IP CULTIVO DE MICROALGA MEDIANTE MASIFICACION UNIVERSIDAD DE PIURA.doc

UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA FACULTAD DE INGENIERIA PESQUERA DEPARTEMENTO ACADÉMICO DE ACUICULTURA

INFORME DE PRACTICA: CULTIVO DE UNA MICROALGA (Dunaliella SP) MEDIANTE LA TÉCNICA DE LA MASIFICACION

CURSO

: ACUICULTURA I

PIURA - PERU

INTRODUCCION Son llamadas microalgas a una gran cantidad de especies que constituyen el fitoplancton que abarca desde organismos autótrofos hasta microflagelados y microciliados auxótrofos. Su posición taxonómica ha sido de gran polémica entre botánicos y zoólogos, como ejemplo podemos mencionar el grupo de los dinoflagelados, conocidos por

unos

como

microalgas

y

por

otros

como

protozoarios. Estas especies aportan un alto contenido nutricional para peces, crustáceos y moluscos, además de ofrecer facilidades de manejo en sistemas de cultivo tanto en laboratorio como en producción a gran escala con fines comerciales. Debido a esto es necesario cultivar los diversos tipos de

microalgas

dándoles

las

condiciones

y

enriqueciéndoles con los nutrientes necesarios para darle mayor calidad a nuestros cultivos hidrobiologicos.

CULTIVO DE UNA MICROALGA MEDIANTE LA TÉCNICA DE LA MASIFICACION DUNALIELLA SP 1.- DESCRIBA DETALLADAMENTE LA COMPOSICIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO GUILLARD TABLA DEL MEDIO DE GUILLARD “F/2” (J. STEIN, 1979) Nutrientes Mayores NaNO3 7.5 NaH2PO4.H2O 0.5 NH4Cl 2.65 Na2SIO3.9N2O 3

Solución Primaria % w/v % w/v % w/v % w/v (calentar para disolver)

Usar 1 ml de éstas soluciones por litro de agua de mar, para preparar el medio “F/2”. Sugerencia: preparar el NaNO3 junto con NaH2PO4 . H2O en 100 ml Metales Traza CuSO4.5H2O ZnSO4.7 H2O ZnCl2 CoCl2.6H2O MnCl2.4H2O Na2MnO4.2H2O

Solución Primaria 0.98 % w/v 2.2 % w/v 1.05 % w/v 1.0 % w/v 18 % w/v 0.63 % w/v

Es conveniente hacer las soluciones primarias en forma individual, y con una concentración menor de 106 mas concentrada que en el medio “F/12” Solución Primaria De Metales Traza A. Con “Secuestrante Férrico” (Cloruro Férrico): Disolver 5g del secuestrante férrico en 900 ml de agua destilada y añadir 1 ml de cada una de las soluciones primarias de metales traza preparados anteriormente; aforar a un litro y asegurar que el pH quede cerca de 4.5. use 1 ml de esta solución por cada litro de agua de mar para hacer el medio de cultivo. Agua de mar filtrada (5, 10, etc.) y de ser posible irradiada con UV B. Con EDTA y Cloruro Férrico (FeCl.6H2O): disuelva 3.15 g de FeCl.6H2O ó 4.36 de EDTA (Na2) en 900 ml de agua destilada, agregue 1 ml de cada una de las soluciones stock primarias de metales traza y afore a 1 litro, asegure un pH de 2.0

Use 1 ml de esta solución por litro de agua de mar para preparar el medio “f/2” Solución Primaria De Vitaminas  Solución primarias de Biotina: se prepara a partir de cristales de Bl, disolver 10 mg de Biotina en 96 ml de agua destilada. Haga esta solución ligeramente ácida para ser autoclavada y manténgase en un congelador.  Solución de Vitamina B12: A partir de Cyanocobalamina U.S. de 100 mg/ml solución inyectable. Tomar 1 ml y aforarlo en 100 ml de agua destilada. La solución se acidifica para ser autoclavada y se congela. Tomar 1ml de la solución primaria de Biotina y 0.1 ml de la solución stock primaria de B12, aforar a 100 ml con agua destilada y añadir 20 mg de Tiamina HCl. Se pueden preparar ampolletas de 2,5 ó 10 ml y almacenarlas estériles (acidificas) en el congelador. Use ½ ml de esta solución por cada litro de agua de mar para preparar el medio “f/12” Preparación del Buffer “Tris” Tome 50 g de “tris” y disuélvase en 200 ml de agua destilada y ajuste el pH a 7.2 en HCl. Use de 1 a 5ml por litro de medio antes de la autoclave, ajustando el pH a 7.4 (recomendado usar 1 ml por litro cuando el pH del medio es 7.9 – 8.2) TABLA DEL MEDIO DE CULTIVO (AGUA DULCE) (Guillard, In: Stein, 1979) Guillard comunicación personal a J. Steinn, 1973. Handbook of phycological methods, Culture Methods and Growth Measurements. Cambridge at the University Press: 448 pp a. Macronutrientes:  CaCl2.H2O 36.76 g/l  MgSO4.7H2O 36.97 g/l  NaHCO3 12.60 g/l  K2HPO4 8.71 g/l  NaNO3 85.01 g/l  Na2SiO3.9H2O 28.42 g/l De esta solución rotulada como a se obtiene 1 ml y se le adiciona a 1 litro de agua esterilizada. b. Micronutrientes:  Na2EDTA  FeCl3.6H2O  CuSO4.5H2O  ZnSO4.7H2O

4.36 g/l 3.15 g/l 0.01 g/l 0.022 g/l

  

CoCl2.6H2O MnCl2.4H2O Na2MoO4.2H2O

c. Vitaminas:  Thiamine. HCl  Biotin  Cyanocobalamina De esta solución rotulada agua esterilizada

0.01 g/l 0.18 g/l 0.006 g/l 0.1 mg/l 0.5 g/l 0.5 g/l como c, se obtiene 1 ml y se adiciona a 1 litro de

d. Tris:  Tris (Hydroxymethyl) – Aminomethano 50 g./200 ml H2O destilada (Cuando el cultivo se encuentra axénico el tris puede reemplazarse por Glycylaglycine). De esta solución rotulada como d, obtener 2 ml y adicionar al litro de agua esterilizada que se esta preparando en cultivo, se debe hacer ajuste de pH a 7.2 con HCl cuidadosamente para no obtener el pH ácido. Solución Básica de Nutrientes  NaNo 75 mg  Po4H2NaH2O 5 mg  SiO2Na29H2O 15 – 30 mg Solución de Metales Traza  Na2EDTA  Cl3FeGH2O  So4CuSH2O  So4Zn7H2O  Cl2Mn4H2O  MoO2Na22H2O  Cl2Co6H2O

4.36 mg. 3.15 mg 0.01 mg 0.022 mg 0.018 mg 0.006 mg 0.01 mg

Solución de Vitaminas  Cianolobalamina (B12) 0.5 mg  Tiamina Mc (B1) 0.1 mg  Biotina (vit. M) 0.5 mg 2. DESCRIBA PUNTUALMENTE TODO EL SISTEMA ACONDICIONAMIENTO REALIZADO EN EL CULTIVO DE MICROALGAS.

DE

Para el cultivo de la microalga Dunaliella sp y para las demás microalgas, se llevo a cabo un acondicionamiento muy cuidadoso, dado que cualquier negligencia

cometida en el acondicionamiento podría ocasionar el fracaso de nuestros cultivos. Materiales  Biotero  Fluorescente  Termómetro  Inóculo o cepa  Aireador  1 pali globo  Cocina eléctrica

    

Botellas de vidrio y plástico de 500 ml, 1500 ml y 3000 ml Sustancias Madres: Nitrógeno y Fósforo Agua de mar esterilizada Pipetas Fiolas

En El Biotero Este inicialmente presentaba el inoculo o cepa de donde se extraería las muestras para el cultivo, y que posteriormente albergaría a todos los cultivos de las microalgas a cultivar. Acondicionamiento Químico Desinfección.- se llevo a cabo en las botellas a utilizar que fueron de vidrio y plástico. Las botellas de vidrio y de plástico fueron desinfectadas con hipoclorito de sodio o lejía, detergentes, las cuales fueron necesarias colocarles un tapón hecho de algodón para evitar el ingreso de microorganismos. Esterilización.- ésta se llevo a cabo en el agua de mar a usar, para esterilizarla solo era necesario dejar que el agua haga un pequeño burbujeo, sin dejarlo que ebullicione debido a que se precipitarían los fosfatos y las sales minerales, si esto sucedía, era necesario volver a esterilizar una nueva muestra de agua. Acondicionamiento Físico En el interior del biotero se acondiciono un fluorescente el cual estaba iluminado las 24 horas del día, con el propósito de dar energía e iluminación a los cultivos para realizar la fotosíntesis. También se coloco un termómetro para poder llevar el control diario de la temperatura. Fue necesario obtener un aireador o agitador, el cual al final de la manguera del aireador se le coloco un pali globo para que pueda tener las condiciones necesarias de aireación a los cultivos, de la misma manera evitar la sedimentación de las microalgas. 3.- ¿CÓMO SE HA LOGRADO CONTROLAR LA CONTAMINACIÓN DE SU CULTIVO? Se logro controlar la contaminación del cultivo de Dunaliella sp, debido a las siguientes razones:  El medio de cultivo que se uso fue el medio de cultivo Guillard.

  

  

Para cada botella de cada masificación se colocó un tapón de algodón el cual evitaba el ingreso de microorganismos, solamente se permitía el paso de la manguera del aireador. Las botellas fueron desinfectadas con Hipoclorito de Sodio o lejía, con detergentes, alcohol. Al momento de realizar la masificación, la persona que manipulaba los cultivos tenía que estar en buen estado de salud, así como evitar los estornudos, evitar el habla, evitar el acercamiento del inóculo con la cara o boca. Las pipeta y la fiola debían estar desinfectadas El agua de mar a usar para las masificaciones debían de estar completamente estériles. Durante las 24 horas del día el cultivo permanecía en el interior del biotero, el cual solamente se sacaba para llevar a cabo la siguiente masificación.

4.- ¿CUÁL HA SIDO EL EFECTO DE LA TEMPERATURA REGISTRADA DURANTE EL EXPERIMENTO, SOBRE EL DESARROLLO DE CULTIVO DE LA MICROALGA? 1er Experimento Se realizó un primer experimento el cual se dejaron los cultivos en la parte externa del laboratorio, para lo cual se llevo a cabo los mismos procedimientos de cultivo, usando la misma técnica. Estos cultivos fueron depositados en el interior de una tolda para darle mayor temperatura, también se les coloco fluorescentes a medio metro de distancia de los cultivos, pero se noto diferentes cambios de temperaturas muy bruscos que variaban de 24ºC a 32ºC, y como consecuencia ocasiono la decoloración de las microalgas, de un color verde pálido a un color transparente en solo pocos días ocasionando el colapso y fracaso de los cultivos por lo que se vio la necesidad de volver a cultivar pero esta vez se tuvo un mayor control de temperatura debido que los cultivos fueron colocados en el laboratorio en el interior de un biotero. 2do Experimento en el Laboratorio Durante el tiempo que duro el 2 do experimento, la temperatura ha sido un factor físico muy importante para el desarrollo de la microalga, debido que su efecto ha sido satisfactorio, ya que se mantuvo dentro del rango óptimo para el desarrollo de la microalga cultivada. La temperatura registrada se mantenía en el rango de 25 – 27 ºC, el cual permitió que las microalgas se reproducieran satisfactoriamente, en el transcurso de los días se noto el cambio de la coloración de verde pálida a otra coloración verde oscura. El cual indicaba que el cultivo marchaba en buenas condiciones. Esta temperatura se dio gracias a la iluminación de los fluorescentes colocados en el interior del biotero. 5.- DESCRIBA DIARIAMENTE EL DESARROLLO DEL CULTIVO (PUNTUALICE LA VARIACIÓN DEL COLOR ) DESPUÉS DE CADA MASIFICACIÓN.

MASIFICACIÓNES DE Dunaliella SP 1 MASIFICACION A 500 ml (10/11/2004)  1 ml de Nitrógeno para 500 ml de agua de mar  1 ml de Fósforo para 500 ml de agua de mar  160 ml del inóculo de Dunaliella sp  350 ml de agua de mar ERA

Días 10/11/2004 11/11/2004 12/12/2004 15/11/2004 16/11/2004 17/11/2004

Temperaturas 9:00 a.m. – 11:00 a.m. 4:00 p.m. – 6:00 p.m. 26 ºC 27 ºC 25 ºC 27 ºC 26 ºC 26.5 ºC 26 ºC 26.5 ºC 25.5 ºC 26 ºC 26 ºC 27 ºC

Cuando se llevo a cabo la primera masificación se noto que el color era verde pálido, y a medida que iban pasando los días se observaba que la coloración de las microalgas de nuestra especie Dunaliella sp. iba tomando la coloración verde mas intenso y al mismo tiempo se notaba la evaporación del agua. 2 MASIFICACION 1500 ml (17/11/2004)  2 ml de Nitrógeno para 1000 ml de agua de mar  2 ml de Fósforo para 1000 ml de agua de mar  Se evaporo 20 ml de agua por lo que se contó con 490 ml del inóculo de Dunaliella sp de la primera masificación  1000 ml de agua de mar Temperaturas Días 9:00 a.m. – 11:00 a.m. 4:00 p.m. – 6:00 p.m. 17/11/2004 26 ºC 27 ºC 18/11/2004 25 ºC 27 ºC 19/12/2004 26 ºC --22/11/2004 26 ºC --23/11/2004 25.5 ºC 26 ºC 24/11/2004 27 ºC 27 ºC 3 MASIFICACION 3000 ml (24/11/2004)  3 ml de Nitrógeno para 1500 ml de agua de mar  3 ml de Fósforo para 1500 ml de agua de mar

 

Se evaporo 55 ml de agua por lo que se contó con 1435 ml del inóculo de Dunaliella sp de la primera masificación 1500 ml de agua de mar

Días 24/11/2004 25/11/2004 26/12/2004 29/11/2004 30/11/2004 01/12/2004 02/12/2004 03/12/2004 06/12/2004 07/12/2004 08/12/2004

Temperaturas 9:00 a.m. – 11:00 a.m. 4:00 p.m. – 6:00 p.m. 26 ºC 27 ºC 26 ºC 27 ºC 26 ºC --26 ºC --26 ºC 26 ºC 26 ºC 27 ºC 26 ºC 26.5 ºC 26 ºC 27 ºC 26 ºC 27 ºC 26 ºC 27 ºC 26 ºC 27 ºC

Porcentaje de Evaporación de agua en las Masificaciones 1era Masificación (500 ml) De los 510 ml de la 1ra masificación se evaporo 10 ml de agua quedando 490 ml de agua, entonces tenemos 510 ml -------------------100 % 490 ml ------------------- x x = 96 %, entonces se evaporo el 4% del total de agua 2da Masificación (1500 ml) 490 ml + 1000 ml de agua = 1490 ml de agua De los 1490 ml de la 2 da masificación se evaporo 55 ml de agua quedando 1435 ml de agua, entonces tenemos 1490 ml -------------------100 % 1435 ml ------------------- x x = 96.31 %, entonces se evaporo el 3.69% del total de agua 3ra Masificación (3000 ml) 1435 ml + 1500 ml de agua = 2935 ml de agua De los 2935 ml de la 2da masificación se evaporo 105 ml de agua quedando 1435 ml de agua, entonces tenemos 2935 ml -------------------100 % 2830 ml ------------------- x x = 96.42 %, entonces se evaporo el 3.58% del total de agua

CONCLUSIONES GENERALES 

El cambio de color es un factor determinante del progreso del cultivo, a mayor coloración verde, la Dunaliella sp se esta desarrollando en mejores condiciones ambientales.



La temperatura debe de ser estable, no debe de existir cambios bruscos de temperatura, ya que esto podría ser mortal para las microalgas



Cuando se da un acondicionamiento adecuado y se evita la contaminación, el cultivo progresa grandemente.



Se recomienda trabajar en laboratorio, siendo mejor colocar los medios de cultivo en el interior de un bioterio, controlando la temperatura constantemente



Se recomienda que la persona que manipulea las masificaciones no debe de estar enferma, ni acercar las cepas y cultivos cerca de la cara o boca debido a los microorganismos que poseemos y que podrían contaminar el cultivo



Para evitar la contaminación se debe tener como principio general la desinfección de los materiales a usar como botellas, fiolas, pipetas, etc; asi como la esterilización del agua de mar para el caso de la Dunaliella sp

DISCUSIONES 

A mayor volumen de masificación se obtendrá menores cantidades de evaporación de agua.



No se debe de hacer hervir el agua porque si esto sucede el agua quedará inactiva para la masificación.



Cuando se llevo a cabo el primer experimento colocando los medios de cultivos en la parte exterior del laboratorio, resulto la muerte total de las microalgas debido a que no se pudo tener un control de la temperatura.



No se logro determinar la absorvancia y tramitancia debido que el laboratorio principal no se encontraba en las condiciones básicas para llevar a cabo estas determinaciones, además no se podía tener acceso a los equipos necesarios.



Al finalizar las practicas de masificaciones, se logro obtener volúmenes mayores de inóculos, los cuales deben de ser aprovechados y no dejarlos morir.

BIBLIOGRAFÍA 

http://www.fao.org/docrep/field/003/AB473S/AB473S02.htm#tbl13

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http://www.cibnor.mx/colecciones/malgas/eintro.php

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www.google.com

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www.yahoo.com

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http://www.fao.org/docrep/field/003/AB473S/AB473S00.htm



Manual de producción de algas; SENAIM



Gilbert Bernabé (1988) Acuicultura. Vol. 1, 681 pág

ANEXOS 1. CONSIDERACIONES GENERALES DE LOS CULTIVOS DE MICROALGAS Muchos factores contribuyen para el desarrollo óptimo de los cultivos de microalgas, algunos de éstos afectan las características del crecimiento. Los recipientes de cultivo más comúnmente usados son de materiales no tóxicos como las cajas de Petri, matraces Erlenmeyer, matraces Ferenback, carboys o garrafas, etc., adecuados para cultivos de laboratorio. Para cultivos a gran escala los recipientes de plástico, madera y concreto son los más recomendables, incluyendo los estanques rústicos en áreas rurales son los sistemas más económicos. En cultivos masivos la aireación es un factor muy importante para la homogenización de los nutrientes y para evitar la sedimentación de las microalgas. Las diatomeas suelen acumularse en lugares donde el agua no se mezcla, esto también depende de la forma del recipiente de cultivo que cuando no es adecuado retarda el crecimiento. Otro factor importante es la penetración de la luz en el cultivo; en los cultivos masivos la profundidad es tan grande que la intensidad de la luz insidente no es suficiente para la fotosíntesis, hasta el fondo del tanque. En los cultivos masivos a la intemperie la penetración de la luz es más efectiva, pero se debe reducir la intensidad de la luz fuerte, cubriendo estos estanques con una malla. En cultivos a gran escala es recomendable la inyección de CO 2 (0.5%) para contribuir al proceso fotosintético.

El crecimiento y la división celular son afectados por la intensidad de la luz y el fotoperíodo (horas de iluminación y oscuridad) en relación también a la temperatura, por ejemplo en Diatomeas a 20°C y 1,000 lux se obtiene un crecimiento favorable. Tabla Nº 1: Características De Algunas De Las Especies De Algas Unicelulares Utilizadas En Acuacultura (Coll-Morales J., 1983)

GENERO Phaeodactylum (diatomea) Skeletonema (diatomea) Dunaliella (cloroficea) Chlorella (cloroficea) Tetraselmis (cloroficea) Monochrysis (crisoficea) Isochrysis (crisoficea)

CICLO 10 h

TEMPERATURA DIAMETRO OPTIMA

MEDIO

25°C

10.4μ

13.1 h 18°C

>20μ

24 h

16°C

17.8μ

7.7 h

25°C

5μ

18 h

18°C

18.4μ

15.3 h 20–25°C

10μ

30.2 h 20°C

10.2μ

Estas especies se han utilizado en acuicultura marina dados su valor nutritivo y digestibilidad, además de su capacidad para crecer en cultivos masivos. La duración del ciclo celular como los requerimientos de temperatura son susceptibles de variación mediante selección de variedades.

TABLA Nº 2 Requerimientos PRINCIPALES DE LOS CULTIVOS DE MICROALGAS

REQUERIMIENTOS Físicos

COMPUESTOS QUIMICOS

VALORES 2,000 –

Luz

4,000 lux

Temperatura

15 – 22°C

Salinidad

0.37‰

pH

7–9

Redox CO2CO3≃

g/100 ml

O, H

O2H2O

g/100 ml

N

N2NH4+ NO3

g/100 ml

P

PO4≃

g/100 ml

S

SO4≃

g/100 ml

Na, K, Ca, Mg

Sales

g/100 ml

Nutritivos C

Fe, Zn, Mn, B, Br, Si Sales Cu, Co, Cl, I, Sr, Rb, Al, et Vitaminas

Sales B12, tiamina, biotina

mg/100 ml μg/100 ml μg/100 ml

En esta tabla Nº 1 se exponen los requerimientos principales de los cultivos de microalgas y sus valores aproximados. En cada caso habrá que estudiar los requerimientos particulares de la especie y de la variedad que se vaya a cultivar en las condiciones concretas de cultivo que se van a utilizar, por lo que estos datos son sólo orientación (Kinne, 1979).

En la tabla Nº 2 se muestran las características de algunas de las especies de microalgas unicelulares utilizadas en acuacultura para la nutrición de moluscos y crustáceos. Además del control de los parámetros antes mencionados es necesario considerar que para el establecimiento de un sistema de producción de alimento vivo es importante el dominio de las técnicas de aislamiento, purificación y mantenimiento de cepas, así como el conocimiento de la fisiología, ciclo de vida, bioquímica, etc. de las especies para determinar su factibilidad de cultivo y sobre todo su contenido nutricional para poder llevarse a niveles masivos de producción para fines acuaculturales. La Tabla 8 muestra algunos de los principales requerimientos de los cultivos de microalgas. 2. MEDIOS DE CULTIVO Se han desarrollado diferentes medios para el cultivo de microalgas que van desde las fórmulas para enriquecer el agua de mar natural, hasta el uso de medios artificiales que permitan resultados constantes en contraste con los resultados tan variables que brinda el uso del agua de mar natural que entre otros factores depende del lugar donde se colecta ésta, y el tiempo de almacenamiento de la misma. Los medios artificiales se usan principalmente para fines experimentales, ya que como se ha mencionado, brinda resultados constantes, aunque existen algunas especies que no crecen en medios artificiales por factores desconocidos que afectan su crecimiento, las principales fórmulas utilizadas van desde el agua de Miguel, que data de 1910, desarrollada por Allen-Nelson; el medio de EndSchereiber de 1934, hasta fórmulas específicas para familias como la fórmula del Laboratorio Haskins de Nueva York para diatomeas, Provasoli et al., 1975; Matthiesen & Thorner, 1966; McIachlan, 1973; Guillard F., 1973; Droop, 1975, 1979; Schoene, 1982, etc. Las principales formulaciones de los medios de cultivo, tanto de mantenimiento de cepas como de producción masiva (minerales, enriquecidos y orgánicos), se describen desde la Tabla 9 hasta la Tabla 16.

El fitoplancton se desarrolla y multiplica en relación de las condiciones fisicoquímicas del medio. En términos generales son los macronutrientes o factores limitantes del crecimiento el carbono, Nitrógeno, Fósforo, Silicio, Magnesio, Potasio y Calcio, que se requieren en cantidades relativamente grandes, mientras que los llamados micronutrientes (Fierro, Manganeso, Cobre, Zinc, Sodio, Molibdeno, Cloro y Cobalto) se necesitan en menores cantidades. Existen otros medios que incluyen en su composición sustancias orgánicas (vitaminas, aminoácidos) necesarios para aquellas especies de microalgas Auxótrofas, es decir que no sintetizan por medio de la fotosíntesis este tipo de compuestos y resultan factores que pueden limitar su crecimiento; tal es el caso de Platimonas, Chrysophytas y algunas Bacillariophyceas. 3. TECNICAS DE AISLAMIENTO Y PURIFICACION Muchos métodos se han desarrollado para obtener cultivos monoespecíficos (de una sola especie) y axénicos (libres de contaminantes). A continuación se brinda una breve descripción de algunos de los principales métodos que se utilizan para aislar y purificar microalgas (O. Umebayashi, 1975) (Fig. 1). 1) Aislamiento Pipeteo capilar: Se utiliza para separar microalgas mayores de 10μ, mediante una pipeta construída con un tubo capilar, a través del microscopio óptico se “pesca” las células y se separan en pequeñas gotas de nutrientes colocados alrededor de una Caja de Petri o en portaobjetos escabados. Rayado de Placas de Agar: Se transfieren pequeñas gotas de plancton con una asa de siembra, extendiendo por estrías (rompiendo un poco el agar). Este agar se prepara con una solución nutritiva para microalgas y con una relación de 1–1.5% w/v de agar disuelto en el medio nutritivo, se incuba la placa bajo iluminación a 18–20°. De este primer crecimiento se transfiere a tubos con agar inclinado sembrando por estrías o bien, se transfiere a medios líquidos en

subcultivos sucesivos para su purificación, de tal manera que en cada dilución se reduzca el número de organismos en una gota, es recomendable combinar la técnica de diluciones con la de transferencia en placa de agar o tubo inclinado para obtener cultivos clonales (de una sola colonia o célula) y poder establecer el cultivo monoespecífico. Después de 10 días, pequeñas colonias aparecen sobre la superficie del agar, que se pueden transferir mediante el Método de Hocking o de la micropipeta a medios líquidos. 2) Purificación Como ya se mencionó al describir las técnicas de aislamiento, estas mismas nos permiten purificar el cultivo a través de las resiembras clonales sucesivas, pero además es recomendable entre otros métodos el uso de antibióticos para eliminar otros microorganismos, generalmente de tipo bacteriano que estén contaminando el cultivo de microalgas de nuestro interés. En el inciso 5 de este mismo capítulo correspondiente a Métodos de Esterilización se amplian las alternativas.