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IV PRÁCTICA DE LABORATORIO

CUANTIFICACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE BIOMASA Y DEL CONSUMO DE SUSTRATO 1. OBJETIVOS 1.1 General Reconocer diferentes protocolos para la cuantificación de biomasa y consumo de sustrato (azucares reductores), técnicas aplicables al seguimiento de un proceso de fermentación. 1.2 Específicos   

Estandarizar el protocolo de determinación de azúcares reductores por el método DNS Realizar una curva de calibración de glucosa para determinar los azúcares reductores Comparar dos métodos diferentes para reportar el contenido de biomasa en una fermentación

2. MARCO TEÓRICO Las técnicas más utilizadas para determinar la concentración microbiana en un cultivo líquido de microorganismos unicelulares son el recuento de células al microscopio o de colonias en cajas de Petri. También es posible la determinación de la masa celular mediante la determinacion de peso seco. Este último es uno de los métodos más empleados, ya que permite expresar la concentración celular en términos de masa seca celular por unidad de volumen. Cuando se realiza una fermentación se busca obtener un producto bien sea biomasa o algún metabolito especifico. El método para determinar dicho metabolito, varía según el producto. El consumo de sustrato se puede realizar por diversas técnicas como por HPLC o por el método de azucares reductores mediante el uso del ácido dinitrosalicilico, si se trata de azucares reductores. Los azucares que poseen extremos carbonilos fácilmente oxidables (azúcares reductores) reaccionan con el ácido 3,5 dinitrosalicílico, produciendo el correspondiente ácido derivado del azúcar y ácido 3,5 amino-nitrosalisílico, de color naranja rojizo. La densidad óptica del color producido es directamente proporcional a la cantidad de azúcares reductores en solución. Para la determinación de azúcares reductores por este método se sigue un protocolo establecido para la preparación del reactivo y la posterior construcción de una curva de calibración con una solución patrón de glucosa con concentraciones diferentes conocidas.

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Espectrofotómetro Baño serológico a 92º C con soporte para tubos de ensayo Incubadora a 30° C Vortex Balanza analítica Centrifuga

3.1 Determinación azucares reductores 3.1.1

Para la preparación del reactivo DNS

Mezclar:

Agua destilada Ácido 3,5 dinitrosalicilico NaOH

1416 mL 10,6 g 19,8 g

Luego adicionar y disolver: Sal Rochelle (tartrato de Na-K) Fenol (fundido a 50° C) Metabisulfito de sodio

306 g 7,6 mL 8,3 g

Titular 3 ml de muestra con fenolftaleína y 0,1 N HCl. Debe tomar 5-6 ml de HCL. Añadir NaOH si se requiere (2 g=0,1 ml N HCl) 3.1.2  

Reactivos adicionales

Glucosa analítica Agua destilada

3.1.3

Materiales            

1 balón aforado de 100 mL con tapa 10 tubos de ensayo con tapa rosca 2 pipetas de 1 ml 2 pipetas de 5 ml 2 pipetas de 10 ml Celdas desechables para espectrofotómetro 1 gradilla para tubos de ensayo 3 vasos de precipitado de 50 ml 2 vaso de precipitado de 100 ml 1 vaso de precipitado de 500 ml 1 pinza para tubos de ensayo 1 cronómetro 2

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1 pipeteador 1 micro espátula o espátula 1 vidrio de reloj o papel para pesar Baño de agua-hielo en un recipiente

3.2 Determinación de biomasa 3.2.1 Reactivos y medios 



250 ml de cultivo puro de la levadura Saccharomyces cerevisiae en caldo Sabouraud (el cultivo debe colocarse a incubar lo más tarde que sea posible el día anterior a la práctica) y repartirlo en un Erlenmeyer de 50 mL para cada uno de los grupos (6 Erlenmeyer con 40 mL) 500 ml de solución isotónica (NaCl 0.9%)

3.2.2 Materiales           

1 tubo de centrífuga 1 membrana de 0,22 m 1 filtro estéril de plástico con manguera que sirva de acople a la bomba de vacío 1 caja de Petri estéril 2 Cajas de Petri con medio (YPD) 1 rastrillo 1 Erlenmeyer de 125 o 150 mL con 90 ml de agua peptonada 0,1 % (p/v) estéril 4 tubos de ensayo con 4,5 ml de agua peptonada al 0,1% (p/v) estériles 1 pipeta de 10 mL estéril 4 pipetas de 1 ml estériles 1 Pipeteador

3.2.3 Equipos   

Incubadora a 30° C Bomba de vacío Cuenta colonias

3.3 Por parte del estudiante, traer alguna bebida azucarada (10 mL es suficiente como muestra problema), tener en cuenta que si es una bebida gaseosa no debe tener gas, y si es una bebida que contiene solidos suspendidos, estos deberán retirarse previamente mediante un proceso de filtración. 4. METODOLOGIA 4.1 Determinación azucares reductores a. Con 10 min de anterioridad prender el espectrofotómetro y ajustar la longitud de onda a 540 nm

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b. Preparar una dilución patrón de glucosa 1 g/L en un balón aforado de 100 ml c. Preparar 6 tubos de ensayo con tapa, marcarlos y colocar en cada uno de ellos una concentración diferente de la solución patrón de glucosa, de acuerdo a los volúmenes reportador en la Tabla 1, adicionar la cantidad indicada de agua para preparar la dilución correspondiente (homogenizar) y posteriormente agregar 3 mL de DNS, en cada paso agitar vigorosamente (ayudarse del vortex) Tabla 1. Diluciones para la curva de calibración de azúcares reductores No. tubo B 1 2 3 4 5

Volumen de solución patrón glucosa (mL) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

Volumen de agua destilada (mL) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

d. Tapar y llevar al baño serológico para calentar durante 10 minutos (revisar previamente que el baño tenga la temperatura adecuada ~92° C y el nivel de agua necesario). Contabilizar el tiempo por cronómetro. NOTA. Tener precaución en la manipulación de los tubos de ensayos en el baño a ebullición, contar con guantes de carnaza si es necesario, utilizar las pinzas para tubos de ensayo y no exponer el rostro en el momento que se abra la compuerta del baño serológico. e. Transcurridos 10 minutos transferir inmediatamente a un baño de agua-hielo preparado con anticipación, para detener la reacción rápidamente, dejar reposar por 5 minutos f.

Luego de que los tubos de ensayo se encuentran fríos, adicionar a cada tubo 4 ml de agua destilada, agitar vigorosamente para homogenizar el color

g. Leer la absorbancia de cada tubo de ensayo en el espectrómetro a una longitud de onda de 540 nm transfiriendo las soluciones a las celdas del espectrofotómetro (desplazarse al laboratorio de Instrumental). Registrar el valor de la absorbancia. Calibrar el equipo con la solución que se preparó como blanco h. Para determinar la concentracion de la muestra problema, se debe tomar en un tubo diferente 0,5 ml de la muestra + 4ml del DNS y seguir el protocolo descrito en los pasos d a g (se debe tener en cuenta la dilucion que debe realizarse a la muestra y registrar este valor)

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4.2 Determinación de biomasa 4.2.1

Por peso seco (parte I)

a. Tomar 10 mL de un cultivo inoculado previamente con levadura Saccharomyces cerevisiae, centrifugar a 4000 rpm durante 30 min, con el fin de separar del medio de cultivo la biomasa (precipitado), mientras centrifuga pese una de las tapas de la caja de Petri (márquela previamente) y una membrana de 0,22 m (recuerde siempre manipularla con guantes y cogerla por los bordes) b. Una vez centrifugado, descartar el sobrenadante y re suspender la biomasa en solución isotónica (NaCl 0.9%) en un volumen de 10 mL hasta obtener una suspensión concentrada de biomasa. c. Filtrar esta solución a través de una membrana de 0,22 m soportada en un filtro estéril y con ayuda de una bomba de vacío como se ilustra en la figura 1

Figura 1. Filtración al vacío para determinación de biomasa por peso seco

d. Colocar la membrana con la biomasa filtrada sobre la caja de Petri previamente marcada y llevar a secar a un horno con una temperatura de 105° C hasta peso constante (recuerde enfriar en un desecador antes de registrar el peso) 4.2.2

Por conteo en placa, a través del método de extensión en placa (parte II)

a. Pipetear 10 ml del medio de cultivo puro, adicionar esta cantidad al Erlenmeyer que contiene 90 mL de agua peptonada 0,1 % (p/v) estéril correspondiente a la dilución 10-1, agitar. b. A partir de la dilución anterior realizar diluciones seriadas 10-2, 10-3, 10-4, adicionando 0,5 mL de cada dilución en los tubos de ensayo que contienen 4,5 mL de agua peptonada. c. Posteriormente sembrar en superficie 0,1 mL de las diluciones 10-3 y 10-4 en cajas de Petri con agar YPD (realizar duplicado) 5

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d. Colocar a incubar las cajas de Petri sembradas a 30° C, el lunes a primera hora realizar el conteo, con ayuda del cuenta colonias 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN    

Graficar la ABS en función de la concentración de glucosa (g/L), la cual será la curva de calibración para azucares reductores, determinar la concentración de azucares reductores de la muestra problema Reportar el peso seco de la biomasa obtenida y el número de células viables/mL Explicar por qué se debe utilizar solución isotónica para re suspender las células Realizar la discusión pertinente de sus resultados

6. BIBLIOGRAFÍA 

Madigan M., Martinko J., Parker J., Brock biología de los microorganismos, 10a Edición. Pearson Prentice Hall.

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