Isolasi Bakteri Dan Identifikasi Bakteri Gram Positif

ISOLASI BAKTERI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI GRAM POSITIF

KELOMPOK 1 ANGGOTA : Rizki N Luh Putu Setianti P Bima Anggara Putra Nuril Insani Aisyah Pandu Gumelar S Devi Intan D A O Dyah Kusumaning W Alex Hariyono P Miranti Verdiana A

(135130100111009) (135130100111012) (135130101111003) (135130101111005) (135130101111012) (135130101111013) (135130101111021) (135130107111009) (135130107111001)

PROGRAM KEDOKTERAN HEWAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2014

BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Pemanfaatan mikroorganisme dalam bidang teknologi semakin banyak digunakan misalnya dalam menghasilkan berbagai produk seperti bahan pangan, industri, pertanian, obat-obatan, dan lain sebagainya. Pemilihan mikroorganisme yang tepat untuk suatu tujuan tertentu dan pemanfaatan mikroorganisme secara maksimal perlu didukung oleh suatu metode isolasi dan identifikasi yang baik. Diketahui bahwa mikroba tersebar di alam, terdapat di lingkungan mana saja dalam populasi campuran. Boleh dikatakan amat jarang mikroba dijumpai sebagai satu spesies tunggal di alam. Untuk mencirikan dan mengidentifikasikan suatu spesies mikroorganisme tertentu, pertama-tama spesies tersebut harus dapat dipisahkan dari organisme lain, lalu ditumbuhkan menjadi biakan murni. Dalam mengisolasi suatu mikroorganisme, dilakukan dengan cara yang aseptis untuk menghindari

terjadinya

kontaminasi

dengan

mikroorganisme

lain.

Kebanyakan

mikroorganisme dapat diisolasi dan diinokulasi dalam biakan murni dengan memindahkan suatu koloni secara cermat, mensuspensikan kembali dalam cairan dan menanamnya kembali pada medium yang selektif. Isolasi dan inokulasi merupakan percobaan yang sangat penting, karena melihat kondisi lingkungan di sekitar kita yang banyak terdapat mikroorganisme baik yang patogen maupun yang non patogen, sehingga pemisahan dan identifikasi bakteri yang satu dengan lainnya juga dibutuhkan. 1.2 Tujuan Adapun tujuan dari pembuatan makalah ini adalah 

Membahas tentang isolasi bakteri



Mengidentifikasi bakteri gram positif

 BAB II

PEMBAHASAN

2.1

Pewarnaan Bakteri

Pewarnaan pada bakteri dibagi menjadi tiga, yaitu : a)

Pewarnaan sederhana Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan. 

Pewarnaan asam Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna

dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan positif adalah metilen biru dan air furksin.  Pewarnaan Basa Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.

b)

Pewarnaan Diferensial (Gram) Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus

dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka. a. Bakteri Gram Negatif Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak. b. Bakteri Gram Positif Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010)

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009). Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek (Fitria, 2009). Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif. Sifat

Bakteri garam (+)

Bakteri gram negatif(-)

Komposisi dinding sel

Kandungan lipid rendah (1-4%)

Kandungan lipid tinggi

Ketahanan terhadap penisilin

Lebih sensitif

Lebih tahan

Penghambatan oleh pewarna Lebih dihambat basa (VK)

Kurang dihambat

Kebutuhan nutrisi

Kebanyakan

spesies

relatif Relatif sederhana

kompleks Ketahanaa terhadap

Lebih tahan

Kurang tahan

perlakuan fisik (Manurung, 2010). Pewarnaan tahan asam yang umum digunakan adalah pewarnaan Zieh – Neelson dengan pewarna utama karbol fuksin dengan pemanasan dan pewarna tandingan metilen blue Loeffler. Perlakuan panas tersebut diganti dengan penggunaan pembasah yaitu suatu deterjen untuk mengurangi tegangan permukaan lemak, untuk menjamin penetrasi. Pewarna yang mengandung pembasah ini disebut pewarna Kinyoun (Purwoko, 2010). Sekali sitoplasma terwarnai, maka sel-sel organisme seperti mikobakteri menahan zat warna tersebut dengan erat, artinya tidak terpucatkan sekalipun oleh zat yang bersifat keras seperti asam alkohol (yaitu 3% HCL dalam etanol 95%). Alkohol asam ini merupakan pemucat yang sangat intensif dan jangan dikelirukan dengan alkohol-aseton yang banyak digunakan dalam prosedur pewarnaan Gram. Kondisi pewarnaan ini, organisme yang dapat menahan zat warna itu dikatakan tahan asam dan tampak merah. Bakteri biasa yang dindingnya tidak bersifat terlampau lipoidal, pewarna karbol fuksin yang mewarnai sel dapat dengan mudah dipucatkan oleh alkohol-asam dan karenanya dikatakan tak tahan asam. Tercucinya karbol fuksin dapat diperagakan oleh terserapnya pewarna tandingan biru metilen oleh sel, sehingga bakteri tersebut tampak biru (Hadioetomo, 1993). Pewarnaan Ziehl Neelsen. Larutan carbol fuchsin 0,3% dituang pada seluruh permukaan sediaan, kemudian dipanaskan diatas nyala api sampai keluar asap tetapi tidak sampai mendidih atau kering selama 5 menit. Sediaan kemudian dibiarkan dingin selama 5-7 menit lalu kelebihan zat warna dibuang dan dicuci dengan air yang mengalir perlahan. Setelah itu larutan asam alkohol 3% (hydrochloric acid-ethanol) dituang pada sediaan dan dibiarkan 2-4 menit kemudian dicuci dengan air mengalir selama 1-3 menit, kelebihan larutan dibuang. Larutan methylene blue 0,1% dituang sampai menutup seluruh permukaan, dibiarkan 1 menit lalu larutan dibuang dan dicuci dengan air mengalir (Karuniawati, 2005).

c)

Pewarnaan Khusus Pewarnaan khusus merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai struktur khusus atau

tertentu dari bakteri seperti bagian spora, kapsul, flagel dsb. Contoh pewarnaan khusus :Pewarnaan

Endospora

Anggota

dari

genus Clostridium,

Desulfomaculatum,

dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi, dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas. Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (Aditya, 2010) 

Pewarnaan kapsul

Pewarnaan ini menggunakan larutan kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang yang berwana biru gelap. 

Pewarnaan spora

Dinding spora relatif tidak permeable, namun zat warna bias menembusnya dengan cara memanaskan preparat. 

Pewarnaan flagel

Pewarnaan flagel dengan memberi suspensi koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel. 

Pewarnaan nucleoid

Pewarnaan nucleoid menggunakan pewarna fuelgen yang khusus untuk DNA (Rudi, 2010).

2.2

Identifikasi Bakteri Gram Positif Melalui Pewarnaan Gram

Alat dan Bahan yang digunakan NO

Alat

Jumlah

Bahan Biakan

1

Jarum ose

1

murni B.

cereus dan E.colipada medium

NA

berumur 24 jam 2

Pembakar

1

Aquades steril

yang

spirtus 3

Kaca preparat

1

Larutan hucker’s crystal violet

4

Pipet tetes

1

Larutan mordan

lugol

iodine 5

Mikroskop

1

Larutan alkohol 96%

6

Gelas kimia

3

Larutan safranin

7

Kaca objek

1

8

Tabung reaksi

1

Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Manurung, 2010). Penambahan violet pada bakteri pada pewarnaan gram. Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu. Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar cat atau pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri. Penambahan lugol pada bakteri. Lugol merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama. Pemberian lugol pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat lugol terperangkap antara dinding

sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Lugol yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin lebih kuat. Selanjutnya, 1 tetes alkohol 96% diteteskan di atas objek glass tersebut kemudian didiamkan selama 45 detik. Setelah itu, kaca objek dibilas dengan air hingga warnanya hilang. Etanol 95% merupakan solven organik yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol 96% juga menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Selanjutnya diteteskan 1 tetes safranin di atas kaca objek tersebut kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, kaca objek dibilas dengan air hingga warnanya hilang. Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain, safranin memberikan warna pada mikroorganisme non target serta menghabiskan sisa-sisa cat atau pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu. Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna lain dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna tersebut dapat berikatan dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu singkat. Karena itulah rentang waktu pemberian zat warna yang satu ke yang lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi bakteri berlangsung cepat. Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap kaca objekdengan menggunakan air. pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan. Setiap akhir pembilasan pada masingmasing reagen, perlu dilakukan penyerapan air bilasan dari air dengan menggunakan kertas tissu agar aquades tidak tercampur dengan reagen atau pewarna baru yang akan diberikan.

Setelah pembilasan terakhir, gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop. Jika terbentuk warna ungu maka termasuk golongan bakteri gram positif , dan jika terbentuk warna merah atau merah muda maka termasuk golongan bakteri gram negatif.

2.3

Isolasi Bakteri

Populasi mikroba di alam sekitar kita besar lagi kompleks. Beratus-ratus spesies pelbagai mikroba biasanya menghuni bermacam-macam bagian tubuh kita, termasuk mulut, saluran pencernaan, dan kulit. Mereka terdapat dalam jumlah yang luar biasa besarnya. Sebagai contoh, sekali bersin dapat menyebarkan beribu-ribu mikroorganisme. Alam sekitar kita, udara, tanah, dan air juga dihuni kumpulan mikroorganisme. Penelitian yang layak mengenai mikroorganisme dalam berbagai habitat ini memerlukan teknik untuk memisah-misahkan populasi campuran yang rumit ini, atau biakan campuran menjadi spesies-spesies yang berbeda-beda sebagai biakan murni. Biakan murni terdiri dari suatu populasi sel yang semuanya berasal dari satu sel induk.(1;85) Isolasi adalah merupakan cara memisahkan mikroorganisme tertentu dari lingkungan, sehingga dapat diperoleh biakan yang sifatnya murni, sehingga biakan tersebut disebut kultur murni. (2;28). Pekerjaan memindahkan mikroba dari medium lama ke medium yang baru harus dilaksanakan secara teliti. Terlebih dahulu harus diusahakan agar semua alat-alat yang sangkut paut dengan medium dan pekerjaan inokulasi (penanaman) itu benar-benar steril, hal ini untuk menghindarkan kontaminasi, yakni masuknya mikroorgasnisme yang tidak kita inginkan. Beberapa langkah pada pekerjaan inokulasi dan isolasi mikroba adalah sebagai berikut: 1.

Menyiapkan ruangan Ruang tempat inokulasi harus bersih, dan bebas angin. Dinding ruang yang basah

menyebabkan butir-butir debu menempel. Pada waktu mengadakan inokulasi, baik sekali bila meja tempat inokulasi didasari dengan kain basah. Pekerjaan inokulasi dapat dilakukan di dalam suatu kotak berkaca (enkas). 2.

Pemindahan dengan Kawat Inokulasi

Ujung kawat inokulasi sebaiknya dari platina atau dari nikrom; ujung kawat boleh lurus, boleh juga berupa kolongan yang berdiameter 1-3 mm. Lebih dahulu ujung kawat ini dipijarkan, sedang sisanya sampai tangkai cukup dilewatkan nyala api saja. Setelah dingin kembali, ujung kawat itu disentuhkan suatu koloni. Mulut tabung tempat pemiaraan itu juga dipanasi setelah sumbatnya diambil. Setelah pengambilan inokulum (sampel bakteri) selesai, mulut tabung dipanasi lagi kemudian disumbat seperti semula. Ujung kawat yang membawakan inokulum tersebut digesekkan pada medium baru atau pada suatu kaca benda, kalau tujuannya memang akan membuat suatu sediaan. 3.

Pemindahan dengan Pipet Cara ini dilakukan misalnya pada penyelidikan air minum atau penyelidikan susu.

Untuk itu diambillah 1 ml sampel untuk diencerkan dengan 99 ml air murni yang disterilkan. Dalam pengenceran ini tergantung dari keadaan air atau susu yang diselidiki. Kemudian diambil 1 ml dari enceran ini untuk dicampur-adukkan dengan medium agar-agar yang masih dalam keadaan cair. Lalu agar-agar yang masih encer dituangkan di cawan petri. Setelah agar-agar membeku, maka cawan petri yang berisi piaraan baru itu disimpan dalam tempat yang aman, misalnya dalam inkubator. 4.

Teknik biakan murni (Cara Menyendirikan Biakan Murni) Di alam bebas tidak ada mikroba yang hidup tersendiri terlepas dari spesies yang lain.

Seringkali mikroba patogen kedapatan secara bersama-sama dengan mikroba saproba (saprobakteri). Dalam teknik biakan murni tidak saja diperlukan bagaimana memperoleh suatu biakan murni, tetapi juga bagaimana memelihara serta mencegah pencemaran dari luar. Medium untuk membiakkan mikroba haruslah steril sebelum digunakan. Pencemaran (kontaminasi) dari luar terutama berasal dari udara yang mengandung banyak mikroorganisme. (3;64-65) Teknik biakan murni untuk suatu spesies dikenal dengan beberapa cara, yaitu: a.

Cara Pengenceran Caranya adalah dengan mengencerkan suatu suspensi yang berupa campuran

bermacam-macam spesies kemudian diencerkan dalam suatu tabung tersendiri. Dari pengenceran ini kemudian diambil 1 ml untuk diencerkan lagi, diambil lagi untuk disebarkan pada suatu medium padat. Kemungkinan besar kita akan mendapatkan beberapa koloni

tumbuh dalam medium tersebut, tetapi mungkin juga kita memperoleh satu koloni saja. Dalam hal demikian, kita telah memperoleh satu koloni murni, dan selanjutnua spesies ini dapat kita jadikan piaraan murni (biakan murni). b.

Cara Penuangan Caranya adalah dengan mengambil sedikit sampel campuran bakteri yang sudah

diencerkan, dan sampel itu kemudian disebarkan dalam satu medium dari kaldu dan gelatin encer. Setelah medium mengental, maka selang beberapa jam kemudian nampaklah koloni yang masing-masing dapat dianggap murni. c.

Cara Penggesekan / Penggoresan Cara ini lebih menguntungkan bila ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi

memerlukan ketrampilan yang diperoleh dari latihan. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Tetapi kelemahan cara ini adalah bakteri-bakteri anaerob tidak dapat tumbuh. 1) Goresan T



Lempengan dibagi menjadi 3 bagian dengan huruf T pada bagian luar dasar cawan Petri



Inokulasikan daerah I sebanyak mungkin dengan gerakan sinambung



Panaskan ose dan biarkan dingin kembali. Gores ulang daerah I sebanyak 3-4 kali dan teruskan goresan di daerah II



Pijarkan kembali ose, Prosedur di atas diulangi untuk daerah III

2) Goresan kuadran

Teknik ini sama dengan goresan T, hanya lempengan agar dibagi menjadi 4, yaitu 3) Goresan radian



Goresan dimulai dari bagian pinggir lempengan



Pijarkan sengkelir dan dinginkan kembali



Putar lempengan agar 900 dan buat goresan terputus dimulai dari bagian pinggir lempengan



Putar lempengan agar 900 dan buat goresan terputus di atas goresan sebelumnya



Pijarkan ose

4) Goresan sinambung



Ambil satu mata ose suspensi dan goreskan setengah permukaan lempengan agar



Jangan pijarkan ose,putar lempengan 1800 ,gunakan sisi mata ose yang sama dan gores pada sisa permukaan lempengan agar

2.3.1

Cara penyebaran Pengenceran sampel seperti pada cara penuangan.,Dengan memipet sebanyak 0,1 ml

cairan dari botol pengencer dan biarkan cairan mengalir ke atas permukaan agar.Cairan sampel disebarkan dengan penyebar yang terbuat dari gelkas. Pada teknik ini sterilisasi penyebar dilakukan dengan mencelupkan alkohol terbakar habis. Penyebar didinginkan dahulu

sebelum

digunakan

untuk

menyebarkan

cairan

sampel

pada

permukaan

agar. Penyebaran cairan contoh(sampel)dilakukan dengan memutar agar lempengan tersebut.

2.3.2 Cara pengucilan satu sel(sinle cell isolation) Cara ini dengan menggunakan suatu alat yang dapat memungut satu bakteri dari sekian banyak bakteri,dengan tanpa ikutnya bakteri yang lain.,Alat semacam ini tidak mudah untuk menggunakannya.Alat iu berupa mikropipet yang ditempatkan pada suatu mikromanipulator Flora mikroba di lingkungan mana saja pada umumnya terdapat dalam populasi campuran. Boleh dikatakan amat jarang mikroba dijumpai sebagai satu spesies tunggal di alam. Untuk mencirikan dan mengidentifikasi suatu spesies tersebut harus dapat dipisahkan dari organisme lain yang umum dijumpai dalam habitatnya, lalu ditumbuhkan menjadi biakan murni. Sesungguhnya ada beberapa metode untuk memperoleh biakan murni dari suatu biakan campuran. Dua diantaranya yang paling sering digunakan yaitu: Metode cawan gores dan Metode cawan tuang. Suspensi mikrobmikroba digoreskan pada agar lempengan, agar miring atau media cair. Sifat biakan dari suatu mikroorganisme tergantung pada penampilannya pada berbagai media. Ciri berikut ini digunakan untuk mengevaluasi biakan: 

Agar Miring Sifat pertumbuhan pada agar miring terlihat sebagai tidak ada, sedikit, atau subur.

Pengamatan pembentukan warna koloni. Mikroba yang tumbuh dengan subur diatas

permukaan suatu media akan telihat lebih buram dibanding dengan pertumbuhan yang tidak subur. 

Media Cair Sifat pertumbuhan pada bagian permukaan, dibawah permukaan dan dasar tabung

dapt terlihat dengan jelas. Pada beberapa mikreoba terlihat pembentukan partikelyang tebal pada lapisan pemukaan. Dibawah lapisan permukaan dapat terlihat pertumbuhan yang keruh,bergranula, atau flokulen, sedangkan pada bagian dasar kadangkala terlihat sedimenberupa granula kental atau terdiri dari partikel besar. 

Agar lempengan Koloni yang tumbuh diatas lempeng perlu diperhatikan warna, sifat tembus cahaya,

pinggiran, sifat permukaan dan bentuknya. Kunci pokok dalam mempelajari identifikasi mikroorganisme termasuk bakteri adalah adanya kultur murni hasil isolasi mikroorganisme, sehingga identifikasi dapat berhasil dengan baik, apabila diperoleh isolat yang telah murni. Kultur murni adalah suatu koloni yang berasal dari satu sel mikroorganisme atau bakteri. Kebanyakan identifikasi sangat tergantung dari raksi-reaksi positif atau negatif yang spesifik yang disebabkan oleh suatu kultur murni. Adanya pencemaran mikroorganisme lain, akan menyebabkan hasil uji dapat positif atau negatif palsu. Sehingga dalam mikrobiologi klinik akan memperoleh hasil diagnosa salah atau palsu. (6;322) Begitu pentingnya kultur murni dalam identifikasi mikroorganisme (bakteri), maka cara-cara untuk memperoleh kultur menjadi sangat fundamental bagi bidang mikrobiologi. Cara termudah untuk memperoleh kultur murni adalah dengan cara penanaman dalam plat agar secara goresan atau dengan taburan. Sel inokulum akan tersebar diatas media agar sedemikian rupa, sehingga koloni yang tumbuh merupakan koloni yang berasal dari satu sel. Koloni-koloni tersebut selanjutnya digoreskan kembali pada medium agar yang lainnya untuk mengecek kemurniannya. Cara lain untuk mempermudah mengenal kultur murni adalah dengan menggunakan media differensial. Suatu reaksi dengan medium memungkinkan differensiasi antara dua atau lebih mikroorganisme. Mikroorganisme yang diinginkan mungkin tidak terbedakan, tetapi kemungkinan-kemungkinan akan memperkecil kelompok yang dicari.

Bacillus Subtilis diasosiasikan dengan keracunan makanan dan bermacam infeksi, seperti septicemia, Panophthalmitis, Pneumonia, infeksi luka dan seritonitis. Koloni bacillus subtilis adalah besar dan biasanya berpigmen kuning atau merah jambu sampai oranye atau coklat. Bacillus merupakan sel berbentuk batang dengan ukuran 0,3-2,2 µm x 1,27-7,0 µm. sebagian besar motif flagellum khas lateral membentuk endospora; tidak lebih dari satu dalam satu sel sporangium. Gram positif. Metabolism dengan respirasi sejati-Fermentasi sejati atau kedua-duanya yaitu respirasi dan fermentasi. Aerobik sejati atau anaerobic fakultatif. Umum dijumpai dalam tanah.

BAB III PENUTUP

3.1

Kesimpulan Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan

spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri Isolasi dan inokulasi merupakan percobaan yang sangat penting, karena melihat kondisi lingkungan di sekitar kita yang banyak terdapat mikroorganisme baik yang patogen maupun yang non patogen, sehingga pemisahan dan identifikasi bakteri yang satu dengan lainnya juga dibutuhkan.

3.2

Saran Diharapkan mahasiswa kedokteran hewan, mampu membedakan bakteri gram positif

dan negatif serta mahasiswa dapat memahami tentang isolasi atau inokulasi bakteri secara lebih detail.

DAFTAR PUSTAKA

Aditya,Mushoffa.2010.Teknik Pewarnaan Bakteri.(http://mushoffaditya.blogspot.com/2010/ 1/teknik-pewarnaan bakteri.html. 11 November 2010) Fitria, Bayu. 2009. Pewarnaan Gram (Gram positif dan Gram Negatif). (http://biobakteri.wordpress.com/2009/06/07/7-pewarnaan-gram-gram-positif-dan gram-negatif. 11 November 2010). Hadioetomo, R. S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Gramedia. Karuniawati, Risdiyani, S. Nilawati, Prawoto, Y. Rosana, B. Alisyahbana, I. Parwati, Wia Melia, dan T.M. Sudiro. 2005. Perbandingan Tan Thiam Hok, Ziehl Neelsen dan Fluorokrom sebagai Metode Pewarna Basil Tahan Asam untuk Pemeriksaan Mikroskopik Sputum. Makara Kesehatan Vol. 9 No. 1. Manurung, Pebrin.2010.Pengamatan Bentuk Bakteri. (http://pebrinmanurung.blogspot.com/2010/10/pengamatan-bentuk bakteri.html. 11 November 2010). Purwoko, Tjahjadi. dkk. 2010. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Laboratorium Mikrobiologi UNS.