi´on a la salida del coraz´on debe alcanzar unos 300mmHg, lo que conlleva, por su parte, que la presi´ on en los extremos de los pies sea muy alta, de unos 500mmHg. Cuando la jirafa inclina su cabeza para comer o para beber, el cambio de presi´ on sangu´ınea sobre el cerebro ser´ıa muy alto y suficiente para destruirlo. Para que esto no ocurra, la jirafa ha adaptado su sistema circulatorio durante la evoluci´ on desarrollando unos vasos sangu´ıneos con fuertes paredes. Otro aspecto interesante de estudio es el comportamiento de la circulaci´on sangu´ınea en condiciones de aceleraci´on. Cuando una persona est´ a sometida a una aceleraci´ on a hacia arriba, ´esta tiene un peso efectivo P = m(g + a) y su sangre est´a sometida a una aceleraci´on efectiva de g +a. Para una persona erguida, ´esto dificulta la subida de la sangre al cerebro hasta perder incluso conciencia para aceleraciones efectivas por encima de 2g. Este efecto es muy importante para los astronautas, que por ello despegan y aterrizan en posici´on transversal a la direcci´on del movimiento. Una manifestaci´on de este efecto son los mareos al levantarnos r´apidamente, que todos hemos notado alguna vez. En condiciones de ingravidez, el flujo sangu´ıneo no cambia, sino que se altera la distribuci´ on del volumen de la sangre venosa de los pies por todo el cuerpo. Esto puede llevar a un hinchamiento de las venas que est´an por encima del coraz´on, e incluso al hinchamiento de la cara. La nueva distribuci´on de la sangre en condiciones de ingravidez puede provocar la reducci´ on del peso del miembro correspondiente. El organismo se puede adaptar r´apidamente a estas condiciones reduciendo la cantidad de plasma en el cuerpo en aproximadamente un 20 %, lo que puede provocar la destrucci´on de eritrocitos.

´ 5.2. BIOMECANICA DEL CUERPO HUMANO

161

Este fen´ omeno de adaptaci´on explica la anemia observada en los astronautas durante los vuelos de larga duraci´on.

5.2.

Biomec´ anica del Cuerpo Humano

En las u ´ltimas d´ecadas se han desarrollado numerosas investigaciones acerca de la biomec´anica del cuerpo humano relacionadas con la forma de andar, de soportar cargas, las tensiones que se producen en los m´ usculos y las articulaciones, etc. Todas estas investigaciones tienen una gran aplicaci´on en la ortopedia, la cirug´ıa, en la implantaci´ on de materiales artificiales en las articulaciones. Un problema importante en estas aplicaciones es entender las condiciones de adaptaci´ on del material a las propiedades viscoel´asticas del hueso vivo. Las modelizaciones matem´aticas del sistema locomotor humano son muy complicadas por el hecho de que se necesitan modelos din´amicos, que est´an compuestos de combinaciones complejas de elementos. Los tendones y los m´ usculos en los seres vivos son los elementos que hacen estable el sistema locomotor. A lo largo de la evoluci´on, todos los sistemas de elementos estables frente a la compresi´on y a la tensi´ on han mostrado una optimizaci´on orientada al uso de la fuerza muscular y la estabilidad ´osea, quedando determinados los vectores de tensi´on y compresi´on en el hueso por los puntos de fijaci´ on de los m´ usculos y de los tendones. Para dar una idea de c´ omo se podr´ıan modelar algunos elementos, vamos a recordar algunas nociones b´ asicas relacionadas con la flexi´on y la torsi´ on en los materiales. Como sabemos, la medida de la flexi´on se define a partir del radio de la curvatura R. Cuando se produce una flexi´ on, la cara c´oncava se comprime y la cara convexa se extiende. Entre ambos planos existe un plano neutro que no experimenta ninguna deformaci´ on. Para entender la flexi´ on en los huesos reales, vamos a estudiar el comportamiento de una barra que est´ a curvada entre dos puntos y que forma un a´ngulo α en radianes, (Fig.5.6). Si el radio de curvatura en el plano neutro es R, entonces la longitud l a una distancia x desde el plano neutro es: l(x) = α(R + x)

162

CAP´ITULO 5. BIOF´ISICA DE LOS CUERPOS VIVOS

Figura 5.6: La geometr´ıa de una barra curvada. El ´angulo de la curvatura es α. La l´ınea discont´ınua define el plano neutro. y la deformaci´on (x) se da con la siguiente expresi´on: (x) =

x l(x) − lN = , lN R

(5.7)

on en el plano neutro. Obviamente, donde lN = αR es la longitud de la secci´ la variable  es positiva en el caso de elongaci´on y negativa en el caso de compresi´on. Como sabemos, la deformaci´on m´as simple de un cuerpo es su alargamiento. En el diagrama (tensi´on-deformaci´ on) existe una regi´on de m´ınima elongaci´ on, hasta el l´ımite de proporcionalidad, donde es v´alida la ley de Hooke. Seg´ un esta ley, la elongaci´on  es directamente proporcional a la tensi´ on σ con el coeficiente de proporcionalidad que es el m´odulo de Young, σ (5.8) Y = .  Combinando la Ley de Hooke con la expresi´on (5.7), podemos calcular la tensi´ on provocada por la flexi´on: x (5.9) σ(x) = Y . R Si calculamos el diferencial de momento dM , podemos utilizar la u ´ ltima expresi´on y as´ı encontrar la fuerza necesaria para curvar la barra. Este diferencial

´ 5.2. BIOMECANICA DEL CUERPO HUMANO

163

Figura 5.7: Representaci´on idealizada de la secci´on de un hueso tubular. se obtiene como el producto de la fuerza F por la distancia del punto de aplicaci´ on del vector de la fuerza F al plano neutro x: dM = xdF = xσda =

Y 2 x da, R

(5.10)

donde da es el diferencial de ´area en el que est´a aplicada la fuerza. El momento total de la flexi´ on de la barra se obtiene integrando sobre x:  Y Y x2 da = Ia . (5.11) M= R R En la ecuaci´ on (5.11), la cantidad Ia es el momento de inercia del ´area y hemos asumido que la barra es homog´enea con un m´ odulo de elasticidad Y constante. Como se puede ver, si el momento de la flexi´on M no cambia y el m´odulo de Young es constante, el momento de inercia es directamente proporcional al radio de la curvatura. En otras palabras, cuando mayor es el valor del Ia , mayor ser´a el valor de R y entonces la flexi´on ser´a menor. Vamos a determinar a continuaci´on el momento de inercia en el caso de un hueso tubular, (Fig.5.7): n  x2i Δai . Ia ≈ i=1

Aqu´ı Δai son las ´areas de los rect´angulos, los xi son las distancias de los centros de los rect´angulos hasta el plano neutro y el sumatorio se extiende a todos los elementos. De esta manera se pueden calcular los momentos para distintas formas geom´etricas. Por ejemplo, para una barra cil´ındrica compacta de radio r, el momento de ´area es: Ia =

π 4 r , 4

164

CAP´ITULO 5. BIOF´ISICA DE LOS CUERPOS VIVOS

mientras que para un tubo con radio interno r1 y radio externo r2 , el momento correspondiente es: π Ia = (r14 − r24 ). 4 En el desarrollo hemos supuesto que el m´odulo de elasticidad Y es constante. Sin embargo, las propiedades de los huesos muestran que este m´odulo puede variar con la posici´ on y tambi´en con la direcci´ on en la que se aplica la fuerza. Dependiendo del a´ngulo de medida, el m´ odulo de Young puede variar hasta el doble. Esta propiedad se debe a la estructura de los huesos, donde las lagunas de las celdas ´oseas se orientan de acuerdo a la carga y siguen la trayectorias de la tensi´ on aplicada. Para dar una idea del orden de las propiedades de elasticidad de algunos materiales, podemos citar el valor del m´odulo de elasticidad, Y , en M P a que es 2 · 105 para el acero, 1 para la goma y al 104 para el hueso. Los l´ımites de elasticidad E para los mismos materiales son acero = 1,2 · 10−3 , goma = 3 y hueso = 10−2 , y la resistencia a la rotura σR en MPa es σacero = 5 · 102 y σhueso = 105 . Afortunadamente los huesos ofrecen una gran robustez antes las deformaciones. La mayor´ıa de los materiales biol´ ogicos tienen las propiedades de elasticidad de la goma, mientras que a los huesos se les atribuye las propiedades de acero. Como un ejemplo t´ıpico de los materiales del primer grupo, hay que citar a los tendones y a los ligamentos, donde algunas prote´ınas estructurales, como el col´ageno, la elastina o la resilina, son responsables de las propiedades de elasticidad de goma de estas estructuras. Las c´elulas y las fibras de un tejido forman una red y las propiedades viscoel´asticas del sistema dependen de las propiedades intr´ınsecas de las fibras, de la forma de la organizaci´ on de la red y del fluido en su interior. Al aplicar una tensi´ on a la red, ´esta se alarga hasta lo que permita la capacidad de deformaci´ on del conjunto. Si los elementos de la red est´an todos orientados por la aplicaci´ on de una fuerza, puede aparecer una tensi´ on adicional por la elongaci´ on de las fibras y esto puede producir un cambio en el valor del m´ odulo de Young. Por ejemplo, este fen´ omeno se observa en las paredes de los vasos sangu´ıneos. Como distintas formas de controlar la viscoelasticidad de los materiales biol´ ogicos hay que citar el contenido de agua en un tejido, el volumen de la c´elula o el espacio intercelular. Todas estas formas de control permiten un estudio profundo de los procesos y su posible aplicaci´ on a efectos de ortopedia, deporte o seguridad laboral y en todas las actividades donde se quiera conocer qu´e clase de tensiones se producen en los m´ usculos y en las articulaciones al

´ Y VUELO 5.3. MOVIMIENTO EN FLUIDOS: NATACION

165

someterlos a una carga o a un movimiento. Problema. Calcular el momento total de la curvatura para una barra cil´ındrica compacta de radio r cuyo radio de la curvatura es R y su m´odulo de Young es Y . Soluci´ on. El momento total de la curvatura es M =

5.3.

Y R Ia

=

πY 4 4R r .

Movimiento en Fluidos: Nataci´ on y Vuelo

Como ya hemos discutido, el n´ umero de Reynolds caracteriza el efecto de la viscosidad del medio sobre el movimiento de los cuerpos. Normalmente los animales volando por el aire o nadando en el agua tienen un n´ umero de Reynolds muy grande. Para una persona nadando, este n´ umero es del orden de 100.000 y la viscosidad no tiene mucha importancia. Por el contrario, los insectos voladores tienen un n´ umero de Reynolds muy bajo, de alrededor de 30, y la fuerza de fricci´on es muy importante. Para una bacteria, este n´ umero es del orden 10−3 . El mundo que perciben es muy viscoso y en estas condiciones la inercia del movimiento es despreciable. En la figura 5.8 est´an presentados los n´ umeros de Reynolds para distintos animales en movimiento. Los animales de cierto tama˜ no, como aves y peces, basan su movimiento en el desplazamiento de masas de aire o agua. Sin embargo, a los organismos con un n´ umero de Reynolds muy bajo no les sirven las propulsiones. En estas condiciones, los microorganismos usan movimientos de tipo flagelar y ciliar. El primer tipo es propio de algunas bacterias, que tienen forma de cilindro y unos filamentos flagelares. En el caso de Escherichia coli, el microorganismo tiene un di´ ametro de unos 10−4 cm, una longitud de unos 2 · 10−4 cm, y seis flagelos de a basado en el movimiento unos 6 · 10−4 cm de longitud. El desplazamiento est´ de dichos flagelos, que giran sincronizadamente como un sacacorchos. El otro mecanismo de propulsi´ on es por medio de unos “pelillos”, llamados cilios, que algunos microorgansmos poseen, y que usan como remos. En la figura 5.9 se han represenado las distintas formas de propulsi´ on. Existe un razonamiento muy interesante relacionado con el movimiento cuando el n´ umero de Reynolds es bajo. Es el siguiente: Imaginemos un movimiento generado por el cambio de la forma de un cuerpo que posteriormente regresa a la forma inicial en secuencia inversa, que se denomina movimiento rec´ıproco. Cuando el n´ umero de Reynolds es bajo, todo

166

CAP´ITULO 5. BIOF´ISICA DE LOS CUERPOS VIVOS

Figura 5.8: Los n´umeros de Reynolds correspondiente a distintos animales. (De R.Glaser, 1996).

Figura 5.9: Las distintas formas de propulsi´on: a) y b) movimiento por medio de cilios, c) movimiento por medio de flagelos.

´ Y VUELO 5.3. MOVIMIENTO EN FLUIDOS: NATACION

167

es reversible y no depende del tiempo, sino s´olo de la configuraci´on. Las ecuaciones que describen el movimiento del fluido, las ecuaciones de Navier-Stokes, son lineales y reversibles en el tiempo. En este caso la viscosidad domina sobre la inercia. Cualquier organismo que utilize una t´ecnica para nadar que implique una reversibilidad de tiempo (tal que no seamos capaces de distinguir si una pel´ıcula que recoja su movimiento est´a siendo reproducida hacia adelante o hacia atr´ as), no producir´ a desplazamiento neto y por tanto no podr´a nadar. Un buen ejemplo representa la almeja, que abre su concha lentamente y la cierra r´apidamente haciendo salir el agua de dentro. Con un n´ umero de Reynolds bajo, la almeja no puede desplazarse, porque tiene s´olo una bisagra y con un s´olo grado de libertad en el espacio configuracional, ella est´ a limitada a realizar u ´ nicamente un movimiento rec´ıproco. El razonamiento descrito en el caso de la almeja es conocido con el nombre de “teorema de la almeja”. Sin embargo, en el caso anteriormente citado de los microorganismos que se mueven gracias a la existencia de cilios o flagelos, los grados de libertad son mayores y estos microorganismos se pueden desplazar en el medio. Si sus flagelos fuesen r´ıgidos e hiciesen movimiento de bisagra, estos microorganismos tampoco podr´ıan nadar. Es necesario un movimiento de sacacorchos o movimientos de latigazos para que ellos puedan desplazarse. A continuaci´ on vamos a discutir los movimientos de los cuerpos en el aire y en el agua, suponiendo un n´ umero de Reynolds grande. El n´ umero de Reynolds cr´ıtico, que indica que la capa laminar del fluido sobre la superficie del cuerpo se desestabiliza, depende tambi´en de la forma del cuerpo. La capa l´ımite alrededor del cuerpo tambi´en se ve afectada por las presiones locales causadas por las diferencias de las velocidades locales. Por la ley de conservaci´on de la energ´ıa, la energ´ıa total, compuesta por la cin´etica del medio en on P V , es constante, lo que lleva a movimiento 12 ρv 2 y la energ´ıa de compresi´ la ecuaci´ on de Bernoulli: 1 (5.12) P = P0 − ρv 2 , 2 donde hemos supuesto que para la velocidad v = 0, la presi´ on hidrost´ atica es P = P0 . Seg´ un esta ecuaci´ on, la presi´on local P que act´ ua en la superficie de un cuerpo, movi´endose en un fluido, es igual a la presi´on hidrost´ atica menos el 1 2 t´ermino 2 ρv . Esto significa que si la velocidad es constante, la presi´on en un punto determinado puede ser muy baja. Esto provoca la aparici´ on de una fuerza, que act´ ua en direcci´on perpendicular a la superficie del cuerpo. En los puntos donde la velocidad es muy grande y la presi´ on efectiva en este punto puede ser incluso negativa, se puede producir la aparici´on de una estela o flujo

168

CAP´ITULO 5. BIOF´ISICA DE LOS CUERPOS VIVOS

turbulento con grandes remolinos dentro de una regi´ on mucho m´ as ancha, comparada con la regi´on de la capa l´ımite turbulenta. De este modo podemos resumir, el aumento de la velocidad puede provocar la aparici´ on de las siguientes formas de flujo: - flujo laminar alrededor del cuerpo, - flujo turbulento en la capa l´ımite alrededor del cuerpo, - flujo turbulento discontinuo en forma de estela. Hay que mencionar que durante la evoluci´ on de las especies, la forma de los animales nadadores se ha optimizado para obtener caracter´ısticas que permiten reducir la fricci´ on debido a la viscosidad del medio. En algunos casos como los peces y los delfines, se impide la discontinuidad del flujo turbulento mediante la formaci´ on de microturbulencias en la superficie del cuerpo por la presencia de escamas. Es muy interesante el caso del delf´ın, que posee una capa amortiguadora viscoel´astica sobre su piel y ciertos pliegues de la piel, que evitan la aparici´on de la inestabilidad del flujo. La nataci´ on Principialmente existen dos tipos de movimientos b´asicos durante la nataci´ on: la anguiliforme y la carangiforme. En el primer caso se realizan movimientos oscilantes de todo el cuerpo, mientras que en el segundo se realizan batidos de la cola. Normalmente la mayor´ıa de los peces usan una combinaci´on de ambos movimientos. A continuaci´ on, vamos a estudiar el movimiento de un pez de masa m, que parte del reposo hasta alcanzar una velocidad v. Durante este movimiento, el pez ha desplazado una cantidad de agua M a la que se ha comunicado una velocidad V . Usando la ley de conservaci´on del momento: mv = M V,

(5.13)

el trabajo, que ha realizado el pez es entonces: 1 1 m 1 ). W = mV 2 + M V 2 = mv 2 (1 + 2 2 2 M

(5.14)

De la ecuaci´on (5.14) obtenemos la siguiente expresi´on para la velocidad del pez en funci´ on de la masa de agua: + 1 2W . (5.15) v= m 1 + m/M

´ Y VUELO 5.3. MOVIMIENTO EN FLUIDOS: NATACION

169

Figura 5.10: La velocidad de nataci´on activa y de arranque de varios animales mar´ıtimos. (Adaptada de Wu, 1977).

Se observa que el caso de m´axima velocidad se alcanza cuando la masa m del pez es despreciable comparada con la masa M del agua desplazada. Un caso de optimizaci´ on de la velocidad se produce en los peces con colas largas y anchas, que pueden desplazar mucha agua. Tambi´en hay que mencionar que no hemos tenido en cuenta la fricci´on con el medio viscoso por el hecho que para los peces el n´ umero de Reynolds es grande y las p´erdidas por la fricci´on no tienen un papel importante. En la figura 5.10 est´ an representados los datos experimentales de las velocidades de nataci´on activa y de arranque de varios animales marinos. En esta gr´afica logar´ıtmica se observa que la dependencia velocidad-longitud sigue una ley de potencia L1/2 , que coincide, como veremos m´as tarde, con la ley de los vuelos de las aves. La ley de la velocidad de arranque va como L0,88 y est´a relacionada con la tasa de m´aximo metabolismo. En la misma gr´ afica tambi´en se observa que los grandes animales marinos alcanzan mayores velocidades, lo que les permite realizar saltos de hasta varios metros de altura.

170

CAP´ITULO 5. BIOF´ISICA DE LOS CUERPOS VIVOS

Figura 5.11: Las fuerzas que actuan sobre un ala. El vuelo Vamos ahora a estudiar el vuelo de los animales. Este movimiento se puede clasificar en tres tipos: el vuelo paraca´ıdas, el planeo y el vuelo batido. El primer tipo de vuelo es el m´as simple. Hay diversas teor´ıas que afirman que este tipo de vuelo fue la primera etapa de la evoluci´ on hacia las otras formas voladoras. Un ejemplo t´ıpico de animal que realiza este tipo de vuelo es la ardilla voladora. En el siguiente tipo de vuelo, el planeo, durante el cual las aves llevan las alas extendidas, se usa el movimiento del aire aprovechando las corrientes t´ermicas. En el u ´ltimo tipo de vuelo, el batido, se utilizan la sustentaci´ on y la propulsi´on: las alas se doblan en el movimiento hacia arriba y baten hacia abajo y hacia atr´ as. Vamos ahora a calcular la fuerza de sustentaci´on durante el vuelo, (Fig. 5.11). Seg´ un la ecuaci´ on de Bernoulli (5.12), 1 Pi − Ps = ρ(vs2 − vi2 ), 2 donde Pi , Ps son las presiones del aire sobre la superficie inferior y superior del ala y vi , vs son las respectivas velocidades del aire, cuya densidad es ρ. La fuerza de sustentaci´on es proporcional a la diferencia de las presiones Pi − Ps y a la superficie S del ala, Fs = ΔP · S, entonces: 1 Fs = ρS(vs2 − vi2 ). 2 Como las velocidades vi , vs son proporcionales a la velocidad del aire v con un coeficiente de proporcionalidad C, vs2 −vi2 ∼ Cv 2 , para la fuerza de sustentaci´on

´ Y VUELO 5.3. MOVIMIENTO EN FLUIDOS: NATACION

171

Fs , obtenemos la siguiente expresi´on final: Fs =

1 CSρv 2 . 2

(5.16)

El coeficiente C depende de la forma del ala y del a´ngulo que forma con la horizontal, teniendo un valor aproximado de 0.75 para el caso de un ave. Durante el vuelo, la fuerza de sustentaci´on es igual al peso del ave mg. Usando esta condici´on y despejando la velocidad de all´ı, obtenemos la siguiente expresi´on para la velocidad del ave: + , 2Fs 2mg = . (5.17) v= CSρ CSρ Seg´ un la ecuaci´ on (5.17), el par´ametro caracter´ıstico del ave es la relaci´on de la carga sobre la envergadura m/S. Si L es la longitud del cuerpo, entonces la masa del cuerpo es proporcional al cubo de su longitud, m ∼ L3 y el ´area on (5.17), es proporcional a su cuadrado S ∼ L2 . Sustituyendo en la ecuaci´ tenemos para la velocidad de la ave v ∼ L1/2 en funci´ on de la longitud de su cuerpo. Vamos ahora a comparar la velocidad de despegue de un ave como, por ejemplo, la gaviota cuya longitud de ala es de aproximadamente 0,2m, con la velocidad de despegue de un colibr´ı, con una longitud de ala de unos 2cm. Seg´ un la expresi´ on (5.17), tenemos: + √ Lgaviota vcolibri = 10vcolibri . vgaviota = Lcolibri Se ve entonces, que la velocidad de despegue de la gaviota es de aproximadamente tres veces mayor que la del colibr´ı. Problema. Calcular la velocidad de despegue de un ´aguila de 1, 2m de envergadura, sabiendo que un vencejo de 10cm de envergadura tiene velocidad de despegue de 20km/h. Soluci´ on. La velocidad de despegue del a´guila se expresa a trav´es de la siguiente f´ormula: + Laguila vvencejo ≈ 69km/h. vaguila = Lvencejo

172

CAP´ITULO 5. BIOF´ISICA DE LOS CUERPOS VIVOS

Para el estudio de la potencia que desarrolla un ave durante el vuelo, hay que tener en cuenta que ´esta se obtiene como el producto de la fuerza por la velocidad. Entonces la potencia necesaria para avanzar, venciendo la fuerza de arrastre, denominada potencia par´asita ppar , viene dada por la siguiente expresi´on: ρv 3 . (5.18) ppar = Fa v = CSt 2 Fa es la fuerza de arrastre, que hemos sustituido por la fuerza de sustentaci´on, dada por la ecuaci´on (5.16). La variable St es la secci´on transversal del ala del ave a la direcci´on del movimiento. Durante el vuelo, el aire ejerce una fuerza F sobre el ave que es igual a su peso mg. Entonces, el ave ejerce una fuerza sobre el aire de sentido contrario a F e igual al peso. Como consecuencia, el ave impulsa aire hacia abajo con una velocidad inducida vind . De aqu´ı, la potencia inducida, que es la potencia necesaria para la sustentaci´on, es pind = mgvind . Ahora vamos a relacionar la velocidad inducida como funci´on de la velocidad de avance del ave. La fuerza que ejerce el ave es: Find =

Δpind , Δt

donde Δpind es la variaci´on del momento lineal de la masa de aire, que impulsa el ave, dentro del intervalo Δt. Para el caso en el que la masa del aire es la que circula con una velocidad v dentro de un cilindo de diametro d, coincidiendo con la envergadura del ave, tenemos: Δpind = mΔvind =

πd2 Δtvρ vind 4

siendo ρ la densidad del aire. Por lo tanto, la fuerza inducida ser´ a: Find = mg =

πd2 vρ vind . 4

(5.19)

De aqu´ı, para la velocidad inducida como funci´ on de la velocidad del avance, tenemos: 4mg (5.20) vind = πd2 vρ

´ 5.4. SONIDO Y BIOF´ISICA DE LA AUDICION

173

y para la potencia inducida: pind = mgvind =

4m2 g2 . πd2 vρ

(5.21)

Se observa que la potencia par´asita crece como el cubo de la velocidad, mientas que la potencia inducida decrece de forma inversamente proporcional a la velocidad. En el caso de una paloma, cuya masa es de aproximadamente 400g, la potencia total tiene un m´ınimo de aproximadamente 5W para una velocidad de unos 48km/h. Problema. Comparar la potencia par´ asita de una paloma y de un colibr´ı, suponiendo que la longitud del ala de la paloma es de unos 15cm. Soluci´ on. 3 7 Como ppar ∼ Sv 3 , S ∼ L2 , v ∼ L1/2 , entonces ppar ∼ L2 L 2 ∼ L 2 . En el caso 7 concreto ppar (paloma) = (0,15/0,02) 2 ppar (colibr´ı) ≈ 1155ppar (colibr´ı).

5.4.

Sonido y Biof´ısica de la Audici´ on

5.4.1.

Vibraciones

El estudio de las vibraciones es muy importante en relaci´on con el efecto de los aparatos, las m´ aquinas, los coches, sobre el comportamiento de los seres. En general, el cuerpo vivo vibra cuando est´ a en contacto con un objeto vibrante y los factores importantes son la intensidad de la vibraci´on y la frecuencia. Recordemos que para una oscilaci´on arm´ onica, el desplazamiento en funci´on de la frecuencia angular ω y del tiempo t viene dado por la siguiente expresi´on: x = x0 sen(ωt). En la pr´actica, los seres vivos est´an sometidos a varias oscilaciones, cada una con su propia amplitud y frecuencia. Por otro lado, cada cuerpo oscilante tiene su propia frecuencia de resonancia y si ´esta es parecida a la externa, provocada por las vibraciones, el cuerpo incluso podr´ıa sufrir importantes da˜ nos si no tiene un sistema de amortiguamiento adecuado. Las vibraciones externas aplicadas al cuerpo humano pueden tener un efecto distinto. Numerosos experimentos han sido llevados a cabo y muestran que

CAP´ITULO 5. BIOF´ISICA DE LOS CUERPOS VIVOS

174

Figura 5.12: Las vibraciones aplicadas al cuerpo humano. (De R.Glaser, 1996). la relaci´on entre la amplitud de la vibraci´ on de un punto del cuerpo humano y la amplitud del soporte, sobre el cual est´a colocado el cuerpo, es muy distinta. Por debajo de 2Hz, el cuerpo sigue el movimiento del soporte. Para una frecuencia externa de 5Hz, que coincide con la frecuencia de resonancia del cuerpo humano, se observa una gran amplificaci´on en las distintas partes del cuerpo como la cadera y el hombro, mientras que la amplificaci´ on es m´axima para la cabeza alrededor de los 20Hz, (Fig. 5.12). La investigaci´ on de la percepci´ on de las vibraciones es de especial inter´es. La sensibilidad de los humanos nos permite, por ejemplo, detectar vibraciones de hasta 200Hz con una amplitud de s´ olo 0,1μm. La sensibilidad de los animales y especialmente de los insectos puede ser mucho mayor, lo que les permite percibir las vibraciones de terremotos mucho antes que a los humanos.

5.4.2.

Sonido

Cuando las ondas ac´ usticas est´an aproximadamente dentro del intervalo de frecuencias 20Hz − 20kHz, entonces se produce una sensaci´on fisiol´ ogica que se denomina sonido. Por encima del l´ımite superior, las ondas se denominan ultrasonidos y por debajo del l´ımite inferior, infrasonidos. Los experimentos ac´ usticos llevados a cabo con distintos animales, muestran que la frecuencia m´axima que pueden percibir es de unos 50kHz para el perro, 100kHz para el rat´ on y aproximadamente 150kHz para el delf´ın. La Ley de Weber-Fechner, relaciona el nivel de la sensaci´on del sonido L,

´ 5.4. SONIDO Y BIOF´ISICA DE LA AUDICION

175

medida en decibelios, dB, con la intensidades de onda I ([I] = W m−2 ) y con las presiones ac´ usticas P , respectivamente: L = 10 log

P2 I = 10 log 2 . I0 P0

(5.22)

En la ecuaci´ on (5.22), hemos tenido en cuenta que la intensidad de la onda I es proporcional al cuadrado de la presi´on ac´ ustica. El par´ametro I0 = 10−12 W · −2 m es la intensidad de referencia de un sonido transmitido por el aire. Este valor corresponde al nivel del umbral de audici´ on del o´ıdo humano normal para una frecuencia de referencia de 1000Hz, que es su frecuencia de m´axima sensibilidad. Finalmente, la presi´on de referencia P0 = 2 · 10−5 P a es la presi´on ac´ ustica que corresponde al valor de I0 , citado anteriormente. A continuaci´ on, vamos a calcular cu´ales son las presiones de las ondas sonoras corespondientes para el umbral de audici´on y para el umbral de la sensaci´on dolorosa. Para el umbral de audici´ on, la intensidad del sonido que el o´ıdo es capaz de detectar, es del orden I0 = 10−12 W ·m−2 . Se puede demostrar que la intensidad de una onda ac´ ustica est´a relacionada con la presi´ on P del medio en donde se propaga, la velocidad de la onda v y la densidad del medio ρ a trav´es de la siguiente expresi´on: I=

1 P2 . 2 ρv

(5.23)

Si el medio es el aire, su densidad en condiciones normales es de ρ = 1,3kgm−3 , on (5.23) y la velocidad del sonido es v = 340ms−1 . Despejando en la ecuaci´ con respecto a la presi´on, obtenemos que el valor de la presi´on correspondiente al umbral de audici´ on es Paudicion = 3 · 10−5 P a. Para el caso del umbral de la sensaci´on de dolor, donde la intensidad correspondiente es I ≈ 1W · m−2 , la presi´on es Pdolor ≈ 26P a, valor que aqu´ı, como en el c´alculo anterior, tenemos que sumar a la presi´on atmosf´erica. Problema. Comparar la intensidad del sonido L despu´es de aumentar la presi´on ac´ ustica 10 veces. Soluci´ on En la expresi´ on: L = 10 log II0 = 10 log derecha se transforma en: 10 log

100P 2 P02

P2 , P02

sustituimos P por 10P . La parte

= 20 + 10 log

la intensidad ha aumentado con el t´ermino

2 2 log P 2 P

0

.

P2 , P02

de donde se ve que

176

CAP´ITULO 5. BIOF´ISICA DE LOS CUERPOS VIVOS

Figura 5.13: El o´ıdo humano.

5.4.3.

Mecanismos de la Audici´ on

El o´ıdo humano puede dividirse en tres partes: externo, medio e interno. El o´ıdo externo se extiende hasta el t´ımpano, el o´ıdo medio se localiza entre el t´ımpano y la ventana oval, mientras que el o´ıdo interno est´a localizado m´as all´ a de la ventana oval, (Fig. 5.13). El o´ıdo externo se puede considerar como un amplificador ac´ ustico con una selectividad direccional y frecuencia de resonancia entre 2Hz y 3kHz. El o´ıdo medio tiene caracter´ısticas m´as particulares. Su funcionamiento se debe a los peque˜ nos huesos, llamados martillo, yunque y estribo, que transmiten las vibraciones desde la membrana timp´anica hasta la ventana oval. Este sistema complejo convierte las vibraciones del aire en vibraciones de los l´ıquidos linf´ aticos, que tienen una densidad y viscosidad parecidas a las del agua. Durante la transformaci´ on se realiza una reducci´on de la amplitud y un aumento de la presi´on. Por ejemplo, para el o´ıdo humano el incremento de la presi´ on interior es de 20 veces mayor que la exterior. Podemos calcular este incremento de la presi´on relacionando las fuerzas que act´ uan sobre el sistema yunque-estribo, (Fig. 5.14): Sean los sub´ındices (1) y (2) para el t´ımpano (o´ıdo externo) y el o´ıdo interno, respectivamente. Por un lado tenemos la relaci´ on entre las fuerzas aplicadas y los brazos de palanca entre yunque y estribo, que incrementan la fuerza sobre el estribo: F2 L2 = F1 L1 .

´ 5.4. SONIDO Y BIOF´ISICA DE LA AUDICION

177

Figura 5.14: La representaci´on del sistema conjunto formado por el yunque y el estribo. La relaci´ on entre la presi´ on del o´ıdo externo P1 y la presi´on del o´ıdo interno P2 es: F2 /S2 P2 = , P1 F1 /S1 donde S1 , S2 son las superficies de los ´organos correspondientes. El a´rea de la membrana timp´anica es aproximadamente 15 veces mayor que el ´area del estribo. Por otro lado, la relaci´on de la longitud de los dos on brazos es L1 /L2 ≈ 1,3, lo que finalmente da la citada magnitud de relaci´ P2 L1 S1 entre las presiones: P1 ≈ L2 · S2 = 15 · 1,3 ≈ 20. Por u ´ltimo, el o´ıdo interno es el responsable de la detecci´on real del sonido. Este o´ıdo est´a compuesto por un canal helicoidal enrollado, que est´a dividido por una membrana, llamada membrana de Reissner. De esta manera se forman dos cavidades, el canal vestibular y el canal timp´anico. El fluido perilinf´ atico de estos canales est´a separado del fluido endolinf´ atico del canal medio. La presi´ on ac´ ustica se transmite desde la ventana oval al fluido perilinf´ atico y pasa al canal timp´ anico. La membrana de Reissner y la membrana basilar transmiten la presi´on ac´ ustica del fluido perilinf´atico al fluido endolinf´ atico del canal medio. Las c´elulas sensoriales, que transmiten los impulsos al cerebro, est´an situadas en la membrana basilar. Esta membrana mide unos 35mm de longitud y su rigidez se reduce hasta 100 veces a medida que se aleja de la ventana oval.

178

CAP´ITULO 5. BIOF´ISICA DE LOS CUERPOS VIVOS

Las c´elulas sensoriales, llamadas c´elulas ciliadas, contienen en su superficie mechones de finas vellosidades, dispuestos de forma hexagonal. Estas vellosidades, llamados estereocilios, se excitan mediante el flujo oscilante por una asociaci´on mec´anica entre ellas y los canales i´onicos de la membrana celular. De esta manera, la vibraci´ on mec´anica se convierte en una se˜ nal electroqu´ımica, que ya hemos estudiado en el cap´ıtulo anterior. Cerca de la m´axima intensidad deben evitarse los da˜ nos en el sistema y cerca del m´ınimo desplazamiento existen mecanismos que protegen el sistema contra el ruido t´ermico. En el u ´ltimo caso, la asociaci´on de los estereocilios con pliegues de propiedades anisotr´ opicas, hacen que estas asociaciones sean menos sensibles a las oscilaciones por el ruido t´ermico y mucho m´as sensibles en la direcci´ on del flujo oscilatorio aportado por la se˜ nal sonora. Para terminar este cap´ıtulo, vamos a facilitar alguna informaci´ on relacionada con el efecto del ruido sobre la salud humana. Las vibraciones y el ruido pueden generar efectos cr´ onicos sobre los vasos sangu´ıneos y dependen del tipo de exposici´on a ellas. Por eso es necesario valorarlas con el fin de tomar medidas preventivas para la salud. La contaminaci´ on ac´ ustica producida por la actividad humana ha aumentado de forma dr´ astica en los u ´ ltimos a˜ nos. Seg´ un las estad´ısticas, 130 millones de habitantes de los pa´ıses miembros de la Comunidad Europea soportan niveles sonoros superiores a 65 decibelios (dB), l´ımite aceptado por la Organizaci´ on Mundial de la Salud. Espa˜ na es el segundo pa´ıs, despu´es de Jap´on, con mayor ´ındice de poblaci´ on expuesta a altos niveles de ruido. El 80 % del nivel medio de ruidos en Espa˜ na, es debido a veh´ıculos a motor, el 10 % a las industrias, el 6 % a ferrocarriles y el 4 % a bares, talleres industriales, etc. La exposici´on continuada produce la p´erdida progresiva de la capacidad auditiva. Adem´ as, el ruido puede causar efectos sobre: - el sistema cardiovascular con alteraciones del ritmo card´ıaco, hipertensi´ on arterial y excitabilidad vascular, - las gl´andulas endocrinas con alteraciones hipofisiarias y aumento de la secreci´on de adrenalina, - el aparato digestivo con incremento de enfermedades g´astricas causadas por dificultades en el descanso, - otras afecciones por incremento del estr´es, dificultades de observaci´ on, concentraci´ on, etc. Hoy la mejor soluci´ on consiste en incorporar un estudio de niveles ac´ usticos on a la planificaci´on urban´ıstica, con el fin de crear islas sonoras. Otra soluci´

´ 5.4. SONIDO Y BIOF´ISICA DE LA AUDICION

179

es insonorizar los edificios pr´ oximos a los puntos negros sonoros. A continuaci´ on, podemos comparar los valores reales del nivel del ruido, producidos por distintos emisores, seg´ un los datos estad´ısticos: Origen P´ ajaros trinando Rumor de hojas de ´arboles Zonas residenciales Conversaci´on normal Ambiente de oficina Interior de f´ abrica Tr´afico rodado Claxon de autom´ovil Claxon de autob´ us Interior de discotecas Motocicletas sin silenciador M´ aquinas taladradoras Avi´ on sobre la ciudad Umbral de dolor

dB 10 20 40 50 70 80 85 90 100 110 115 120 130 140

En los lugares p´ ublicos, los ruidos emitidos procedentes de exteriores no pueden sobrepasar los siguientes l´ımites en dB: Origen Hospitales Bibliotecas y Museos Cines, Teatros y Salas de conferencias Centros docentes y Hoteles Oficinas y Despachos p´ ublicos Grandes almacenes, Restaurantes y Bares

dB 25 30 40 40 45 55

En las viviendas, no pueden existir aparatos que emitan m´as de 80 dB y los aparatos dom´esticos no pueden emitir por encima de 40 dB por la noche. Por u ´ltimo, los veh´ıculos tambi´en est´an sometidos a niveles de emisi´on de ruidos dentro de los reglamentos legales.

CAP´ITULO

6

Radiaci´on

No cabe duda de la importancia que tiene la radiaci´on en Biolog´ıa, tanto desde el punto de vista del efecto de ´esta sobre los sistemas vivos, como desde el punto de vista pr´ actico: gran parte de los m´etodos y t´ecnicas empleados en el estudio anal´ıtico y en la obtenci´on de im´ agenes de sistemas biol´ogicos tienen como fundamento la interacci´on de la radiaci´ on con la materia. En el presente cap´ıtulo veremos algunos procesos de interacci´on de la radiaci´ on con la materia y, espec´ıficamente, con los sistemas biol´ ogicos. Mostraremos tambi´en el fundamento de importantes t´ecnicas en las que a partir de dicha interacci´ on se puede obtener informaci´ on espec´ıfica de los complejos sistemas biol´ ogicos. Para comenzar, vamos a centrarnos, en primer lugar, en el origen y particularidades de la radiaci´ on.

6.1.

Propiedades de la Radiaci´ on Electromagn´ etica

La radiaci´ on electromagn´etica es un tipo de energ´ıa, en forma de campos el´ectricos y magn´eticos, que se puede transmitir sin soporte material y a una velocidad m´ axima de c = 3 · 108 m/s. Estos campos el´ectricos y magn´eticos constituyen ondas perpendiculares entre s´ı, y perpendiculares a la direcci´ on de propagaci´ on, cuya longitud de onda es inversamente proporcional a la energ´ıa que transportan. Por otra parte, en su interacci´on con la materia, esta radiaci´on presenta propiedades de part´ıcula. Por ello se considera la radiaci´ on como paquetes dis-

´ CAP´ITULO 6. RADIACION

182

Figura 6.1: Representaci´on de onda electromagn´etica. Cada plano perpendicular a la direcci´on de propagaci´ on contiene un vector de campo el´ectrico y otro magn´etico, perpendiculares entre s´ı.

cretos de ondas, que se comportan como si fueran part´ıculas individuales, a los que se les denominan fotones. Este doble comportamiento dif´ıcil de conciliar, part´ıcula y onda, fue denominado dualidad onda-corp´ usculo por De Broglie. Adem´as, esta dualidad no es exclusiva de la radiaci´on electromagn´etica, sino que lo presentan todas las part´ıculas que viajan a elevadas velocidades. El mejor ejemplo lo presentan los electrones que pueden experimentar fen´ omenos de interferencia o difracci´ on como la luz. Vamos a ver, a continuaci´on, algunas de las propiedades m´as importantes de la radiaci´ on electromagn´etica en su comportamiento como onda y en su comportamiento como part´ıcula.

6.1.1.

Propiedades de Onda

Una onda electromagn´etica se puede describir como un campo el´ectrico que experimenta oscilaciones sinusoidales, que lleva acoplado un campo magn´etico proporcional y perpendicular a ´el. Ambos campos oscilan siempre perpendiculares a la direcci´on de propagaci´ on, es decir, son ondas transversales, como se muestra en la figura 6.1. La amplitud de la oscilaci´ on es la amplitud del campo. Como toda onda, lleva asociada una energ´ıa en su propagaci´ on. Dado que se puede transmitir sin medio material asociaremos su energ´ıa a los propios campos que est´an oscilando. Vamos a ver un peque˜ no recordatorio de los conceptos b´asicos referente a las ondas en general. El tiempo que tarda en pasar dos m´ aximos consecutivos

´ ELECTROMAGNETICA ´ 6.1. PROPIEDADES DE LA RADIACION

183

del campo por un mismo punto se denomina per´ıodo, T . La frecuencia, ν, es el n´ umero de oscilaciones del campo que ocurren por segundo; matem´aticamente se puede expresar como la inversa del periodo, ν = 1/T . Su unidad en el Sistema Internacional es el s−1 o hertzio (Hz). Esta frecuencia depende exclusivamente de la energ´ıa de la onda. La relaci´on entre la energ´ıa y la frecuencia de la onda viene dada por la relaci´ on de Planck: E = hν,

(6.1)

donde h es la constante de Planck (6, 63 · 10−34 J · s). Sin embargo, la velocidad de propagaci´on de la onda (distancia recorrida por el campo por unidad de tiempo) var´ıa dependiendo del medio en el que se est´a propagando la onda electromagn´etica. La m´axima velocidad de propagaci´on se alcanza en el vac´ıo con el valor ligeramente inferior a 3 · 108 m/s (representado por el s´ımbolo c). Cuando la onda electromagn´etica atraviesa una sustancia material los campos el´ectricos y magn´eticos de la onda interaccionan con las propias cargas y campos constituyentes de la materia produci´endose un retraso en su propagaci´on. La relaci´ on entre la velocidad m´axima, c y la velocidad de propagaci´on en un medio se denomina ´ındice de refracci´ on, n, n = c/ν. De la misma forma que se han definido unos par´ ametros temporales caracter´ısticos se puede definir los espaciales. El m´as importante que se utiliza para caracterizar una onda es la longitud de onda, λ, que es la distancia espacial entre dos m´aximos consecutivos. Matem´aticamente se puede obtener como el producto entre la velocidad de propagaci´on y el per´ıodo: λ =c·T =

c . ν

Otra forma de expresar la forma espacial de una onda es mediante el n´ umero de ondas, k, que es el n´ umero de ondas completas que hay por unidad de longitud. Matem´ aticamente se expresa como k=

2π . λ

Su unidad en el Sistema Internacional es, por tanto, m−1 , aunque tambi´en se puede ver expresado como cm−1 .

´ CAP´ITULO 6. RADIACION

184

Problema. Un instrumento de espectroscop´ıa trabaja en un intervalo de longitudes de onda desde 180nm a 3200nm. Calcular el intervalo de frecuencias que utiliza. Soluci´ on. Haciendo uso de la relaci´on entre la frecuencia y la longitud de onda: ν=

c , λ

podemos calcular la frecuencia m´ınima y m´ axima: νmin =

c = 93, 75 · 1012 Hz 3, 2 · 10−6 m

νmax =

c = 1, 67 · 1015 Hz. 0, 18 · 10−6 m

y

6.1.2.

Propiedades de Part´ıcula

Cuando se tiene en cuenta la interacci´on de la radiaci´ on electromagn´etica con la materia, es necesario postular que estas ondas est´ an constituidas por part´ıculas individuales (denominadas fotones) que pueden ser absorbidos o dispersados por a´tomos o mol´eculas incorporando para s´ı la energ´ıa transportada por la onda. Cuando sucede esto, el a´tomo o mol´ecula pasa a un estado energ´etico superior (utilizando la nomenclatura de la Mec´ anica Cu´antica, pasa a un estado excitado caracterizado por una serie de n´ umeros cu´ anticos distintos). De manera equivalente, cuando un a´tomo o mol´ecula pasa de un estado excitado a otro menos energ´etico, el exceso de energ´ıa es emitido en forma de un fot´ on, cuya frecuencia es exactamente la correspondiente a esta diferencia de energ´ıa, ν = ΔE/h.

6.1.3.

(6.2)

Espectro Electromagn´ etico

El espectro electromagn´etico es el conjunto de longitudes de onda de la radiaci´ on electromagn´etica. El intervalo conocido y de inter´es para el hombre

´ ELECTROMAGNETICA ´ 6.1. PROPIEDADES DE LA RADIACION

185

Figura 6.2: Regiones del espectro electromagn´etico. En la escala superior se representa la frecuencia en Hz, y en la escala inferior las longitudes de onda en metros.

cubre un rango enorme, desde las longitudes de onda subat´ omicas de los fotones de rayos X y gamma (10−10 m − 10−13 m) hasta las longitudes de onda del orden del metro de los fotones de radiofrecuencia y los kil´ometros de las ondas largas. En la figura 6.2 se muestra el espectro electromagn´etico con las distintas regiones en las que se suele dividir. La regi´on del espectro visible se muestra ampliado porque comprende un intervalo relativamente peque˜ no de longitudes de onda. La escala superior corresponde a la frecuencia en hertzios y la inferior es la escala equivalente para la longitud de onda, en metros. Hay que notar que estas representaciones del espectro aparecen siempre en escala logar´ıtmica dada la enorme variaci´ on de los ´ordenes de magnitud: la longitud de onda va desde los miles de kil´ometros hasta longitudes menores que el tama˜ no del n´ ucleo at´omico. El espectro electromagn´etico suele dividirse en regiones en las que la radiaci´on recibe un nombre particular. Una regi´ on muy relevante, desde el punto de vista biol´ ogico, es el espectro visible (VI), que cubre longitudes de onda desde los 380nm (0, 38μm) del violeta hasta los 780nm (0, 78μm) del rojo. Todos los colores del espectro visible est´an dentro de este intervalo. Como veremos en el cap´ıtulo referente al microscopio, es justamente el orden de magnitud de esta longitud de onda la que determine el tama˜ no del objeto m´ as peque˜ no que

´ CAP´ITULO 6. RADIACION

186

puede verse (en sentido literal) con ning´ un instrumento ´optico. Entre el visible y los rayos X se encuentra el ultravioleta (UV). Como cubre un amplio rango del espectro se diferencian, a su vez, varias regiones del UV: longitudes de onda mayores que 200nm corresponden al ultravioleta cercano y por debajo de este valor, ultravioleta extremo. Por el otro extremo del visible se encuentra el infrarrojo (IR). Por igual motivo se distinguen varias regiones dentro de este tipo de radiaci´ on: el infrarrojo cercano corresponde a longitudes de onda menores que 2500nm (2, 5μm), el infrarrojo medio se encuentra entre este valor y los 50μm; y el infrarrojo lejano o submilim´etrico a la regi´on entre los 50μm y 1mm. Por encima del mil´ımetro se encuentran los microondas, hasta los 30cm, correspondientes a frecuencias entre 1GHZ y 300GHz (recordemos que el prefijo Giga, G, tiene el valor 109 ). Longitudes de onda mayores corresponden a las llamadas ondas de radio (ultra alta frecuencia, muy alta frecuencia, onda corta, onda media, onda larga y muy baja frecuencia)

Problema. Indicar a qu´e rango del espectro corresponden las siguientes radiaciones: 1. λ = 1m. 2. k = 103 cm−1 . 3. λ = 25nm. 4. ν = 1018 Hz.

Soluci´ on. Localizando en el espectro electromagn´etico (Figura 6.2): 1. Radio. 2. IR. 3. UV. 4. Rayos X. Como la energ´ıa de la radiaci´ on es proporcional a la frecuencia, y ´esta es inversamente proporcional a la longitud de onda, los fotones de menor longitud

6.2. ESPECTROSCOP´IA

187

de onda ser´an m´as energ´eticos que los de mayor longitud de onda. Por ello cuando se representa el espectro electromagn´etico se suele hacer una doble representaci´on, en la que adem´ as de indicarse la longitud de onda de cada regi´on, se expresa la frecuencia o, directamente, la energ´ıa correspondiente a esa longitud de onda.

6.2.

Espectroscop´ıa

Los elementos b´asicos constituyentes de toda la materia (viva e inerte) son los ´atomos y mol´eculas. El estado con menos energ´ıa en que se pueden encontrar estos ´atomos y mol´eculas se denomina estado fundamental. Si un ´atomo o mol´ecula absorbe energ´ıa abandona este estado y pasa a otro estado de mayor energ´ıa, llamado estado excitado. La Mec´anica Cu´antica afirma que los estados excitados corresponden a valores concretos de energ´ıa, caracterizados por unos valores discretos (llamados n´ umeros cu´ anticos). De igual forma, la energ´ıa que un a´tomo o mol´ecula puede tomar o irradiar es tambi´en discreta, y corresponde justamente a la diferencia de energ´ıa entre los estados en los que se encontraba el ´atomo o mol´ecula. Cuando un a´tomo absorbe energ´ıa lo que ocurre realmente es que sus electrones toman esa energ´ıa para pasar a otro estado de mayor energ´ıa. Sin embargo, una mol´ecula, con sus ´atomos en continua vibraci´ on y rotaci´ on, tambi´en puede tomar energ´ıa pasando a otro estado de rotaci´ on o vibraci´ on de mayor energ´ıa (tambi´en con valores discretos de la energ´ıa, caracterizados por unos n´ umeros cu´ anticos). La frecuencia de rotaci´ on o vibraci´ on s´olo podr´ a ser la correspondiente a un estado cu´antico permitido. Un a´tomo o mol´ecula absorbe o emite energ´ıa, correspondiente a una transici´on de niveles cu´anticos, en forma de fotones, que son las part´ıculas (sin masa) portadoras de la unidad b´ asica de energ´ıa radiante. La energ´ıa de un fot´ on vimos que viene dada por su frecuencia, de la forma: E = h · ν. Es decir, para que un a´tomo o mol´ecula absorba un fot´on su energ´ıa debe corresponder exactamente con la diferencia energ´etica entre dos niveles cu´anticos. De igual manera, cuando un a´tomo o mol´ecula se relaja desprendiendo energ´ıa (pasando a un nivel energ´etico inferior) emite un fot´on cuya frecuencia corresponde a la diferencia de energ´ıa habida en el salto (Ec. (6.2)). Como los niveles energ´eticos (cu´anticos) de un a´tomo o mol´ecula son caracter´ısticos de ´estos, las frecuencias de los fotones que podr´an absorber o emitir tambi´en ser´an caracter´ısticos. El conjunto de frecuencias que un a´tomo puede emitir/abosrber constituye el llamado espectro de emisi´on/absorci´on

188

´ CAP´ITULO 6. RADIACION

Figura 6.3: Espectro de absorci´on del sodio. Transiciones del sodio desde el nivel fundamental (3s) a estados excitados (3p, 4p y 5p). La anchura de la flecha representa la probabilidad de la transici´ on.

del susodicho a´tomo. As´ı pues, por la forma del espectro es posible identificar los ´atomos y mol´eculas (la intensidad de las l´ıneas del espectro viene dada por la cantidad de a´tomos que est´en irradiando). La figura 6.3 muestra, como ejemplo, el espectro de absorci´on del sodio. A la derecha est´an representadas las transiciones correspondientes a las longitudes de onda de dicho espectro. Este es el fundamento de la espectroscop´ıa, la identificaci´ on de a´tomos o mol´eculas a partir de su espectro de emisi´on o absorci´ on. Dependiendo de la frecuencia del fot´ on emitido o absorbido por el a´tomo o mol´eculas se hablar´a de distintos tipos de espectroscop´ıas como veremos m´as adelante. De entre los diversos tipos de espectroscop´ıas vamos a centrarnos en cuatro de las m´as importantes: de absorci´on molecular, de fluorescencia molecular, de infrarrojo y finalmente, la resonancia magn´etica nuclear (RMN). Los otros tipos de espectroscop´ıas (como la at´ omica por llama, de plasma, etc.) tienen el mismo fundamento, diferenci´ andose b´asicamente en la forma en que se excita el ´atomo para hacerlo emitir.

6.2.1.

Absorci´ on de Radiaci´ on Electromagn´ etica

El t´ermino de absorci´on, en espectroscop´ıa, se refiere a que una especie qu´ımica situada en un medio transparente a la radiaci´ on aten´ ua selectiva-

6.2. ESPECTROSCOP´IA

189

mente ciertas frecuencias de radiaci´on electromagn´etica. Igual que sucede con los ´atomos, las mol´eculas tienen un conjunto caracter´ıstico de posibles estados de energ´ıa, siendo el estado fundamental el de menor energ´ıa. Cuando una mol´ecula es excitada por alg´ un mecanismo (por radiaci´ on, por colisi´on o t´ermicamente) pasa a otro de los posibles estados energ´eticos. Cuando la excitaci´on es debida a la absorci´ on de un fot´ on debe ocurrir que la energ´ıa del fot´ on incidente coincida exactamente con la diferencia de energ´ıa entre el nivel fundamental (en el que se encuentre la mol´ecula) y la del nivel excitado alcanzado. En estas condiciones, la energ´ıa del fot´ on se transfiere ´ıntegramente a la mol´ecula, pudi´endose representar como M + hν → M ∗ . Despu´es de un corto intervalo de tiempo la especie se relaja a su estado inicial transfiriendo su exceso de energ´ıa (la misma que absorbi´o) a otros a´tomos, mol´eculas o al medio.

Problema. En una medida de absorci´ on molecular, la longitud de onda de la radiaci´ on absorbida es de 10μm. Calcular: 1. La frecuencia y el n´ umero de ondas de dicha radiaci´ on. 2. La energ´ıa involucrada por cada mol´ecula. 3. La energ´ıa absorbida por mol. 4. ¿Qu´e longitud de onda tendr´ıa la radiaci´ on absorbida si la diferencia de energ´ıa entre los niveles involucrados fuera el doble?

Soluci´ on. 1. ν =

c λ

= 3 · 1013 Hz; k =

2π λ

= 628318, 5rad/m.

2. Emolec = h · ν = 1, 986 · 10−20 J  2 · 10−20 J. 3. Emol = Emolec · NA = 1,196 · 104 J/mol. 4. ν  = 2 · ν = 2 λc =

c λ/2

→ λ =

λ 2

= 5 · 10−6 m.

190

´ CAP´ITULO 6. RADIACION

La excitaci´on con radiaci´on visible o UV determina la promoci´ on de un electr´on de un orbital molecular o at´omico a otro de mayor energ´ıa. Cuando sucede esta transici´on electr´onica se denomina absorci´ on electr´ onica. Adem´as de la transiciones electr´onicas pueden suceder transiciones vibracionales, esto es, entre niveles vibracionales en los que los ´atomos de la mol´ecula vibran en ciertas energ´ıas discretas (existen multitud de niveles vibracionales para un cierto nivel electr´onico). La energ´ıa de transici´on entre estos niveles suele ser aproximadamente un orden de magnitud menor que la de transici´on entre niveles electr´onicos. A su vez, para cada estado vibracional existen multitud de estados rotacionales, cuya diferencia de energ´ıa es t´ıpicamente un orden de magnitud menor que entre los vibracionales. As´ı pues, podemos decir que la energ´ıa total propia de una mol´ecula, incluyendo la energ´ıa de translaci´on, viene dada por ET ot = Eelect + Evibr + Erotac + Etransl . Dependiendo de la energ´ıa de la radiaci´ on incidente se podr´ a producir absorci´on de radiaci´ on para promocionar entre diferentes estados energ´eticos, ya sea entre estados rotacionales, vibracionales o electr´onicos. La radiaci´on visible/UV promocionar´ a electrones entre estados electr´onicos, pero como para cada nivel electr´onico existen numerosos niveles vibracionales y, a su vez, para cada vibracional numerosos estados rotacionales pr´ oximos, el espectro de absorci´on consistir´ a en bandas de absorci´ on (en lugar de l´ıneas aisladas si fuera s´olo entre niveles electr´onicos). Sin embargo, la radiaci´ on IR no tiene suficiente energ´ıa para producir transiciones electr´onicas, aunque s´ı entre estados vibracionales y rotacionales. En la figura 6.4 (a) se representa la absorci´ on de un fot´ on asociada a una transici´on vibracional de un mol´ecula diat´omica. En la figura 6.4 (b) se representa la absorci´on de un fot´ on asociada a una transici´on rotacional. El tiempo de vida de un estado excitado es corto porque existen diversos mecanismos por los que un ´atomo o mol´ecula excitada puede volver a su estado fundamental emitiendo el exceso de energ´ıa absorbido. Este proceso de relajaci´ on puede darse de dos formas distintas, radiante y no radiante. La relajaci´ on no radiante tiene lugar entre niveles vibraciones y rotacionales, simplemente por colisiones entre las mol´eculas entre s´ı, o con las del disolvente, transfiri´endose as´ı el exceso de energ´ıa al entorno (contribuyendo al aumento de temperatura del medio). Este proceso de relajaci´on es el m´as probable para un estado vibracional excitado, siendo la vida media de estos niveles de 10−15 s.

6.2. ESPECTROSCOP´IA

191

Figura 6.4: Representaci´on de la absorci´on de un fot´on por una mol´ecula diat´omica. a) Frecuencia correspondiente a una transici´on vibracional. b) Frecuencia correspondiente a una transici´ on rotacional.

Cuando la diferencia de energ´ıa entre estados es elevada (superior al eV 1 ) corresponder´a a radiaci´on visible o UV, mientras que cuando son transiciones entre niveles vibracionales (diferencias de d´ecimas o cent´esimas de eV ) corresponde a radiaci´ on IR; las transiciones entre niveles rotacionales corresponden a diferencias de energ´ıa de mil´esimas de eV . La diferencia de energ´ıa entre los estados vibracionales y rotacionales es tan peque˜ na que por las propias colisiones entre mol´eculas se cede esa energ´ıa, pasando as´ı a sucesivos estados menos energ´eticos. Este procedimiento se denomina relajaci´ on vibracional y −15 suele tener un tiempo caracter´ıstico de 10 s. Tambi´en puede tener lugar una relajaci´ on no radiante entre el nivel m´ as bajo vibracional de un estado electr´onico excitado y el nivel vibracional superior de otro estado electr´ onico inferior. Este tipo de relajaci´on se denomina conversi´ on interna y es mucho menos eficaz, con un tiempo de vida media de 10−6 − 10−9 s. As´ı, por ejemplo, los gases y vapores dan espectros de rayas y de bandas (los vapores est´an constituidos por a´tomos y mol´eculas libres desligados de su estado condensado). Las rayas son producidas por las transiciones electr´onicas at´ omicas, t´ıpicas de los espectros at´omicos. Las bandas son producidas por las mol´eculas presentes en el gas. Estas l´ıneas tan pr´ oximas que aparecen formando bandas son las propias de los espectros moleculares. En la figura 6.5 se muestran las transiciones que pueden ocurrir en una emisi´on at´ omica (izquierda) y en una emisi´on molecular (derecha). En los espectros moleculares 1 Recordemos que un eV es una unidad de energ´ıa definida como la energ´ıa que adquiere una carga de un electr´ on cuando es acelerado por un potencial de 1V .

192

´ CAP´ITULO 6. RADIACION

Figura 6.5: Espectro de emisi´on at´omica y molecular. E1 y E2 representan estados electr´onicos excitados. En la emisi´on molecular el estado final puede ser cualquiera de los distintos niveles vibracionales (representados por los n´umeros 0, 1, 2, 3 y 4) del estado electr´onico fundamental.

aparecen varias transiciones desde un mismo estado electr´onico excitado, lo que hace que en lugar de rayas aparezcan una serie de bandas.

6.2.2.

Espectro de Absorci´ on. Ley de Beer

Cuando una muestra se somete a radiaci´on, parte de esta radiaci´on puede ser absorbida, mientras que el resto la atravesar´ a y podr´ a ser detectada a la salida. La absorci´on se puede medir a partir de distintas magnitudes. La fracci´on de la radiaci´ on electromagn´etica incidente que transmite una muestra, es decir, la cantidad de radiaci´ on no absorbida, se denomina transmitancia, T . La energ´ıa de radiaci´ on que incide sobre un ´area de 1cm2 es el poder radiante, p0 , luego midiendo la radiaci´ on a la salida de la muestra, p, se calcula la transmitancia como T = p p0 , esto es, la fracci´on de radiaci´ on incidente transmitida por la disoluci´ on (tambi´en se puede representar en %). Se denomina absorbancia, A, al logaritmo de la inversa de la transmitancia,

6.2. ESPECTROSCOP´IA

193

A = log(1/T ) y expresado en funci´ on de la radiaci´ on incidente y de salida: -

A = −logT = log p0 p

Problema. Transformar los siguientes datos de transmitancia a absorbancia: 1. 1 % 2. 10 % 3. 33 % 4. 90 % 5. 99 % Soluci´ on. Haciendo uso de la definici´ on, A = − log(T ) : 1. A = − log(0, 01) = 2, 0 2. A = − log(0, 1) = 1, 0 3. A = − log(0, 33) = 0, 48 4. A = − log(0, 9) = 0, 0457 5. A = − log(0, 99) = 0, 00436 Obs´ervese que la absorbancia vale 1 cuando la transmitancia es del 10 %. Para transmitancias mayores tendremos valores cada vez menores, sin alcanzar el 0 (corresponder´ıa a una transmitancia del 100 %). Por el otro extremo, cada vez que la transmitancia se hace 10 veces m´as peque˜ na la absorbancia se incrementa en una unidad.

El espectro de absorci´on es una representaci´on de alguna funci´ on de la atenuaci´on del haz de radiaci´ on al que ha sido expuesta la muestra, frente a

´ CAP´ITULO 6. RADIACION

194

Figura 6.6: Esquema de la medida de la transmitividad. b es el espesor de la celda y C es la concentraci´on de la muestra.

la longitud de onda, la frecuencia o el n´ umero de onda. La ordenada de la representaci´on puede ser el porcentaje de absorci´on ( %), la transmitancia T , la absorbancia, A o el logaritmo de la absorbancia. Es normal que el propio espectrofot´ometro d´e la lectura directamente de A y T( %). Relaci´ on entre Absorbancia y Concentraci´ on: Ley de Beer. Se puede relacionar la absorbancia con la concentraci´ on de analito2 , a trav´es de la denomina ley de Beer: -

A = log p0 p =  · b · C, donde  es la absortividad molar ([] = L/mol ·cm), caracter´ıstica de la sustancia, b es la longitud de camino (tama˜ no de celda) y C la concentraci´ on (figura 6.6). Como se ve, la ley de Beer muestra la relaci´on lineal existente entre la absorbancia y la concentraci´ on de analito. A la hora de medir experimentalmente, el analito estar´a en un recipiente transparente; sin embargo, inevitablemente se producir´ an p´erdidas de la radiaci´ on incidente por absorci´ on y reflexi´ on de la celda (aproximadamente del 8 %). As´ı pues, para compensar estos efectos, la potencia del haz transmitido a trav´es de la celda se compara con la de un haz que atraviesa una celda id´entica con s´olo disolvente. As´ı se redefine la absorbancia como -

A = log p∗0 p , 2

Componente (elemento, compuesto o i´ on) de la muestra de inter´es anal´ıtico.

6.2. ESPECTROSCOP´IA

195

siendo p∗0 la potencia de radiaci´on que atraviesa la celda sin analito. Cuando la disoluci´ on contiene m´ as de una especie absorbente la absorbancia del sistema multicomponente ser´a la suma de las absorbancia de cada componente: AT ot = A1 + A2 + · · · + An = 1 bc1 + 2 bc2 + · · · + n bcn . Hay que se˜ nalar tambi´en que existen limitaciones a la ley de Beer. En primer lugar deja de ser una ley exacta cuando se trata de concentraciones elevadas en las que las perturbaciones sobre una part´ıcula afectan tambi´en a sus vecinas. Tambi´en existen desviaciones de esta ley cuando las especies absorbentes participan en equilibrios que dependen de su concentraci´ on (reacciones de asociaci´on o disociaci´on). Otras desviaciones son debidas al uso de radiaci´ on policrom´ atica que hace que aparezcan absorciones para diferentes longitudes de onda; otras por la presencia de radiaci´ on dispersa producida por el paso a trav´es de las diferentes superficies, filtros y lentes, provocando desviaciones en la longitud de onda y en la cantidad de radiaci´on que atraviesa la muestra. Problema. Una disoluci´on que contiene Bi(III) y tiourea presenta, a 470nm, una absortividad molar de 9, 3 · 103 l · cm−1 · mol−1 . Calcular: 1. La absorbancia que tendr´ a una disoluci´ on 6, 5 · 10−5 M a 470nm en una celda de 5mm de espesor. 2. La transmitancia de la disoluci´ on. 3. La concentraci´ on de una disoluci´ on que presenta una transmitancia del 60 %. Soluci´ on. l · 6, 5 · 10−5 mol 1. A =  · b · C = 9, 3 · 103 cm·mol l · 0, 5cm = 0, 30225.

2. T = 10−A = 0, 4986  50 %. 3. A = − log(0, 6) = 0, 22185; luego la concentraci´ on ser´ a: C=

0, 22185 A = = 4, 77 · 10−5 M. ·b 9, 3 · 103 · 0, 5

´ CAP´ITULO 6. RADIACION

196

6.2.3.

Equipos

Se puede hacer una clasificaci´on general de los instrumentos de espectroscop´ıa seg´ un los elementos que los componen y su finalidad: Espectroscopio. Es un instrumento destinado a identificar elementos en una muestra que se ha excitado con una llama u otro medio (espectroscop´ıa de absorci´on). Consta de un monocromador y un ocular m´ovil en el plano focal de salida. La longitud de onda se determina a partir del a´ngulo de salida del haz. Color´ımetro. Es un instrumento de medida de absorci´on, con el ojo como detector. Para su uso se requieren patrones de comparaci´on. Fot´ ometro. Este instrumento permite la medida cuantitativa de radiaci´on. Se utiliza para absorci´on, emisi´on o fluorescencia (los destinados u ´nicamente a fluorescencia se denominan, a menudo, fluor´ımetros), tanto con infrarrojo, visible o ultravioleta. Utiliza filtros de absorci´on o interferencia para seleccionar la longitud de onda y dispone de un fotodiodo para medir la potencia radiante. Espectr´ ografo. Registra espectros en una placa o pel´ıcula fotogr´afica en el plano focal del monocromador (como se ver´a m´as adelante, es un elemento que permite seleccionar una determinada longitud de onda), apareciendo como conjunto de im´ agenes negras de la rendija de entrada. Se utiliza b´asicamente para an´alisis cualitativo elemental. Espectr´ ometro. Consta de un monocromador con una rendija fija en el plano focal. Cuando va equipado con transductor en la rendija de salida para la medida de la potencia radiante se denomina de forma espec´ıfica espectrofot´ ometro. Adem´as, seg´ un el dise˜ no del instrumento, ´este puede ser de haz simple, de doble haz o multicanal. En el de haz simple un u ´nico haz atraviesa la muestra y llega al detector. La medida de la transmitancia incluye, pues, tres pasos: el ajuste del 0 % de Transmitancia, mediante un obturador entre la fuente y el fotodetector; ajuste del 100 %T , haciendo pasar el haz por el disolvente (sin muestra) y variando la intensidad o amplificaci´ on hasta el valor 100; determinaci´on final de la transmitancia, sustituyendo la celda del disolvente por el de la muestra. Como la se˜ nal es proporcional a la potencia de radiaci´ on absorbida se refiere directamente a %T . Cambiando la escala se puede obtener la

6.2. ESPECTROSCOP´IA

197

Figura 6.7: Esquema de montajes experimentales habituales en espectroscop´ıa. a) Instrumento de haz simple, b) instrumento de doble haz con separaci´ on espacial, c) doble haz con separaci´ on temporal. (De Skoog 1997).

´ CAP´ITULO 6. RADIACION

198

absorbancia. Estos instrumentos deben tener la fuente bien estabilizada para que no existan variaciones en la se˜ nal entre el segundo y tercer paso. El equipo de doble haz utiliza un dispositivo (divisor de haz) para separar los rayos en dos, de modo que unos se hacen pasar por una disoluci´ on de referencia y otros por la muestra; de esta forma ajustando el fotodetector al primer haz se mide el del segundo. Las se˜ nales se amplifican y se determina el cociente de ellas. Otro tipo de equipo de doble haz utiliza un espejo con sectores girado por un motor. Al girar el motor el haz se deja pasar a la muestra o se refleja a la celda de referencia. Las dos se˜ nales se recombinan y se llevan hasta un fotodetector. Mediante una cu˜ na o´ptica se va atenuando la se˜ nal de referencia hasta que se igualen las se˜ nales (mediante un detector de punto cero). La aguja en la cu˜ na permite leer directamente la transmitancia (o absorbancia). Este montaje realiza una separaci´ on temporal del haz, mientras que el anterior realizaba una separaci´on espacial. La ventaja de estos equipos es que compensan las fluctuaciones de la fuente al hacer pasar el mismo haz por la disoluci´on de referencia. El equipo de multicanales utiliza una fuente policrom´ atica sobre la muestra y despu´es se hace pasar el haz por un monocromador de red de difracci´ on. La radiaci´ on dispersada incide en el detector de fila de fotodiodos (compuesto por varios centenares de fotodiodos), de entre 15 y 50 micras de tama˜ no, de modo que se registra en cada diodo una longitud de onda distinta; se obtiene el espectro completo al barrer de forma secuencial toda la salida. Este equipo permite una resoluci´on de 1nm − 2nm, en un tiempo muy corto (del orden de un segundo).

6.2.4.

Componentes B´ asicos

Respecto a los componentes de un equipo de espectroscop´ıa, podemos decir que todos constan de cuatro elementos b´asicos (dispuestos, seg´ un el caso, en distinta configuraci´ on): una fuente de radiaci´ on, un selector de longitudes de onda, un detector y un procesador y lector de la se˜ nal. En la figura 6.7 se muestra el esquema de montaje experimental de las tres configuraciones habituales en espectrocop´ıa: Instrumento de haz simple (a), instrumento de doble haz con separaci´ on espacial (b) e instrumento con doble haz con separaci´on temporal (c). -Fuente de radiaci´ on. Dependiendo del tipo de espectrometr´ıa emitir´a en un rango determinado de longitudes de onda. Pudiendo emitir en continuo o

6.2. ESPECTROSCOP´IA

199

Figura 6.8: Esquema de un filtro de interferencia. Una parte del haz incidente se transmite y otra se refleja en la cara semiespejada. Los rayos que no han salido, despu´es de dos reflexiones, vuelven a la cara semireflejante y, de nuevo, unos atravesar´an el material y otros volver´an a reflejarse, y as´ı sucesivamente. A la salida del material el haz observado ser´a el resultado de la interferencia de los rayos que han sufrido distinto n´ umero de reflexiones. La longitud de onda predominante ser´a la que d´e interferencia constructiva entre todos los rayos (ver la expresi´ on en el texto). en rayas (para la absorci´ on at´ omica y la fluorescencia at´omica) -Selector de longitud de onda. Existen b´ asicamente dos tipos de selectores, los filtros y los monocromadores. Los primeros pueden ser, a su vez, por interferencia o de absorci´on. Los filtros de interferencia est´an constituidos por dos caras semiespejadas en las que se produce interferencia constructiva en la reflexi´on. Si el espaciado entre las caras es igual a la mitad de la longitud de onda deseada (o un m´ ultiplo de ´esta) se reforzar´a dicha longitud de onda, atenu´ andose las dem´as (Fig. 6.8). La interferencia entre los distintos rayos reflejados por la primera y segunda cara espejada ser´ a constructiva cuando se cumpla la condici´ on: 2 · n · d = m · λ, siendo d el espesor, m el orden de la interferencia y n el ´ındice de refracci´ on. Luego la longitud de onda m´ axima vendr´ a dada por

´ CAP´ITULO 6. RADIACION

200

Figura 6.9: Monocromador por red de reflexi´on. En la figura, la longitud de onda λ1 queda seleccionada, mientras que λ2 no sale por la rendija de salida.

λmax =

2·n·d . m

Los filtros de absorci´on est´an constituidos por un material que absorbe una gama de longitudes de onda, dejando pasar otras. Aunque son m´ as baratos, los inconvenientes de estos selectores son la anchura de banda (Δλ) respecto a la longitud de onda nominal y su baja transmitancia. Los monocromadores consisten en redes de reflexi´on o en prismas que producen la dispersi´ on del espectro, de modo que mediante un orificio desplazable en el plano focal de salida se puede seleccionar la longitud de onda deseada. Un esquema de un monocromador por red de reflexi´ on se muestra en la figura 6.9. Cada longitud de onda sale con una determinada orientaci´ on que puede ser seleccionada desplazando la rendija de salida en el plano focal del espejo de salida. Las redes de reflexi´on est´an formadas por superficies espejadas en forma de diente de sierra, formando sus caras un cierto ´angulo. Mediante un espejo c´oncavo se orienta el haz paralelo hacia esta red. Dos rayos paralelos al reflejarse en distintas superficies (en distintos dientes) van a recorrer distinta distancia y, por tanto, van a salir con distinta fase. El resultado de esta interferencia ser´ a la aniquilaci´ on de ciertas longitudes de onda (interferencia destructiva) y la intensificaci´on de otras (como sucede con los filtros de in-

6.2. ESPECTROSCOP´IA

201

Figura 6.10: Interferencia en una red de reflexi´on. La diferencia de camino entre los dos rayos ser´a la distancia recorrida desde que incide el rayo 1 sobre la superficie (AC) hasta que sale reflejado el rayo 2 (BD) y vuelven a ser paralelos. Es decir, la diferencia de camino ser´a AB − CD (ver el desarrollo en el texto).

terferencia). Las longitudes de onda que saldr´ an intensificadas ser´ an las que cumplan que el desfase entre los distintos rayos es un m´ ultiplo entero de dicha longitud de onda, es decir, cuando las ondas salgan completamente en fase. En la figura 6.10 puede verse dos rayos reflejados en distintas superficies. La diferencia de camino entre ambos puede verse (por semejanza de tri´ angulos) que es: AB − CD = d · sin(α) − d · sin(β), donde α es el ´angulo que forma el rayo incidente con la normal a la red, N , y β es el ´angulo que forma el rayo reflejado con dicha normal (seg´ un el convenio ´ de signos habitual en Optica el ´angulo reflejado y el incidente tienen signos opuestos). Para que tenga lugar la interferencia constructiva se debe cumplir que esta diferencia de camino sea un m´ ultiplo entero de longitudes de onda: nλ = |AB − CD| = d (sin(α) + sin(β)) . Para cada ´angulo de incidencia existe un ´angulo de salida para el que una cierta longitud de onda aparece reforzada mientras que las dem´ as quedan atenuadas. De esta manera, mediante otro espejo se focaliza este haz hasta un peque˜ no

202

´ CAP´ITULO 6. RADIACION

Figura 6.11: Montaje con un prisma monocromador. Los rayos que entran desde la rendija de entrada pasan por una lente colimadora que los saca paralelos. Al atravesar el prisma el haz se dispersa produci´endose mayor desviaci´on en los rayos de mayor longitud de onda. Finalmente, una nueva lente focaliza los rayos seleccionados con una determinada longitud de onda en la rendija de salida.

orificio de modo que s´ olo va a poder pasar la longitud de onda deseada (con una cierta anchura de banda). Mediante el prisma tambi´en se consigue una dispersi´on del espectro, de modo que con una lente final se hace focalizar en el orificio de salida, seleccionando as´ı una cierta longitud de onda (como se muestra en la figura 6.11). -Detectores y transductores de radiaci´ on. Seg´ un el tipo de radiaci´ on a la que son sensibles se distinguen dos tipos de detectores: los detectores fot´onicos y los detectores de calor. Los detectores fot´onicos se basan en la interacci´ on de la radiaci´ on con una superficie reactiva que produce fotoemisi´ on, o que eleva los electrones a estados de energ´ıa en los cuales puede conducir electricidad (fotoconducci´ on). Existen varios tipos de detectores fot´onicos: Fototubos. Compuestos por un c´atodo de material fotoemisivo encerrado, junto a un a´nodo, en un tubo sellado de cuarzo; se aplica una tensi´on de unos 90V para acelerar los electrones arrancados. Fotomultiplicador. Similar al anterior pero compuesto por 9 d´ınodos entre los que los electrones se van multiplicando y acelerando en cada etapa hasta alcanzar los 900V . Al multiplicarse el n´ umero de fotones en cada anodo se consiguen entre 106 − 107 electrones/fot´on. Un esquema de un ´ fotomultiplicador se puede ver en la figura 6.12.

6.2. ESPECTROSCOP´IA

203

Figura 6.12: Esquema de un fotomultiplicador. Al incidir un fot´on sobre el fotoc´atodo ´ es acelerado hacia el electrodo positivo (primer d´ınodo). En cada arranca un electr´on. Este etapa, un electr´on choca contra el siguiente d´ınodo arrancando all´ı nuevos electrones. De nuevo, estos electrones son acelerados hacia el siguiente d´ınodo. En la salida se pueden conseguir hasta un mill´on de electrones por fot´on incidente.

Fotodiodo de silicio. Se trata de un diodo de silicio polarizado en sentido inverso de modo que los electrones de UV y VI crean electrones y huecos en la capa vac´ıa, aumentando la conductividad. C´elulas fotovoltaicas o fotoc´elulas. Consiste en un electrodo de Cu o F e con capa de semiconductor, recubierto con oro, plata o plomo como segundo electrodo. La radiaci´ on sobre el semiconductor crea electrones y huecos que migran en sentido contrario, apareciendo una peque˜ na corriente externa. Los detectores de calor se utilizan para la espectrometr´ıa de infrarrojo. Se mide la subida de temperatura de un material ennegrecido, situado en vac´ıo y muy bien aislado (por ello se requiere un riguroso control de la temperatura). El haz procedente de la fuente se corta con un disco rotatorio obteniendo as´ı una se˜ nal alterna, pudi´endose aislar luego de la se˜ nal continua de fondo. La medida de la temperatura puede hacerse por distintos medios: Termopares. Uno o m´ as pares de uniones de dos metales distintos crean una diferencia de potencial que depende de la temperatura.

´ CAP´ITULO 6. RADIACION

204

Termorresistencias o bol´ ometros. Resistencia dependiente de la temperatura, como el platino o algunos semiconductores. Detectores neum´ aticos. Peque˜ na c´amara cil´ındrica con xen´ on con una membrana ennegrecida que absorbe calor; en el otro extremo un diafragma flexible variar´ a seg´ un la temperatura. Detectores piroel´ectricos. Cristales piroel´ectricos compuestos por dos electrodos, uno de ellos transparente a la radiaci´ on IR, cre´andose una diferencia de voltaje entre ellos dependiente de la temperatura.

-Procesadores y medidores de la se˜ nal. Ser´an dispositivos electr´ onicos que amplifican, filtran y procesan la se˜ nal para mostrar finalmente el valor de la medida. Aunque conceptualmente ser´an semejantes a cualquier otro equipo electr´onico de medida, tendr´an la especificidad propia de cada equipo para trabajar con se˜ nales determinadas que necesitan un tratamiento espec´ıfico.

6.2.5.

Espectroscop´ıa de Absorci´ on Molecular

Este tipo de espectroscop´ıa est´a basada en la radiaci´on ultravioleta, visible e infrarroja y se usa mucho en la identificaci´on y determinaci´ on de miles de especies inorg´anicas y org´ anicas. Esta t´ecnica en visible y UV se emplea primariamente en an´ alisis cuantitativo y es probablemente el procedimiento m´ as usado en los laboratorios qu´ımicos y cl´ınicos de todo el mundo. Los espectros de absorci´on UV y visible se obtienen de ordinario con muestras gaseosas del analito o con disoluciones diluidas del analito en un disolvente transparente. La excitaci´ on con radiaci´on visible o UV determina la promoci´on de un electr´ on de un orbital molecular o at´ omico a otro de mayor energ´ıa. Cuando sucede esta transici´on electr´onica se denomina absorci´ on electr´ onica. Las mol´eculas absorben, generalmente, radiaci´on UV o visible en forma de una o m´as bandas de absorci´ on electr´onica, cada una de las cuales consta de un n´ umero muy grande de rayas discretas muy pr´ oximas unas de otras. Cada raya se debe a la transici´ on de un electr´on desde el estado fundamental a uno de los muchos estados de energ´ıa vibracionales y rotacionales asociados con cada estado de energ´ıa electr´onica excitado. Dado que las diferencias de energ´ıa entre estos estados vibracionales o rotacionales var´ıa muy poco, y al gran n´ umero de estos estados posibles, hay un gran n´ umero de rayas contenidas en una banda t´ıpica. Si adem´as hay una interacci´ on, de cierta forma, con las mol´eculas del disolvente, se modifican los niveles vibracionales (Fig. 6.13).

6.2. ESPECTROSCOP´IA

205

Figura 6.13: Transiciones propias de absorci´on molecular. Con IR se producen transiciones rotacionales y vibracionales dentro del mismo nivel electr´onico. Con visible se producen transiciones electr´onicas al siguiente nivel electr´onico. Con UV suceden transiciones electr´onicas a niveles superiores o cuando existen grandes diferencias de energ´ıa entre los niveles.

Los electrones responsables de que las mol´eculas org´anicas absorban UV y visible son los electrones compartidos que participan directamente en enlaces (dobles fundamentalmente) y que est´an asociados a m´as de un a´tomo, y los electrones externos no compartidos, localizados preferentemente en torno a ´ atomos como el ox´ıgeno, hal´ogenos, azufre y nitr´ ogeno. Sin embargo, los enlaces sencillos de carbono-carbono o carbono-hidr´ ogeno corresponden a longitudes de onda de la regi´on ultravioleta de vac´ıo (λ < 180nm) por estar fuertemente sujetos. Los grupos funcionales org´anicos no saturados que absorben en las regiones UV y visibles se llaman crom´ oforos. Experimentalmente se observan grandes absorciones con los denominados complejos de transferencia de carga, presentando absortividades molares mayores que las habituales ( > 10,000). Se origina un espectro de transferencia de carga cuando la absorci´on de un fot´ on ocasiona la tranferencia de un electr´ on desde un ligando al metal, o viceversa, en complejos de metales de transici´ on. El estado excitado es, por tanto, el producto de una especie de proceso interno de oxidaci´on/reducci´ on. Si bien suelen volver a su estado original, tambi´en puede disociarse y producir productos fotoqu´ımicos de oxidaci´on/reducci´on.

´ CAP´ITULO 6. RADIACION

206

6.2.6.

Espectroscop´ıa de Fluorescencia Molecular

La fluorescencia y la fosforescencia son procesos de emisi´on de importancia anal´ıtica, basados en la excitaci´on de ´ atomos o mol´eculas por absorci´on de radiaci´ on electromagn´etica. La especie excitada se relaja despu´es al estado fundamental cediendo el exceso de energ´ıa pero en forma de fotones de mayor longitud de onda. La relajaci´ on consiste en un salto entre un nivel electr´onico excitado y el nivel fundamental, pero a cualquiera de sus estados vibracionales. Este procedimiento se denomina fluorescencia. Lo mismo que las bandas de absorci´ on molecular (proceso inverso) las bandas de fluorescencia molecular constan de multitud de rayas tan pr´ oximas entre s´ı que suelen ser dif´ıcil de umeresolver. La fluorescencia es un fen´omeno que puede durar 10−5 s. El n´ ro de mol´eculas que presentan fluorescencia es relativamente peque˜ no porque se requieren caracter´ısticas estructurales que disminuyan la velocidad de los procesos de relajaci´on no radiante y aumenten la velocidad de relajaci´ on fluorescente. Puede suceder, adem´as, que por motivos estructurales la relajaci´on sea todav´ıa m´as lenta, durando minutos e incluso horas. Cuando ocurre esto se denomina al fen´ omeno fosforescencia. Desde el punto de vista qu´ımico, los compuestos que contienen anillos arom´ aticos son los que suelen presentar una emisi´on de fluorescencia molecular m´as intensa y u ´til. Tambi´en presentan fluorescencia las estructuras de dobles enlaces conjugados o los hidrocarburos arom´ aticos no sustituidos. La sustituci´ on de un anillo arom´atico determina el corrimiento de las longitudes de onda de absorci´ on y cambios correspondientes en los picos de fluorescencia. Experimentalmente se comprueba que la fluorescencia est´a particularmente favorecida por la rigidez de la mol´ecula, ya que disminuye la velocidad de relajaci´ on no radiante. En este mismo sentido, cuando disminuye la temperatura de la muestra disminuye la frecuencia de colisiones, disminuyendo la probabilidad de relajaci´ on vibracional y, por tanto, aumenta la eficiencia de la fluorescencia. Un aumento de la viscosidad del disolvente conduce al mismo resultado.

6.2.7.

Espectroscop´ıa de Infrarrojo

Esta es una de las t´ecnicas m´as eficaces para identificar compuestos org´ anicos e inorg´ anicos puros porque, con la excepci´ on de unas pocas mol´eculas homonucleares (O2 , N2 , Cl2 ) todas las especies moleculares absorben radiaci´on infrarroja. Adem´ as, exceptuando mol´eculas quirales en el estado cristalino, cada especie molecular tiene un u ´ nico espectro de absorci´on de infrarrojo. As´ı,

6.2. ESPECTROSCOP´IA

207

Figura 6.14: Transiciones no radiantes y de fluorescencia. Estas u´ltimas tienen lugar desde el nivel vibracional m´as bajo de un estado electr´ onico excitado.

la coincidencia exacta entre el espectro de un compuesto de estructura conocida y la de un analito identifica a este u ´ltimo de forma inequ´ıvoca. Por otra parte, esta t´ecnica es menos satisfactoria para an´alisis cuantitativos que sus correspondientes UV y VI porque los picos que caracterizan la absorci´on son estrechos y de ordinario no se cumple la Ley de Beer. Los espectros de IR presentan picos de absorci´ on estrechos situados muy cerca unos de otros, que resultan de transiciones entre los niveles cu´anticos vibracionales. El n´ umero de formas en las que puede vibrar una mol´ecula est´a relacionado con el n´ umero de ´atomos y, por tanto, con el n´ umero de enlaces que contiene. Aunque todas las mol´eculas presentan multitud de modos vibracionales, no todos producen picos en IR. Un gran inconveniente de esta t´ecnica es la incertidumbre producida por la radiaci´ on t´ermica del entorno. Para minimizar los efectos de este ruido externo los detectores est´an alojados bajo vac´ıo y se protegen cuidadosamente de su medio ambiente.

´ CAP´ITULO 6. RADIACION

208

6.2.8.

Resonancia Magn´ etica Nuclear

De manera similar a las t´ecnicas anteriormente citadas, la resonancia magn´etica nuclear (RMN) utiliza radiaci´on para producir cierta excitaci´ on en los ´atomos de la muestra a examinar. Sin embargo, esta radiaci´on no se utiliza para alterar la configuraci´ on electr´onica de los ´ atomos, sino que sirve para inducir un cambio en la configuraci´ on del estado de las part´ıculas nucleares del a´tomo. El fundamento de la RMN es la interacci´ on entre los campos magn´eticos nucleares y una radiaci´ on de radiofrecuencia (RF) que hace entrar en resonancia las part´ıculas nucleares. Para comprender esta interacci´on vamos a ver, en primer lugar, las propiedades magn´eticas del n´ ucleo at´omico (haciendo uso de algunos conceptos de Mec´anica Cu´antica, pero sin entrar en demasiado detalle). Las part´ıculas subat´ omicas del n´ ucleo (tambi´en llamados nucleones), protones y neutrones, tienen asociado un momento magn´etico (como si fueran peque˜ nos imanes, que podr´ıa asociarse al campo magn´etico creado por el giro de una part´ıcula cargada) que hace que en presencia de un campo magn´etico ´estas se orienten siguiendo al campo externo. El par´ ametro o n´ umero cu´ antico que sirve para cuantificar este momento magn´etico es el llamado esp´ın (o spin). La Mec´anica Cu´antica nos dice que el momento magn´etico nuclear con esp´ın nuclear I dentro de un campo magn´etico s´olo puede tener un n´ umero determinado de posibles orientaciones, dado por la expresi´on 2I + 1. El n´ umero cu´ antico de esp´ın que define el subnivel es mI y puede valer desde −I hasta +I, en incrementos enteros (es decir, un valor dentro del conjunto {−I, −I + 1, ..., I − 1, I}). De esta forma un n´ ucleo con esp´ın I = 1 tendr´ a 3 posibles orientaciones mI , mientras que uno con esp´ın I = 1/2 tendr´ a dos posibles orientaciones. En ausencia de campo magn´etico externo todas estas posibles orientaciones corresponden al mismo nivel de energ´ıa. Sin embargo, si se aplica un campo magn´etico este nivel energ´etico se separa en 2I +1 subniveles distintos de energ´ıa. El momento magn´etico de un n´ ucleo con esp´ın I, y con una orientaci´on mI es: μ=g

e·h mI = gμN mI , 4πmp

donde g es un valor num´erico, denominado factor de Lande o factor g, propio de cada n´ ucleo (como ejemplo, para el n´ ucleo de hidr´ogeno g = 5, 58 y para el 17 n´ ucleo del O , g = −3, 78), h es la constante de Planck y μN es el denominado magnet´ on nuclear que se define como el momento magn´etico del prot´on de carga e y masa mp , como

6.2. ESPECTROSCOP´IA

μN =

209 e·h = 5, 05 · 10−27 J/T. 4πmp

Tambi´en se puede escribir el momento magn´etico a partir de otra constante que nos va a ser m´as u ´til para describir la resonancia magn´etica: 1 μ = γ · h, 2 donde γ es tambi´en una constante caracter´ıstica de cada n´ ucleo que se denomina relaci´ on giromagn´etica (que para el prot´ on vale 42, 58M Hz/T y para el C 13 vale 10, 71M Hz/T ). Los ´atomos con n´ umero par de nucleones no van a ser susceptibles de producir se˜ nales de resonancia magn´etica porque, en promedio, no presentan momento magn´etico nuclear, es decir, tienen I = 0 y, por tanto, no presentar´ an desdoblamiento de sus niveles de energ´ıa. De los ´atomos con n´ umero 1 13 impar de nucleones, el hidr´ ogeno H y el carbono C son los m´as interesantes desde el punto de visto biol´ ogico. En concreto, el H 1 presente en el agua y grasas del cuerpo (y en la mayor´ıa de las biomol´eculas, y que se estima representa cerca del 80 % de los ´atomos del cuerpo), es el elemento m´as utilizado en la RMN. No obstante, la utilidad anal´ıtica de esta t´ecnica radica en las variaciones del momento magn´etico efectivo del n´ ucleo debido a los electrones pr´ oximos, tanto del propio a´tomo como los de enlace. Esto hace que dependiendo de la localizaci´ on en la mol´ecula y del tipo de enlace que tenga se va a producir un peque˜ no desplazamiento en la relaci´on giromagn´etica, denominado desplazamiento qu´ımico, presentando as´ı diferentes frecuencias de resonancia. Para simplificar, vamos a continuar esta parte centr´ andonos u ´nicamente en la detecci´on de los protones (H 1 ), con esp´ın I = 12 . La energ´ıa asociada a cada subnivel viene dada por la interacci´on de su momento magn´etico con el campo magn´etico externo, B0 , de la forma: 1 Em = −μ · B0 = − γh · B0 . 2 Luego la diferencia de energ´ıa entre dos subniveles ser´a dos veces el incremento de energ´ıa magn´etica del esp´ın, es decir, ΔE = 2μB = γh · B0  1, 76 · 10−7

eV · B(T ), T

(6.3)

Consideremos ahora una muestra en ausencia de campo magn´etico. Como los vectores del momento magn´etico de cada prot´ on tienen una orientaci´ on al

´ CAP´ITULO 6. RADIACION

210

Figura 6.15: Representaci´on de la precesi´on del esp´ın nuclear dentro de un campo magn´etico.

azar, el promedio para el conjunto de todos los protones de la muestra, realizando la suma de todos los vectores, ser´ a nulo, es decir, no presentar´ a momento magn´etico macrosc´ opico (magnetizaci´on nula). Si ahora se coloca la muestra on interactuar´ a con este campo en el seno de un campo magn´etico B0 , cada prot´ tendiendo a alinearse con ´el, produciendo un efecto equivalente a la precesi´ on de una peonza al girar y estar sometida a la fuerza de la gravedad (como se muestra en la figura 6.15). Aparecer´ a una frecuencia de precesi´ on, llamada 3 on: frecuencia de Larmor , ω0 , que est´a dada por la ecuaci´

ω0 = γB0 .

(6.4)

Esta frecuencia de resonancia corresponde a la frecuencia de absorci´on entre los dos subniveles, cuya diferencia de energ´ıa vimos en la ecuaci´on (6.3).

3

Conviene aclarar que habitualmente se representa con el s´ımbolo ω0 aunque no se trata de una frecuencia angular (en rad/s). En la notaci´ on general y de este libro el s´ımbolo para frecuencia es ν0 .

6.2. ESPECTROSCOP´IA

211

Problema. Calcular qu´e campo magn´etico ser´ıa necesario aplicar en una medida de RMN si quisi´eramos crear una diferencia de energ´ıa de 10−6 eV entre los dos estados de esp´ın del n´ ucleo de hidr´ogeno y con qu´e frecuencia habr´ıa que excitar. Soluci´ on. ΔE = 2 · μ · B = 1, 758 · 10−7 eV · B, luego B=

10−6 eV = 5, 69T. 1, 758 · 10−7 eV /T

La frecuencia correspondiente ser´a, seg´ un la relaci´on de Planck: ν=

10−6 eV · 1, 6 · 10−19 J/eV ΔE = = 242 · 106 Hz = 242M Hz. h 6, 62 · 10−34 J · s

Es importante darse cuenta que la frecuencia de Larmor es distinta para cada tipo de n´ ucleo y, por tanto, para un mismo campo externo, la frecuencia de precesi´ on ser´a distinta para n´ ucleos distintos. Esta tendencia a alinearse con el campo va a producir una interacci´on con el campo que se conoce como interacci´on Zeeman. Esta interacci´on va a hacer que exista una diferencia de energ´ıa entre los n´ ucleos alineados paralelos a B0 y aqu´ellos con alineaci´on antiparalela a B0 . En este caso, en presencia de campo, el promedio del momento magn´etico va a dar una contribuci´ on neta en la direcci´ on del campo externo B0 , es decir, la muestra va a presentar una magnetizaci´on neta, M , no nula. Esta magnetizaci´ on va a ser la fuente de se˜ nal para el experimento de resonancia magn´etica. Por tanto, cuanto mayor sea el campo externo, B0 , mayor ser´a la magnetizaci´on y, consecuentemente, mayor ser´a la se˜ nal de resonancia magn´etica. Veamos, a continuaci´on, c´omo se produce la se˜ nal de resonancia magn´etica. En ausencia de campo magn´etico externo los protones, en equilibrio, ocupar´ an el estado de m´ınima energ´ıa (estado fundamental). En presencia de campo magn´etico externo, como existe una peque˜ na diferencia de energ´ıa entre ambos subniveles, una cierta poblaci´on estar´a en el nivel fundamental y otra, menor, en el estado excitado. Esta diferencia de energ´ıa es mucho menor que la energ´ıa t´ermica. Para temperatura ambiente la energ´ıa t´ermica, Et = kB T (donde ahora T es la

212

´ CAP´ITULO 6. RADIACION

Figura 6.16: Al aumentar el campo magn´etico aplicado se incrementa la diferencia de de energ´ıa entre los subniveles nucleares. Por ejemplo, para un campo externo de aproximadamente 7T la diferencia de energ´ıa entre un subnivel con esp´ın alineado paralelamente (α-esp´ın) y otro antiparalelamente (β-esp´ın) corresponde a una frecuencia de 300M Hz.

temperatura), es del orden de 0, 04eV , mientras que para un campo de 1T on la energ´ıa magn´etica ser´a Em  2, 28 · 10−8 eV . La distribuci´on de poblaci´ en los distintos subniveles (es decir, el n´ umero de protones en cada subnivel) sigue la ley de distribuci´on de Boltzmann. Seg´ un esta estad´ıstica, el n´ umero de protones con esp´ın en estado excitado (no alineado con el campo externo), respecto al fundamental (alineado con el campo) ser´ a, para un valor t´ıpico de B = 1T , de: ΔE Nnoalin − ΔE = 1 − 4,4 · 10−6 . = e kB T  1 − Nalin kB T Es decir, que el exceso de protones en el estado alineado (menor energ´ıa) es s´olo de 4 en un mill´ on. Afortunadamente, a pesar de esta fracci´ on tan peque˜ na el n´ umero de protones es tan elevado que se podr´a obtener una se˜ nal medible cuando se produzca la relajaci´ on. Se puede observar que incrementando el valor el campo externo aumentamos las diferencias de energ´ıa entre subniveles y, por tanto, la diferencia

6.2. ESPECTROSCOP´IA

213

de poblaci´on entre ellos. La magnitud de la se˜ nal de RMN es directamente dependiente de esta diferencia de poblaci´ on. Por tanto, para obtener buenas medidas con RMN ser´a fundamental disponer de un campo magn´etico externo muy intenso (m´as adelante veremos c´omo se puede obtener estos campos intensos). La figura 6.16 muestra c´ omo aumenta la diferencia de energ´ıa entre los subniveles al aumentar el campo magn´etico externo,

La manera de producir una se˜ nal detectable que indique la presencia de un prot´ on (o cualquier n´ ucleo con esp´ın nuclear distinto de cero) es inducir, mediante una radiaci´ on con la energ´ıa correspondiente al salto energ´etico entre dichos subniveles, la excitaci´on de los protones en estado fundamental y detectar, posteriormente, la radiaci´on emitida en su proceso de relajaci´ on.

Mediante una radiaci´ on con la energ´ıa correspondiente a la diferencia energ´etica entre estos subniveles (E = hν = 2μB, correspondiente a radiaci´ on de radiofrecuencia) se puede excitar la part´ıcula nuclear cambiando as´ı su polarizaci´on de esp´ın, pasando de tener su momento magn´etico alineado con el campo externo a tenerlo contra-alineado.

En la visi´ on de una part´ıcula precesando alrededor de la direcci´on del campo externo, una perturbaci´ on con una frecuencia igual a la frecuencia de precesi´ on (frecuencia de Larmor) permitir´a que aqu´ella absorba toda la energ´ıa pasando a un estado de mayor energ´ıa. Cu´ anticamente diremos que cuando un fot´ on con frecuencia de Larmor, correspondiente seg´ un la ley de Planck (Ec.(6.2)) a la diferencia de energ´ıa de dos subniveles, interacciona con el prot´ on se induce un salto entre dichos subniveles. Como hay m´as n´ ucleos en el estado de nivel bajo de energ´ıa, habr´ a una absorci´ on neta de radiaci´ on en la muestra.

La frecuencia del pulso de radiofrecuencia (RF) aplicado tendr´ a su m´aximo en la frecuencia ω0 . Cuando esta radiaci´on cesa se producir´a una relajaci´on paulatina ya que termodin´ amicamente es m´as favorable este estado. Si se coloca una bobina conductora perpendicular al plano XY, como antena, se podr´ a detectar el conjunto de se˜ nales de RF emitido por los distintos n´ ucleos de la muestra.

´ CAP´ITULO 6. RADIACION

214

Problema. Calcular el campo magn´etico que ser´ıa necesario aplicar para separar los subniveles de esp´ın nuclear del C 13 la misma cantidad que la separaci´on existente entre los subniveles del H 1 cuando se le somete a un campo de 1T . ¿Qu´e frecuencia debe tener la radiaci´on aplicada para producir la resonancia magn´etica? Soluci´ on. Partiendo de las relaciones giromagn´eticas: γC 13 = 10, 71M Hz/T, γH 1 = 42, 58M Hz/T, podemos escribir el campo magn´etico a partir del cociente entre ambas, de la forma: 1

B=

42, 58 γ 1 h · 1T γ H · 1T ΔE = = H = T = 3, 98T. 13 C γC 13 h γC 13 h 10, 71 γ

Y la frecuencia de la radiaci´on ser´a: ν = ω0 = γB0 = 10, 71

M Hz · 3, 98T = 42, 58M Hz, T

como era de esperar, ya que hemos impuesto que la diferencia de energ´ıa entre los subniveles fuera la misma que para el hidr´ ogeno con un campo de 1T . Para obtener una se˜ nal de RM necesitaremos, en primer lugar, un muestra contenida en un recipiente, generalmente un tubo de vidrio de unas determinadas cualidades y caracter´ısticas; seguidamente necesitaremos un campo magn´etico en el que introducir dicha muestra, es decir un im´ an. Los primeros fueron imanes convencionales (un n´ ucleo de hierro dulce y una bobina enrollada en torno a ´el), pero desde mediados de los 60 se suelen utilizar superconductores que son m´as f´ aciles de fabricar y alcanzan campos mucho m´ as intensos. A continuaci´on, un emisor de radiofrecuencias con el que irradiar dicha muestra y, con el fin de observar si se ha producido absorci´on, necesitaremos tambi´en un receptor (una antena) y un detector de las mismas para comparar dichas radiaciones. Finalmente ser´a necesario un ordenador que convierta las ondas observadas en un espectro de RMN interpretable. Un esquema

´ DE LA RADIACION ´ CON LA MATERIA 6.3. INTERACCION

215

Figura 6.17: Esquema de un sistema de Resonancia Magn´etica Nuclear. La muestra se encuentra rodeada del emisor y detector de radiofrecuencia, y situada entre dos potentes electroimanes. La emisi´on y recepci´ on de la se˜nal est´a controlada por un ordenador que permite obtener directamente el espectro de RMN.

de este tipo de montaje se muestra en la figura 6.17.

6.3.

Interacci´ on de la Radiaci´ on con la Materia

El hecho de que los ´atomos y mol´eculas absorban radiaci´on, adem´ as de permitirnos identificarlos de manera u ´ nica en estudios anal´ıticos, va a tener una repercusi´ on especial en los sistemas vivos. Vamos a ver, a continuaci´on, el efecto directo de la interacci´on con los constituyentes de la materia y, posteriormente, veremos algunos ejemplos concretos del efecto de la radiaci´on sobre algunos sistemas biol´ ogicos.

6.3.1.

´ Efectos de la Interacci´ on de los Fotones con los Atomos y Mol´ eculas

Adem´as de la absorci´on y emisi´on de fotones, existen otros mecanismos de interacci´ on entre los fotones y las part´ıculas materiales. Realmente las interacciones con la materia son fen´omenos muy complejos en los que intervienen tanto las propiedades de las radiaciones como la estructura at´omica y las energ´ıas de ligadura de los nucleones y electrones. Se pueden clasificiar, por sus diferentes consecuencias, tres niveles generales de interacciones: a nivel nuclear (cuando interacciona directamente con los nucleones), a nivel electr´onico de capas profundas y con los electrones de valencia. A nivel nuclear las interacciones son muy complejas y las consecuencias son mucho m´as dr´ asticas, ya que suele conllevar la transformaci´ on del n´ ucleo. Veremos brevemente las interac-

216

´ CAP´ITULO 6. RADIACION

ciones a nivel electr´onico: las interacciones m´as importantes con los electrones profundos son el efecto Compton y el efecto fotoel´ectrico. F´ısicamente, las interacciones con los electrones de valencia dan lugar, entre otros, a dos fen´omenos importantes: la ionizaci´ on y la excitaci´ on asociativa. En ambos procesos se forman radicales libres (iones, mol´eculas o fragmentos moleculares que tienen electrones desapareados) muy energ´eticos. A la radiaci´on que en su interacci´ on con la materia produce la ionizaci´ on de la misma se le denomina radiaci´ on ionizante (aunque este t´ermino engloba, adem´ as, radiaci´on no electromagn´etica como electrones o n´ ucleos at´omicos). Dada la enorme importancia, desde el punto de vista tecnol´ogico, biol´ ogico y m´edico de este tipo de radiaci´ on, vamos a centrarnos en ella en la pr´oxima secci´on. De las interacciones con los electrones de valencia comentaremos algunos ejemplos concretos de inter´es biol´ogico, como el ozono, el fen´ omeno de la visi´on o la fotos´ıntesis. Efecto Fotoel´ ectrico Consiste b´asicamente en la absorci´on de un fot´ on por un a´tomo captando toda su energ´ıa. Como consecuencia de ello un electr´on es arrancado de su capa electr´onica. La diferencia de energ´ıa del fot´ on (E) y la energ´ıa de enlace del electr´on (Wi ) ser´a la energ´ıa cin´etica con la que saldr´a despedido el electr´on (Fig. 6.18 (a)). Su hueco es ocupado en cascada por electrones superiores, dando lugar a fluorescencia de rayos X caracter´ıstica. El efecto fotoel´ectrico s´olo se puede producir con un electr´on de una capa i si E ≥ Wi . Entonces, la ionizaci´ on de la capa i a la que pertenec´ıa el electr´on va seguida de la emisi´on de fotones de fluorescencia. Efecto Compton Esta interacci´ on sucede cuando un fot´ on incidente con energ´ıa E interacciona con un electr´ on de la corteza, arranc´andolo y transfiri´endole una parte de su energ´ıa (Fig. 6.18 (b)). El resultado de la interacci´ on es un incremento de la energ´ıa cin´etica del electr´on y la emisi´on de un fot´ on de menor energ´ıa (fot´ on dispersado). Existen unas expresiones (denominadas relaciones de Compton) que dan cuenta de la relaci´ on entre las energ´ıas del electr´on y la del fot´ on dispersado, y de los ´angulos seg´ un los cuales son emitidos. La energ´ıa transferida variar´ a entre Ec = 0 (choque tangencial) y Ec,max (choque frontal). El exceso de energ´ıa cin´etica captada por el electr´on termina por cederse al ambiente. Este efecto contribuye a la generaci´ on de electrones

´ DE LA RADIACION ´ CON LA MATERIA 6.3. INTERACCION

217

Figura 6.18: Esquema de la interaccin de un fot´on energ´etico con un ´atomo. A la izquierda se muestra el efecto fotoel´ectrico (a) y a la derecha el efecto Compton (b).

secundarios energ´eticos en el seno del material. Cuando los fotones son muy energ´eticos la mayor parte de su energ´ıa es transferida al electr´ on (y finalmente absorbida por el medio); mientras que cuando los fotones son poco energ´eticos la casi totalidad de la energ´ıa se transfiere al fot´on dispersado. Esta interacci´on es proporcional a la densidad del material (realmente a la densidad electr´onica). Ionizaci´ on Es la consecuencia directa de la interacci´on de radiaci´ on con carga, es decir, part´ıculas α (n´ ucleos de Helio) y β (electrones), ya que al acercarse a los electrones sus campos el´ectricos pueden arrancar a los electrones de valencia que son los menos ligados de los ´atomos. L´ogicamente tambi´en quedar´ an ionizados los ´atomos que experimenten el efecto Compton o el efecto fotoel´ectrico ya que normalmente los huecos creados se ir´an rellenando con electrones m´ as externos, en cascada, hasta afectar a los electrones de valencia. Cuando afecta a un electr´ on de una mol´ecula, ´esta se convierte en un radical libre, muy reactivo, produciendo nuevas reacciones qu´ımicas. Un ejemplo importante de las reacciones radiol´ıticas es la ionizaci´on del agua : H2 0 + hν → (H2 O)+ + e− → H + + OH − + e− ,

´ CAP´ITULO 6. RADIACION

218

donde como producto aparece el radical hidroxilo (OH − ) con el electr´on desapareado. Excitaci´ on Disociativa La radiaci´ on con carga puede excitar electrones de los orbitales de valencia, sin llegar a arrancarlos. Este estado excitado puede acabar produciendo la disociaci´ on de enlaces. En el caso del agua tambi´en se puede producir la reacci´on radiol´ıtica por este proceso: H2 O + hν → (H2 O)∗ → H + + OH − . Nuevamente, los radicales hidroxilo y el hidr´ ogeno reactivo dar´ an lugar a una cadena de reacciones con ´atomos o mol´eculas de su entorno. Vamos a ver, a continuaci´on, algunos efectos de la interacci´on de la radiaci´on con los dos medios donde se desarrolla la vida, la atm´osfera y el agua. Despu´es veremos el papel fundamental que tiene la radiaci´on en algunos procesos biol´ogicos, as´ı como un ejemplo en el que se utiliza la radiaci´ on con fines pr´ acticos, para producir alteraciones letales en algunos sistemas vivos. En la secci´on de Radiaciones Ionizantes veremos m´as espec´ıficamente los efectos nocivos de esta radiaci´on que es necesario prevenir porque puede ser especialmente peligrosa para la vida.

6.3.2.

Efectos Fotobiol´ ogicos

Dada la importancia del papel de la radiaci´ on en muchos procesos biol´ ogicos vamos a comentar brevemente algunos ejemplos de c´omo se produce la interacci´ on de la radiaci´ on con algunas mol´eculas biol´ ogicas espec´ıficas, en determinados mecanismos biol´ ogicos. De especial inter´es en Biolog´ıa cabe destacar el proceso de la fotos´ıntesis y la visi´on. Desde el punto de vista de las aplicaciones biom´edicas podemos citar, adem´as, la esterilizaci´on por radiaci´on ultravioleta o el radiodiagn´ ostico (como se comentar´a al final del cap´ıtulo). Muchos procesos biol´ ogicos llevan involucradas reacciones qu´ımicas que tienen como catalizador o como fuente de energ´ıa la absorci´ on de radiaci´ on luminosa (radiaci´ on cuya longitud de onda corresponde al espectro visible). En los procesos fotobiol´ogicos la mol´ecula biol´ ogicamente funcional absorbe un fot´ on para pasar a un estado excitado. En este estado excitado se produce una transformaci´ on qu´ımica (reacci´on fotoqu´ımica). Despu´es de este primer acto fotoqu´ımico las dem´ as reacciones qu´ımicas involucradas se realizan sin luz.

´ DE LA RADIACION ´ CON LA MATERIA 6.3. INTERACCION

219

El Ozono En los or´ıgenes de la Tierra la atm´ osfera no estaba constituida, como en la actualidad, por ox´ıgeno y nitr´ ogeno como componentes m´as abundantes. Las mol´eculas de vapor de agua existentes en la atm´ osfera primitiva eran descompuestas por la radiaci´on ultravioleta muy energ´etica procedente del Sol (no exist´ıa ning´ un tipo de filtro para esta radiaci´ on) en hidr´ ogeno y ox´ıgeno gaseosos: hν

2H2 O −→ 2H2 + O2 . Este ox´ıgeno formado en la descomposici´on del agua junto con el producido en otras reacciones qu´ımicas en la superficie de la Tierra (en la que participaron tambi´en los primeros sistemas vivos que habitaron en esta atm´osfera reductora) fueron creando una atm´ osfera oxidante m´as parecida a la actual. Por otra parte, el ox´ıgeno gaseoso tambi´en se descompone por la acci´on de la radiaci´ on ultravioleta, pero en su recombinaci´on puede unirse con una andose una mol´ecula de ozono (O3 ): mol´ecula de O2 , form´ O2 + hν|λ 100eV ) que son emitidos cuando un n´ ucleo pasa a otro estado de menor energ´ıa, despu´es de haber sido excitado al absorber energ´ıa (aunque tambi´en puede producirse el decaimiento energ´etico por conversi´on interna, es decir, cediendo esta energ´ıa a los electrones orbitales, sin emisi´on de radiaci´ on gamma). Estos rayos son equivalentes a los rayos X, aunque normalmente son m´as energ´eticos; u ´ nicamente difieren en su origen, los rayos gamma son nucleares y los rayos X son orbitales. Son altamente penetrantes pero escasamente ionizantes. Su efecto al interaccionar con la materia depende de su energ´ıa (o lo que es lo mismo de su longitud de onda). Si su energ´ıa es inferior a 100keV , puede interaccionar con un electr´on orbital del a´tomo con el que se encuentre cedi´endole toda su energ´ıa haciendo que ´este salga eyectado a alta velocidad (efecto fotoel´ectrico). Cuando la energ´ıa del fot´ on es mayor que 100keV la interacci´ on dominante es el efecto Compton, dando como resultado, como ya vimos, un electr´on arrancado y un nuevo fot´ on con menor energ´ıa, es decir, con mayor longitud de onda.

6.4.2.

Actividad

En la desintegraci´ on de una sustancia radiactiva se puede definir la tasa de desintegraci´ on (o velocidad de desintegraci´ on) como la masa desintegrada por unidad de tiempo: indicando el n´ umero m´ asico.

6.4. RADIACTIVIDAD

227

Figura 6.23: Poder de penetraci´on de las distintas radiaciones. Las part´ıculas alfa no atraviesan la mano, las part´ıculas beta son frenadas por el alumninio, los rayos X son retenidos por el plomo, mientras que los rayos gamma y los netrones necesitan muros de hormig´on para ser interceptados.

v=−

dM , dt

donde el signo menos indica que la variaci´on de masa es una p´erdida. Cuando esta tasa de desintegraci´on se expresa en t´erminos de n´ umero de desintegraciones por unidad de tiempo se denomina actividad, A, A=

−dN . dt

(6.5)

En este caso N es el n´ umero de is´otopos radiactivos de la muestra. El n´ umero de desintegraciones por unidad de tiempo es proporcional al n´ umero total de is´otopos existentes (antes de desintegrarse), A = λN, y la constante de proporcionalidad, λ, se denomina constante de desintegraci´ on. Sustituyendo ahora en la ecuaci´ on (6.5) resulta dN = −λN. dt La soluci´on de esta ecuaci´on es una exponencial decreciente

´ CAP´ITULO 6. RADIACION

228

Figura 6.24: Representaci´on de Ley de desintegraci´on radiactiva. El tiempo en el que la actividad ha bajado a un 50 % define el per´ıodo de semidesintegraci´ on, τm . En el tiempo −1 1/λ la actividad es un factor e veces la original, es decir, del 36, 8 %. Nt = N0 e−λt , umero de is´otopos en el instante considerado inicial. E igualdonde N0 es el n´ mente, derivando podemos encontrar la evoluci´on de la actividad de una muestra radiactiva At = A0 e−λt , donde A0 es la actividad de una fuente a tiempo cero (t = 0), At es la actividad de la fuente al cabo de un tiempo t, y λ es la constante de desintegraci´on radiactiva de la fuente. Esta constante puede interpretarse, desde el punto de vista estad´ıstico, como la probabilidad que tiene un determinado ´atomo de radiois´otopo de desintegrarse en la unidad de tiempo. Su unidad es, por tanto, la inversa de un tiempo, es decir, de frecuencia. El tiempo que tarda en desintegrarse un n´ ucleo radiactivo es indeterminado, sin embargo, estad´ısticamente podemos definir un tiempo medio de vida, on o simplemente semiτm (tambi´en denominado per´ıodo de semidesintegraci´ per´ıodo) como el tiempo necesario para que su actividad (n´ umero de desintegraciones por unidad de tiempo) decaiga a la mitad, o lo que es lo mismo, que el n´ umero de is´otopos se reduzca a la mitad (como se muestra en la Fig. 6.24).

6.4. RADIACTIVIDAD

229

La relaci´ on entre la constante de desintegraci´on y el tiempo medio de vida se puede obtener a partir de la definici´ on de ´este: A0 e−λτm =

A0 , 2

luego despejando el tiempo medio de vida: τm =

ln2 . λ

Como muestra esta ecuaci´on, este tiempo es otra manera de expresar la constante de desintegraci´ on (caracter´ıstica de cada is´ otopo), independiente de 24 la masa inicial. Por ejemplo, si 1g de N a tarda 14, 9h en reducirse a 0, 5g (per´ıodo de semidesintegraci´on), el mismo tiempo tardar´ a 1mg en reducirse a 0, 5mg. Como se ve, este par´ametro nos sirve para saber cu´anto tiempo tardar´ a la muestra en perder la mayor parte de su actividad. La unidad de actividad radiactiva en el Sistema Internacional es el Becquerel, Bq, que equivale a una desintegraci´on por segundo. Cl´ asicamente se utilizaba como unidad de actividad el Curie, Ci, que es la actividad que presenta 1g de radio y equivale a 3, 7 · 1010 desintegraciones en un segundo (dps). Hay que pensar que cuanto mayor sea el per´ıodo de semidesintegraci´on de un is´otopo menor ser´a su constante de desintegraci´on y, por tanto, ser´a necesaria m´as cantidad de sustancia para tener la misma actividad que otro is´otopo de menor vida media. Por otra parte, conviene dejar claro que no se debe confundir la actividad de una muestra con la energ´ıa de sus radiaciones. La actividad depende de la cantidad de sustancia, a mayor cantidad de is´ otopos mayor n´ umero de desintegraciones por segundo ocurrir´an, sin embargo, la energ´ıa de la emisi´on depende del tipo de radiaci´ on, como veremos a continuaci´on. En el proceso de desintegraci´on un is´ otopo (normalmente se habla de desintegraci´ on de un n´ ucleo porque realmente es ´este el que sufre el proceso de desintegraci´on) emite radiaci´on y queda transformado en otro n´ ucleo distinto, normalmente tambi´en radiactivo. Este nuevo is´ otopo volver´a a desintegrarse (con su particular tiempo de vida medio) produciendo otro is´ otopo distinto, continuando as´ı el proceso hasta que se cree un n´ ucleo estable, no radiactivo. Todos los n´ ucleos radiactivos que proceden de un mismo is´ otopo original forman lo que se denomina serie o cadena radiactiva. As´ı, todos los is´otopos utilizados en aplicaciones pr´ acticas pertenecen a una de las cuatro series conocidas, tres de las cuales existen en la naturaleza desde la formaci´on de la Tierra

´ CAP´ITULO 6. RADIACION

230

(es decir su tiempo de vida media es comparable a la edad de la Tierra). Los n´ ucleos padre de estas cadenas son el T h232 , U 238 , Ac227 y el N p297 . Problema. Calcular el per´ıodo de semidesintegraci´on del N a22 si comparado con una muestra de K 42 presentan la misma actividad cuando la masa de N a22 es 2000 veces mayor que la del K 42 , sabiendo la vida media del K 42 es de 12, 4h. Soluci´ on. Escribimos primero las respectivas actividades en funci´on de sus constantes de desintegraci´ on: AN a = λN a · NN a , AK = λK · NK . Como nos dicen que son iguales, podemos despejar la constante de desintegraci´ on del sodio en funci´ on de la del potasio: AN a = AK −→ λN a · NK = λK · NK , λK . 2000 Escribiendo el per´ıodo de semidesintegraci´on en funci´ on de la constante λ tenemos: λN a =

τ=

ln 2 ln 2 ⇒ τN a = , λ λK

quedando as´ı, el per´ıodo de semidesintegraci´on del sodio en funci´ on del per´ıodo de semidesintegraci´on del potasio: τN a = 2000 · τK = 2000 · 12, 4h = 24,800h  1033d´ıas.

6.4.3.

Detectores de Radiactividad

Vamos a clasificar los instrumentos de detecci´on y medida de las radiaciones emitidas por los radiois´ otopos seg´ un su principio de funcionamiento. Detectores basados en la impresi´ on de placas fotogr´ aficas. Las radiaciones X y γ que son las m´as penetrantes pueden detectarse por su efecto

6.4. RADIACTIVIDAD

231

de ennegrecer placas fotogr´aficas (equivalentemente a como sucede con las pruebas de diagn´ ostico o radiograf´ıas). El grado de ennegrecimiento es proporcional a la dosis de radiaci´on recibida. Los trabajadores que pudieran estar expuestos a este tipo de radiaci´ on portan un dos´ımetro fotogr´ afico constituido por placas fotogr´ aficas recubiertas por distintos materiales (plomo, cobre, aluminio, papel); posteriormente se revelan estas placas y en funci´on del grado de ennegrecimiento se puede calcular la dosis recibida.

Detectores basados en la ionizaci´ on de un gas. Contador de GeigerMuller. Consiste en una c´amara de vac´ıo con un gas inerte y dos electrodos entre los que se aplica una tensi´ on elevada (entre 400V y 1500V ). Una de las caras de la c´ amara permite la entrada de la radiaci´on que al interaccionar con el gas lo ionizar´a con lo que se har´a conductor, produci´endose as´ı un paso de corriente entre los electrodos. La intensidad media de corriente es, en general, proporcional a la intensidad de radiaci´ on que recibe. El problema es que requiere un cierto tiempo para que el gas pase, de nuevo, de su estado ionizado a su estado fundamental (tiempo muerto del contador), por lo que es un inconveniente para medir altas actividades.

Detectores basados en el fen´ omeno de centelleo. Este fen´ omeno consiste en la emisi´on de radiaci´ on electromagn´etica, de longitud de onda pr´ oxima a la visible, por parte de un material luminiscente que absorbe la radiaci´ on incidente. La part´ıcula nuclear cargada o el fot´on de radiaci´ on X o γ cede parte de su energ´ıa al interaccionar con el material. Esta energ´ıa absorbida excita los electrones de valencia a la banda de conducci´ on de la que vuelven a su estado fundamental emitiendo un fot´on de luz (como vimos en el apartado de Fluorescencia). Dependiendo del tipo de radiaci´ on que se quiere detectar se utilizan diversos materiales luminiscentes, por ejemplo, para detectar part´ıculas γ bastan delgadas l´ aminas de sulfuro de cinc activado con plata, o el yoduro de sodio activado con talio para detectar electrones (radiaci´on β) y radiaci´ on gamma. Posteriormente una etapa amplificadora, denominada fotomultiplicadora, similar a la que se explic´ o en los detectores en Espectroscop´ıa, eleva el n´ umero de electrones en el ´anodo para poder ser medido.

´ CAP´ITULO 6. RADIACION

232

6.5.

Radiaciones Ionizantes

Dentro del amplio rango de energ´ıas de las radiaciones relacionadas con la Biolog´ıa, las m´ as energ´eticas son capaces de ionizar la materia, es decir, de arrancar electrones a los ´atomos y, por tanto, alterar los componentes celulares. Los sistemas vivos est´an normalmente expuestos a radiaci´on ionizante procedente del sol y, seg´ un la localizaci´ on, a m´as o menos radiaci´ on procedente de radiactividad natural. Sin embargo, lo que m´ as nos va a interesar aqu´ı, tanto por su utilidad como por los efectos que va a producir en los sistemas biol´ ogicos, son las radiaciones creadas por dispositivos fabricados por el hombre con fines diagn´osticos, con fines terap´euticos o para investigaci´on. Vamos a nombrar los m´as comunes y, posteriormente, veremos m´as en detalles los que consideramos m´as relevantes. Con fines diagn´ osticos podemos clasificarlos en los utilizados para generar im´agenes y los de an´alisis. Con generaci´on de im´ agenes: Radiolog´ıa (rayos X). Tomograf´ıa. Gammagraf´ıa. Y para la realizaci´on de an´alisis: Determinaciones radioisot´opicas (in vitro). Ensayos radioisot´ opicos (in vivo). Con fines terap´euticos podemos citar el tratamiento del hipertiroidismo con yodo, o la radioterapia con cobalto. Antes de comenzar a explicar el fundamento de estos m´etodos, vamos a exponer algunas conceptos b´asicos de radiodosimetr´ıa.

6.5.1.

Radiodosimetr´ıa

Al interaccionar la radiaci´ on ionizante con un sistema viviente produce efectos biol´ogicos negativos como consecuencia de la interacci´on con a´tomos y mol´eculas de alguno de sus o´rganos fundamentales. El efecto producido vendr´ a dado por la cantidad de energ´ıa recibida. Vimos que para medir la energ´ıa recibida por un ser vivo, por unidad de a´rea, se define el concepto de dosis. Para ello se toma como referencia la ionizaci´ on producida en el aire por

6.5. RADIACIONES IONIZANTES

233

radiaci´ on electromagn´etica (rayos X o γ), y se habla de dosis de exposici´ on. Su unidad es el Roentgen, R, que se define como la radiaci´on que produce en su interacci´ on con un cm3 de aire una unidad de carga (de cada signo), en condiciones normales de presi´on y temperatura. En el Sistema Internacional se utiliza el Coulomb/kilogramo, que es la radiaci´ on que produce una carga de 1C en 1kg de aire. La equivalente entre ambas unidades es 1C/kg = 3876R. Se define la dosis de absorci´ on al cociente entre la energ´ıa absorbida y la masa considerada. Su unidad en el Sistema Internacional es Gray, Gy, que representa la absorcion de un julio de radiaci´on gamma por un kilogramo de materia (1J/kg); otra unidad utilizada es el Rad (rad) que equivale a 100ergios/g. La relaci´on entre ambas es: 1Gy = 100rad. Sin embargo, el efecto producido por una radiaci´ on en un sistema depende del tipo de radiaci´ on considerado; por ello es necesario definir un par´ametro que represente el efecto producido por cada radiaci´ on. El factor de calidad, Q o eficacia biol´ ogica relativa es un factor que mide la capacidad de cada radiaci´on para producir un cierto efecto biol´ ogico. As´ı se defini´ o el Rem (rem) como la cantidad de radiaci´ on que produce el mismo efecto que un rad o un cGy (por definici´ on de radiaci´ on gamma). Actualmente, en el Sistema Internacional se ha reemplazado esta unidad por el Sievert, Sv que es la cantidad de radiaci´ on absorbida que produce el mismo efecto que un Gray. 1Sv = 100rem. Ahora bien, una vez definidas las magnitudes relacionadas con la dosis de irradiaci´ on, habr´ a que determinar el efecto que producir´ a una fuente sobre los sistemas vivientes pr´oximos a ella. Como la radiaci´on emitida por una fuente, en principio, saldr´ a en todas las direcciones, para una misma ´area, la dosis recibida decrecer´a con la distancia a la fuente al cuadrado. As´ı, por ejemplo, a una distancia de 10cm la dosis recibida ser´a 100 veces menor que a 1 cm. ua una radiaci´ on Cuando se tiene una poblaci´on celular sobre la que act´ ionizante es interesante conocer la relaci´on entre tasa de supervivencia y dosis recibida. Esta relaci´on representa la fracci´on de c´elulas supervivientes, S, en funci´ on de la dosis, D. El caso m´as sencillo corresponde a virus y bacterias, en el que esta relaci´on es de tipo exponencial decreciente. Si N0 es el n´ umero de

´ CAP´ITULO 6. RADIACION

234

c´elulas supervivientes en un instante inicial, al recibir una dosis D el n´ umero de c´elulas supervivientes pasar´ a a ser N . La tasa de supervivencia ser´ a: S=

N − D = e D0 , N0

(6.6)

donde D0 es una constante que indica la resistencia de tales c´elulas a la radiaci´ on, y se denomina radiosensibilidad. Si se representa en escala semilogar´ıtmica la tasa de supervivencia frente a la dosis, se obtiene una recta cuya pendiente es −1/D0 . Es decir, la tasa de supervivencia decrece m´as deprisa cuanto menor es D0 . En el aparatado de Germicidas (dentro de los Efectos Fotobiol´ ogicos) vimos un ejemplo num´erico del significado esta ley (Ec. (6.6)).

6.5.2.

Coeficiente de Atenuaci´ on

Al incidir radiaci´ on sobre una porci´ on de materia, una parte de los fotones interaccionar´ an directamente con los a´tomos y mol´eculas constituyentes de la misma, mientras que otra parte atravesar´ a la materia sin sufrir ning´ un tipo de interacci´ on. Para expresar qu´e parte de la radiaci´ on incidente va a perderse ´ se define el coeficiente de atenuaci´ on, μ. Este expresa la probabilidad de que un fot´ on incidente experimente alg´ un tipo de interacci´ on con la materia y no salga indemne. El n´ umero de fotones colisionados, Ncol ser´a proporcional al n´ umero de fotones incidente, N0 , y al espesor de la muestra materia, dx: Ncol = −μN0 · dx,

(6.7)

donde μ es el coeficiente lineal de atenuaci´on. El signo menos indica que cada interacci´ on implica un fot´ on incidente menos. Como el n´ umero de fotones que colisionan es igual al n´ umero de fotones desaparecidos se puede escribir la ecuaci´ on (6.7) como dN = −μN · dx. Esta ecuaci´on diferencial tiene como soluci´on una exponencial decreciente de la forma: N = N0 e−μx . El coeficiente μ depende de la naturaleza del medio y de la energ´ıa transportada por los fotones. Su unidad en el Sistema Internacional es el m−1 , aunque suele expresarse en cm−1 .

6.5. RADIACIONES IONIZANTES

6.5.3.

235

Radioqu´ımica

Antes de considerar los efectos de la radiaci´on a nivel celular y sus consecuencias negativas en los organismos vivos, vamos a ver los cambios a nivel qu´ımico producidos por la radiaci´on ionizante. El efecto sobre un sistema biol´ogico puede tener lugar a nivel molecular, bien de forma directa sobre una cierta mol´ecula o de manera indirecta cuando la radiaci´ on produce la radiolisis del agua. Cuando una mol´ecula interacciona con radiaci´ on ionizante puede quedar ionizada (al perder un electr´ on) o excitada (presentando un excedente de energ´ıa). En este caso el exceso de energ´ıa puede ser liberado por emisi´on de fotones (fluorescencia) o por ruptura de un enlace covalente y escisi´on de la mol´ecula en dos radicales (no es necesario que la interacci´ on con la radiaci´on haya sido sobre un electr´ on de ese enlace) En la radiolisis lo que ocurre es que, o bien por ionizaci´ on o bien por excitaci´on, la mol´ecula de agua se escinde en iones y electrones que pueden ser captados por otras mol´eculas. Los electrones que no son captados van perdiendo su energ´ıa cin´etica hasta quedar rodeados de mol´eculas de agua fuertemente polarizadas (reciben el nombre de electrones solvatados). Estos electrones solvatados producen roturas de dobles enlaces con formaci´on de compuestos de adici´ on. Los iones producidos en la hidr´ olisis reaccionar´an con las mol´eculas pr´oximas produciendo hidroxilaci´ on por los radicales OH − o la deshidrogenaci´on por los radicales H + . Efecto de la Radiaci´ on a Nivel Celular El efecto directo de las radiaciones sobre las c´elulas aparece por la ionizaci´on y ruptura de uniones qu´ımicas a nivel molecular, especialmente cuando la mol´ecula afectada, directa o indirectamente, es el ADN. De manera directa la propia radiaci´ on puede romper las mol´eculas de ADN, las prote´ınas o el agua celular form´ andose H2 0+ y OH − . Si por acci´ on directa se rompe la cadena principal de ADN, los fragmentos pueden combinarse con cadenas vecinas form´ andose enlaces transversales que alteran la secuencia nucleot´ıdica del c´odigo gen´etico. De manera indirecta los iones o electrones producidos por la interacci´ on pueden, a su vez, reaccionar con otras mol´eculas produciendo nuevas roturas o ionizaciones. Por ejemplo, los radicales OH − liberados pueden interaccionar con el ADN, oxidando la cadena principal en las uniones pentosafosfato y produciendo su rotura, y destruyendo tambi´en las bases pirim´ıdicas y p´ uricas (A,C,T,G y U).

236

´ CAP´ITULO 6. RADIACION

A nivel celular, los efectos producidos a nivel molecular se traducen en una serie de cambios biol´ogicos que pueden ser, dependiendo de la dosis recibida, muerte celular (inmediata o tras un per´ıodo de latencia, muerte diferida), detenci´on de la divisi´ on celular, alteraciones en la s´ıntesis de ADN (produciendo mitosis anormales, desigualdad en la distribuci´ on de cromosomas, etc.), establecimiento de una mutaci´ on viable, es decir, que produce una alteraci´on gen´etica compatible (aunque desconociendo siempre otras posibles manifestaciones a posteriori), o una cancerificaci´on (en este caso se produce una desdiferenciaci´ on celular y un desarrollo de una l´ınea celular inmortal, lo que implica el car´acter invasivo del desarrollo canceroso). Por otro lado, el efecto sobre las c´elulas depende en gran medida de su estado. La llamada ley de Bergognie y Tribondeau (1906) o ley de radiosensibilidad, establece que la sensibilidad de un tejido es directamente proporcional a su capacidad reproductiva e inversamente proporcional a su grado de diferenciaci´ on. Esto se debe a que durante la mitosis el ADN se encuentra en estado de actividad y, por ello, especialmente sensible a la radiaci´ on. Por otra parte, un menor grado de diferenciaci´ on implica un riesgo a˜ nadido debido a la potencialidad de la c´elula. Efectos Nocivos sobre las Personas Respecto a los efectos biol´ogicos producidos por la radiaci´ on ionizante hay que distinguir entre los producidos por dosis altas y los producidos por sucesivas exposiciones a dosis bajas. Existen estudios realizados a partir de desastres nucleares (como el bombardeo de Hiroshima y Nagasaki, o la destrucci´on de reactores de centrales nucleares, como los de Three Milles Island y Chernobyl) en los que se puede relacionar el efecto directo de estas radiaciones en altas dosis sobre el organismo. Los efectos m´as importantes debidos a una exposici´on a una u ´nica dosis elevada de radiaci´on podemos clasificarlos dentro de unos l´ımites establecidos de radiaci´ on: para dosis superiores a 0, 5Sv aparecen efectos hematol´ogicos leves, para dosis superiores a 1Sv existen cambios hematol´ogicos severos, acompa˜ nados de n´ auseas y v´omitos; para dosis superiores a 2Sv aparecen, adem´as, problemas gastrointestinales severos, ca´ıda del cabello, debilidad, fiebre e, incluso, la muerte entre el 10 y 20 % de los casos; 4Sv es la dosis letal 50, es decir la que provoca la muerte en un 50 % de los casos; 6Sv es la dosis letal, produciendo la muerte de todos los individuos expuestos (con corto per´ıodo de latencia). Sin embargo, para dosis bajas u ´nicamente puede hablarse de efectos es-

6.5. RADIACIONES IONIZANTES

237

toc´asticos, es decir, de la relaci´on entre la dosis recibida y la probabilidad de aparici´ on de efectos biol´ogicos patentes. Entre los m´as importantes y peligrosos destacan los efectos cancer´ıgenos y las mutaciones.

6.5.4.

Exposici´ on a Radiaci´ on Ionizante

Exposici´ on a Fuentes Naturales de Radiaci´ on En la propia naturaleza existen numerosas fuentes de radiactividad que hace que estemos continuamente expuestos a radiaci´on. Estas fuentes se encuentran en ciertos materiales geol´ogicos del suelo, en el agua y en el aire, de modo que finalmente todas las plantas y animales tienen incorporado a su organismo elementos radiactivos. Aunque la radiaci´on emitida por estas fuentes es muy peque˜ na, las mayores cantidades proceden del suelo y del aire (incluyendo la radiaci´ on c´ osmica). En el caso de la radiaci´ on c´ osmica la dosis media recibida depende mucho de la altitud, pudiendo ser m´ as de cien veces superior en la cima de una monta˜ na que a nivel del mar, presentando un valor medio de 0, 35mSv/a˜ no. En el aire tambi´en existen peque˜ nas cantidades de rad´on, gas procedente de la descomposici´on del radio y del torio, que inhalamos continuamente y que se traduce en una dosis media anual de aproximadamente 1, 25mSV /a˜ no, dependiendo de las caracter´ısticas geol´ogicas del suelo. Por simple incorporaci´ on de is´otopos al organismo estamos expuestos a unos 0, 3mSv/a˜ no, y a 0, 45mSv/a˜ no por radiaci´ on del suelo. Es decir, como promedio el 15 % de la dosis recibida se debe a la radiaci´on c´ osmica, el 20 % a la radiaci´ on terrestre, el 15 % al propio organismo y el 50 % al rad´on. En total, procedente de fuentes naturales de radiactividad, estamos expuestos a una dosis media5 (variando mucho de unas zonas a otras) de unos 2, 4mSv/a˜ no. Exposici´ on a Fuentes Artificiales de Radiaci´ on Se consideran fuentes artificiales a aquellas de origen no naturales, como puedan ser las emitidas por la televisi´ on, las esferas luminosas de los relojes, los viajes en avi´on (debido a la mayor radiaci´ on c´ osmica recibida durante el vuelo a gran altura), el poso radiactivo procedente de las explosiones nucleares en la atm´ osfera que tuvieron lugar en el pasado, las emisiones de las centrales t´ermicas de carb´on (los humos contienen is´otopos radiactivos), las centrales nucleares o las exploraciones radiol´ogicas con fines m´edicos. De todas ellas, la principal fuente de irradiaci´ on son las exploraciones radiol´ogicas, que en los pa´ıses desarrollados dan lugar a unas dosis equivalentes a la radiaci´on c´ osmica. 5

Fuente: Foro Nuclear 2006.

238

´ CAP´ITULO 6. RADIACION

Figura 6.25: Dosis medias anuales de radiaci´on recibidas por una persona (De Consejo de Seguridad Nuclear, 2006).

Respecto a las dosis recibidas en aplicaciones m´edicas podemos mencionar las tres fuentes principales: el radiodiagn´ostico, la Medicina Nuclear y la radioterapia. En radiodiagn´ ostico las mayores dosis recibidas proceden de exploraciones con rayos X. No obstante, la cantidad recibida depende del tipo de exploraci´ on y del estado del equipo. Por ejemplo, en una radiograf´ıa de t´orax se recibe una dosis de 0, 05mSv, mientras que en una tomograf´ıa computerizada de regi´ on lumbar la dosis es de 6mSv. La dosis media recibida en pa´ıses desarrollados por este tipo de exploraciones es de unos 0, 5mSv/a˜ no − 1mSv/a˜ no. Como veremos m´as adelante, en Medicina Nuclear la radiaci´ on utilizada en resonancia magn´etica nuclear es mucho menos energ´etica, contribuyendo con dosis menores. La otra fuente importante de radiaci´ on en Medicina es la radioterapia pero dada su especificidad y localizaci´ on de la zona a tratar la dosis no sobrepasa los 10mSv/a˜ no. En total, la dosis media absorbida por una persona debido a fuentes artificiales no suele alcanzar 1mSv/a˜ no. Un resumen de las cantidades medias de radiaci´on recibidas por el hombre al a˜ no se representan en la figura 6.25. Dosis M´ aximas Permisibles Hay que tener en cuenta que las sucesivas dosis absorbidas por una persona tiene efecto acumulativo, es decir, a lo largo del tiempo van sumando sus efectos.

´ 6.6. APLICACIONES MEDICAS

239

La Comisi´ on Internacional de Protecci´ on Radiol´ogica (ICRP) ha establecido los l´ımites m´aximos de dosis que pueden recibir personas que se exponen a radiaci´ on ionizante por motivos laborales, as´ı como para el p´ ublico en general, con el fin de evitar riesgos biol´ogicos directos y posibles da˜ nos gen´eticos. El l´ımite m´aximo de dosis radiol´ogica efectiva fijado por la Uni´ on Europea para el p´ ublico general es de 1mSv/a˜ no, pero para ciertas regiones del cuerpo es sensiblemente superior, como en manos y pies, que es de 50mSv/a˜ no. Para los trabajadores profesionalmente expuestos (que trabajan con este tipo de material) la dosis efectiva m´axima es de 20mSv/a˜ no (100mSv de promedio en 5 a˜ nos).

6.6.

Aplicaciones M´ edicas

Dentro de las diversas aplicaciones diagn´osticas de los radiois´otopos en la Medicina, vamos a hacer una clasificaci´on b´ asica para abordar cada uno de los tipos por separado: el diagn´ ostico por im´agenes y t´ecnicas de an´alisis. La Medicina Nuclear es la especialidad de la Medicina que utiliza radiaciones ionizantes procedentes de radiois´otopos o radionucleidos para la realizaci´on de estudios morfol´ogicos y funcionales de algunos ´organos, as´ı como para realizar determinaciones cuantitativas (radioan´alisis) de numerosas sustancias contenidas en el organismo.

6.6.1.

Determinaciones Cuantitativas

Existen diversos m´etodos de determinaci´ on y cuantificaci´ on de determinados agentes o sustancias biol´ ogicas u ´tiles para realizar ciertos diagn´osticos, basados en la incorporaci´on de un trazador radiactivo. Este trazador consiste b´ asicamente en una sustancia radiactiva que se introduce en el sistema (sin afectar al sistema) y tiene que tener id´enticas caracter´ısticas fisico-qu´ımicas y biol´ ogicas que la sustancia a determinar. Radioinmunoan´ alisis (in vitro) Es un m´etodo de determinaci´on cuantitativa de sustancias biol´ ogicas con una gran sensibilidad, lo que permite detectar y cuantificar numerosas sustancias que est´an en cantidades muy peque˜ nas en sangre u orina y que son muy dif´ıciles de detectar por medios anal´ıticos convencionales. Se basa en la uni´on ant´ıgeno-anticuerpo, en el que se ha marcado uno de estos dos elementos con un is´ otopo radiactivo, generalmente I 125 . Consiste en introducir la mol´ecula

240

´ CAP´ITULO 6. RADIACION

que se quiere cuantificar a la que se le ha a˜ nadido un marcador radiactivo. Si la mol´ecula receptora est´a en concentraci´on inferior a la marcada, existir´ a una competencia entre las mol´eculas marcadas y las originales hasta alcanzar un equilibrio. Posteriormente se separan las mol´eculas marcadas libres de las que se han acoplado al receptor y se calcula la relaci´on entre ambas concentraciones. Si conocemos previamente la relaci´on existente entre dicho cociente de concentraciones en funci´on de la concentraci´ on de la mol´ecula original, bastar´ a con interpolar en dicha curva de calibraci´ on para el valor del cociente medido. Se denomina radioinmunoensayo porque la mol´ecula receptora es un anticuerpo contra la sustancia a determinar, y la sustancia a determinar act´ ua como ant´ıgeno. Por este m´etodo se cuantifican, especialmente diversas hormonas como T3, T4, TSH, FSH, e incluso vitaminas y algunas drogas. Estudios Metab´ olicos (in vivo) Para la realizaci´ on de estos estudios se le suministra al paciente una peque˜ na cantidad de sustancia radiactiva, denominada radiof´ armaco (puede ser por diferentes v´ıas, intravenosa, digestiva, inhalaci´ on, etc.). Estas sustancias por su especial afinidad, se fijan en el o´rgano que se desea estudiar emitiendo radiaci´ on gamma que es detectada. La elecci´on del radionucleido depender´ a del tiempo de semidesintegraci´on m´ as adecuado para la prueba a realizar. Existen diversas aplicaciones de los trazadores radiactivos para realizar estudios metab´olicos. Uno de las m´as comunes es el estudio de la funcionalidad on de I 131 por la gl´ andula de la gl´andula tiroidea utilizando I 131 . La captaci´ tiroidea se realiza con una peque˜ na dosis (50mCi − 100mCi) de I 131 administrada por v´ıa oral. Con un simple contador de centelleo colocado sobre el cuello del paciente en distintos per´ıodos de tiempo se puede obtener la curva de captaci´on del yodo, lo que dar´a informaci´on de la actividad funcional de dicho o´rgano. Como la avidez del tiroides por el yodo mide la actividad funcional de esta gl´andula, la curva de fijaci´ on de I 131 en el tiroides nos dar´a la informaci´ on que buscamos. En la figura 6.26 se muestra la curva de fijaci´ on del yodo en los primeros d´ıas para distintos pacientes: cuando el paciente presenta hipertiroidismo se produce una gran absorci´on de yodo inicial que decae a partir de medio d´ıa, mientras que en un paciente hipotiroideo la fijaci´ on de I 131 es m´ınima. Las ventajas fundamentales de los m´etodos exploratorios de la Medicina Nuclear son el no ser peligrosos ni molestos para el paciente, y el tener efectos secundarios m´ınimos, ya que la dosis recibida es igual o menor a los estudios

´ 6.6. APLICACIONES MEDICAS

241

Figura 6.26: Curva de fijaci´on del yodo en las tiroides en distintos pacientes. (De Dutreix, 1980).

radiol´ ogicos habituales.

6.6.2.

Diagn´ ostico por Im´ agenes

Gracias al empleo de radiaciones penetrantes la Medicina ha logrado grandes avances en casi todos sus campos. La posibilidad de “ver” el interior del cuerpo humano para poder realizar diagn´ osticos o realizar intervenciones m´as precisas y menos invasivas ha sido fundamental para campos como la traumatolog´ıa o la cirug´ıa y tiene especial importancia en el diagn´ostico, localizaci´on y tratamiento del c´ancer. Hay que a˜ nadir que la obtenci´ on real de im´agenes de cavidades internas se puede conseguir hoy en d´ıa introduciendo microc´ amaras por alg´ un conducto corporal, pero lo que no se podr´ a recoger nunca con luz visible es el interior de cuerpos opacos (la imagen representada de cuerpos opacos se crea a partir de informaci´on obtenida por otros medios distintos del habitual de sensibilizaci´on con luz visible). Dentro de los diversos dispositivos que permiten esa “visi´ on” interior de los organismos podemos clasificarlos en cuatro grandes grupos en funci´ on del principio f´ısico y el tipo de radiaci´on empleado para interaccionar con el organismo y generar la se˜ nal de salida: radiolog´ıa, tomograf´ıa, gammagraf´ıa y resonancia magn´etica. Hay que se˜ nalar que la Resonancia Magn´etica Nuclear era una t´ecnica de an´alisis antes de convertirse en una herramienta tan potente en el diagn´ ostico por im´agenes, sin embargo, dada la gran importancia que tiene este campo la hemos incluido tambi´en en el segundo apartado.

´ CAP´ITULO 6. RADIACION

242 Radiolog´ıa

En 1895 Roentgen descubri´ o una nueva radiaci´on que pod´ıa atravesar la materia y sensibilizar material fotogr´afico. Esa gran inc´ ognita que supon´ıa el desconocimiento de esa radiaci´on le hizo llamarla radiaci´on X. Actualmente se denomina radiaci´ on X o radiaci´ on Roentgen a la radiaci´on electromagn´etica cuyo rango de longitudes de onda va entre los 80nm y 10−5 nm aproximadamente, y dentro del espectro electromagn´etico se localiza entre el ultravioleta y la radiaci´ on gamma. Dentro del amplio rango de longitudes de onda (o frecuencias) se subdividen, desde el punto de vista m´edico, en dos tipos: rayos X duros y rayos X blandos. Los primeros son m´as penetrantes y, por tanto, m´as peligrosos; los blandos producen im´ agenes menos n´ıtidas pero son menos peligrosos. Vamos a ver, a continuaci´on, el fundamento de un dispositivo generador de im´agenes por rayos X. El elemento central es el generador de los rayos X ´ (Fig. 6.27). Este consta de un electrodo que al ponerse incandescente por el paso de una corriente el´ectrica emite electrones (la emisi´on se puede controlar regulando la temperatura del metal emisor). Estos electrones emitidos son dirigidos y acelerados aplicando un potencial entre el emisor (c´atodo) y un electrodo positivo (´anodo o antic´atodo). La energ´ıa cin´etica de los electrones es proporcional al potencial aplicado. Cuando los electrones alcanzan el ´anodo colisionan con los ´atomos de ´estos emitiendo dos tipos de radiaci´ on: por un lado, al frenarse los electrones cuando se aproximan a un n´ ucleo at´omico emiten fotones (por conservaci´on de energ´ıa) que se denomina radiaci´ on de frenado, siendo su energ´ıa cin´etica, Ec = ΔV qe , donde ΔV es el potencial aplicado entre c´atodo y ´anodo y qe es la carga del electr´on. Como la variaci´ on de energ´ıa de estos electrones puede tomar cualquier valor menor que su energ´ıa cin´etica inicial, el conjunto de las longitudes de onda emitidas constituyen un espectro continuo de radiaci´ on. Por otra parte, si al colisionar con los ´atomos del ´anodo consiguen arrancar un electr´ on, el hueco dejado por ´este ser´a ocupado por un electr´on de un nivel superior (con mayor energ´ıa). En este salto de nivel emitir´a un fot´ on cuya energ´ıa corresponder´a justamente con la diferencia de energ´ıa entre ambos niveles. La longitud de onda del fot´ on emitido corresponde al rango de los rayos X. Estos rayos X tienen una longitud de onda caracter´ıstica para cada salto de nivel constituyendo un espectro discontinuo (caracter´ıstico para cada

´ 6.6. APLICACIONES MEDICAS

243

Figura 6.27: Esquema de un emisor de rayos X. Los electrones emitidos por el c´atodo son acelerados por un potencial elevado para hacerlos colisionar con el antic´atodo.

material). La mayor´ıa de la radiaci´ on X utilizada en la obtenci´on de im´ agenes es radiaci´on de frenado; el resto procede del espectro caracter´ıstico del ´anodo. Hay que tener en cuenta, sin embargo, que s´olo una m´ınima parte de los electrones emitidos por el c´atodo (1 %) dan como resultado la emisi´on de un fot´ on, de modo que la gran mayor´ıa de la energ´ıa cin´etica de los electrones se transforma en calor al alcanzar el ´anodo, por lo que se requiere un buen sistema adicional de dispersi´ on del calor. Esta es la raz´on por la que el material utilizado en la fabricaci´ on de estos electrodos es el tungsteno, por su elevado punto de fusi´ on y su elevada difusi´ on t´ermica.

Problema. ¿C´omo podemos conseguir rayos X m´as duros para hacer un radiodiagn´ ostico de una regi´on menos sensible? Soluci´ on. Aumentando el potencial de la fuente, entre c´atodo y ´anodo, para incrementar la energ´ıa cin´etica de los electrones arrancados del c´atodo.

El radiodiagn´ ostico se basa en la diferente absorci´on de los rayos X que presentan los distintos tejidos del cuerpo. La imagen se consigue al situar al

´ CAP´ITULO 6. RADIACION

244

paciente entre el emisor de rayos X y una pel´ıcula radiogr´afica. Para interpretar la imagen hay que tener en cuenta que est´ a constituida por las sombras proyectadas por los distintos o´rganos y estructuras que atraviesa la radiaci´ on. Un tejido que absorba mucho esta radiaci´on proyectar´a una sombra m´as oscura. El contraste est´a directamente relacionado con la diferencia entre los coeficientes de atenuaci´on de los tejidos atravesados. Si se tienen dos materiales de distinto coeficiente de atenuaci´ on, μ1 y μ2 y del mismo espesor, x, la exposici´ on (radiaci´ on saliente que sensibiliza la pel´ıcula radiol´ ogica) ser´a: X1 = X0 e−μ1 x , = X0 e−μ2 x ,

X2

donde X0 es la radiaci´ on entrante y X1,2 la radiaci´ on saliente. Cuando el espesor es peque˜ no la exponencial se puede aproximar hasta primer orden en la serie de potencias, quedando la exposici´on como una funci´ on lineal del espesor: X2  X0 (1 − μ1 x), X2

 X0 (1 − μ2 x).

El contraste de la imagen radiante (se transforma en imagen luminosa al sensibilizar el material radiol´ogico) se define como: X2 − X1 . X2 + X1 Y si el espesor es peque˜ no se puede aproximar a C=

1 (μ1 − μ2 )x. 2 Vemos, pues, que el contraste radiol´ogico depende directamente de la diferencia de los coeficientes lineales de atenuaci´ on, y ´estos, a su vez, dependen de la naturaleza del medio y de la energ´ıa transportada por la radiaci´ on. Como se ve en la figura 6.28, el coeficiente disminuye al aumentar la energ´ıa del haz (notar la escala logar´ıtmica en el eje de ordenadas). Por ejemplo, para obtener buen contraste entre la grasa y el m´ usculo es necesario emplear tensiones bajas (entre 20kV y 30kV en mamograf´ıa). Sin embargo, tampoco se puede disminuir mucho la energ´ıa de la radiaci´ on porque en ese caso habr´ıa una fuerte absorci´on y, por tanto, muy poca sensibilizaci´ on del material radiol´ ogico. C=

´ 6.6. APLICACIONES MEDICAS

245

Problema. Calcular el contraste radiol´ogico entre dos tejidos de coeficientes lineales de as de un medio de atenuaci´on μ1 y μ2 y espesor x, que est´an situados detr´ coeficiente μm y espesor y. Soluci´ on. La atenuaci´on producida por este medio ser´ a: X0 − X0 = e−μm y , luego las exposiciones van a ser ahora: X1  X0 (1 − μ1 x) y

X2  X0 (1 − μ2 x).

Por lo que el contraste ser´ a ahora: C =

X2 − X1 X2 − X1 = =C   X2 + X1 X2 + X1

Luego, te´oricamente, el contraste no se ver´a afectado.

Hay que tener en cuenta, adem´as, que la imagen final es la sombra total generada por las distintas atenuaciones producidas por los sucesivos o´rganos o estructuras que ha ido atravesando la radiaci´on, es decir, nos da en una imagen la superposici´on de las im´agenes (imagen integrada) producidas por todos los tejidos situados a lo largo de la propagaci´ on del haz. Es por ello que el “visionado” (interpretaci´on) de una imagen radiol´ ogica debe hacerse por personal cualificado y experimentado que pueda discernir entre una patolog´ıa o un da˜ no y una sombra producida por otro o´rgano. Como variedades a la radiolog´ıa convencional existen la radioscop´ıa, en la que la imagen producida por la radiaci´ on que atraviesa al paciente no es recogida en una pel´ıcula radiogr´ afica que posteriormente hay que revelar, sino que directamente se proyecta en una pantalla fluorescente que emite luz visible al incidirle radiaci´ on X. Con esta t´ecnica se puede visualizar una secuencia continua de im´agenes en forma de v´ıdeo para apreciar movimientos de algunas v´ısceras, m´ usculos o articulaciones. Otra variedad es la radiograf´ıa con contraste. Consiste en la incorporaci´on

246

´ CAP´ITULO 6. RADIACION

Figura 6.28: Absorci´on de rayos X por distintos o´rganos del cuerpo. (De Dutreix, 1980). al torrente sangu´ıneo de un radiois´ otopo (normalmente una sustancia yodada) por medio de un cat´eter. La emisi´on de radiaci´ on desde el interior del organismo es recogida en una placa exterior pr´ oxima al paciente (en este caso act´ ua como emisor). Permite visualizar la circulaci´ on sangu´ınea para detectar malformaciones vasculares, enfermedades arteriales oclusivas, aneurismas, etc. Al tratarse de un m´etodo invasivo de diagn´ ostico presenta ciertos riesgos. Tomograf´ıa Hemos visto que la radiograf´ıa consist´ıa en una imagen integrada de todos los tejidos que atravesaba la radiaci´on. La obtenci´ on de una imagen de u ´nicamente uno de los planos atravesados permite una visi´on m´ as n´ıtida de un tejido, sin interferencia de los tejidos anteriores y posteriores. Esto se consigue con la t´ecnica de la tomograf´ıa (del griego tomos=corte y grafos=escritura, imagen). Esta t´ecnica consiste en realizar una secuencia de im´agenes obtenidas al mover s´ıncronamente, respecto a la zona a explorar, el emisor y la placa en sentido opuesto (Fig. 6.29). De esta forma las im´agenes de la zona enfocada se superpondr´an mientras que los planos restantes ir´an perdiendo definici´ on. Una variedad de esta t´ecnica que ha supuesto un avance revolucionario es la tomograf´ıa axial computerizada. Con esta t´ecnica, ayudado por un ordenador (de ah´ı el nombre que recibe), se puede reconstruir con gran detalle cada uno

´ 6.6. APLICACIONES MEDICAS

247

Figura 6.29: Esquema de la obtenci´on de im´agenes por tomograf´ıa axial computerizada. Se van adquiriendo im´agenes seg´un va girando el emisor de radiaci´on alrededor del objeto. Posteriormente se reconstruye la imagen a partir de todas las proyecciones obtenidas.

de los ´organos y estructuras internos. En esta t´ecnica u ´ nicamente se enfoca la salida del emisor (utilizando un haz colimado de radiaci´on) para radiar un plano (o rodaja) en el que se encuentre la zona de inter´es. El emisor va a girar entorno a un eje vertical que pasa por la regi´ on de inter´es y la imagen se va a recoger a lo largo de una cadena de receptores (fototubos) en configuraci´on semicircular para ir registrando seg´ un va girando el emisor. La base de la tomograf´ıa axial computerizada es la reconstrucci´on por ordenador de la imagen interior (del plano irradiado) a partir del conjunto de sombras que se han ido recogiendo a medida que el emisor va girando entorno al paciente. Los rayos emergentes son recogidos en los fototubos y convertidos en se˜ nal el´ectrica para posteriormente ser digitalizada y almacenada en el ordenador. Los datos recogidos por los detectores se procesan mediante algoritmos complejos, teniendo en cuenta la radiaci´on inicial, obteniendo como resultado valores de coeficientes de atenuaci´on de la radiaci´ on para cada punto (cada punto de una imagen digitalizada se denomina p´ıxel). El fundamento de la reconstrucci´ on de la imagen es el an´alisis de las sombras proyectadas en los distintos detectores al incidir los rayos desde distintas direcciones. Si en un punto del detector aparece una sombra significa que el rayo que deber´ıa haber incidido en dicho punto ha sido absorbido por alg´ un tejido en su trayectoria.

248

´ CAP´ITULO 6. RADIACION

A partir de los datos de todas las sombras en los distintos detectores y mediante algoritmos matem´aticos puede localizarse exactamente los puntos, en cada plano de estudio, de mayor y menor absorci´ on, lo que podr´ a identificarse posteriormente con los distintos ´organos y tejidos. Asociando para el rango de valores de coeficientes una escala de grises (se asocia el valor m´as peque˜ no para el coeficiente de m´ınima absorci´on, o sea, el aire y el valor m´aximo para el coeficiente de m´axima absorci´on, el metal), se representa la imagen bidimensional en blanco y negro de la rodaja procesada. La imagen aparecer´a m´as n´ıtida cuanto mayor sea el rango de la escala de grises (m´as continua ser´a la transici´on de un tono de gris al siguiente) y, por tanto, cuanto mayor sea la precisi´on con la que se obtienen los coeficientes para cada p´ıxel. A la hora de realizar un estudio concreto de una zona es m´ as u ´til variar la escala de grises de la imagen digitalizada, de manera que puede mostrarse u ´ nicamente los valores de alta absorci´on, potenciando as´ı la visualizaci´on de las zonas m´as densas como los huesos, o los de baja absorci´on, haciendo m´ as patentes las partes m´as blandas, o cualquier otra combinaci´ on que nos permita visualizar de la mejor manera posible la estructura que nos interese (variando el valor central de la escala de grises -centro de la ventana- y su rango -amplitud de la ventana-). Si tenemos en cuenta ahora que la rodaja tiene un cierto espesor (si al p´ıxel le a˜ nadimos la dimensi´on de profundidad obtenemos un prisma denominado v´ oxel) correspondiente a la anchura del haz colimado utilizado en la exploraci´ on podemos representar esa imagen bidimensional como una rodaja tridimensional de espesor constante. Como toda la informaci´on se guarda en el ordenador, a partir de las sucesivas rodajas se puede reconstruir una imagen tridimensional que puede ser manipulada inform´ aticamente como si se tratase de un objeto real tridimensional. Uno de los pocos inconvenientes es que como se realizan varias exposiciones para cada plano y esto se repite para cada plano la cantidad de radiaci´ on a la que se ve expuesto el paciente es mucho mayor (l´ogicamente est´a relacionado de manera directa con la informaci´ on que se obtiene). Gammagraf´ıa Es una t´ecnica que permite visualizar la distribuci´on de un radiois´ otopo en un o´rgano, generando una imagen bidimensional de la distribuci´ on en dicho ´organo. Sin embargo, se trata de una t´ecnica invasiva, en la que al paciente hay que inyectarle el radiois´ otopo (radiof´ armaco) que emite radiaci´on gamma. Se trata de obtener informaci´ on a partir de la detecci´on de esta radiaci´ on cuan-

´ 6.6. APLICACIONES MEDICAS

249

do sale del cuerpo. Para ello se utiliza una c´ amara gamma que contiene unos cristales detectores que convierten los fotones emergentes en se˜ nales el´ectricas (a partir de un fotomultiplicador). Adem´as, entre el paciente y el cristal se coloca una plancha de plomo con perforaciones que hace de colimador y atenuador de la radiaci´ on secundaria. Las se˜ nales el´ectricas generadas por cada detector proporcionan la informaci´ on para cada punto del plano explorado. El dispositivo con los detectores (gammac´ amara) se desplaza lentamente respecto al paciente de modo que puede recogerse la informaci´ on del plano deseado. Estas se˜ nales analizadas y procesadas permiten generar im´agenes virtuales de la regi´ on analizadas. Las principales estudios imagenol´ogicos derivados de la gammagraf´ıa son la gammagraf´ıa o´sea (que permite detectar y evaluar ´areas de aumento o disminuci´ on del metabolismo ´oseo, relacionados en cada caso con tumores metast´aticos, osteoporosis, fracturas, etc.), la gammagraf´ıa pulmonar de ventilaci´on-perfusi´ on (procedimiento compuestos por dos gammagraf´ıas, una para medir la ventilaci´on a partir de un radiois´ otopo inhalado y otra para ver la circulaci´ on en todas las a´reas de los pulmones), la gammagraf´ıa de la tiroides o la gammagraf´ıa de cr´ aneo, que va asociada a una tomograf´ıa axial computerizada. Im´ agenes por Resonancia Magn´ etica Aunque casi todas las t´ecnicas de diagn´ ostico por im´agenes utilizan radiaciones ionizantes, hay que hacer notar que las im´ agenes por Resonancia Magn´etica (RM) u ´ nicamente utilizan radiaci´on de radiofrecuencia. Esta radiaci´ on tiene una longitud de onda del orden de las se˜ nales de TV y radio, que no es ionizante, y que es aproximadamente nueve ´ordenes de magnitud menos energ´etica que los rayos X o rayos gamma. Adem´as, en esta nueva t´ecnica la obtenci´ on de la imagen no se basa en la proyecci´on de las “sombras” producidas por los diferentes tejidos al ser atravesados por la radiaci´on, sino que la radiaci´ on se utiliza para excitar ciertos n´ ucleos at´omicos y, posteriormente, se recoge la se˜ nal emitida por ´estos, se procesa y se reconstruye la imagen. Esta t´ecnica utilizada en la obtenci´on de im´ agenes m´edicas tuvo su origen como m´etodo de an´alisis. Por ello hacemos referencia a la secci´on de Espectroscop´ıa en el que se explica el fundamento de esta t´ecnica. Aqu´ı vamos a ver c´omo se aplica la se˜ nal de RMN para la obtenci´ on de im´ agenes. Recordemos que mediante una exposici´on de la muestra a una se˜ nal de radiofrecuencia, y situada dentro de un campo magn´etico elevado se consigue una se˜ nal de RMN de determinados n´ ucleos (normalmente de hidr´ ogeno).

250

´ CAP´ITULO 6. RADIACION

Figura 6.30: Emisi´on y recepci´on de la se˜nal de RF. Durante un corto per´ıodo de tiempo se emite una se˜nal de RF, compuesta por un conjunto de frecuencias. Al cortar la emisi´on se comienza a registrar la se˜nal emitida por los n´ ucleos que se va atenuando durante un peque˜ no intervalo de tiempo. A esta se˜nal temporal se le aplica la Transformada de Fourier para descomponerla en frecuencias. Cada frecuencia detectada corresponde a la respuesta de un determinado tipo de n´ ucleo.

Para obtener las im´agenes con esta t´ecnica es necesario determinar la localizaci´ on espacial del n´ ucleo emisor que ha sido detectado. Si todos los n´ ucleos at´ omicos est´an sometidos al mismo campo magn´etico la frecuencia de respuesta va a ser la misma para todos ellos, con lo que no tendremos posibilidad de localizarlos. Para ello, superpuesto al fuerte campo magn´etico constante (encargado de producir la polarizaci´ on parcial de los espines), se aplica un nuevo campo magn´etico que va variando linealmente desde un extremo al otro (lo que se denomina gradiente de campo magn´etico). Como el campo magn´etico local en cada regi´on va a ser distinto, cada regi´ on emitir´ a con una frecuencia distinta. Estas se˜ nales est´an superpuestas en el tiempo, de modo que habr´a que descomponer la se˜ nal en el conjunto de frecuencias que la componen, esto es, aplicar la transformada de Fourier6 . La se˜ nal de RF a la salida tendr´ a un pico de frecuencia a la frecuencia de Larmor, emitida en el proceso de relajaci´on. Como se representa en la figura 6.30, despu´es de la aplicaci´on del pulso de radiofrecuencia se procede a la detecci´on de la se˜ nal de RF emitida por la muestra durante un breve per´ıodo de tiempo en el que la respuesta va decayendo. Pos6

En la pr´ actica se utiliza casi siempre un algoritmo matem´ atico denominado Fast Fourier Transform (FFT) que para un n´ umero de puntos que sea potencia de 2 realiza el c´ alculo de forma mucho m´ as r´ apida.

´ 6.6. APLICACIONES MEDICAS

251

teriormente, aplicando la Transformada de Fourier podemos descomponerla en las distintas frecuencias y, as´ı, determinar las distintas concentraciones de protones en funci´ on de la frecuencia. Como se ha superpuesto un gradiente de campo magn´etico al campo est´atico de RMN, para cada punto la frecuencia de Larmor (Ec. (6.4)) va a ser distinta. De esta forma, se puede reconstruir la imagen al poder identificar cada frecuencia con una posici´ on espacial. En im´ agenes se utilizan tres gradientes, uno para la direcci´ on X, otro para la Y y otro para la Z. La imagen de RMN es un mapa de frecuencias de los protones generadas por un campo magn´etico distinto para cada punto de la imagen. La intensidad del punto de la imagen (p´ıxel) est´a relacionado directamente con el n´ umero de protones contenido en un elemento de volumen definido por el v´ oxel (un p´ıxel con la profundidad de la secci´on analizada). Aunque van apareciendo nuevos sistemas de imagen por RMN, con m´as resoluci´on, rapidez y prestaciones, los componentes b´asicos de todo equipo de RMN es pr´ acticamente el mismo. Un generador de campo magn´etico muy intenso. Puede obtenerse mediante un potente im´an de grandes dimensiones (varias toneladas) con los que se pueden generar campos de hasta 0, 3T . Tambi´en pueden obtenerse mediante electroimanes, consistentes en grandes bobinas por las que han de pasar intensidades de corriente muy altas para conseguir generar en su interior campos de hasta 0, 7T . El mayor inconveniente es la enorme cantidad de calor disipada por las corrientes tan elevadas involucradas. La manera de conseguir campos mayores es utilizando superconductores, de manera que no existe esa disipaci´on t´ermica por el paso de corriente. El inconveniente es que se requieren temperaturas muy bajas para conseguir el comportamiento de superconductor (entre −263◦ C y −269◦ C), con lo que es necesario muy buenos sistemas criog´enicos. As´ı, aunque no existe consumo el´ectrico por no existir resistencia el´ectrica, el consumo de estos dispositivos es del sistema criog´enico. Con estos dispositivos se han conseguido campos magn´eticos de m´as de 10T . Sistema de gradiente de campo magn´etico. Para localizar las se˜ nales de RF de las distintas regiones de la muestras se aplican peque˜ nas variaciones lineales al campo magn´etico principal, con intensidades m´ aximas de 10mT /m - 15mT /m. Sistema de radiofrecuencia. Es el responsable de la generaci´on y transmisi´on de la radiaci´ on de RF utilizada para excitar los protones. Consta

252

´ CAP´ITULO 6. RADIACION de un sintetizador de la onda, con una frecuencia central correspondiente a la frecuencia de Larmor, y una envolvente discreta que contiene un rango de frecuencias. Posteriormente se amplifica con un amplificador de potencia de unos 10kW . Finalmente una antena transmisora irradiar´ a la se˜ nal de RF hacia la muestra. El sistema de adquisici´ on. Consta de una bobina receptora para detectar los voltajes inducidos por los protones en su relajaci´ on, un amplificador para pasar la se˜ nal del orden de nV o μV a valores de mV o V . Posteriormente se filtrar´a la se˜ nal y se procesar´a, mediante una FFT, para obtener finalmente unos valores de intensidad relativa para cada peque˜ na regi´ on de la muestra. Un sistema de visualizaci´ on convertir´ a esa tabla de valores en im´agenes interpretables.

Conviene recalcar que esta t´ecnica de diagn´ostico no utiliza radiaci´on ionizante, a diferencia de las anteriores, por lo que no entra˜ na ning´ un riesgo para el paciente al someterse a esta radiaci´on. No obstante, se desconocen los efectos a largo plazo sobre el organismo que pudieran provocar los campos magn´eticos tan intensos necesarios para realizar esta t´ecnica.

CAP´ITULO

7

T´ecnicas e Instrumentaci´on Fisico-Qu´ımicas.

7.1.

Fundamentos F´ısicos

Buena parte de los an´alisis bioqu´ımicos tienen por finalidad determinar, identificar, separar o purificar los componentes de mezclas de mol´eculas. Las macromol´eculas biol´ ogicas tienen un peso molecular del orden de 10000 Daltons. Estas mol´eculas tan complejas cumplen, cada una, una funci´ on tan importante como espec´ıfica. Esta funci´ on est´a ligada a su tama˜ no, forma y estructura. Existen diversas t´ecnicas f´ısicas que permiten determinar caracter´ısticas fundamentales de estas biomol´eculas como el peso molecular, volumen, forma y estructura. Aunque estas t´ecnicas son tema de estudio y aplicaci´on en materia de Qu´ımica Anal´ıtica, sus fundamentos y principios ´ıntimamente relacionados con la F´ısica permiten que hagamos aqu´ı una peque˜ na exposici´on. Vamos a hacer una breve descripci´on y a explicar el fundamento de algunas de estas t´ecnicas. Veremos, en primer lugar, los principios f´ısicos de las distintas t´ecnicas m´as habituales de separaci´on y an´ alisis. Comenzaremos por las caracter´ısticas b´ asicas de los fluidos biol´ogicos desde el punto de vista f´ısico: las suspensiones coloidales. A continuaci´ on nos centraremos en el movimiento de las part´ıculas en suspensi´ on: los fen´ omenos de difusi´ on y sedimentaci´on, en los que se basan las t´ecnicas de cromatograf´ıa y centrifugaci´ on y daremos unos breves apuntes referentes a la viscosidad.

´ ´ CAP´ITULO 7. TECNICAS E INSTRUMENTACION

254

Figura 7.1: Sistema disperso. La fase A es la fase continua en la que se encuentra inmersa la fase B discreta.

7.1.1.

Coloides

La pr´actica totalidad de los fluidos biol´ ogicos, tanto los interiores al organismo (la sangre, la orina, la leche, etc) como del medioambiente (el agua, el humo, los residuos l´ıquidos, etc) son complejos sistemas dispersos. Un sistema disperso es el compuesto por una fase continua, denominada fase dispersante en la que se encuentran inmersas una o varias fases discretas dispersas. En la figura 7.1 la fase A es la fase continua (siempre se puede trazar una l´ınea continua para ir de un punto a otro de la misma fase) en la que hay inmersas part´ıculas de la fase B. Normalmente esta fase dispersa suele ser un conjunto muy variado de macromol´eculas, constituyendo lo que se denomina suspensiones coloidales (recordemos que en los cursos b´asicos de Qu´ımica suele trabajarse con soluciones, que son sistemas homog´eneos). Las suspensiones coloidales son dispersiones en fluidos de part´ıculas de tama˜ no mucho mayor (varios ´ordenes de magnitud) que las dimensiones de las mol´eculas de fluido (entre 1nm y 1μm). Estas part´ıculas se encuentran en suspensi´ on, inmersas en el fluido en movimiento continuo debido a la agitaci´ on t´ermica (denominado, como vimos en la secci´on del Caminante Aleatorio, movimiento browniano). Dependiendo del tipo de part´ıculas que forman la suspensi´ on, los coloides se clasifican en varios tipos: aerosoles, geles, espumas y emulsiones. Aerosoles. Son suspensiones en gases. Cuando las part´ıculas son s´olidas reciben nombre espec´ıfico: humo cuando las part´ıculas s´olidas son muy

7.1. FUNDAMENTOS F´ISICOS

255

Figura 7.2: Imagen microsc´opica de la estructura de un gel. peque˜ nas y polvo cuando las part´ıculas son de mayor tama˜ no. Cuando el aerosol est´a formado por gotas l´ıquidas en suspensi´ on en el gas se denomina niebla. Cuando existen part´ıculas s´olidas y l´ıquidas en suspensi´ on se denomina smog. El aire que respiramos es, en s´ı, un aerosol constituido por part´ıculas s´olidas, l´ıquidas (microgotas de vapor de agua) y microorganismos (bacterias, virus y mohos) en suspensi´ on. Geles. Est´ an constituidos por part´ıculas s´olidas y l´ıquidas en un medio l´ıquido. En este caso las part´ıculas pueden interaccionar entre s´ı formando un entramado de tama˜ no casi macrosc´opico que tiene como consecuencia un gran aumento de la viscosidad del l´ıquido. En ocasiones se puede formar una estructura cuasi cristalina en la que la interacci´ on entre part´ıculas alcanza a todo el sistema, perdiendo as´ı la caracter´ıstica de fluido, y constituyendo lo que se denomina transici´ on sol-gel (form´andose una estructura como la de la gelatina). En la figura 7.2 se muestra una imagen microsc´opica de la estructura de un gel. Espumas. Son suspensiones de c´ umulos de gas en el seno de un l´ıquido. Para ello es necesario que exista una sustancia que genere estructuras de tipo vacuola en las que permanezca encerrado el gas, el agente espumoso (como ciertas prote´ınas, saponinas, etc.). Como ejemplo de espumas se pueden mencionar las utilizadas para combatir incendios en las que el gas encerrado es di´ oxido de carbono. Emulsiones. Se trata de una suspensi´ on de part´ıculas l´ıquidas en el seno de otro l´ıquidos, siendo ambos inmiscibles. Mediante agitaci´ on mec´ani-

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´ ´ CAP´ITULO 7. TECNICAS E INSTRUMENTACION

Figura 7.3: Imagen de una emulsi´on de aceite en agua (izquierda). Esquema de la estructura de las microgotas de aceite recubiertas con lecitina (derecha). ca se pueden quedar atrapadas peque˜ nas gotas en el interior del otro l´ıquido. Para que una emulsi´ on sea estable y no se fusionen las gotas entre s´ı y termine por separarse una fase de la otra, es necesario a˜ nadir ´ un emulsionante. Estos est´an constituidos por mol´eculas con una zona apolar y otra polar. La zona apolar le permite enlazarse con las manchas lip´ıdicas, ya sean aceites o grasas. El ´area polar le permite interaccionar con el agua. De esta manera el agente emulsionante logra recubrir la superficie de la sustancia lip´ıdica permitiendo que la misma sea desplazada por el agua. Una imagen de una emulsi´ on de aceite en agua se puede ver en la figura 7.3. En la parte derecha de la figura se puede observar la estructura estable de gotas de aceite recubiertas con lecitina, en las que la parte apolar de ´esta queda orientada hacia la gota y la parte polar hacia el exterior de la gota. Una gran cantidad de preparados alimenticios, cremas y ung¨ uentos son emulsiones. En el caso de la margarina, por ejemplo, se trata de una suspensi´ on de gotas de agua en aceite. En el estudio de los suspensiones coloidales se consideran las part´ıculas sometidas, en principio, a dos tipos de fuerzas: una fuerza viscosa que se opone al movimiento de las part´ıculas en el fluido y una fuerza estoc´ astica (aleatoria) generada por la agitaci´on t´ermica de las part´ıculas. Adem´as de estas fuerzas existir´a alguna otra fuerza de interacci´on entre las part´ıculas, dependiente de la naturaleza de ´estas y del fluido, que determinar´ a, en gran medida, el com-

7.1. FUNDAMENTOS F´ISICOS

257

portamiento de la suspensi´on. As´ı se podr´an cambiar las caracter´ısticas de una suspensi´on si se conoce la interacci´on de un coloide individual con otro. Por ejemplo, en el tratamiento de purificaci´ on de agua se deben minimizar las fuerzas de repulsi´on entre las part´ıculas que la enturbian, para que as´ı se formen grandes aglomerados que sedimenten y filtren f´ acilmente. La manera habitual de cambiar la interacci´ on entre coloides es mediante fen´omenos electrocin´eticos. Es decir, las fuerzas electrost´aticas entre la superficie del coloide con la de otro coloide o con las del l´ıquido determinan el comportamiento de la suspensi´on. Incrementando la carga superficial aumenta la repulsi´ on electrost´atica entre part´ıculas permaneciendo as´ı dispersos y en suspensi´on. Si, por el contrario, se reducen o eliminan las cargas superficiales los coloides se aglomeran y pueden llegar a sedimentar fuera de la suspensi´ on. Potencial Zeta La interacci´ on entre las part´ıculas coloidales puede entenderse si se estudia la configuraci´ on de carga alrededor de cada coloide. En primer lugar supondremos que la part´ıcula est´a cargada, por lo que no se formar´an aglomerados debido a la repulsi´ on electrost´atica. Alrededor de este i´ on, por ejemplo negativo, se producir´ a una aglomeraci´on de iones de signo contrario (contra-i´ on) a su alrededor formando una capa r´ıgida, llamada capa de Stern. Adem´as, otros iones positivos sentir´ an el campo el´ectrico grande creado por el coloide y tender´ an a aproximarse. Como el coloide est´a completamente rodeado de iones positivos, los nuevos iones quedar´an pr´ oximos pero sin acercarse demasiado a la capa de Stern. En este equilibrio entre la atracci´ on debida al coloide altamente negativo y la repulsi´ on de la capa de Stern se establece una capa difusa en la que la concentraci´ on de iones positivos va decreciendo con la distancia (puede visualizarse como una nube de carga rodeando al coloide, con una densidad de carga decreciente con la distancia). Lejos del coloide la concentraci´on de iones positivos y negativos ser´a semejante, alcanz´andose una densidad de carga nula. Al conjunto de contra-iones de la capa de Stern y la capa difusa se le denomina doble capa. Una imagen representativa de estas capas puede verse en la figura 7.4. El coloide negativo con su doble capa crea, a su alrededor, un potencial el´ectrico (relativo a la disoluci´ on) decreciente con la distancia. El valor m´aximo del potencial corresponder´ a a la superficie del coloide, y fuera de la capa difusa tender´ a a cero. La forma de esta ca´ıda de potencial ser´a un indicador de la fuerza repulsiva entre los coloides en funci´ on de la distancia que los separa. El potencial en la zona de separaci´ on entre la capa de Stern y la capa difusa se

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´ ´ CAP´ITULO 7. TECNICAS E INSTRUMENTACION

Figura 7.4: Visualizaci´on de la doble capa, con la capa de Stern y la capa difusa. (De Zeta-Meter, Inc.).

denomina potencial zeta. Este potencial es una manera efectiva de controlar el comportamiento del coloide puesto que indica cambios en el potencial de la superficie y en las fuerzas de repulsi´on entre los coloides. Cuando la doble capa es muy grande el potencial zeta y el potencial de superficie son muy parecidos, como ocurre cuando el fluido es agua (Fig. 7.5). El comportamiento de los coloides en suspensi´on vendr´ a dado por el balance entre la fuerza de repulsi´ on electrost´atica y la fuerza de atracci´on de Van der Waals (la que mantiene unidas a las mol´eculas entre s´ı dentro de un l´ıquido). Al aproximarse los coloides sus respectivas dobles capas interaccionan apareciendo una repulsi´ on entre ellas. Por otra parte, las mol´eculas individuales de cada coloide al aproximarse entre s´ı experimentan atracci´on de Van der Waals. Se puede obtener una representaci´ on de la energ´ıa neta de interacci´ on restando la energ´ıa de atracci´ on a la energ´ıa de repulsi´on. En la regi´on en la que la energ´ıa neta sea positiva existir´a una repulsi´ on entre los coloides, mientras que cuando esta energ´ıa neta sea negativa corresponder´ aa una atracci´ on. Normalmente, a medida que se aproximan los coloides aparece una energ´ıa de repulsi´on que va aumentando hasta un m´ aximo, denominado barrera de energ´ıa, a partir del cual desciende hasta hacerse atractiva, regi´on denominada trampa de energ´ıa (Fig. 7.6). La altura de esta barrera indica lo estable que ser´a el sistema. Para que dos coloides queden unidos es necesario que tengan suficiente energ´ıa cin´etica para salvar esta barrera. Si esta

7.1. FUNDAMENTOS F´ISICOS

259

Figura 7.5: Definici´on del Potencial zeta. (De Zeta-Meter, Inc.). barrera es suficientemente peque˜ na las part´ıculas quedar´ an f´ acilmente atrapadas formando as´ı aglomerados. Dependiendo de nuestros prop´ ositos, podremos modificar esta barrera de energ´ıa en un sentido u otro. Con este fin se puede cambiar el pH, agregar activos para afectar a la carga del coloide, o cambiar la distribuci´ on de la doble capa. Un ejemplo importante son las dispersiones de arcilla en agua (coloide de barro). Para que fluyan bien las arcillas l´ıquidas se debe minimizar su viscosidad para que se liberen f´ acilmente las burbujas de aire. Esto se consigue buscando que el potencial zeta sea m´aximo. Para eliminar coloides del agua residual (de tama˜ no peque˜ no y, por tanto, dif´ıcil de eliminar por filtraci´on o sedimentaci´on) se disminuye el potencial zeta con coagulantes como el alumbre, cloruro f´errico y/o pol´ımeros cati´onicos. De esta forma desaparecen las fuerzas repulsivas y con una ligera agitaci´on se formar´an sistemas microfoculados (uni´ on de part´ıculas coloidales en grupos de mayor tama˜ no), que crecer´an hasta hacerse visibles y f´ acilmente filtrados.

7.1.2.

Difusi´ on y sedimentaci´ on

Para separar part´ıculas es necesario que ´estas se desplacen por el disolvente de diferente manera unas de otras. Desde el punto de vista macrosc´opico, para que exista un movimiento neto de part´ıculas en el medio, es decir, que se establezca un flujo material, es necesario que exista una fuerza neta sobre las part´ıculas en una direcci´on determinada. Sin considerar fuerzas externas o

260

´ ´ CAP´ITULO 7. TECNICAS E INSTRUMENTACION

Figura 7.6: Energ´ıa neta de interacci´on: balance entre la energ´ıa atractiva y la repulsiva. (De Zeta-Meter, Inc.). transporte activo sobre las part´ıculas, va a existir un flujo de part´ıculas cuando se d´e alguna de las siguientes condiciones: que exista un gradiente de concentraciones (o desequilibrio del potencial qu´ımico, como se vi´o en la secci´on de Introducci´ on a la Termodin´ amica de No Equilibrio: Flujos y Fuerzas, y en la Ecuaci´on de Nernst-Planck) o cuando exista una diferencia de densidades (por ejemplo, una suspensi´ on coloidal). La primera circunstancia da lugar al proceso denominado difusi´ on. La segunda condici´on propiciar´a la sedimentaci´ on. En este caso ser´a la fuerza de la gravedad la que de manera natural realice la segregaci´on. Por otra parte, en el movimiento de las part´ıculas dentro de un medio va a existir un rozamiento de ´estas con las mol´eculas del solvente. Como es una fuerza de rozamiento din´ amico se escribe como un t´ermino negativo en la ecuaci´ on de movimiento de la part´ıcula, siendo proporcional a la velocidad de la misma Fext − f v = m (dv/dt) , donde Fext es la resultante de las fuerzas externas y f es el coeficiente de fricci´ on de la part´ıcula en el solvente. Para part´ıculas esf´ericas este coeficiente es proporcional a la viscosidad del mismo, η, y al radio de la part´ıcula ra . Esta es la denominada ley de Stokes:

7.1. FUNDAMENTOS F´ISICOS

261

fesf = 6πηra . Para part´ıculas que no son esf´ericas, como sucede con la mayor´ıa de las mol´eculas biol´ ogicas, su forma se puede aproximar a un elipsoide (una elipse en revoluci´ on). De esta forma la ley de Stokes se modifica introduciendo un factor de forma. La relaci´ on entre el coeficiente de fricci´on de la mol´ecula, fi y el de una esfera equivalente fesf es el denominado factor de forma, F : F ≡ (fi /fesf ) .

7.1.3.

(7.1)

Viscosidad

Como ya se vi´o en la secci´on de Propiedades B´ asicas de los Fluidos, la viscosidad es la resistencia al movimiento relativo de las part´ıculas de un fluido, es decir, la resistencia a fluir. Esta resistencia depende del fluido, de su temperatura, as´ı como de las sustancias que ´este tenga disueltas. La medida de la viscosidad se hace partiendo de la ecuaci´on de movimiento de un fluido en r´egimen laminar a trav´es de un capilar. De esta manera, a partir de la medida de la viscosidad se puede obtener informaci´ on de las sustancias disueltas. Una medida sencilla puede hacerse, por ejemplo, con el viscos´ımetro de Ostwald. Consiste en un tubo en forma de “U ” con un bulbo en cada brazo a diferentes alturas (Fig.7.7). Se rellena el bulbo inferior y se succiona por el otro brazo hasta llenar el bulbo superior y llegar a una marca superior, a. Con otra marca situada por debajo del bulbo, b, se deja caer la soluci´on y se mide el tiempo, t, que tarda en bajar desde la primera marca a la segunda. La viscosidad se calcula como

4 πp · t · rcap , η= 8·l·V donde p es la presi´on hidrost´ atica del l´ıquido, rcap es el radio del capilar, l es la longitud ocupada por el fluido es su descenso desde la abertura inferior del bulbo, V es el volumen del l´ıquido que fluye y t es el tiempo que tarda en bajar el l´ıquido a trav´es del capilar desde la marca a hasta la b. Es m´as f´ acil, sin embargo, calcularla a partir de un l´ıquido de referencia del que se conoce bien su viscosidad, η0 , y su densidad, ρ0 . En este caso, el cociente de viscosidades es proporcional al cociente de sus respectivas densidades y de sus respectivos tiempos de bajada. ρ t η = . η0 ρ0 t0

262

´ ´ CAP´ITULO 7. TECNICAS E INSTRUMENTACION

Figura 7.7: Viscos´ımetro de Ostwald. Se llena hasta la marca a y se mide el tiempo que tarda en descender el nivel del fluido hasta la marca b.

Normalmente se suele tomar como l´ıquido de referencia el agua, o bien el disolvente si queremos conocer la viscosidad de una disoluci´ on. Las part´ıculas disueltas van a introducir un aumento en la viscosidad, de modo que para peque˜ nas concentraciones se puede expresar la viscosidad de la disoluci´on como una peque˜ na variaci´ on en la viscosidad del disolvente. Esta peque˜ na variaci´on puede expresarse matem´aticamente como una serie de potencias de la concentraci´ on, de la forma: η = η0 (1 + k1 C + k2 C + · · · ) , donde la concentraci´on viene expresada habitualmente en gr/cm3 . Como primera aproximaci´on, es decir, ignorando t´erminos cuadr´aticos y superiores en la concentraci´ on y suponiendo part´ıculas de soluto grandes y esf´ericas, se puede escribir la viscosidad como: η = η0 (1 + νφ), donde ν es un coeficiente que para part´ıculas esf´ericas vale ν = 5/2 (para elipsoides muy alargados este factor puede llegar a ser mayor que 100) y φ es la fracci´ on de volumen. Si Vpart es el volumen ocupado por las part´ıculas y VT es el volumen total, la fracci´on de volumen es:

7.1. FUNDAMENTOS F´ISICOS

263

φ=

Vpart . VT

Expresando el volumen total a partir de la concentraci´on de soluto (en gr/cm3 ) y la masa en funci´on de la masa molecular obtenemos: φ=

vh NA C , M

siendo vh el volumen hidratado de la part´ıcula de soluto y M su masa molecular. Tambi´en podemos reescribirlo en t´erminos del volumen espec´ıfico parcial, v (en unidades de cm3 /g). El volumen espec´ıfico molar est´a definido como el volumen que ocupa un gramo de soluto dentro de la disoluci´ on. Si vh es el volumen de una part´ıcula hidratada, se tendr´ a: vh =

M v , NA

luego la fracci´ on de volumen ser´ a: φ = Cv. De esta forma la viscosidad relativa se puede escribir como: η η0 = 1 + νvC. Podemos definir ahora una viscosidad espec´ıfica, ηesp , como: ηesp = η η0 − 1. Esta viscosidad se relaciona directamente con las caracter´ıstica de la mol´ecula: ηesp =

νNA vh C. M

De esta forma se ve que la viscosidad introducida por las part´ıculas de soluto no depende del tama˜ no real de las part´ıculas en s´ı, sino del volumen que ocupan cuando ya han interaccionado con la disoluci´ on. Si las part´ıculas no fueran esf´ericas habr´ıa que corregir esta expresi´on con un factor num´erico (factor de forma, Ec. (7.1)) que d´e cuenta de la anisotrop´ıa de la mol´ecula.

264

´ ´ CAP´ITULO 7. TECNICAS E INSTRUMENTACION

Figura 7.8: Cuando existe una diferencia de concentraci´on a lo largo del espacio se establece un gradiente de concentraci´on, ΔC/Δx, que va a producir un flujo de masa por unidad de ´area, A.

7.1.4.

Ley de Fick

Adem´as del movimiento aleatorio debido a la agitaci´on t´ermica, las part´ıculas tambi´en pueden difundir debido a una diferencia de concentraci´ on. Como sabemos de la secci´on de la Ecuaci´ on de Nernst-Planck, cuando existe una diferencia de concentraci´on a lo largo del espacio se establece un gradiente de concentraci´ on que va a producir un flujo de masa por unidad de a´rea (Fig. 7.8). En este caso, el movimiento no tiene un desplazamiento medio nulo como ocurr´ıa con el movimiento browniano debido a la agitaci´on t´ermica, sino que aparece una fuerza de arrastre sobre las part´ıculas. La expresi´on que nos dice c´ omo se mueven las part´ıculas cuando hay una diferencia de concentraci´ on es la Ley de Fick. Seg´ un ´esta el n´ umero medio de part´ıculas que atraviesa una secci´on A por unidad de tiempo es proporcional al gradiente de la concentraci´on: dn = −DA dt



δC δr

 .

El signo menos indica que las part´ıculas se desplazan desde la regi´ on de mayor concentraci´on a la regi´ on de menos concentraci´on; el factor de proporcionalidad es el coeficiente de difusi´ on, D. En estas condiciones, el flujo difusivo se puede expresar como

7.1. FUNDAMENTOS F´ISICOS

265 

Jdif = −D

δC δr

 .

El coeficiente de difusi´on depende de la temperatura y del coeficiente de fricci´ on de la part´ıcula en dicho medio, seg´ un la relaci´ on: D=

kB · T , f

(7.2)

conocida como ecuaci´ on de Nernst-Einstein, donde kB es la constante de Boltzmann, T es la temperatura absoluta y f es el coeficiente de fricci´on. Este on t´ermica. De esta forma, el producto kB T representa la energ´ıa de agitaci´ cociente kB T /f representa el ´area barrida por la part´ıcula por unidad de tiempo en su movimiento aleatorio debido a la agitaci´ on t´ermica.

7.1.5.

Sedimentaci´ on y Centrifugaci´ on

En el caso de la difusi´ on (Ley de Fick) hemos visto que un gradiente en la concentraci´ on produce un movimiento neto de dichas part´ıculas en el seno de la disoluci´ on. Tambi´en se puede conseguir que unas part´ıculas se muevan y, por tanto, se separen, mediante la propia fuerza de la gravedad o aplicando una rotaci´ on cuyo efecto es una aceleraci´on que puede llegar a ser varios ´ordenes de magnitud mayor que la de la gravedad. Se habla de sedimentaci´ on cuando las part´ıculas en suspensi´on caen y se separan del disolvente u ´ nicamente por el efecto de la gravedad. En este caso, hay que decir que las part´ıculas realmente no est´an disueltas (es decir, integradas a las part´ıculas del disolvente formando una mezcla homog´enea) sino en suspensi´ on (como se indic´o al comienzo del cap´ıtulo). Cuando la fuerza de la gravedad es insuficiente para conseguir la sedimentaci´on en un tiempo razonable, se puede forzar una precipitaci´on mediante una rotaci´ on a gran velocidad. La fuerza centr´ıfuga depende de la velocidad de giro, ω y del radio de giro rg de la siguiente forma: Fc = mω 2 rg , donde m es la masa de la part´ıcula. La masa efectiva de una part´ıcula en el seno de un fluido es (m − V ρ), donde V es el volumen de la part´ıcula y ρ es la densidad del fluido. As´ı pues, la fuerza centr´ıfuga o radial es Fc = (m − V ρ)ω 2 rg . Si se alcanza velocidad uniforme en el desplazamiento de las part´ıculas se tendr´ a un equilibrio entre la fuerza centr´ıfuga y la de rozamiento. La fuerza

266

´ ´ CAP´ITULO 7. TECNICAS E INSTRUMENTACION

de rozamiento vimos que era proporcional a la velocidad, en este caso a la velocidad radial, v:   (m − V ρ) 2 dr −→ v = ω rg . (m − V ρ)ω 2 rg = f dt f Definiendo el coeficiente de sedimentaci´ on, s, como la velocidad por unidad de aceleraci´on centr´ıfuga s≡

v ω 2 rg

,

la velocidad se puede escribir como v = s · ω 2 rg . De la expresi´on anterior podemos obtener una ecuaci´on que nos determina la masa molecular en funci´ on del coeficiente de sedimentaci´on V (ρs − ρd ) = f · s, donde ρs es la densidad del soluto y ρd es la densidad del disolvente. Luego el peso molecular ser´a M=

NA f s , (1 − ρd /ρs )

on de la y recordando la relaci´ on de Nernst-Einstein (D = kB T /f ) y la relaci´ constante de los gases con la constante de Boltzmann (R = NA · kB ) podemos escribir M=

RT · s - . D 1 − ρd ρs

(7.3)

Esta es la llamada ecuaci´ on de Svedberg. La unidad del coeficiente de sedimentaci´on en el S.I. es el segundo, sin embargo, en la pr´ actica se utiliza un subm´ ultiplo muy peque˜ no, el Svedberg, S: 1S ≡ 10−13 s. Dentro de las t´ecnicas que se fundamentan en las diferencias de difusi´on y sedimentaci´on comentaremos las m´as utilizadas: la cromatograf´ıa y la ultracentrifugaci´ on.

´ ´ Y ANALISIS ´ 7.2. TECNICAS DE SEPARACION

267

Figura 7.9: Perfil de concentraciones en una ultracentr´ıfuga.

7.2.

T´ ecnicas de Separaci´ on y An´ alisis

7.2.1.

Centrifugaci´ on y Ultracentrifugaci´ on

Uno de los equipos b´ asicos en un laboratorio de an´alisis es la centr´ıfuga. En ella las muestras se colocan en peque˜ nas probetas que, una vez cerrado el aparato, se hace girar a gran velocidad con el fin de acelerar el proceso de sedimentaci´on. La ultracentr´ıfuga consiste en una centr´ıfuga que puede hacer girar la muestra a muy alta velocidad, del orden de decenas de miles de revoluciones por minuto, obteni´endose aceleraciones del orden de 3.000.000 veces la gravedad. Esta t´ecnica puede ser utilizada como preparativa (para separar componentes de una muestra o purificar) o como anal´ıtica (para determinar pesos moleculares). Las componentes de un sistema se separan en bandas seg´ un sus coeficientes de sedimentaci´on. Adem´as, esta t´ecnica requiere muy poca cantidad de muestra. La determinaci´ on de pesos moleculares puede hacerse por varios m´etodos. En el m´etodo de velocidad de sedimentaci´on se utiliza una ultracentr´ıfuga a alta velocidad y se registra el movimiento de la capa de sedimentaci´on en funci´on del tiempo, obteniendo la velocidad de sedimentaci´ on, v. Para obtener ´ los cambios de concentraci´on se utiliza el sistema o´ptico de Schlieren. Este est´a basado en el hecho de que la luz sufre refracci´ on al atravesar un medio con densidad variable; el cambio en el ´ındice de refracci´ on se relaciona con el cambio de densidad (Fig. 7.9). Tambi´en se emplea la interferencia Rayleigh que consiste en utilizar una doble celda, una para el disolvente y otra para la muestra, se mide el desplazamiento de las franjas de interferencia y se obtiene la diferencia en el ´ındice de refracci´ on entre ambas celdas. Para ello la

268

´ ´ CAP´ITULO 7. TECNICAS E INSTRUMENTACION

Figura 7.10: Montaje experimental de la ultracentr´ıfuga con el dispositivo o´ptico para estudiar el perfil de concentraciones.

ultracentr´ıfuga incorpora sendas ventanas por las que un haz l´ aser atraviesa la muestra para obtener el perfil de concentraciones (Fig. 7.10). En el m´etodo del equilibrio, la muestra se centrifuga hasta alcanzar un equilibrio entre la sedimentaci´ on y la difusi´ on de las part´ıculas, quedando un gradiente de concentraci´ on estables, es decir, se consigue un flujo neto, Jneto , nulo. El flujo centr´ıfugo se podr´ a escribir como Jc = v · C = sω 2 rC, luego: Jneto = sω 2 rC − D(δC/δr) = 0, o bien, (δD/δr) s = , D ω 2 rC y sustituyendo en la ecuaci´on de Svedberg (7.3): M=

RT (δC/δr) . (1 − ρd /ρs ) ω 2 rC

(7.4)

El inconveniente es que no se puede utilizar velocidades muy altas. Como se observa en la ecuaci´on (7.4) cuanto mayor sea M menor tendr´a que ser la

´ ´ Y ANALISIS ´ 7.2. TECNICAS DE SEPARACION

269

velocidad de giro para alcanzar el equilibrio (por ejemplo, para 50000 daltons, se requiere 10000rpm1 ). Otro m´etodo para calcular los pesos moleculares es la ultracentrifugaci´on con gradiente de concentraci´ on. Utiliza otra soluci´on de bajo peso molecular (p.e. CsCl), de forma que se forma un gradiente de densidades en equilibrio. Al a˜ nadir una sustancia de elevado peso molecular, ´esta se suspender´a en un punto donde su densidad de flotaci´ on sea igual a la densidad de la soluci´ on de bajo peso molecular. Si tenemos una muestra multicomponente (como ocurrir´a la mayor´ıa de las veces), se formar´a una fina capa de macromol´eculas, separadas seg´ un sus coeficientes de sedimentaci´on. A este se le llama sedimentaci´ on por zonas. Los m´etodos de sedimentaci´on tambi´en pueden dar informaci´on del tama˜ no y forma de las part´ıculas. La variaci´on de la velocidad de sedimentaci´ on es proporcional al radio y a la densidad de la part´ıcula: v0 = 2rp2 (ρp − ρs )ω 2 r 9η. Cuando la part´ıcula no es perfectamente esf´erica existe una discrepancia con esta ecuaci´on y habr´ a que corregirla mediante el factor de forma, F (Ec. (7.1)).

7.2.2.

Electroforesis

Cuando una mezcla de mol´eculas ionizadas es colocada en el interior de un campo el´ectrico (generado por un par de electrodos) ´estas migrar´an hacia el electrodo que tenga el signo opuesto a su carga. La diferencia de movilidad de las distintas especies a trav´es de un medio va a permitir separar las distintas biomol´eculas en su migraci´on hacia el electrodo. El movimiento de las mol´eculas tiene tres contribuciones: la fuerza electrost´atica que depende de la carga de la mol´ecula y del campo el´ectrico creado, y va dirigida en el sentido del campo el´ectrico (del electrodo positivo al negativo) para los iones positivos y en sentido contrario para los iones negativos; la fricci´on con el solvente que dificulta el movimiento de las mol´eculas en el medio y la agitaci´on t´ermica, responsable del movimiento browniano, dando una contribuci´ on aleatoria como vimos en el apartado anterior. Como resultado, si se coloca una peque˜ na cantidad de muestra en un determinado punto se formar´ a un frente que ir´ a avanzando arrastrado por la 1 Aunque en las ecuaciones la velocidad angular ω viene expresada en rad/s, en la pr´ actica es m´ as com´ un hablar de revoluciones por minuto, rpm.

270

´ ´ CAP´ITULO 7. TECNICAS E INSTRUMENTACION

fuerza electrost´atica. Por otra parte, debido al efecto de difusi´ on, el frente se va a ir ensanchando con el tiempo. La concentraci´on de iones en dicho frente presenta una distribuci´ on de tipo gaussiano, con su m´ aximo en la posici´on media del frente y cuya varianza va aumentando con el tiempo. Para reducir la anchura de este frente se puede dificultar el movimiento de las mol´eculas empleando un medio que oponga resistencia a su movimiento. A esta versi´on se denomina electroforesis en zona. La forma habitual de conseguir esto es mediante un gel. Un gel es un medio formado por un pol´ımero soluble de muy alto peso molecular que atrapa mol´eculas de agua y forma un tamiz o malla que dificulta el movimiento de los solutos. De esta forma, aunque la migraci´ on electrofor´etica es m´as lenta, el ensanchamiento del frente tambi´en se ver´a reducido obteni´endose una mejor separaci´on de especies. El medio soporte estabilizante impide, adem´as, la difusi´on de las mol´eculas al acabar. Una vez que han sido separadas las biomol´eculas de inter´es, se corta el potencial aplicado y se ti˜ nen para su mejor visualizaci´ on. Suponiendo una part´ıcula esf´erica no hidratada, de radio r, con una cierta carga q, la fuerza electrost´atica se puede escribir como: V , δ donde δ es la distancia entre electrodos y V el potencial aplicado; y la fuerza viscosa es: FE = q · E = q

|FH | = f v = 6πηrv. Cuando se mueve sin aceleraci´on se satisface la igualdad entre ambas fuerzas. Podemos, as´ı, encontrar la velocidad estacionaria de movimiento igualando ambas ecuaciones: v=

qV . 6πηrδ

Vamos a definir ahora un par´ ametro pr´ actico que es la movilidad electrofor´etica como la velocidad por unidad de campo el´ectrico, caracter´ıstica de cada part´ıcula: μ=

q v = . E 6πηr

De este modo, al aplicar un campo el´ectrico, la separaci´on de componentes por sus distintas velocidades la podemos relacionar con la movilidad electrofor´etica de los mismos.

´ ´ Y ANALISIS ´ 7.2. TECNICAS DE SEPARACION

271

Figura 7.11: Ejemplo de utilizaci´on de la electroforesis para la discriminaci´on de componentes en el an´alisis de quesos. Seg´un la distribuci´ on de las prote´ınas de suero l´acteo en gel de poliacrilamida se distingue f´acilmente los tipos de leche utilizados en la fabricaci´ on del queso.

No obstante, este resultado se obtiene partiendo de la hip´ otesis de tratarse de una part´ıcula cargada no hidratada, sin embargo, en la realidad toda part´ıcula cargada disuelta se encontrar´a hidratada y rodeada de contraiones (iones de signo contrario atra´ıdos por interacci´ on electrost´atica). Teniendo en cuenta la capa de contra-iones rodeando a la macromol´ecula la carga neta efectiva ser´a menor, con lo que la movilidad electrofor´etica real tambi´en va a ser menor. El movimiento resultante provoca que las mol´eculas no migren de manera homog´enea, y dependiendo de su carga, su masa y su coeficiente de difusi´on alcanzar´an el electrodo en tiempos distintos. Como la difusi´on depende de la temperatura, a mayor temperatura m´as difunden las part´ıculas y, por tanto, m´ as anchura tendr´ a el frente. En Biolog´ıa esta t´ecnica es empleada para separar prote´ınas o ´ acidos nucleicos (e incluso c´elulas). Los ´acidos nucleicos ya disponen de una carga el´ectrica negativa, que los dirigir´ a al polo positivo, mientras que las prote´ınas se cargan con sustancias espec´ıficas que incorporan cargas negativas de una manera dependiente del peso molecular. En la figura 7.11 se muestra una utilizaci´on pr´ actica en el an´alisis de alimentos, en concreto, la determinaci´ on del tipo de

272

´ ´ CAP´ITULO 7. TECNICAS E INSTRUMENTACION

leche utilizada en la fabricaci´on de quesos.

7.2.3.

Cromatograf´ıa

Es la t´ecnica m´as potente y de aplicaci´on m´ as general para separar, identificar y determinar componentes qu´ımicos de mezclas complejas. Cuando un fluido con solutos disueltos (fase m´ ovil) se hace desplazar a trav´es de otro medio inmiscible (denominado fase estacionaria), cada uno de los componentes van a difundir de manera distinta en ambos medios. De esta forma, si se hace fluir la fase m´ovil (con los componentes que se desean separar) a trav´es de la fase estacionaria, los distintos componentes se van a transportar a distinta velocidad, de modo que al salir van apareciendo separadamente. Se denomina eluci´ on al proceso mediante el cual los solutos son arrastrados a trav´es de una fase estacionaria por el movimiento de una fase m´ ovil (mediante la adici´on sucesiva de disolvente). Al introducir la muestra disuelta en la fase m´ovil en el cromat´ografo los componentes se van distribuyendo en las dos fases, seg´ un sea su afinidad a una u otra fase. Al a˜ nadir m´ as disolvente (eluyente) se fuerza a la porci´on de muestra disuelta en la fase m´ovil a descender por la columna (tubo estrecho, relleno con la fase estacionaria, por el que se hace circular la fase m´ovil), de modo que tienen lugar nuevos repartos entre las fases m´ovil y estacionaria. Esto sucede de manera continua, de manera que la velocidad a la que es arrastrado cada soluto depende de la fracci´on de tiempo que pasa cada uno en la fase m´ovil. Para conseguir separar especies de una mezcla hay que hacer pasar a trav´es de la columna una cantidad suficiente de fase m´ ovil hasta que emerjan por el otro extremo; se dice entonces que han sido eluidas. En la figura 7.12 se representa en distintos instantes de tiempo el avance de distintos solutos a trav´es de una columna cromatogr´ afica; dependiendo de su afinidad a una u otra fase avanzar´a m´as deprisa o m´as lentamente consigui´endose as´ı su separaci´on. El perfil de concentraciones a la salida de la columna cromatogr´afica producir´ a en el detector una se˜ nal durante un peque˜ no intervalo de tiempo, con un m´ aximo situado aproximadamente en el punto medio de dicho intervalo. Como se trata de un proceso difusivo, igual que en la electroforesis, la se˜ nal ser´ a una gaussiana cuya anchura va creciendo linealmente con el tiempo de eluci´on. Las diferencias de velocidad de los distintos componentes determinan que se vayan separando en bandas o zonas a lo largo de la columna. A medida que recorren m´as distancia se van desfasando m´ as temporalmente; sin embargo, tambi´en se produce, al mismo tiempo, un ensanchamiento de las bandas, lo que dificulta, por otra parte, su separaci´ on.

´ ´ Y ANALISIS ´ 7.2. TECNICAS DE SEPARACION

273

Figura 7.12: La separaci´on de los componentes en una columna cromatogr´afica se va produciendo a medida que se va a˜ nadiendo eluyente.

La efectividad de una columna cromatogr´afica para separar dos solutos depende en gran medida de las velocidades relativas a las cuales emigran (eluyen) ambas especies. En cada instante de tiempo se puede describir el equilibrio Am´ovil  Aestacionario , cuya constante K es la relaci´ on o coeficiente de reparto: CS , CM donde CS es la concentraci´on en fase estacionaria y CM es la concentraci´on en la fase m´ ovil, es decir, el cociente entre las concentraciones en ambas fases. En el caso ideal esta relaci´on es constante, luego CS ∝ CM . Sin embargo, para grandes concentraciones existen notables desviaciones de esta linealidad (cromatograf´ıa lineal). Para hacer determinaciones cuantitativas se mide el tiempo de retenci´ on, tR , es decir, el tiempo que tardan en llegar al detector (al final de la columna) cada una de las especies; y el tiempo muerto, tM , que es el tiempo que tarda en salir una sustancia no retenida, o lo que es lo mismo el tiempo que tarda en salir el eluyente. Entonces, la velocidad media de migraci´on de un soluto es: K=

´ ´ CAP´ITULO 7. TECNICAS E INSTRUMENTACION

274

L , (7.5) tR donde L es la longitud del empaquetamiento de columna. Para las mol´eculas de la fase m´ovil ser´a: v¯ =

L . (7.6) tM Ahora podemos expresar la velocidad de migraci´on como una fracci´ on de la velocidad de la fase m´ ovil, es decir, el producto de la velocidad de la fase m´ovil multiplicado por la fracci´ on de tiempo que pasa en fase m´ ovil, u=

moles fase m´ovil , moles soluto 1 1 CM VM =u· =u· , v¯ = u · S CM VM + CS VS 1 + CS VS /CM VM 1 + K VVM

v¯ = u ·

donde K es la relaci´on de reparto de ambas especies. Se puede definir ahora una nueva constante, denominada factor de capacidad, al producto  ≡ KA kA

VS , VM

luego v¯ = u

1  . 1 + kA

Sustituyendo las definiciones de v¯ (Ec. (7.5)) y u (Ec. (7.6)), tendremos: 1 L L =  , tR tM 1 + kA y, por tanto,  = kA

tR − tM . tM

´ Esta es una magnitud medible directamente de un cromatograma (representaci´ on de la concentraci´ on de soluto detectada a la salida en funci´ on del  apida tiempo o del volumen de eluci´ on). Cuando kA  1 la eluci´on es muy r´ (tR  tM ), con lo que es muy dif´ıcil determinar con exactitud tR . Si, por el  1, los tiempos son muy largos t t . Lo ideal es un factor contrario, kA R M  ≤ 5. Para modificar los factores de capacidad se puede de capacidad 1 ≤ kA variar la temperatura, el empaquetado y la composici´on de las fases.

´ ´ Y ANALISIS ´ 7.2. TECNICAS DE SEPARACION

275

Figura 7.13: Determinaci´on de la resoluci´on de una columna. Se mide la diferencia entre los tiempos de retenci´on de los analitos y la anchura de los respectivos picos.

Factor de Selectividad Para caracterizar la medida de lo bien que una columna cromatogr´ afica separa dos especies, se define el factor de selectividad, α, de una columna como el cociente α = KB KA , siendo B la especie m´as fuertemente retenida (luego siempre se cumplir´a que α > 1). Es f´acil deducir que α tambi´en se puede escribir como:

α=

 kB  , kA

o bien,

α=

(tR )B − tM , (tR )A − tM

por lo que puede obtenerse directamente de los tiempos de retenci´ on y el tiempo muerto.

´ ´ CAP´ITULO 7. TECNICAS E INSTRUMENTACION

276

Problema. Se pretenden separar dos especies A y B por eluci´on con hexano en una columna empaquetada con gel de s´ılice que tiene agua adsorbida. Los coeficientes de reparto en agua/hexano, K, de las especies A y B son 6, 01 y 6, 20 (K = [A]H2 0 /[A]hex ). La relacion VS /VM del empaquetado es de 0, 422. a) Calcular el factor de capacidad de cada soluto. b) Calcular el factor de selectividad. c) Si se emplea una velocidad de flujo de 7, 0cm/min ¿qu´e tiempo se necesitar´ a para eluir las dos especies si la longitud de empaquetamiento de la columna es de 9, 8cm? Soluci´ on. a)El factor de capacidad ser´ a:  = KA kA

VS = 6, 01 · 0, 422 = 2, 5362, VM

 = KB kB

VS = 6, 20 · 0, 422 = 2, 6164. VM

y

b)El factor se selectividad ser´ a: α=

 kB  = 1, 03 kA

c)Ahora las velocidades se pueden obtener a partir de la velocidad del eluyente y del factor de capacidad: vA = u

1 1 = 1, 98cm/min = 7, 0  1 + kA 1 + 2, 5362

y vB = u

1 1  = 7, 0 1 + 2, 6164 = 1, 94cm/min. 1 + kB

Luego los tiempos para una determinada longitud ser´an: tA =

L = 4, 95min vA

tB =

L = 5, 05min. vB

y

´ ´ Y ANALISIS ´ 7.2. TECNICAS DE SEPARACION

277

Resoluci´ on Como ya hemos visto, en un cromatograma van apareciendo sucesivos picos o bandas correspondientes a las distintas sustancias que componen la muestra. Sin embargo, cuando estos picos aparecen muy juntos pueden llegar a verse como un u ´nico pico. La capacidad para separar gr´ aficamente dos analitos es lo que se denomina resoluci´ on. Se define el factor de resoluci´ on Rs a la relaci´on entre la separaci´ on temporal de los picos y la anchura media de los picos (Fig. 7.13). 2 [(tR )B − (tR )A ] , WA + WB donde WA y WB son las anchuras de las bases de los picos del analito A y B, respectivamente. Cuando Rs = 0, 5 la separaci´on entre los picos es igual a la mitad de la base media de las bandas; cuando Rs = 1, 0 se aprecian separados ambos picos (la separaci´on es igual a la anchura media de las bandas). Se considera que la separaci´on de los picos es completa cuando Rs > 1, 5. Rs =

Eficacia de una columna cromatogr´ afica La eficacia de una columna cromatogr´afica es el grado de ensanchamiento de bandas que experimenta una muestra al atravesar la columna. Es decir, mide la capacidad de la columna para ensanchar los picos. La anchura es consecuencia directa de la difusi´ on de las part´ıculas de soluto a trav´es de la fase estacionaria. Al existir un n´ umero elevado de part´ıculas de soluto (del a que algunas difundir´ an m´ as en el medio estacionario, orden de NA ) ocurrir´ mientras que otras difundir´ an menos y pasar´an de nuevo la fase m´ ovil en la que ser´an arrastradas. El proceso de eluci´on ser´a un conjunto de transferencias continuas de una fase a otra, de modo que cuanto mayor sea el tiempo que permanece el soluto en la columna mayor ser´an las diferencias entre part´ıculas m´as difundidas y menos difundidas produci´endose el ensanchamiento de la banda. El efecto de la velocidad de eluci´on puede verse en la figura 7.14. Cuando la velocidad es muy lenta (Fig. 7.14(a)) todos los picos se separan bien pero algunos aparecen muy anchos (5 y 6); cuando es muy r´ apida (Fig. 7.14(b)) los picos son estrechos pero algunos quedan sin resolver (1 y 2); la velocidad ideal debe dar un cromatograma con picos resueltos y suficientemente estrechos (Fig. 7.14(c)). Por razones hist´ oricas el par´ametro que mide la eficacia de una columna se denomina altura de plato (H), en referencia a los platos que constitu´ıan

278

´ ´ CAP´ITULO 7. TECNICAS E INSTRUMENTACION

Figura 7.14: Efecto de la velocidad de eluci´on (sobre un cromatograma ficticio): a) picos separados y ensanchados, b) picos estrechos pero sin resolver, c) cromatograf´ıa bien resuelta. las columnas de fraccionamiento para separar hidrocarburos. A partir de la varianza (σ 2 ) de las curvas o bandas, se define la altura de plato como la varianza por unidad de longitud de columna: σ2 , (7.7) L donde la varianza se mide sobre la gaussiana del perfil del analito a la salida de la columna (Fig. 7.15). Como la dimensi´ on de la varianza es una longitud al cuadrado, las unidades de la altura de plato ser´ an de longitud (normalmente se da en cent´ımetros). La varianza de una gaussiana representa la anchura de la campana tal que el ´area comprendida entre L − σ y L + σ es aproximadamente el 86 % del ´area total de la curva; es decir, el intervalo en el que pasa por el detector el 86 % de las mol´eculas de analito eluido. En analog´ıa con las columnas de fraccionamiento, cada plato representa un equilibrio te´ orico de distribuci´on del soluto entre las fases. La altura de plato puede entenderse como la anchura de la banda por unidad de distancia recorrida, es decir, indica c´omo se va ensanchando la banda a medida que avanza en la columna. Para cuantificar la eficacia de una columna se utiliza tambi´en el n´ umero de platos. Este par´ametro representa el n´ umero de platos te´oricos que hay en una columna: H=

´ ´ Y ANALISIS ´ 7.2. TECNICAS DE SEPARACION

279

Figura 7.15: La altura de plato de una columna cromatogr´afica se estima como la anchura de la banda a la salida por unidad de distancia recorrida.

L . (7.8) H Cuanto mayor sea el n´ umero de platos mayor ser´a la eficiencia de la columna cromatogr´afica. A partir de la ecuaci´ on (7.7) tambi´en puede escribirse el n´ umero de platos como N=

L2 . (7.9) σ2 Para estimar experimentalmente la altura de plato hay que hacer uso del cromatograma. La varianza del perfil del analito a la salida de la columna se puede relacionar con la curva del cromatograma, dado que la velocidad media de avance del perfil del analito es la longitud de la columna entre el tiempo de eluci´on, N=

vm =

L . tR

As´ı pues, la anchura en el cromatograma correspondiente al tiempo de eluci´on del analito estar´ a relacionada con la anchura del perfil del analito de la forma:

280

´ ´ CAP´ITULO 7. TECNICAS E INSTRUMENTACION

Figura 7.16: Estimaci´on de la anchura de un pico cromatogr´afico para el c´alculo de la altura de plato.

τ=

σ , L/tR

(7.10)

donde τ es la varianza del pico del soluto en el cromatograma y L es la longitud de empaquetado de la columna. Para estimar ahora la anchura del pico del cromatograma podemos recurrir a un procedimiento gr´afico que nos da un valor bastante aproximado. Consiste en prolongar las rectas tangentes a los lados del pico cromatogr´ afico en el punto de inflexi´ on de sendos lados, creando as´ı un tri´ angulo con base en el eje del cromatograma (como se muestra en la figura 7.16). Este tri´angulo as´ı creado tiene un a´rea aproximada del 96 % del ´area total; este ´area equivale a la integral de la gaussiana en un entorno de 2σ respecto a su m´aximo. Luego la anchura de este tri´angulo equivale a W = 4τ . Sustituyendo ahora en la ecuaci´ on (7.10) podemos obtener un valor estimado para la varianza del perfil del analito: σ=

L·W , 4tR

(7.11)

que sustituido en la definici´on de la altura de plato (Ec. (7.7)) nos dar´ıa un valor experimental de dicho par´ ametro.

´ ´ Y ANALISIS ´ 7.2. TECNICAS DE SEPARACION

H=

281

L · W2 . 16t2R

El n´ umero de platos se obtendr´ıa, a partir de (7.8) como: N=

16t2R . W2

Problema. Una columna cromatogr´ afica tiene una longitd de empaquetado de 24, 7cm. En un cromatograma se mide, para una sustancia A, un tiempo de retenci´on de 3, 5min y presenta una anchura de la base del pico de 0, 95min. Calcular el n´ umero de platos y la altura de plato de la columna. Soluci´ on. La varianza de la banda se puede calcular a partir del tiempo de retenci´ on y de la anchura de la base en el cromatograma: σ=

24, 7 · 0, 95 L·W = 1, 676cm. = 4 · tR 4 · 3, 5

El n´ umero de platos ser´a, entonces, N=

16 · t2R = 217, 2 W2

Y la altura de plato de la columna: H=

L · W2 = 0, 114cm. 16 · t2R

Problema. Se van a separar dos especies en una columna empaquetada con gel de s´ılice que tiene agua adsorbida. Los tiempos de retenci´ on de dos especies pr´oximas son tA = 2, 45min y tB = 2, 30min. a) ¿Cu´ antos platos se necesitan para conseguir una resolucion de 1, 5? b) ¿Qu´e longitud debe tener la columna para que la altura de plato del empaquetado sea 2 · 10−2 cm?

282

´ ´ CAP´ITULO 7. TECNICAS E INSTRUMENTACION

Soluci´ on. a) La resoluci´on se define a partir de los tiempos de retenci´on (tA y tB ) y las anchuras de pico como, 2 [tB − tA ] . Rs = WA + WB La anchura del pico se puede escribir en funci´on del tiempo de retenci´on (Ec.(7.11)): 4σ · tA , WA = L y como la anchura se relaciona directamente con el n´ umero de platos (Ec. (7.9)): 1 σ =√ , L N entonces

4 WA + WB  √ (tA + tB ) . N Luego la resoluci´on se puede escribir como: √ N (tB − tA ) . RS = 2 (tB + tA ) As´ı, para conseguir una resoluci´on de 1, 5 tendremos: √

N=

2 · RS [tB + tA ] = 95, [tB − tA ]

luego el n´ umero de platos ser´a: N = 9025. b) Como el n´ umero de platos se define como la altura de plato por unidad de longitud de columna, se puede expresar L en funci´ on de N y H: L = N · H. Luego para N = 9025 la longitud del empaquetamiento tendr´a que ser: L = 9025 · 2 · 10−2 = 180, 5cm.

´ ´ Y ANALISIS ´ 7.2. TECNICAS DE SEPARACION

7.2.4.

283

Espectrometr´ıa de Masas

Una t´ecnica muy importante para la identificaci´on de mol´eculas es a partir de la medida de su relaci´on masa/carga, m/q, en estado ionizado. Es especialmente importante para la detecci´on de macromol´eculas de peque˜ na masa −12 (m < 10 g). La idea fundamental es acelerar las mol´eculas ionizadas en campos el´ectricos para, a continuaci´ on, hacerlos girar por la acci´on de campos magn´eticos o el´ectricos (al tratarse de part´ıculas cargadas se pueden utilizar lentes electrost´aticas y/o magn´eticas para colimar y guiar el haz). El radio de giro vendr´ a dado por el equilibrio entre la fuerza centr´ıfuga (que depende de la masa) y la fuerza normal o de giro (que depende de la carga de la mol´eculas). Cuanto mayor sea la velocidad de entrada en el deflector mayor ser´a la separaci´on angular entre las distintas relaciones carga/masa. La fuerza que experimenta una part´ıcula cargada en movimiento, dentro de un campo magn´etico es la denominada Fuerza de Lorentz:    , FL = q v ∧ B donde ∧ es el s´ımbolo para el producto vectorial. Si el campo magn´etico es perpendicular a la trayectoria el m´odulo de la fuerza ser´a el producto del m´odulo de la velocidad por el m´odulo del campo magn´etico y multiplicado por la carga. Esta fuerza produce una trayectoria circular en el movimiento de la part´ıcula cargada. Dado que la part´ıcula tiene una cierta masa experimentar´ a una fuerza centr´ıfuga que es inversamente proporcional al radio de giro. A lo largo de la trayectoria ambas fuerzas son iguales pero de sentido contrario, luego

m

v2 = q · v · B. r

Se puede ver pues que, una vez introducidos dentro del campo magn´etico, las part´ıculas tendr´ an un radio de giro proporcional a su masa e inversamente proporcional a su carga: r=

m·v . q·B

(7.12)

´ ´ CAP´ITULO 7. TECNICAS E INSTRUMENTACION

284

Problema. ¿Qu´e diferencia espacial presentar´an dos iones, uno con valor masa/carga m/q = 5 · 10−11 kg/C y el otro con la misma masa y con el doble de carga, en un espectr´ ometro en el que se aceleran con un potencial de 10kV y se hacen girar en un deflector angular de π/2 con un campo de 0, 01T ? Soluci´ on. Al acelerarse los iones en un potencial, la velocidad alcanzada ser´ a: , q 1 2 mv = q · ΔV −→ v = 2 ΔV . 2 m Ahora, al entrar en un campo magn´etico el radio de giro es (Ec.(7.12)): , m 1 2 ΔV . r= B q De esta forma, para el primer i´on: r1 =

1 ( 10−3 2 · 10kV · 5 · 10−11 kg/C = −2 m = 0, 1m 0, 01T 10

y para el segundo, al tener el doble de carga su relaci´on m/q ser´a la mitad: r2 =

1 ( 10−3 2 · 10kV · 2, 5 · 10−11 kg/C = √ m = 0, 071m. 0, 01T 2 · 10−2

Como el deflector angular es de π/2 ambos iones describir´an sendos arcos tangentes en su origen (Fig. 7.17). Cuando van a salir, la separaci´on espacial ser´a igual a la diferencia de sus respectivos radios de giro, es decir: Δs = r1 − r2 = 100 − 71 = 29mm. Luego a la salida de la c´amara las part´ıculas se podr´an seleccionar por la posici´on ocupada seg´ un su radio de giro. Vemos que el valor del radio tiene una dependencia expl´ıcita en una caracter´ıstica propia de cada part´ıcula, su relaci´on masa/carga (m/q). Componentes b´ asicos El dise˜ no general de un espectr´ometro comprende un inyector, un ionizador, un acelerador, un selector de part´ıculas en funci´ on de su relaci´on car-

´ ´ Y ANALISIS ´ 7.2. TECNICAS DE SEPARACION

285

ga/masa y, finalmente, un detector. -Ionizador. Para que los iones sean acelerados y separados al desviarse en el campo magn´etico es necesario que el sistema se encuentre en condici´on de vac´ıo (para que no existan colisiones con las part´ıculas del aire). La muestra ha de ser transformada en i´ on gaseoso; para ello existen dos clases de fuentes de iones, las fuentes de gas y las fuentes de desorci´on. En las fuentes de gas las muestras se volatizan y posteriormente se ionizan sus componentes. Dentro de esta clase existen diferentes m´etodos de ionizaci´on, como son la ionizaci´on qu´ımica a presi´ on atmosf´erica (bombardeando los ´atomos gaseosos con un gas reactivo, como el metano, ox´ıgeno, amoniaco o hidr´ ogeno), por impacto electr´ onico (se generan electrones y se hacen colisionar con los ´atomos o mol´eculas del gas, M + e− → M + + 2e− , los iones moleculares positivos son acelerados por un campo el´ectrico) o por ionizaci´on por campo (al someter a las mol´eculas a un campo el´ectrico muy elevado). Las fuentes por desorci´ on no requieren que las mol´eculas se encuentren en estado gaseoso; mediante un haz dirigido a la superficie del material se van arrancando a´tomos de la fase condensada, permitiendo el an´alisis de mol´eculas no vol´ atiles y t´ermicamente inestables. Dentro de esta clase de fuente tambi´en hay varios tipos: desorci´on por campo (similar al de ionizaci´on por campo), desorci´on por l´ aser asistido por matriz o mediante bombardeo con ´atomos r´ apidos (xen´ on o arg´ on) -Acelerador. Para incrementar la velocidad de los iones se utiliza un acelerador formando por un generador de campo el´ectrico. Como el radio de giro es proporcional a la velocidad del i´on, cuanto mayor sea ´esta, m´as separados aparecer´ an los distintos iones. Una forma de seleccionar una velocidad determinada puede hacerse mediante la combinaci´on de un campo el´ectrico y otro magn´etico, estrat´egicamente colocados de forma que la direcci´on de las fuerzas el´ectrica y magn´etica sobre el i´on sea la misma. Como la fuerza magn´etica depende de la velocidad, se puede seleccionar ´esta ajustando el campo el´ectrico, igualando ambas fuerzas, de modo que contrarreste la magn´etica y evite desviarse al i´ on qE = qvB, donde directamente hemos expresado el m´odulo de las fuerzas el´ectrica y magn´etica (de Lorentz). Luego la velocidad del i´ on que no sufra desviaciones ser´a

286

´ ´ CAP´ITULO 7. TECNICAS E INSTRUMENTACION

Figura 7.17: Deflector magn´etico. Dentro de un campo magn´etico los iones girar´an con distinto radio seg´un su relaci´on masa/carga, seleccion´andose as´ı a la salida. v=

E . B

-Selector. De acuerdo a la forma de detectar y el tipo de medida podemos encontrar diversos tipos de espectr´ometros: a) De deflector magn´etico y/o el´ectrico. (Fig. 7.17). Al entrar el haz ionizado en el deflector, un campo magn´etico perpendicular a su trayectoria desv´ıa las part´ıculas con diferentes ´angulos de giro en funci´ on de su relaci´on masa/carga. La detecci´on se puede hacer seleccionando un determinado a´ngulo de giro (y por tanto un u ´nico tipo de part´ıculas con relaci´on m/q determinado) o con un detector multicanal que permite detectar simult´aneamente, para un intervalo de radios de giro, las distintas part´ıculas que tengan su radio de giro en dicho intervalo. b) De cuadripolo. (Fig. 7.18). El haz se hace pasar por un analizador en el que se crea un campo cuadripolar mediante cuatro barras entre las que se aplica unos potenciales de corriente continua y alterna ajustados de forma que se hace entrar en resonancia las part´ıculas que tengan una determinada relaci´ on carga/masa. De esta forma variando los potenciales aplicados se pueden ir seleccionando diferentes valores m/q.

´ ´ Y ANALISIS ´ 7.2. TECNICAS DE SEPARACION

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Figura 7.18: Selector por cuadripolo. Las barras crean un campo cuadripolar que hace entrar en resonancia las part´ıculas con distinta relaci´ on masa/carga a la especificada.

Figura 7.19: Detector por tiempo de vuelo. Los iones son acelerados por unos electrodos, siendo su velocidad dependiente de su relaci´on masa/carga.

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´ ´ CAP´ITULO 7. TECNICAS E INSTRUMENTACION

c) De tiempo de vuelo. (Fig. 7.19). En este tipo de espectr´ ometros se seleccionan las part´ıculas aceleradas que han tardado un tiempo espec´ıfico en recorrer una cierta distancia; para ello se utilizan pulsos de l´aser o pulsos el´ectricos que sincronizan el disparo con el tiempo de detecci´on. Despu´es de ser aceleradas por un potencial V , adquieren una cierta energ´ıa cin´etica y, por tanto: q·V =

1 mv 2 , 2

luego el tiempo que tarda en recorrer una distancia l despu´es de ser acelerado (tiempo de vuelo) ser´a (tv = l/v): , tv = l

m . 2·q·V

De esta forma los iones con menor relaci´on m/q llegar´an antes al detector. Sincronizando el tiempo de la detecci´ on a partir del disparo se pueden seleccionar las distintas part´ıculas. El inconveniente es que no todos los iones comienzan a moverse en el mismo instante y no todos alcanzan la misma velocidad, dando lugar a una cierta dispersi´on. Para solventar este problema (denominado “aberraci´on crom´atica” por analog´ıa con el problema en ´optica) se utilizan unos reflectores para alargar el recorrido y permitir una mejor sincronizaci´ on. d) De transformada de Fourier o de resonancia de ciclotr´ on. A partir de una bobina se hace entrar a los iones en o´rbitas de giro cada vez mayores al aplicarles una se˜ nal en resonancia con la frecuencia de ciclotr´on2 . Los iones as´ı girando emiten una radiofrecuencia que despu´es de medirse se calcula su transformada inversa de Fourier (se destransforma) obteniendo as´ı los picos de las distintas sustancias. Con este tipo de espectr´ometro se consiguen resoluciones muy altas.

2

El ciclotr´ on es un acelerador circular de part´ıculas cargadas en el que se las hace girar dentro de un campo magn´etico y se las acelera mediante un campo el´ectrico. Este campo se aplica en dos regiones diametralmente opuestas y en la direcci´on del movimiento, justo en el instante en que la part´ıcula pasa por ellas. La frecuencia de este campo el´ectrico ha de ser, por tanto, la misma que la de giro de las part´ıculas, y es la denominada frecuencia de ciclotr´ on, f = qB/2πm. Con esta frecuencia del campo el sistema entra en resonancia alcanzando energ´ıas muy elevadas.

´ ´ Y ANALISIS ´ 7.2. TECNICAS DE SEPARACION

289

Problema. ¿Cu´ antos datos por segundo deber´ıa proporcionar el sensor de un detector por tiempo de vuelo para discriminar sustancias con relaci´ on carga/masa, (q/m)A = 1,7 · 1010 C/kg y (q/m)B = 0,8 · 1010 C/kg, si la longitud de vuelo es de 1m y se aceleran con un potencial de 100V ? Soluci´ on. El tiempo de vuelo ser´a: , tv = l

1 m = ( q · 2V 10 2q/m

t1 = 0, 54 · 10−6 s; t2 = 0,79 · 10−6 s, luego,

Δtv = t1 − t2 = 0, 25 · 10−6 s = 0, 25μs.

Para que el sensor pueda detectar dos se˜ nales separadas temporalmente menos de 0, 25μs, el tiempo de lectura ha de ser menor que ´este y, por tanto, la frecuencia mayor que su inversa: f≥

1 = 4 · 106 datos/s. Δtv

Finalmente, vamos a definir el poder de resoluci´ on de un espectr´ ometro como la relaci´ on entre la masa del i´on detectado y la diferencia de masa de dos picos consecutivos, Δm: R=

m . Δm

Combinaci´ on con m´ etodos cromatogr´ aficos Para el estudio de sistemas muy complejos, como pueda ser una c´elula completa, la espectrometr´ıa de masas se combina con m´etodos cromatogr´aficos (Fig. 7.20), como la cromatograf´ıa l´ıquida de alta presi´ on (HPLC), cromatograf´ıa l´ıquida r´ apida (FPLC) o la cromatograf´ıa de gases (GC). La separaci´ on que proporciona la cromatograf´ıa unida a la descomposici´ on de la espectrometr´ıa da como resultado un espectro bidimensional. As´ı, por

290

´ ´ CAP´ITULO 7. TECNICAS E INSTRUMENTACION

Figura 7.20: Montaje combinado de espectr´ometro de masas acopado a un cromat´ografo.

Figura 7.21: Salida de un an´alisis combinado de cromatograf´ıa con espectrometr´ıa de masas. Para cada tiempo de eluci´on se obtiene una segunda descomposici´ on por su relaci´ on masa/carga.

´ ´ Y ANALISIS ´ 7.2. TECNICAS DE SEPARACION

291

Figura 7.22: Selector de inercia. Las part´ıculas de mayor tama˜no poseen m´as inercia y no pueden girar hacia las salidas laterales. En sucesivas etapas se pueden ir seleccionando tama˜ nos m´as peque˜nos.

ejemplo, con una cromatograf´ıa de intercambio i´onico aplicada sobre el extracto de una c´elula se puede obtener una resoluci´ on de 100, que combinada con una espectrometr´ıa de masas con poder de resoluci´on 10,000 da una resoluci´ on total de 1,000,000 para prote´ınas celulares de tama˜ no peque˜ no y medio (para cuyos tama˜ nos ambos m´etodos son bastante independientes). Como se ve en la figura 7.21 el resultado es un mapa bidimensional en el que para cada tiempo de eluci´on se obtiene una nueva separaci´ on dada por el espectr´ ometro seg´ un la relaci´on masa/carga de las sustancias eluidas. Aplicaciones biof´ısicas Aparte del inter´es propio en el campo del an´ alisis qu´ımico, desde el punto de vista biol´ ogico tiene importantes aplicaciones, especialmente cuando se utiliza como detector port´atil de sustancias biol´ogicas, tales como la detecci´on r´ apida de sustancias t´oxicas, virus, bacterias o ciertas prote´ınas. Como detector de agentes biol´ogicos el espectr´ometro de masas lleva incorporadas unas etapas iniciales para seleccionar y preparar las part´ıculas que van a ser analizadas. En primer lugar, en la etapa de selecci´ on del tama˜ no de part´ıculas incorpo-

292

´ ´ CAP´ITULO 7. TECNICAS E INSTRUMENTACION

ra un selector de inercia (Fig. 7.22). Este consiste en una boquilla aceleradora por la que entra el aerosol que se bifurca en unas ramas laterales por las que sale el flujo principal de aire transportando las part´ıculas peque˜ nas, y una peque˜ na abertura, en la direcci´ on de entrada, por la que pasa el flujo menor que transporta las part´ıculas grandes que tienen mayor inercia (y por tanto no tienen tiempo de girar). De esta manera, con sucesivos selectores se puede ir eliminando las part´ıculas grandes, qued´ andonos con las que tengan tama˜ no peque˜ no. Para preparar estas part´ıculas, se les hace pasar por un pirolizador (tubo en el que se pueden alcanzar altas temperaturas) que las descompone para hacerlas pasar finalmente por el espectr´ometro. La sensibilidad de este tipo de detectores puede ser de una part´ıcula de agente biol´ogico por litro, en menos de tres minutos. Otras aplicaciones importantes son la detecci´on de mutaciones en ADN, el diagn´ostico de enfermedades, la identificaci´on de prote´ınas, el an´alisis prote´omico, el estudio conformacional de prote´ınas, etc.

7.3.

Instrumentaci´ on de Medici´ on y Registro

Cuando se estudia un biosistema se pretende obtener una informaci´ on del sistema en cuesti´on de manera cualitativa o cuantitativa. En el primer caso la informaci´ on suele ser de tipo visual y para ello se utilizar´ an equipos o sistemas de obtenci´on y registro de im´ agenes. En el segundo caso se requiere una medici´on y recogida de datos con instrumentaci´on adecuada. Vamos a comenzar este cap´ıtulo por los equipos de medici´on y registro de magnitudes cuantificables. En la u ´ltima parte del cap´ıtulo veremos las caracter´ısticas de los dispositivos de obtenci´on y registro de im´ agenes, con algunos ejemplos concretos.

7.3.1.

Caracter´ısticas B´ asicas

El tipo de instrumentaci´ on que se va a requerir depender´a en cada caso del tipo de medida que se vaya a realizar, de la magnitud a medir y de las condiciones en las que se tenga que realizar dicha medida. Sin pretender hacer una lista de todos los tipos de instrumentos de medida y registro, vamos a ver las caracter´ısticas b´asicas que debemos exigir a un instrumento para que satisfaga nuestras necesidades, sin entrar en gran detalle, pero para tener las nociones b´asicas sobre instrumentaci´on en general.

´ Y REGISTRO 7.3. INSTRUMENTACION DE MEDICION

293

Rango Lo primero que debe considerarse a la hora de elegir un instrumento es el rango de medida. Rango es el intervalo de valores entre los que se puede encontrar la magnitud a medir. Cubre desde el valor m´ınimo al valor m´ aximo de una magnitud dentro del cual el instrumento est´ a dise˜ nado para medir con precisi´on. Siempre se buscar´a que el valor m´aximo del instrumento sea suficientemente mayor que el valor m´as elevado que esperamos encontrar en nuestra medida, con el fin de evitar el posible deterioro del equipo o la p´erdida de datos si ocurre alguna fluctuaci´ on. Por ejemplo, si pensamos que un circuito de presi´on puede alcanzar una presi´ on de 5,5bar, en lugar de utilizar un bar´ ometro cuya rango de medida es 0bar − 6bar ser´ıa m´as conveniente buscar otro cuyo fondo de escala fueran al menos 7bar − 8bar. Tambi´en hay que considerar el rango de los par´ ametros utilizados en la medida. Normalmente, dentro de las caracter´ısticas t´ecnicas de los aparatos, adem´as de indicarnos el rango de medida, viene indicado el rango en las variables ambientales (por ejemplo, temperatura y humedad) en las que el aparato est´a calibrado. En este sentido, aunque el aparato pueda medir y dar resultados fuera de ese rango no est´a asegurado que la medida sea fiable o, al menos, no tenga la fidelidad propia del aparato, como veremos m´ as adelante. Adem´as, deber´ a indicar el rango de los par´ametros utilizados en la realizaci´ on de la medida. Es decir, por un lado hay que tener en cuenta el rango de la medida que nos dice el valor m´ aximo y el m´ınimo (´este suele ser la sensibilidad del instrumento) entre los que vamos a poder medir y, por otro lado, los requisitos que han de cumplir las muestras para poder realizar dicha medida. Por ejemplo, si queremos medir la temperatura de una soluci´on, no s´olo debemos tener en cuenta el rango de temperatura que podr´ a alcanzar la muestra, sino tambi´en, por ejemplo, su pH o su compatibilidad qu´ımica con la sonda. Si nuestro dispositivo de medida es un espectrofot´ ometro, deber´a indicar cu´ al es el rango de longitudes de onda con las que trabaja; aunque la medida se obtiene a partir del flujo energ´etico, para cada longitud de onda, ´esta debe ser la adecuada para detectar el compuesto que estamos buscando. Tambi´en hay que tener en cuenta que, por lo general, cuanto mayor es el rango de medida de un instrumento, menor ser´a la capacidad para registrar diferencias peque˜ nas, como se ha mencionado anteriormente. Normalmente existir´a un elemento del equipo que sea sensible a la magnitud a medir, denominado transductor, como veremos a continuaci´on. La limitaci´on de utilizaci´on del instrumento vendr´ a dada, en gran medida, por las caracter´ısticas f´ısicas del transductor, de modo que cuando se quiere cambiar el rango de medi-

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´ ´ CAP´ITULO 7. TECNICAS E INSTRUMENTACION

da normalmente es necesario cambiar el transductor. De forma general, si un transductor es capaz de responder a una magnitud grande no podr´ a apreciar peque˜ nas diferencias. Precisi´ on Una vez que sabemos el rango en el que vamos a medir debemos especificar el grado de precisi´ on con el que queremos la medida, es decir, la fracci´on m´ as peque˜ na de unidad que queremos que el instrumento nos d´e de nuestra medida. A este par´ametro tambi´en suele llamarse sensibilidad. Aunque son conceptos similares existe una clara diferencia. La sensiblidad, s, es la capacidad del instrumento de amplificar una peque˜ na variaci´ on de la magnitud, Δx, para mostrarla como una variaci´on en el valor medido, Δy: s=

Δy . Δx

Es decir, la sensibilidad es el cociente entre la variaci´on observada en el instrumento y la variaci´ on de la magnitud detectada, aunque ambas diferencias sean de diferente especie; por tanto su unidad ser´a la del cociente de unidades. Sin embargo, la precisi´on tiene las mismas unidades que la magnitud a medir. La noci´on de precisi´on est´a relacionada con el concepto estad´ıstico de reproducibilidad o repetitibilidad. Esto quiere decir que encontramos siempre el mismo resultado cuando se realizan distintas medidas bajo las mismas condiciones pero en distintos instantes de tiempo, dentro de un error dado por la precisi´on del aparato. Tambi´en conviene aclarar que habitualmente se suele identificar la precisi´ on con el n´ umero de d´ıgitos que muestra el instrumento, sin embargo, esto no es del todo cierto. El n´ umero de d´ıgitos que muestra un instrumento viene dado por el n´ umero de cifras significativas de la medida. El n´ umero de cifras significativas es el n´ umero de cifras que se conocen, con precisi´on, de la medida, luego, el n´ umero de d´ıgitos depender´a de la precisi´on del aparato. Sin embargo, el n´ umero de d´ıgitos tambi´en depende del rango de medida. Esto quiere decir que con el mismo n´ umero de d´ıgitos la precisi´on ser´a distinta seg´ un el rango en el que estemos midiendo. En este caso, cuando se cambia el rango de medida en un instrumento normalmente cambiar´a la posici´on del punto decimal o el prefijo de la unidad de la medida. Pero ello no significa que tener menor n´ umero de d´ıgitos implique menos precisi´on. Un instrumento con pocos d´ıgitos puede tener m´as precisi´on que otro que muestre m´as d´ıgitos, depender´a de la fracci´on m´as peque˜ na de la magnitud que nos muestre.

´ Y REGISTRO 7.3. INSTRUMENTACION DE MEDICION

295

Normalmente estas dos propiedades, rango y precisi´ on, suelen ser contrapuestas: cuando un instrumento presenta un rango de medida muy amplio, suele tener una precisi´on peque˜ na, y viceversa, cuando tiene una gran precisi´on, el rango de medida suele ser muy estrecho. La mayor´ıa de los instrumentos electr´onicos de medida son digitales, esto quiere decir que son dispositivos que tienen una etapa de conversi´ on anal´ogica/digital. En este proceso, una se˜ nal el´ectrica anal´ogica es convertida en un digitalizador, pasando de ser un valor el´ectrico de determinado potencial o intensidad de corriente a un valor num´erico almacenado en una memoria; en esta conversi´on es determinante el n´ umero de bits utilizados en la digitalizaci´on. El proceso de digitalizaci´ on consiste, b´ asicamente, en asignar al valor el´ectrico de entrada el dato discreto m´as pr´ oximo dentro de un conjunto finito de valores. El n´ umero de posibles valores viene dado justamente por el n´ umero de bits utilizados. Con n-bits se pueden escribir 2n − 1 valores decimales; por ejemplo, con 12 bits se pueden tener umeros distintos. 212 − 1, es decir, 4095 valores distintos, y con 16 bits, 65535 n´ Hay que resaltar que el n´ umero de valores es exponencial con el n´ umero de bits, lo cual significa que con 16 bits se pueden escribir el doble de n´ umeros que con 15 bits y con 18 bits ocho veces m´ as. Este n´ umero de posibles valores que se pueden escribir determina el n´ umero de d´ıgitos que presentar´a el instrumento de la medida. En resumen, la precisi´on de un instrumento depende fundamentalmente de la sensibilidad del transductor, mientras que el n´ umero de d´ıgitos que presenta de la medida depende adem´ as del n´ umero de bits empleados en la conversi´on anal´ogico/digital.

Problema. Un instrumento de medida digital de 20-bits mide presiones con un fondo de escala de 20 bar. ¿Qu´e precisi´on tendremos en la medida de presi´on con dicho instrumento? Soluci´ on. El n´ umero de valores en los que se va a dividir el fondo de escala es : N = 220 − 1 = 1048575, luego el valor m´as peque˜ no que va a mostrar es ΔP =

20 = 1, 9 · 10−5  2 · 10−5 bar. 1048575

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´ ´ CAP´ITULO 7. TECNICAS E INSTRUMENTACION

Frecuencia de Muestreo Por u ´ltimo, y relacionado con el proceso de digitalizaci´on, hay que hablar ´ de la frecuencia de muestreo. Esta es el n´ umero de muestras por segundo que el dispositivo puede tomar o digitalizar. Tambi´en se puede definir el tiempo de medida como el tiempo empleado en realizar una medida. Este tiempo es igual a la inversa de la frecuencia de muestreo. Cuando el transductor proporcione una se˜ nal de manera continua la frecuencia de muestreo vendr´a dada por la frecuencia de digitalizaci´ on del equipo. Cuando el proceso de medida tenga un tiempo de respuesta o un tiempo muerto (tiempo en el que el sensor no puede medir por tener que inicializarse antes de volver a hacer otra medida) la frecuencia de muestreo vendr´a determinada por el mayor de estos tiempos (incluyendo el tiempo de digitalizaci´ on). De esta forma, la frecuencia de muestreo ser´a la inversa del mayor de los tiempos. Normalmente, la frecuencia de muestreo y la precisi´ on suelen estar en contraposici´on, es decir, cuanta mayor precisi´on queramos exigirle a un instrumento menor ser´a su frecuencia de muestreo. Esto se debe a que para conseguir mayor precisi´on los aparatos suelen realizar una cantidad de medidas auxiliares para posteriormente promediarlas. Por otra parte, los aparatos digitales suelen disponer de una memoria en la que almacenan los datos registrados. La capacidad de memoria va a determinar el tiempo total durante el cual podemos almacenar datos. El tiempo total de muestreo va a ser la capacidad total de memoria (cu´antos datos puede almacenar) dividida por la frecuencia de muestreo. Por lo tanto, si queremos almacenar datos durante un determinado tiempo largo nos podemos encontrar con una limitaci´ on en la frecuencia de muestreo. La m´axima frecuencia de muestreo ser´a la capacidad de memoria dividida por el tiempo de recogida de datos. Finalmente vamos a comentar los conceptos de exactitud y fidelidad de una medida. La exactitud de la medida es la certeza de que la magnitud medida se corresponde con el valor real de la magnitud. Aunque esto es imposible de afirmar, existen formas de tener cierta seguridad de que un valor est´ a suficientemente pr´oximo al hipot´etico valor real. Para ello se suele recurrir a los patrones y a las calibraciones. La seguridad de que la medida realizada es fiel vendr´ a dada por el certificado de calibraci´on que venga acompa˜ nando al equipo. Este certificado nos asegura que toda medida realizada con el aparato se corresponder´ a, dentro de la precisi´on del mismo, con la que se obtendr´ıa con los m´etodos utilizados en la

´ Y REGISTRO 7.3. INSTRUMENTACION DE MEDICION

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calibraci´ on del equipo (que han de cumplir unos requisitos de estandarizaci´on). Adem´as, en este certificado figurar´ a el rango, la precisi´on y las condiciones con las que se ha realizada dicha calibraci´on. Es importante pensar que si no existe una calibraci´ on previa del equipo no podemos tener ninguna confianza en que los valores medidos sean fiables.

7.3.2.

Instrumentaci´ on Electr´ onica

Todo instrumento electr´onico consta de cuatro partes b´asicas: la fuente de alimentaci´on, el transductor, la electr´ onica de tratamiento y amplificaci´on de la se˜ nal, y una salida (o bien un lugar donde se representa el valor medido, o bien una via de comunicaci´on con un ordenador). El principio b´ asico de cualquier instrumento de medida consiste en interaccionar con la muestra mediante un dispositivo que modifique alguna propiedad, de manera directa o indirecta, con la magnitud a medir. A continuaci´ on debe conseguirse transformar esa variaci´ on, si no lo es ya, en una variaci´on de una propiedad el´ectrica (resistencia, capacidad, voltaje, etc.). De esta forma tenemos una se˜ nal el´ectrica cuyo valor est´a directamente relacionado con la magnitud medida. Posteriormente, mediante un circuito electr´onico adecuado, se filtrar´a dicha se˜ nal (para eliminar fluctuaciones ajenas a las de la se˜ nal), se amplificar´ a y se tratar´a adecuadamente para, finalmente, ser representada. Esta u ´ltima etapa simplemente deber´a reescalar el valor de la se˜ nal el´ectrica al valor de la magnitud medida, procesarla adecuadamente y enviar ´esta al sistema de representaci´on del equipo, ya sea un pantalla alfanum´erica (display) o un monitor. Transductor Es el elemento encargado de interaccionar con la muestra, de manera que modifique alguna propiedad caracter´ıstica relacionada de manera directa o indirecta con la magnitud medida. A continuaci´ on debe transformar ese cambio en una variaci´ on de una propiedad el´ectrica (si no lo es ya), como resistencia, capacidad, voltaje, autoinducci´ on, etc., guardando una correspondencia un´ıvoca con la magnitud medida. Es la fase m´as importante y la que define realmente la magnitud y el rango que se puede medir. Normalmente podemos cambiar la resoluci´on (o a veces el tipo de medida) cambiando la sonda o el elemento transductor. En la pr´ actica existen numerosos instrumentos mutimedida, en el que cambiando la sonda o el dispositivo en el que se realiza la medida (en el que se sit´ ua el transductor) se puede trabajar

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´ ´ CAP´ITULO 7. TECNICAS E INSTRUMENTACION

Figura 7.23: Esquema de un sensor de presi´on. El movimiento de la membrana produce una variaci´ on en la capacidad del condensador. La medida de esta capacidad est´a relacionada de manera directa con la presi´ on.

como si se dispusiese de otro instrumento de medida distinto. Vamos a comentar, como ejemplo, el principio f´ısico en el que se basan algunos transductores. Los instrumentos de medida de temperatura suelen tener como sonda un elemento termorresistivo, de modo que un cambio en la temperatura se traduce en un cambio en su resistencia el´ectrica. Existen varios tipos de termorresistores. Los m´as utilizados son las resistencias de platino y los termistores. Las primeras son peque˜ nos elementos de platino cuya resistencia var´ıa linealmente con la temperatura, dentro de un rango de −50o C hasta 550o C. Los termistores son elementos semiconductores cuya variaci´on con la temperatura no es lineal sino logar´ıtmica. Esta propiedad permite cubrir m´as rango de temperaturas. Midiendo con buena precisi´ on la resistencia ser´a muy f´acil su conversi´on a temperatura. Para medir presiones, adem´as de los instrumentos anal´ogicos de medida directa, se pueden utilizar los instrumentos electr´ onicos que adem´as nos permiten hacer un registro de dichas medidas. Los instrumentos electr´onicos utilizan un transductor constituido por un conjunto de cuatro resistencias de material el´ astico, en configuraci´on de puente de Wheatstone, y unido a un diafragma. Al desplazarse el diafragma, por efecto de la presi´ on, dos de las ramas del puente se estiran y otras dos se contraen, cambiando el valor de las resistencias. De forma similar se puede hacer con condensadores, como se muestra en la figura 7.23, de manera que al desplazarse el diafragma se mueve una placa de un condensador variando as´ı su capacidad; mediante circuitos oscilantes se comparan las capacidades del condensador variable (C1 ) y el de referencia (C2 ).

´ Y REGISTRO 7.3. INSTRUMENTACION DE MEDICION

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Figura 7.24: Representaci´on de una se˜nal el´ectrica. a) Con ruido normal. b) Con ruido que imposibilita discrimar la se˜nal.

Amplificador Una vez tenemos una propiedad el´ectrica variable (relacionada un´ıvocamente con la magnitud a medir), mediante un circuito electr´onico adecuado se filtrar´ a (para eliminar ruidos externos), se tratar´ a adecuadamente y se amplificar´ a la se˜ nal. Esta etapa de tratamiento y amplificaci´ on es muy importante y delicada. Hay que pensar que algunas se˜ nales procedentes de determinadas medidas son extremadamente peque˜ nas, por ejemplo, los potenciales en las transmisiones neuronales. La etapa de la amplificaci´ on ser´a crucial para tener una medida fiable. Las caracter´ısticas b´asicas de un amplificador son la ganancia, el ruido, la respuesta en frecuencia y la impedancia de entrada. -Ganancia. La ganancia es la relaci´ on entre el voltaje de salida respecto al que ten´ıa de entrada. El elemento b´asico de los amplificadores actuales es el amplificador operacional. Este componente, trabajando en bucle cerrado puede amplificar la se˜ nal de entrada hasta varios ´ordenes de magnitud, y presenta una impedancia de entrada tan grande que pr´ acticamente queda aislado el circuito de entrada del de salida; esto hace que la corriente de entrada sea despreciable. Por esta caracter´ıstica tambi´en puede ser utilizado como convertidor corrientevoltaje (produce un voltaje proporcional a la corriente de entrada). Esto es muy u ´til cuando se trabaja con transductores cuya salida es una se˜ nal de corriente como, por ejemplo, los fotodiodos.

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´ ´ CAP´ITULO 7. TECNICAS E INSTRUMENTACION

-Ruido. La precisi´on del instrumento vendr´ a dada por la se˜ nal m´ as peque˜ na que es capaz de discernir y cuantificar, cuyas variaciones no se puedan atribuir al ruido. Hay que a˜ nadir que, adem´ as del ruido considerado como las fluctuaciones espurias de la se˜ nal, hay que tener en cuenta el propio ruido de los circuitos electr´onicos que impedir´a precisar m´as en la medida. Es pr´acticamente imposible que dentro de un equipo electr´ onico no aparezcan potenciales el´ectricos indeseables que se a˜ naden a la se˜ nal. Estos potenciales no son producidos por ninguna fuente concreta y aparecen como peque˜ nas fluctuaciones que se superponen a la medida. Estas fluctuaciones espurias no tienen gran importancia cuando su amplitud es mucho menor que las de la medida (Fig. 7.24(a)); sin embargo, cuando la se˜ nal es muy peque˜ na puede llegar a enmascararla (Fig. 7.24(b)). La caracter´ıstica de un amplificador que indica cu´ anto puede llegar a representar el ruido en el proceso de amplificaci´on ´ es la denominada “relaci´ on se˜ nal-ruido”. Este valor indica cu´antos o´rdenes de magnitud se mantiene la se˜ nal respecto a las m´aximas amplitudes del ruido. -Respuesta en frecuencia. Cuando la magnitud que se mide es constante o de variaciones lentas no existen dificultades para amplificar la se˜ nal; sin embargo, cuando la medida es en s´ı una se˜ nal con r´ apidas fluctuaciones puede ocurrir que la electr´onica no sea capaz de seguir estas variaciones. Cuando se va a trabajar con se˜ nales as´ı es necesario verificar que la frecuencia m´as alta en la medida est´a dentro del rango de la respuesta en frecuencia del amplificador. En este gr´afico se representa la ganancia del amplificador en funci´ on de la frecuencia de la se˜ nal (´esta en escala logar´ıtmica para cubrir varios o´rdenes de magnitud). La ganancia suele ser constante hasta un valor m´aximo de la frecuencia, a partir de la cual la ganancia ya no puede mantener su valor y decae hasta cero. -Impedancia de entrada. Dentro de la complejidad electr´ onica de un amplificador la entrada del equipo puede representarse por una resistencia, denominada impedancia de entrada (se habla de impedancia en lugar de resistencia por tratarse de circuitos de corriente alterna) a la que se aplica la tensi´on de entrada. En la figura 7.25 se muestra un esquema el´ectrico en el que est´a representada la impedancia (Zin ) de entrada como un elemento conectado en paralelo a la se˜ nal de entrada, la cual se representa, a su vez, con una impenal en la entrada dancia de salida (Zext ). Es decir, cuando se le aplica una se˜ existir´a un peque˜ no paso de corriente a trav´es de esa hipot´etica impedancia, entre los puntos A y B. Cuanto mayor sea el valor de esta impedancia de entrada menor ser´ a la corriente que lo atraviese (seg´ un la ley de Ohm) y, por

´ Y REGISTRO 7.3. INSTRUMENTACION DE MEDICION

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Figura 7.25: Esquema de la entrada a un amplificador con una impedancia de entrada finita.

tanto, menor ser´a la p´erdida de tensi´ on a la entrada. Esta impedancia tiene que ser muy elevada porque es la responsable de que parte de la corriente que circula por el circuito externo a medir se derive, falseando as´ı la medida. Por otra parte, es aconsejable que la impedancia del circuito externo (sonda, transductor, equipo de medida, etc.) sea peque˜ na en comparaci´ on con la impedancia de entrada del amplificador (por el mismo motivo). La ca´ıda de potencial que se medir´a vendr´ a dada por la relaci´ on de impedancia:

ΔVin ∝

Zex , Zin + Zex

con Zext ω2 ), cuando se sit´ ua a menor distancia. Para esta definici´on normalmente se considera el objeto situado en el punto de visi´ on c´ omoda del observador, fijada en 250 mm. En este caso si, por ejemplo, estamos utilizando una lupa de aumento 4X nos dar´ a la sensaci´on de ver la imagen cuatro veces m´as grande porque el ´angulo con el que se ve es cuatro veces mayor que el ´angulo bajo el que ver´ıamos el objeto a ojo desnudo. Por otra parte, hay que se˜ nalar que el aumento visual real depender´a de la posici´ on del objeto y la distancia de trabajo del observador, como puede comprobarse experimentalmente con una simple lupa. Por ello, para las lupas se define el aumento normal (o aumento comercial) situando al objeto en la focal de la lupa y considerando una distancia de visi´ on c´ omoda de 250 mm. El aumento total de un instrumento compuesto (por ejemplo, un microscopio est´a compuesto por un objetivo y un ocular) es el producto de los aumentos de cada uno de sus elementos; y si se trata de una imagen final obtenida a trav´es de una serie de procesos (im´agenes intermedias), siempre que estos mantengan las proporciones originales de la imagen, el aumento total ser´a el producto de los aumentos laterales en cada uno de los procesos. Ilustr´emoslo con un ejemplo. Supongamos que tomamos una imagen a trav´es de un microscopio con un objetivo 20X y le acoplamos la c´amara a trav´es de un adaptador 1,5X. Este acoplamiento sustituye al ocular porque ´este proporciona una imagen virtual para ser vista por el ojo, no para ser recogida en un soporte material, luego en este caso no se tendr´ a en cuenta el aumento del ocular. As´ı pues, a la salida del microscopio tendremos un aumento de 35X. Recordamos tambi´en

´ 7.4. OBTENCION DE IMAGENES

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Figura 7.26: Formaci´on de la imagen en retina. El tama˜no aparente depende del ´angulo con el que llegan los rayos. Aunque el tama˜no del objeto es el mismo al situarse m´as cerca el ´angulo subtendido es mayor (ω1 > ω2 ) y, por tanto, su tama˜ no en retina (tama˜ no aparente) tambi´en es mayor.

que las c´amaras, fotogr´ aficas o de v´ıdeo, cuando se acoplan al microscopio lo hacen directamente sin su objetivo, por lo que tampoco se tendr´a en cuenta los aumentos de la ´optica de la c´amara. Si la imagen se recoge en una pel´ıcula (negativo) de 35 mm, y luego se amplia a papel de 20 cm (´estas suelen ser las dimensiones horizontales, guardando una proporci´ on constante con sus respectivos tama˜ nos verticales) estamos consiguiendo un aumento en esta etapa de 200/35, es decir, 5,7X. Con lo que el aumento total ser´a de 35 multiplicado por 5,7 es decir, 200X. Esto se traduce en que, por ejemplo, una part´ıcula que en nuestra fotograf´ıa tenga un tama˜ no de 2 mm, su tama˜ no real ser´a de 10 micras. Campo El campo es la regi´ on tridimensional del espacio de la que el instrumento proporciona im´ agenes n´ıtidas. Esta caracter´ıstica es complementaria al aumento, puesto que si queremos ver m´as campo tenemos que sacrificar el aumento, y viceversa, a mayor aumento menor campo. Normalmente se estudia de forma separada el campo axial y el campo transversal. En la figura 7.27 se representan algunos par´ ametros relacionados con la captura de imagen a trav´es de una c´amara: la distancia de trabajo, los campos transversal y axial (denominado profundidad de campo) y el tama˜ no del sensor.

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´ ´ CAP´ITULO 7. TECNICAS E INSTRUMENTACION

El campo transversal es la porci´ on del plano perpendicular al eje o´ptico que es visible a trav´es del instrumento. Sin embargo, hay que se˜ nalar que no todos los puntos del campo transversal se ven con igual iluminaci´on a la salida del instrumento, ya que existe una regi´ on de la periferia desde cuyos puntos ciertos rayos no llegan a atravesar todo el sistema ´optico. Este es el fen´omeno denominado vi˜ neteo. El elemento f´ısico que limita la cantidad de luz que entra en el instrumento se denomina diafragma (puede ser el propio di´ ametro de una lente o un elemento colocado expresamente para ese fin). La regi´on de campo cuyos puntos presentan en la imagen todos igual iluminaci´on se denomina campo de iluminaci´ on plena; por el contrario, el l´ımite del campo transversal estar´a constituido por los puntos de los que u ´nicamente un u ´nico rayo l´ımite atravesar´a el sistema, constituyendo el denominado campo de iluminaci´ on l´ımite. Entre el campo de iluminaci´on plena y el campo de iluminaci´ on l´ımite existe una regi´ on (en forma de corona circular por la simetr´ıa de las lentes) en la que la iluminaci´on ir´ a decreciendo de forma paulatina al alejarnos del eje ´optico. Para solucionar este problema de iluminaci´on se suele colocar un diafragma (denominado diafragma de campo) de tama˜ no y ubicaci´ on determinados para eliminar el vi˜ neteo o, al menos, restringir el campo al denominado campo de iluminaci´ on media de donde aproximadamente la mitad de los rayos atravesar´an el sistema ´optico. El campo axial es la longitud, medida en la direcci´on del eje ´optico, cuyos puntos generan im´ agenes aceptablemente n´ıtidas a trav´es del instrumento. Los fen´omenos que limitan este campo axial son de naturaleza diferente en los instrumentos objetivos de los instrumentos subjetivos. En los instrumentos objetivos el campo axial se denomina profundidad de campo, y es debido a la naturaleza discreta del elemento receptor de la imagen (tama˜ no de grano de la pel´ıcula, tama˜ no del p´ıxel en una c´amara digital, etc.). Un punto situado delante del plano enfocado producir´ a como imagen un punto borroso (pseudoimagen) de un cierto tama˜ no. Mientras el tama˜ no de la pseudoimagen sea menor que la dimensi´ on del fotorreceptor, podremos decir que la imagen sigue enfocada. A la distancia entre los puntos anteriores y posteriores al plano enfocado en los que se consigue una imagen aceptable en el plano imagen se denomina profundidad de campo; entre dichos puntos la imagen quedar´ a enfocada. En los instrumentos subjetivos el campo axial depende de la capacidad de acomodaci´ on del observador, puesto que ´este ver´a enfocado un punto mientras se encuentre situado entre su punto remoto (punto lejano que puede ser visto n´ıtidamente, es decir, sus rayos convergen en la retina) y su punto pr´oximo (punto m´ as cercano que se puede enfocar haciendo un esfuerzo de acomoda-

´ 7.4. OBTENCION DE IMAGENES

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Figura 7.27: Par´ametros relacionados con el campo y el aumento al trabajar con una c´amara.

ci´on). A la distancia entre estos puntos es lo que se define como profundidad de enfoque, y abarca todos los puntos de los que el observador puede obtener una imagen enfocada gracias a un esfuerzo de acomodaci´on (cuando el objeto se encuentre en su punto remoto el esfuerzo de acomodaci´on ser´a nulo, mientras que cuando se encuentre en su punto pr´ oximo el esfuerzo de acomodaci´on ser´a m´aximo). Luminosidad La luminosidad o claridad de un instrumento o´ptico es un par´ ametro que indica la relaci´on entre la cantidad de luz de la imagen (con que sale del instrumento) y la cantidad de luz emitida por el objeto observado (esta luz emitida puede ser por transmisi´on, si se trata de un objeto muy delgado como en los microscopios, o por luz reflejada por el objeto cuando es iluminado por una fuente de iluminaci´on externa). Las definiciones de luminosidad, flujo luminoso y otras magnitudes fotom´etricas escapan del prop´osito de introducir de forma cualitativa los par´ ametros fundamentales de los instrumentos ´opticos; por ello no vamos a exponer las ecuaciones correspondientes a la luminosidad de una imagen proporcionada por un instrumento o´ptico (de nuevo, las expresiones son distintas seg´ un se trate de un instrumento objetivo o de uno subjetivo). Simplemente indicaremos que esta luminosidad es inversamente proporcional

´ ´ CAP´ITULO 7. TECNICAS E INSTRUMENTACION

308

al cuadrado del aumento lateral y directamente proporcional al factor de transmisi´on (relaci´ on entre la intensidad luminosa que sale de una lente y la que ha entrado) de todas las lentes que forman el instrumento. De esta forma, cuando multiplicamos por dos el aumento, la luminosidad se hace cuatro veces menor.

7.4.2.

´ Microscopio Optico

Formalmente, microscopio ser´ıa cualquier instrumento ´optico subjetivo capaz de crearnos una imagen visible de objetos diminutos (no visible a ojo desnudo). Esta definici´ on incluir´ıa a las lupas de gran aumento. La idea b´asica del microscopio (denominado compuesto) consiste en a˜ nadirle a la lupa otro elemento convergente de modo que aumente la imagen creada por ´esta (de ah´ı el nombre original de microscopio compuesto). As´ı pues, el microscopio es un sistema compuesto, formado por una lente (o sistema de lentes) convergente, denominado objetivo, que crea una imagen aumentada de un objeto diminuto, al que se le a˜ nade, a una cierta distancia, una segunda lente (en la pr´ actica tambi´en ser´a un sistema de lentes), denominado ocular, que permite ver aumentada la imagen creada por el objetivo. Adem´as de poseer m´as aumento que una simple lupa, el microscopio presenta otras mejoras, como mayor luminosidad y mayor campo visual con menos aberraciones (adem´as ´estas son m´as f´ aciles de corregir). Estructura El primer elemento, el objetivo, es un sistema convergente con una distancia focal muy peque˜ na. Cuando en un sistema convergente as´ı se sit´ ua el objeto a una distancia mayor que su distancia focal, fob , ´este forma una imagen mayor, invertida y real (detr´as del sistema), aunque a gran distancia. El segundo elemento, el ocular, se sit´ ua detr´ as de aqu´el, a una distancia tal que la  y el foco objeto del ocular, F , distancia entre el foco imagen del objetivo, Fob oc llamada longitud o ´ptica o intervalo o ´ptico, sea una distancia fija, t, (para que las f´ ormulas sean las mismas para todos los microscopios todos los fabricantes han adoptado un mismo valor, t = 160mm). As´ı, el objeto se coloca delante del objetivo de forma que la imagen dada por ´este se forme en el plano focal objeto del ocular. De esta manera la imagen final que crea de esta imagen intermedia est´a en el infinito (un observador em´etrope no necesita acomodar para ver la imagen a trav´es del microscopio). En la figura 7.28 se muestra el objeto (a), su imagen a trav´es del objetivo, (b) y la imagen de ´esta dada por el ocular, (c); finalmente de esta imagen el ojo forma una imagen en retina (d).

´ 7.4. OBTENCION DE IMAGENES

309

Figura 7.28: Esquema de la formaci´on de las distintas im´agenes a trav´es de un microscopio: (a) objeto, (b) imagen dada por el objetivo, (c) imagen formada por el ocular, (d) imagen final formada sobre la retina del ojo.  , se puede calcular a La f´ ormula para la distancia focal del microscopio, fm partir de la expresi´ on para un sistema compuesto:

 = fm

 · f −fob oc . t

Como las focales del objetivo y ocular son peque˜ nas (especialmente la del objetivo) y adem´ as est´an divididas por un valor relativamente grande, la focal del microscopio va a ser muy peque˜ na. Aumento normal Para calcular el aumento del microscopio hay que tener en cuenta que es un sistema compuesto, luego ser´a el producto del aumento del objetivo multiplicado por el aumento del ocular. El objetivo crea una imagen real y su  , se puede calcular a partir de: aumento lateral, βob

310

´ ´ CAP´ITULO 7. TECNICAS E INSTRUMENTACION

 = βob

−t  . fob

Como el ocular crea una imagen virtual su aumento se define a partir del aumento normal, Γoc (para instrumento subjetivo) Γoc =

250 ,  foc

expresando la distancia focal en mil´ımetros. Luego el aumento normal del microscopio, Γm , ser´a el producto de ambos:  · Γoc = Γm = βob

−t · 250 250 =  .   fob · foc fm

De esta expresi´on se puede deducir que cuanto menor sea la distancia focal  , mayor ser´ a el aumento (igual que sucede con las lupas), del microscopio, fm pero al tratarse de una focal negativa el aumento tambi´en ser´a negativo, lo que significa que la imagen final que da el microscopio ser´ a invertida. As´ı, por ejemplo, un aumento normal de 100X implica una distancia focal del microscopio de 2, 5mm. Desde el punto de vista comercial, el aumento de los microscopio suele expresarse como el producto de dos valores M x N, donde M es el aumento del objetivo (en el que figurar´ a la marca “M x”), y N es el aumento comercial del ocular (en el que figurar´ a la marca “x N”). Como las distancias focales de los microscopios son tan peque˜ nas, la profundidad de enfoque tambi´en es muy peque˜ na. Esta distancia, para el caso del microscopio se puede calcular como 2 · AA, Δe = f m

donde AA es la amplitud de acomodaci´on normal. Para un microscopio de 100 aumentos y para una amplitud de acomodaci´on normal de 4 dioptr´ıas3 se obtiene una distancia de enfoque de  Δe =

250 100

2

4 = 0, 025mm. 1000

Esto quiere decir que u ´nicamente quedar´an enfocados planos separados axialmente 25μm del plano de enfoque. 3

Dioptr´ıa es la unidad de potencia ´ optica; 1D = 1/1000mm.

´ 7.4. OBTENCION DE IMAGENES

311

Luminosidad Para caracterizar la luminosidad de un microscopio se utiliza la denominada apertura num´erica, A.N., A.N. = n · sinσ, donde n es el ´ındice de refracci´ on de espacio anterior al objetivo y σ es el m´aximo ´angulo que forma el cono de luz que parte del objeto y entra en el sistema (´angulo formado por el eje o´ptico y un rayo que entra por el borde del objetivo). Sin entrar en conceptos de fotometr´ıa podemos expresar la luminosidad de un microscopio como  Ce = K

A.N. Γ

2 .

Es decir que cuando el aumento es muy grande la luminosidad decrece cuadr´ aticamente. Por ello, en los microscopios de gran aumento es necesario que el objetivo tenga una apertura num´erica grande y un sistema de iluminaci´on adecuado. Una forma de conseguir mayores valores de apertura num´erica es utilizando un medio de mayor ´ındice de refracci´ on. Estos objetivos, llamados de inmersi´on, utilizan un aceite entre el objetivo y el portaobjetos, de modo que se puede conseguir una A.N. mucho mayor. L´ımite de resoluci´ on La resoluci´ on de un microscopio es la capacidad de mostrar separados (resolver) dos puntos muy pr´ oximos entre s´ı. L´ ogicamente, cuanto mayor sea el aumento m´as separados veremos dos puntos pr´oximos. O dicho de otro modo, si el aumento es suficientemente grande podremos distinguir como dos objetos distintos lo que antes no se ve´ıa o aparec´ıa como una u ´nica mancha. La distancia m´as peque˜ na a la que se pueden situar dos objetos puntuales y sean vistos todav´ıa como separados se denomina l´ımite de resoluci´ on. Cuando un haz procedente de un punto atraviesa un orificio (como pueda ser la montura de una lente) va a experimentar el fen´omeno de la difracci´ on (por tratarse de ondas) produciendo una figura de difracci´ on formada por unos anillos conc´entricos alternados claros y oscuros de intensidad r´ apidamente decreciente. Cuando tengamos dos puntos pr´oximos sus figuras de difracci´on se superpondr´ an presentando unos perfiles de intensidad como los mostrados en la figura 7.29. Existen varios criterios para considerar resueltos dichos puntos. El criterio m´as aceptado es el de Rayleigh, que dice que se considerar´an separados

312

´ ´ CAP´ITULO 7. TECNICAS E INSTRUMENTACION

Figura 7.29: Dos perfiles de difracci´on pr´oximos. Arriba, la intensidad presenta un m´aximo central suma de los dos m´aximos pr´ oximos: no quedan resueltos. Abajo, la envolvente presenta un m´ınimo local entre los m´aximos apreci´andose as´ı separadas.

dos puntos cuando el m´ aximo de difracci´on de uno coincida con el primer m´ınimo del otro (Fig. 7.29 inferior). Este criterio da un l´ımite de resoluci´on, ηdif , dependiente de la longitud de onda y de la abertura del haz de la forma aproximada 0, 61 · λ , A.N. donde λ es la longitud de onda de la luz utilizada. Como se ve aumentando la apertura num´erica se puede conseguir un l´ımite de resoluci´on m´ as peque˜ no y, por otro lado, utilizando una luz de menor longitud de onda tambi´en se puede disminuir este l´ımite. Por otra parte, debido al car´acter discreto de la retina existir´a un l´ımite de resoluci´on impuesto por la condici´on de que las distintas im´ agenes caigan en puntos distintos de la retina (distintos fotorreceptores). Considerando un on l´ımite de resoluci´on del ojo de 1, 3 (rayos convergentes con menor separaci´ ηdif ≈

´ 7.4. OBTENCION DE IMAGENES

313

angular se ven como un u ´nico rayo), el l´ımite de resoluci´on que impone es de aproximadamente ηojo ≈

1 . 10 · Γ

Vemos, pues, que por mucho que se quiera conseguir un aumento muy grande de un microscopio, siempre nos vamos a encontrar con dos tipos de limitaciones: el fen´ omeno de la difracci´on de la luz y el efecto producido por la estructura discreta de la retina. De esta forma, el l´ımite real vendr´ a dado por el factor que sea m´as desfavorable, es decir, / . 0, 61 · λ 1 . , η = max 10 · Γ A.N.

Problema. Obtener una expresi´ on para el m´ aximo aumento que puede tener un microscopio para que el l´ımite de resoluci´on por difracci´ on coincida con la limitaci´ on por la estructura discreta de la retina, para la longitud de onda de m´ axima sensibilidad del ojo, λ = 550nm (a dicho aumento se le denomina aumento util o resolvente del microscopio). Soluci´ on. Igualando ambos l´ımites de resoluci´on: ηdif = ηojo ⇒

1 0, 61 · λ = . A.N. 10Γ

Luego el aumento m´aximo ser´a: Γ = es decir,

A.N. A.N. = , 6, 1λ(mm) 6, 1 · 0, 00055 Γ  300 · A.N.,

aproximadamente 300 veces la apertura num´erica.

´ ´ CAP´ITULO 7. TECNICAS E INSTRUMENTACION

314

Problema. Una marca comercial asegura que cierto modelo de microscopio que estan presentando es capaz de discernir unos org´anulos celulares de tama˜ no 0, 4 micras. Si su objetivo tiene una apertura numerica de 1, 2, comprobar si es cierta dicha afirmacion para el pico del espectro visible (λ = 550nm). Soluci´ on. ηdif ≈

0, 61 · 0, 55mm 0, 61 · λ = = 0, 28μm < 0, 4μm. A.N. 1, 2

Luego s´ı tiene capacidad para discernir puntos separados 0, 4μm.

7.4.3.

Microscopio Electr´ onico

Como ya hemos comentado en el l´ımite de resoluci´on en las mejores condiciones experimentales, la difracci´on va a ser, en u ´ltimo t´ermino, el efecto que nos va a marcar el l´ımite inferior del que no podremos bajar utilizando luz visible. Por este motivo, para poder ver por debajo de d´ecimas de micra hay que recurrir a otro tipo de haz (rayos) de menor longitud de onda (para bajar as´ı el l´ımite de resoluci´on por difracci´ on). El fundamento de la microscop´ıa electr´onica consiste en el empleo de rayos cat´odicos en lugar de rayos luminosos. El instrumento cambia radicalmente porque, aunque b´asicamente utiliza lentes para focalizar y dirigir los rayos, ´estas son electrost´aticas o magn´eticas que generan los campos adecuados para desviar el haz de electrones. Y, por otro lado porque los rayos en s´ı no forman una imagen final que podamos ver, sino que necesitamos un elemento visualizador que convierta este haz de electrones en luz visible. En la radiaci´ on electromagn´etica se relaciona la longitud de onda con la energ´ıa transportada λ=

h . E/c

Una part´ıcula material en movimiento a muy alta velocidad tambi´en lleva asociada una longitud de onda, seg´ un postul´ o De Broglie (y comprobado experimentalmente con la difracci´ on de electrones) λ=

h h = . p mv

´ 7.4. OBTENCION DE IMAGENES

315

As´ı pues, la longitud de onda de una part´ıcula en movimiento viene dada por su momento, es decir, por su velocidad. Como ejemplo, un electr´on (de masa 9, 1 · 10−31 kg) viajando a una velocidad de 100m/s llevar´ıa asociada una onda de longitud 7μm. Como nos interesa usar haces de longitud de onda muy peque˜ na es necesario conseguir velocidades muy elevadas. Para ello ser´a necesario acelerar mediante grandes diferencias de potencial (del orden de 100,000V ) para poder conseguir longitudes de onda de hasta 0, 03 ˚ A (3 · 10−12 m), es decir, cien mil veces menor que la luz visible. Sin embargo, aunque aumentando los potenciales de aceleraci´on se pueda conseguir longitudes de onda tan peque˜ nas, van a existir otros tipos de limitaciones a la resoluci´ on. Por un lado existen limitaciones en las lentes magn´eticas para conseguir focalizar el haz de manera exacta, es decir, igual que con las lentes ´opticas, aparecen aberraciones que producen im´ agenes borrosas o distorsionadas. Por otro lado, para conseguir una imagen contrastada es necesario que la relaci´ on de intensidad entre el objeto y el fondo sea mayor que 0, 2. Para conseguir contrastes mayores es necesario aumentar la intensidad del haz, sin embargo, un exceso de intensidad en el haz incidente tiene un efecto nocivo en los materiales biol´ ogicos, como se coment´o en la secci´on de Efectos Fotobiol´ ogicos. No obstante, los microscopios electr´onicos actuales presentan un aumento y resoluci´on mucho mayores que los microscopios ´opticos, alcanzando valores de 100000 X e incluso superiores, lo que permite resolver estructuras proteicas, virus, ADN, etc. Existen dos tipos b´asicos de microscopios electr´onicos, de transmisi´ on y de barrido. Microscopio Electr´ onico de Transmisi´ on El microscopio electr´onico de transmisi´ on (normalmente denominado TEM, abreviatura de su nombre en ingl´es) presenta un esquema similar a un microscopio ´optico, con su fuente de electrones, sus lentes (magn´eticas) que dirigen la trayectoria de los rayos y un portamuestras constituido de fin´ısimos materiales pl´ asticos (incluso se puede te˜ nir la muestra, pero en lugar de colorante se emplean sustancias que son opacas al paso de los electrones). Todo este sistema, incluyendo la muestra ha de estar cerrado en un recinto en el que se practica el vac´ıo para evitar que el haz de electrones colisione con part´ıculas del aire (Fig. 7.30). Finalmente, para visualizar las im´ agenes los haces transmitidos deben recogerse en pantallas fluorescentes (como la de los televisores o monitores) que producen luz visible al ser impactadas por los electrones. Hay que tener en cuenta que la formaci´on de la imagen es diferente que en el microscopio ´opti-

316

´ ´ CAP´ITULO 7. TECNICAS E INSTRUMENTACION

Figura 7.30: Esquema de un microsc´opio electr´onico de transmisi´on (TEM). co. En ´este la imagen se forma por las diferencias de absorci´on de luz de los distintos cuerpos (el portamuestras es transparente). En el TEM la mayor´ıa de los electrones atraviesan la muestra sin desviarse. S´ olo una peque˜ na parte del haz sufre desviaciones en su interacci´on con la muestra. Un objetivo posterior focaliza estos haces desviados para proyectarlos en una pantalla. Microscopio Electr´ onico de Barrido El microscopio electr´onico de barrido (denominado tambi´en SEM, abreviatura de su nombre en ingl´es) tienen los mismos principios que el TEM, pero se diferencia en la obtenci´ on de la imagen. Aunque la generaci´on y direccionamiento de los rayos cat´odicos es similar en el microscopio de barrido, los electrones no atraviesan la muestra, sino que al impactar con ella le arrancan electrones a la misma, que son atra´ıdos por un detector de muy alta sensibilidad (Fig. 7.31). Esta se˜ nal detectada es amplificada y tratada de modo que se puede visualizar en un monitor. Se denomina de barrido porque el haz no incide directamente sobre toda la muestra, sino que interacciona de manera puntual y la va barriendo siguiendo l´ıneas paralelas (mediante un sistema de deflexi´on igual que en los aparatos de TV) en sucesivas pasadas. Este sistema de barrido va sincronizado con el del monitor, de modo que cada punto de la muestra se corresponde con un punto en la pantalla.

´ 7.4. OBTENCION DE IMAGENES

317

Figura 7.31: Esquema de un microsc´opio electr´onico de barrido (SEM). Los electrones focalizados van barriendo la superficie de la muestra arrancando electrones. La detecci´ on de estos electrones permite la creaci´on de una imagen topogr´afica de la muestra.

La imagen dada por el SEM es sustancialmente distinta a la del TEM. En este u ´ ltimo es una imagen de transmisi´on, es decir, se observan las distintas densidades (de manera similar a lo que ocurre en una radioscop´ıa); en el SEM es una imagen por reflexi´ on, tanto de los electrones primarios del haz que colisionan con la muestra y salen dispersados en sentido contrario al incidente, como con los secundarios generados en la interacci´on de los primarios con los ´atomos de la muestra. El contraste en la imagen viene dado, por una parte, por la diferente capacidad de cada ´atomo de dispersar los electrones (denominada secci´on eficaz) y, por otra parte, de la topograf´ıa de la superficie. Por este motivo, el SEM tiene un dispositivo para inclinar el portamuestras, de modo que se puede conseguir que la imagen d´e distintos aspectos de relieve, pues recoge efectos de sombra. La resoluci´on de este microscopio depende del tama˜ no del punto de incidencia del haz sobre la muestra y puede ser del orden de 50 ˚ A.

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´Indice alfab´etico

Absorbancia, 192 Absorci´on, 188 Absorci´on, Banda de, 190 Absorci´on electr´onica, 190, 204 Absorci´on molecular, 204 Absortividad molar, 194 Acci´on de masas, Ley de, 48, 57 Acci´on, Potencial de, 140 Actina, 83 Actividad, 226, 227 ADN, 76 Aerosol, 254 Alfa, Part´ıcula, 217, 225 Almeja, Teorema de la, 167 Amplificador, 299 Apertura num´erica, 311 ARN, 77 ARN mensajero, 78 ARN de transferencia, 80 Atenuaci´on, Coeficiente de, 234 Atm´osfera, 219 ATP, 2, 119, 134 ATP, Hidr´ olisis del, 62 Audici´ on, Umbral de, 175 Aumento, 304 Aumento lateral, 304

Aumento normal, 309 Aumento visual, 304 Avogadro, N´ umero de, 7 Becquerel (Bq), 229 Beer, Ley de, 194 Bernoulli, Ecuaci´on de, 170 Beta, Part´ıcula, 217, 226 Biomec´anica, 153 Biopol´ımero, 75 Boltzmann, Constante de, 33 Boltzmann, Entrop´ıa de, 33 Bomba sodio-potasio, 48 Boyle, Ley de, 7 Cable, Ecuaci´ on del, 148 Cable, Teor´ıa del, 147 Calidad, Factor de, 233 Calor, 10 Calor espec´ıfico, 12 Caminante aleatorio, 85 Campo, 305 Campo axial, 306 Campo constante, Teor´ıa de, 124 Campo, Diafragma de, 306 Campo de iluminaci´ on l´ımite, 306 Campo de iluminaci´ on media, 306

´INDICE ALFABETICO ´ Campo de iluminaci´ on plena, 306 Campo, Profundidad de, 306 Campo transversal, 306 Capa difusa, 257 Capa, Doble, 257 Capa de Stern, 257 Capacidad calor´ıfica, 12 Capacidad, Factor de, 274 Carnot, Ciclo de, 25 Centrifugaci´ on, 265, 267 Chaperona, 80 Cin´etica enzim´atica, 95 Circuito equivalente, 138 Citoesqueleto, 83 Clapeyron, Diagrama de, 16 Clausius, Enunciado de, 21 Cod´ on, 79 Coeficiente adiab´atico, 12 Coeficiente estequiom´etrico, 52 Coeficiente de transporte, 64 Coloidales, Suspensiones, 37, 254 Coloides, 37, 254 Color´ımetro, 196 Compton, Efecto, 216, 226 Condensaci´on, 81 Constante de equilibrio, 57 Conversi´ on interna, 191 Corte, Velocidad de, 153 Cromatina, 77 Cromatograf´ıa, 272 Crom´ oforo, 205 Cromosoma, 77 Cuadripolo, 286 Cu´ anticos, N´ umeros, 184, 187 Curie (Ci), 229 Dalton, Ley de, 53 Decibelio (dB), 175 Deformaci´ ones el´asticas, 91

323 Desintegraci´on, Constante de, 227 Desintegraci´on radiactiva, 225 Desintegraci´on, Tasa de, 226 Despegue, Velocidad de, 171 Detector de calor, 203 Detector por centelleo, 231 Detector fot´onico, 202 Detector por impresi´on, 230 Detector por ionizaci´on de gas, 231 Detector neum´atico, 204 Detector piroel´ectrico, 204 Detectores de radiactividad, 230 Diafragma, 306 Diafragma de campo, 306 Di´ alisis, 45 Diferencial, 4 Difusi´ on, 88, 259 Difusi´ on, Coeficiente de, 88, 264 Difusi´ on i´ onica, 128 Dioptr´ıa, 310 Disipaci´ on, 37 Disoluci´ on dilu´ıda, 43 Disoluci´ on hipert´ onica, 48 Disoluci´ on isot´ onica, 47 Dispersi´ on, 254 Dogma central, 80 Dolor, Umbral de, 175 Donnan, Raz´on de, 130 Dosis, 224, 232 Dosis de absorci´on, 233 Dosis de exposici´on, 233 Dosis m´aximas, 238 Efecto Efecto Efecto Efecto Efecto Efecto

alost´erico, 116 Compton, 216, 226 cooperativo, 113 Dufour, 66 fotoel´ectrico, 216, 226 Soret, 66

324 Eficacia biol´ ogica relativa, 233 Elasticidad, 91 Electroforesis, 269 Electroneutralidad, Principio de, 128 Electr´ on-Voltio (eV ), 191 Eluci´ on, 272 Emulsi´ on, 255 Energ´ıa, 3 Energ´ıa cin´etica, 35 Energ´ıa libre de formaci´ on, 57 Enfoque, Profundidad de, 307 Entalp´ıa, 41 Entalp´ıa de formaci´on, 57 Entalp´ıa libre, 41 Entrop´ıa, 28, 31 Entrop´ıa de formaci´on, 57 Enzima, 95 Equilibrio y espontaneidad, 41 Equilibrio mec´anico, 34 Equilibrio qu´ımico, 48 Equilibrio termodin´ amico, 6 Esfuerzo, 92 Espectro de absorci´on, 187, 192 Espectro continuo, 242 Espectro electromagn´etico, 184 Espectro de emisi´ on, 187 Espectro visible, 185 Espectrofot´ ometro, 196 Espectr´ografo, 196 Espectrometr´ıa de masas, 283 Espectr´ometro, 196 Espectroscop´ıa, 187 Espectroscopio, 196 Esp´ın, 208 Espuma, 255 Estado biol´ ogico est´andar, 62 Estado cuasiestacionario, 99 Excitaci´ on disociativa, 218 Exones, 78

´INDICE ALFABETICO ´ Exposici´ on, 244 Fick, Ley de, 264 Filamento intermedio, 83 Filamento prote´ınico, 83 Filtro, 199 Filtro de absorci´on, 200 Filtro de interferencia, 199 Flexi´ on, 161 Fluctuaci´ on-disipaci´on, Teorema de, 37, 90 Fluido newtoniano, 154 Fluido no newtoniano, 155 Flujo termodin´ amico, 64 Flujos acoplados, 66 Flujos laminares, 153 Fluorescencia, 206 Fluorescencia molecular, Espectroscop´ıa de, 206 Fluor´ımetro, 196 Forma, Factor de, 261 Fosforescencia, 206 Fosforilaci´ on, 2 Fotoc´elula, 203 Fotodiodo, 203 Fotoel´ectrico, Efecto, 216, 226 Fot´ ometro, 196 Fotomultiplicador, 202, 231 Fot´ on, 184, 187 Fotos´ıntesis, 222 Fototubo, 202 Frecuencia, 183 Frecuencia de muestreo, 296 Frecuencia, Respuesta en, 300 Fricci´on, 37, 88 Fuerza termodin´ amica, 64 Funci´ on de estado, 4 Gammagraf´ıa, 248

´INDICE ALFABETICO ´ Ganancia, 299 Gas ideal, 7, 13 Gay-Lussac, Ley de, 7 Geiger-Muller, Contador de, 231 Gel, 255 Genes, 77 Germicidas, 223 Gibbs, Energ´ıa libre de, 40 Gibbs-Donnan, Potenciales de, 128 Giromagn´etica, Relaci´on, 209 Gl´ obulo rojo, 47 Goldman-Hodgkin-Katz, Ecuaci´ on de, 133 Goldman-Hodgkin-Katz, Ecuaci´ on de flujo, 127 Gradiente, 65 Gravedad, 160 Gray (Gy), 233 Helmoltz, Energ´ıa libre de, 40 Hemoglobina, 47, 106 Hertzio (Hz), 183 Hidr´ olisis, 2, 81 Hill, Funci´ on de, 114 Histona, 77 Hodgkin y Huxley, Modelo de, 141 Hooke, Ley de, 162 Impedancia de entrada, 300 Infrarrojo, 186, 190, 206 Infrarrojo, Espectroscop´ıa de, 206 Infrasonido, 174 Intrones, 78 Ionizaci´on, 217 Ionizaci´on del agua, 217, 218 Ionizador, 285 Isomerizaci´on, 50, 59 Is´otopo, 225 Kelvin, Enunciado de, 20

325 Larmor, Frecuencia de, 210 Lineweaver-Burk, Representaci´on de, 101 Longitud de persistencia, 94 Luminosidad, 307 Luminosidad del microscopio, 311 M´ aquina reversible, 21 Maxwell, Demonio de, 33 Mayer, Relaci´on de, 12 Membrana basilar, 177 Membrana celular, 47 Membrana semipermeable, 45, 121 Metabolismo, 1, 71 Michaelis, Constante de, 101 Michaelis-Menten, Ecuaci´on de, 101 Michaelis-Menten, Teor´ıa de, 95 Microestado, 31 Microfilamento, 83 Microscopio, 308 Microscopio electr´onico, 314 Microscopio electr´onico de barrido, 316 Microscopio electr´onico de transmisi´on, 315 Microscopio, Luminosidad del, 311 Microt´ ubulo, 83 M´ odulo de torsi´ on, 92 Mol, 7 Molalidad, 96 Molaridad, 96 Monocromador, 200 Mon´ omero, 75 Morfog´enesis, 42 Movilidad electrofor´etica, 270 Movimiento browniano, 37, 88 Mutaci´ on viable, 236 Nataci´on, 168 Nernst, Ecuaci´on de, 122

326 Nernst-Einstein, Ecuaci´ on de, 265 Nucleosoma, 77 Nucl´eotido, 76 Objetivo, 308 Ocular, 308 O´ıdo, 176 Olig´ omero, 106 Onda, Longitud de, 183 Onda, N´ umero de, 183 Onda, Propiedades de, 182 Onda-corp´ usculo, Dualidad, 182 Ondas ac´ usticas, 174 Onsager, Teorema de, 66 Ozono, 219 Ozono, Capa de, 219 Part´ıcula alfa, 217, 225 Part´ıcula beta, 217, 226 P´eptido, 79 Per´ıodo, 183 Per´ıodo de semidesintegraci´on, 228 pH, 62 P´ıxel, 247 Planck, Constante de, 183 Planck, Relaci´on de, 183 Plato, Altura de, 278 Platos, N´ umero de, 278 Poisson, Raz´ on de, 92 Polimerizaci´on, 81 Pol´ımero, 75 Polip´eptido, 79 Potencia inducida, 172 Potencia par´ asita, 172 Potencial electroqu´ımico, 121 Potencial qu´ımico, 49 Potencial zeta, 257 Potenciales termodin´amicos, 39 Precisi´on, 294

´INDICE ALFABETICO ´ Presi´on osm´otica, 45 Presi´on parcial, 53 Prigogine, Teorema de, 71 Primer Principio, 10, 30 Prisma, 202 Proceso termodin´ amico, 4 Producci´ on entr´ opica, 69 Prote´ına, 77 Protones, Transferencia de, 62 Rad (rad), 233 Radiaci´ on, 181 Radiaci´ on, Detectores de, 202 Radiaci´ on, Detectores fot´onicos de, 202 Radiaci´ on electromagn´etica, 181 Radiaci´ on de frenado, 242 Radiaci´ on, Fuente de, 198 Radiaci´ on ionizante, 216, 232 Radiaci´ on Roentgen, 242 Radiaci´ on visible, 222 Radiactiva, Desintegraci´on, 225 Radiactividad, 225 Radiactividad, Detectores de, 230 Radiactivo, Marcador, 240 Radiodosimetr´ıa, 232 Radiof´ armaco, 240 Radioinmunoensayo, 240 Radiolog´ıa, 242 Radioqu´ımica, 235 Radiosensibilidad, 234, 236 Rango, 293 Rayos gamma, 185, 226, 230, 240 Rayos X, 185, 216, 226, 230, 242 Reciprocidad, Teorema de, 66 Red de reflexi´on, 200 Regla de las fases, 7 Reissner, Membrana de, 177 Relajaci´ on vibracional, 191 Rem (rem), 233

´INDICE ALFABETICO ´ Reparto, Coeficiente de, 273 Resoluci´on cromatogr´afica, 277 Resoluci´on, L´ımite de, 311 Resonancia Magn´etica Nuclear, 208 Resonancia Magn´etica Nuclear, Imagen por, 249 Respuesta lineal, 65 Retenci´ on, Tiempo de, 273, 275 Reynolds, N´ umero de, 158, 165 Ribosoma, 79 Rigidez, 92 RMN, 208 Roentgen (R), 233 Ruido, 178, 300 Schwartz, Teorema de, 6 Sedimentaci´on, 259, 265 Sedimentaci´on, Coeficiente de, 266 Sedimentaci´on por zonas, 269 Segundo Principio, 20, 30 Selectividad, Factor de, 275 Selector de longitud de onda, 199 SEM, 316 Semiper´ıodo, 228 Sievert (Sv), 233 S´ıntesis de pol´ımeros, 81 Sistema termodin´amico, 3 Spin, 208 Stern, Capa de, 257 Stokes, Ley de, 260 Sustentaci´ on, Fuerza de, 170 Svedberg (S), 266 Svedberg, Ecuaci´ on de, 266 TEM, 315 Temperatura absoluta, 36 Termodin´ amica, 3 Termodin´ amica de no equilibrio, 63 Termopar, 203

327 Termorresistencia, 204 Termorresistor, 298 Tiempo medio de vida, 228 Tiempo muerto, 273, 275 Tiempo de retenci´on, 273, 275 Tiempo de vuelo, 288 Tomograf´ıa, 246 Torsi´on, 161 Trabajo, 10 Traducci´on gen´etica, 78 Transcripci´on gen´etica, 77 Transductor, 297 Transiciones rotacionales, 190 Transiciones vibracionales, 190 Transmitancia, 192 Transporte activo, 119 Transporte pasivo, 118 Tubulina, 84 Ultracentrifugaci´ on, 267 Ultracentrifugaci´ on por equilibrio, 268 Ultracentrifugaci´ on por gradiente de concentraci´ on, 269 Ultrasonido, 174 Ultravioleta, 186, 191, 204, 219, 223 Van´t Hoff, C´amara de reacci´on de, 53 Van´t Hoff, Relaci´on de, 47 Variables de estado, 3 Velocidad de reacci´on, 99, 101 Vibraciones, 173 Vi˜ neteo, 306 Viscosidad, 154, 261 Viscosidad espec´ıfica, 263 Viscosidad relativa, 263 Visible, Radiaci´on, 204, 222 Visi´ on, 219 Voltaje, Pinzamiento de, 140 Volumen molar, 7

328 V´oxel, 248 Vuelo, 170 Weber-Fechner, Ley de, 174 Young, M´ odulo de, 92, 162 Zeta, Potencial, 257

´INDICE ALFABETICO ´