isolasi DNA

BAB I PENDAHULUAN 1.1. Tujuan Tujuan dari percobaan kali ini adalah dapat mengisolasi asam nukleat dari sel atau jaringan 1.2. Tinjauan Pustaka Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsisp isolais DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung (Mader 1993). Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell 2002) Asam nukleat merupakan molekul biologis yang besar dan penting bagi kehidupan. Termasuk juga didalamnya DNA (asam deoksiribonukleat) dan RNA (asam ribonukleat). Bersama dengan protein, asam nukleat adalah makromolekul biologis yang sangat penting, masing-masing ditemukan melimpah dalam semua makhluk hidup, di mana mereka berfungsi dalam encoding, transmisi dan mengekspresikan informasi genetik. (Dahm, 2008) DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontaminasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder seperti tanin, pigmen, alkaloid dan flavonoid. Sedangkan DNA dari hewan lebih banyak mengandung protein. Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat dan seringkali pada beberapa jenis tanaman, kontaminasi tersebut sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat. Kehadiran kontaminasi di atas dapat menghambat aktivitas enzim, misalnya DNA tidak sensitif oleh enzim restriksi dan menggangu proses amplifikasi DNA dengan PCR. Demikian pula pada hewan yang memiliki kandungan kitin (seperti serangga), memerlukan teknik dan metode khusus untuk menghancurkan sel hingga isi dapat terpisah atau keluar dari sel. (kusumawati, 2012)

DNA dapat diisolasi dari jaringan apapun yang mempunyai sel inti. Langkahlangkah yang harus diikuti dengan jaringan apapun adalah: diantaranya proses pengumpulan sel-sel (cell harvest), pemecahan sel-sel (cell lysis), pencernaan protein agar asam nucleat dilepaskan (protein digestion) dan pengendapanan DNA (DNA precipation). (Muray, 1980) Pada saat proses destruksi jaringan tanaman atau hewan maupun bakteri dapat menyebabkan degradasi pada DNA dengan adanya aktivitas enzim endonuklease, karena itu digunakan buffer ekstraksi yang mengandung senyawa Tris, EDTA, CTAB dan buffer lisis yang mengandung potassium asetat dan SDS. Proteinase digunakan untuk membantu mendenaturasi protein pada jaringan. Senyawa CTAB dan SDS merupakan detergen, yang dapat melisis dinding sel dan juga mendenaturasi protein. Selain itu CTAB dan EDTA adalah senyawa inhibitor yang dapat menghambat aktivitas enzim nuklease. Potasium asetat adalah senyawa yang dapat berikatan dengan debris sel dan protein sehingga membentuk senyawa kompleks dengan CTAB-Potasium asetatprotein-debris sel. Selanjutnya pada tahap berikutnya digunakan klorofom: isoamil alcohol (24:1) yang membantu mendenaturasi protein yang masih menempel pada kromosom, sedangkan untuk mempresipitasi asam nukleat digunakan alkohol 96%100%. DNA dalam alkohol akan terpresipitasi (menggumpal) sedangkan DNA dalam air akan larut, tetapi protein tidak dapat larut dalam air. (kusumawati, 2012) 1.3. Tinjauan Bahan 1.3.1. Larutan Buffer Tris Merupakan larutan dengan pH netral, mudah larut dalam air dingin dan air panas, larut sebagian dalam metanol dan aseton. Bersifat tidak menyala, iritan, dan tidak korosif. (Anonim1, 2013). 1.3.2. Larutan SDS SDS (Sodium Dodesil Sulfat) merupakan larutan yang tidak berwarna. Memiliki pH 5 – 8 pada 25 oC, densitas 1.01, dan mudah larut dalam air. Bersifat sedikit iritan, sensitif, dan tidak menyala (Anonim1, 2013). 1.3.3. Larutan NaCl Sodium Klorida atau (NaCl) merupakan larutan yang berasal dari padatan NaCl yang berwarna putih. Memiliki titik didih 1413 oC, titik leleh 801 oC, densitas 2.165, mudah larut

dalam air, larut dalam gliserol dan amonia, dangat sedikit larut dalam alkohol, dan tidak dapat larut dalam HCl. Bersifat sedikit iritan dan tidak menyala (Anonim1, 2013). 1.3.4. Metilen klorida Memiliki rumus kimia C-H2-Cl2. Merupakan larutan yang memiliki titik didih 39.75 o

C, titik leleh -96.7 oC, densitas 1.3266, mudah larut dalam metanol, dieil eter, n-oktanol,

aseton, dan larut larut sebagian dalam ar dingin. Bersifat sangat iritan dan dapat terbakar pada suhu tinggi (Anonim1, 2013). 1.3.5. 2-butanol Memiliki rumus kimia CH3CH2CHOHCH3. Merupakan larutan yang memiliki titik didih 99.5 oC, titik leleh -114.7 oC, densitas 0.81, mudah larut dalammetanol, dietil eter, dan sangat sedikit larut dalam air. Bersifat sangat iritan dan menyala (Anonim1, 2013). 1.3.6. Amonium Sulfat Memiliki rumus kimia (NH4)2SO4. Merupakan padatan berwarna abu-abu kecoklatan hingga putih, tidak berbau, memiliki titik leleh 280 oC, densitas 1.77, mudah larut dalam air dingin dan tidak larut dalam aseton. Bersifat iritan dan mudah terbakar pada suhu tinggi (Anonim1, 2013). 1.3.7. Etanol Memiliki nama lain etanol absolut, etil alkohol dengan rumus kimia CH 3CH2OH yang merupakan larutan yang memilki bau seperti wine atau whiskey, tidak berwarna. Memilki berat molekul 46.07 g/mol, titik didih 78.5 oC, titik leleh -114.1 oC, densitas 0.789, mudah larut dalam air, larut dalammetanol, dietil eter, aseton (Anonim1, 2013). 1.3.8. Kecambah Kecambah adalah tumbuhan (sporofit) muda yang baru saja berkembang dari tahap embrionik di dalam biji. Terdapat 3 jenis kecambah yaitu kecambah kacang hijau, kecambah kacang kedelai, dan kecambah alfafa. Kecambah merupakan pangan yang rendah kadar lemak, kaya vitamin C, serta memiliki folat dan protein yang dapat memperkecil risiko timbulnya penyakit kardiovaskular dan merendahkkan LDL dalam darah (Winarno dkk, 2009). 1.3.9. Pasta Sel Bakteri Memiliki nama kimia enzim bakteri. Berwujud cairan padat (pasta), berbau botanikal. Memiliki pH 6.8 – 7.8, densitas 1.02. Bersifat tidak berbahaya (Anonim2, 2012). 1.3.10. Na2EDTA

Sodium

etilendiamintetraasetat

memiliki

rumus

kimia

C10H14N2Na2O8.2H2O

merupakan larutan yang tidak berwarna, memiliki titik leleh 248 oC kelarutan dalam air 100 g/L pada 20 oC. bersifat tidak berbahaya (Anonim3, 2008). 1.3.11. Larutan Lizozim Larutan ini berasal dari padatan, biasanya berasal dari putih telur. Memiliki nama lain mukopeptida N-asetilmuramoilhidrolase, muramidase. Bersifat tidak berbahaya (Anonim3, 2008). 1.3.12. NaClO4 Sodium perklorat merupakan padatan atau kristalin, memiliki titik leleh 480 oC, densitas 2.82, mudah larut dalam air panas dan larut dalam air dingin. Bersifat sangat iritan dan tidak menyala (Anonim1, 2013). 1.3.13. Kloroform Memiliki rumus kimia CHCl3, berwujud cair dengan bau yang manis seperti eter, rasa manis, dan tidak berwarna. Memiliki titik didih 61 oC, titik leleh -63.5 oC, densitas 1.484, sangat sedikit larut dalam air dingin. Bersifat iritan dan tidak menyala (Anonim1, 2013). 1.3.14. Isoamil Alkohol Memiliki (CH3)2CHCH2CH2OH, merupakan larutan yang berbau tajam, tidak berwarna. Memiliki titik didih 132 oC, titik leleh -117.2 oC, densitas 0.81, mudah larut dalam metanol, dietil eter, dan larut dalam air. Bersifat sangat berbahaya, iritan, dan menyala (Anonim1, 2013).

BAB II METODOLOGI

2.1 Alat Alat yang digunakan pada percobaan ini adalah pipet ukur 10 mL, gelas kimia, pipet ukur 2 mL ,corong pisah,pipet pasteur,spatula, mortar dan pastle, pH meter,sentrifuge,tabung, inkubator , penangas air, dan botol gelas. 2.2 Bahan Bahan- bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah larutan buffer Triss-HCl 0,1 M pH 8, larutan SDS , campuran 240 metilen klorida dan 10 mL 2-butanol, larutan ammonium sulfat 4 M, etanol 90% dingin, pasta sel bakteri, NaCl 0,15 M , Na 2EDTA 0,1 M, larutan lizozim 10 mg/mL, larutana SDS 25%,MaCl4 5 M, kloroform-isoomilakohol ( 24:1 ), etanol 95%, larutan NaCl 0,015 M, Natrium Sitrat 0,015 M, larutan Natrium Asetat 3 M, EDTA 0,001 M pH 7, isopropanal, kloroform, perekasi difenilamin, DNA standar (0,5mg/mL) 2.3 Skema Kerja 2.3.1 Isolasi Asam Nukleat dari Kecambah 5 gram kecambah - Ditambah 10 mL buffer tris -

Digerus dalam mortar

-

Dipindahkan pasta yang terbentuk ke dalam gelas kimia

-

Ditambahkan 2 mL larutan ammonium sulfat

-

Diaduk dengan pengaduk gelas selama 10 menit

-

Ditambahkan 15 mL larutan SDS

-

Diaduk kembali 10 menit

-

Dipindahkan campuran pasta ke dalam corong pisah

-

Diekstrak dengan 20 mL metilen klorida-butanol

Lapisan Atas - Di sentrifugasi pada 400 g selama 10 menit - Dipipet cairan atas - Dipindahkan ke dalam gelas kimia - Di tambahkan etanol 2,5 kali volume Hasil

Lapisan Bawah - dibuang Hasil

BAB III HASIL DAN PENGAMATAN 3.1. Isolasi Asam Nukleat dari Kecambah No. Perlakuan Pengamatan 1. Kecambah dipisahkan antara ekor dan kepalanya Didapatkan bagian kecambah berupa kepala besar, kepala kecil, ekor besar dan ekor kecil. 2. Bagian kecambah (kepala besar, ekor besar, Diperoleh masing-masing bagian kepala kecil, ekor kecil) masing-masing kecambah sebanyak 5 gram ditimbang sebanyak 5 gram 3. Masing-masing di masukkan kedalam mortar, Didapat pasta dengan warna ditambah 10 mL buffer tris, ditumbuk hingga Kepala besar: kuning berbentuk seperti pasta, Kepala kecil: kuning Ekor besar: coklat muda Ekor kecil: coklat muda 4. Pasta tersebut dipindahkan kedalam gelas kimia, Warna pasta tetap ditambahkan 2 mL amonium sulfat dan diaduk selama 10 menit. 5. Ditambah 15 mL larutan SDS dan diaduk Terbentuk busa, dan warna pasta kembali selama 10 menit Kepala besar: kuning Kepala kecil: kuning Ekor besar: kuning Ekor kecil: coklat muda 6. Campuran pasta dipindahkan kedalam corong Diperoleh 2 lapisan pisah dan diekstrak dengan 20 mL metilen Lapisan atas: sperti endapan pasta klorida butanol, dan dikocok dengan tekhnik berwarna kunig pucat ekstraksi. Lapisan bawah: berwarna keruh kekuningan 7. Lapisan bawah yang terbentuk dikeluarkan dari Diperoleh 2 lapisan corong pisah dan dibuang sedangkan lapisan Lapisan atas: kuning bening atas dimasukkan ditampung dalam kuvet Lapisan bawah: endapan putih sentrifugasi dan disentrifugasi selama 10 menit. kekuningan 8. Lapisan atas dipindahkan kedalam gelas ukur Volume yang didapatkan dan dicatat volumenya Kepala besar: 3 mL Kepala kecil: 11 mL Ekor besar: 9,2 mL Ekor kecil: 12,75 mL 9. Larutan yang diperoleh dimasukkan kedalam Larutan menjadi keruh dan gelas kimia dan ditambahkan etanol sebanyak terbentuk butiran-butiran serat Kepala besar: 7,5 mL berwarna putih yang diduga asam Kepala kecil: 27,5 mL nukleat Ekor besar: 23 mL Ekor kecil: 32 mL

BAB IV PEMBAHASAN Pada percobaan isolasi DNA ini, tahap pertama adalah proses perusakan atau penghancuran membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan dari awal isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel. Tahap penghancuran sel atau jaringan dilakukan dengan cara menggerus 5 gram kecambah ditambah dengan 10 mL buffer tris menggunakan mortar. Fungsi buffer tris adalah untuk menjaga struktur DNA selama proses penghancuran dan purifikasi sehingga memudahkan dalam menghilangkan protein dan RNA serta mencegah aktivitas enzim pendegradasi DNA dan mencegah perubahan pada molekul DNA. Konsentrasi dan pH dari bufer yang digunakan harus berada dalam rentang pH 5 sampai 12. Larutan buffer dengan pH rendah akan mengkibatkan depurifikasi dan mengakibatkan DNA terdistribusi ke fase metilen klorida-butanol selama proses deproteinisasi. Sedangkan pH larutan yang tinggi di atas 12 akan mengakibatkan pemisahan untai ganda DNA. Kemudian ditambahkan dengan larutan amonium sulfat dan diaduk selama 10 menit. fungsi amonium sulfat adalah untuk menghilangkan polisakarida dan fungsi pengadukan adalah untuk memberikan waktu kepada reagen-reagen untuk beraksi dalam proses perusakan membran dan dinding sel. Proses kedua adalah proses pelisisan sel. Pada proses lisis digunakan sodium dodecyl sulphate (SDS) sebanyak 15 mL sebagai tahap pelisisan membran sel kemudian diaduk selama 10 menit. SDS tersebut selain berperan dalam melisiskan membran sel juga dapat berperan dalam mengurangi aktivitas enzim nuklease yang merupakan enzim pendegradasi DNA. Pada tahap ekstraksi DNA, pasta yang terbentuk pada proses tahap 1 dan 2 dimasukkan kedalam corong pisah dan diekstraksi menggunakan metilen klorida butanol. Fungsinya adalah agar protein kehilangan kelarutannya dan mengalami presipitasi yang selanjutnya dapat dipisahkan dari DNA melalui sentrifugasi. setelah sentrifugasi akan terbentuk 2 fase yang terpisah yakni fase organik pada lapisan bawah dan fase aquoeus (air) pada lapisan atas sedangkan DNA dan RNA akan berada pada fase aquoeus setelah sentrifugasi sedangkan protein yang terdenaturasi akan berada pada interfase dan lipid akan berada pada fase organik. Penambahan etanol sebanyak 2,5 kali volume juga berfungasi untuk menghilangkan kelarutannya sehingga akan didapatkan endapan seperti benang-benang halus yang diduga merupakan DNA. Berdasarkan hasil percobaan yang didapat, ternyata volume filtrat yang didapatkan dari hasil sentrifugasi adalah 3 mL untuk kepala besar, 9,2 mL untuk ekor besar, 11 mL untuk

kepala kecil dan 12,75 mL untuk ekor kecil. Dari hasil yang diperoleh, dapat dikatakan bahwa kecambah berukuran besar lebih sedikit DNA yang diperoleh daripada kecambah yang berukuran kecil. DNA pada ekor diduga juga lebih besar daripada pada kepala. Hal ini dikarenakan bagian kecambah yang aktif membelah adalah bagian ekornya, sehingga DNA akan lebih banyak berkumpul disana karena DNA merupakan bagian tak terpisahkan dari pertumbuhan sel. Kecambah kecil lebih besar DNA nya karena masa pertumbuhan DNA paling cepat adalah pada saat masa pertumbuhan kecambah.

DAFTAR PUSTAKA Dahm, R. 2008. Discovering DNA: Friedrich Miescher and the early years of nucleic acid research. Human Genetics 122 (6): 565–81. Kusumawati, dyah. 2012. Isolasi DNA sekala Kecil. Program studi biologi, jurusan pendidikan bilogi. Mader, Sylvia S. 1993. Understanding Human Anatomy and Physiology. McGraw-Hill Higher Education: USA Campbell, G. 2002. Distalization of the Drosophila leg by graded EGF-receptor activity. Nature 418(6899): 781--785. MG Murray, WF Thompson.1980. Nucleic acids research. Oxford Univ Press

LAMPIRAN 1. Reaksi Isolasi Asam Nukleat

2. Reaksi Hidrolisis Asam Nukleat

3. Reaksi Isolasi DNA