Introduo-Microbiologia

Matéria de Microbiologia

Fotografias colorizadas de bactérias observadas ao microscópio eletrônico. Da esquerda para a direita: Bacillus anthracis, Escherichia coli, Neisseria gonorrhoeae

2008

Introdução à Microbiologia Introdução Microbiologia: Mikros (= pequeno) + Bio (= vida) + logos (= ciência) A Microbiologia era definida, até recentemente, como a área da ciência que dedica-se ao estudo dos microrganismos, um vasto e diverso grupo de organismos

unicelulares

de

dimensões

reduzidas,

que

podem

ser

encontrados como células isoladas ou agrupados em diferentes arranjos (cadeias ou massas), sendo que as células, mesmo estando associadas, exibiriam um caráter fisiológico independente. Assim, com base neste conceito, a microbiologia envolve o estudo de organismos procariotos (bactérias, archaeas), eucariotos inferiores (algas, protozoários, fungos) e também os vírus.

Archaea

Bactérias

Fungos

Algas

Vírus

Protozoários

Tipos estudados (Adaptado de Tortora et al., Microbiology, 8 ed)

de pelos

microrganismos microbiologistas.

Esta área do conhecimento teve seu início com os relatos de Robert Hooke e Antony van Leeuwenhoek, que desenvolveram microscópios que possibilitaram

as

primeiras

observações

de

bactérias

e

outros

microrganismos, além de diversos espécimes biológicos. Embora van Leeuwenhoek seja considerado o "pai" da microbiologia, os relatos de Hooke,

descrevendo

a

estrutura

de

um

bolor,

foram

publicados

anteriormente aos de Leeuwenhoek. Assim, embora Leeuwnhoek tenha fornecido importantes informações sobre a morfologia bacteriana, estes dois pesquisadores devem ser considerados como pioneiros nesta ciência. Recentemente foi publicado um artigo discutindo a importância de Robert Hooke para o desenvolvimento da Microbiologia.

Esquema do microscópio construído por Robert Hooke e um esquema de um fungo observado por este pesquisador. (Adaptado de Tortora et al., Microbiology - 8 ed)

Réplica do microscópio construído por Leeuwenhoek e de suas ilustrações, descrevendo os "animálculos" observados. (Adaptado do livro Brock Biology of Microorganisms, 10 Ed., 2003)

Classificação dos seres vivos De acordo com a definição tradicional da microbiologia, esta é uma ciência que até recentemente, era responsável pelo estudo de organismos classificados em três reinos distintos: Monera, Protista e Fungi. No entanto, a partir dos estudos de Carl Woese, a microbiologia passou a estar relacionada a três domínios de seres vivos. Sistemas de classificação dos seres vivos: Linnaeus (séc. XVIII): reinos Animal e Vegetal Haeckel (1866): introdução do reino Protista Whittaker

(1969):

5

reinos,

dividos

principalmente

pelas

características morfólogicas e fisiológicas: Monera: Procariotos Protista: Eucariotos unicelulares - Protozoários (sem parede celular) e Algas (com parede celular) Fungi: Eucariotos aclorofilados Plantae: Vegetais Animalia: Animais

Classificação dos seres vivos, de acordo com Whittaker (1969) (Adaptado de Pommerville, J.C.(2004) Alcamo's Fundamentals of Microbiology)

No entanto, a partir dos estudos de C. Woese (1977), passamos a dispor de um sistema de classificação baseado principalmente em aspectos evolutivos (filogenética), a partir da comparação das sequências de rRNA de diferentes organismos. Com esta nova proposta de classificação, os organismos são agora subdividos em 3 domínios (contendo os 5 reinos), empregando-se dados associados ao caráter evolutivo. Archaea: Procariotos Bacteria: Procariotos Eukarya: Eucariotos

Classificação dos seres vivos, de acordo com Woese (1977) (Adaptado de Pommerville, J.C.(2004) Alcamo's Fundamentals of Microbiology)

A princípio, acredita-se que estes 3 domínios divergiram a partir de um ancestral comum. Provavelmente os microrganismos eucarióticos atuaram como ancestrais dos organismos multicelulares, enquanto as bactérias e archaeas correspondem a ramos que não evoluíram além do estágio microbiano. Archaea: encontrados

são

em

organismos

ambientes

procariotos

cujas

que,

condições

freqüentemente

são

bastante

são

extremas

(semelhantes às condições ambientais primordiais na Terra), sendo por isso, muitas vezes considerados como sendo “ancestrais” das bactérias. No entanto,

hoje

em

dia

considera-se

as

archaeas

como

um

grupo

vivendo

em

locais

“intermediário” entre procariotos e eucariotos. Muitos

destes

organismos

são

anaeróbios,

"inabitáveis" para os padrões humanos - fontes termais (com temperaturas acima de 100°C), águas com elevadíssimos teores de sal (até 5M de NaCl limite de dissolução do NaCl), em solos e águas extremamente ácidos ou alcalinos (espécies que vivem em pH 0, outras em pH 10) e muitas são metanogênicas.

Genericamente, podemos dizer que as Archaeas definem os limites da tolerância biológica às condições ambientais. Bacteria: anteriormente

Corresponde

a

um

classificados

como

enorme

grupo

eubactérias,

de

procariotos,

representadas

pelos

organismos patogênicos ao homem, e bactérias encontradas nas águas, solos,

ambientes

em

geral.

Dentre estas, temos as bactérias fotossintetizantes (cianobactérias) e outras quimiossintetizantes (E. coli), enquanto outras utilizam apenas substratos inorgânicos para seu desenvolvimento. Eukarya: No âmbito microbiológico, compreende as algas, protozoários e

fungos

(além

das

plantas

e

animais).

As algas caracterizam-se por apresentarem clorofila (além de outros pigmentos), sendo encontradas basicamente nos solos e águas. Os protozoários correspondem a células eucarióticas, apigmentados, geralmente móveis e sem parede celular, nutrindo-se por ingestão e podendo

ser

saprófitas

ou

parasitas.

Os fungos são também células sem clorofila, apresentando parede celular, realizando metabolismo heterotrófico, nutrindo-se por absorção. Como mencionado anteriormente, os vírus são também assunto abordado

em

microbiologia,

embora,

formalmente,

não

exibam

as

características celulares, no sentido de não apresentarem metabolismo próprio, de conterem apenas um tipo de ácido nucléico, etc.

A Microbiologia na atualidade A definição clássica de "microbiologia" mostra-se bastante imprecisa, e até mesmo inadequada, frente aos dados da literatura publicados nesta última década. Como exemplo pode-se citar duas premissas que já não podem mais ser consideradas como verdade absoluta na conceituação desta área de conhecimento: as dimensões dos microrganismos e a natureza independente destes seres.

Em 1985 foi descoberto um organismo, denominado Epulopiscium fischelsoni que, a partir de 1991, foi definido como sendo o maior procarioto já descrito, exibindo cerca de 500 µm de comprimento. Esta bactéria foi isolada do intestino de um peixe marinho (Surgeonfish, peixe barbeiro ou cirurgião), encontrado nas águas da Austrália e do Mar Vermelho. Além de apresentar dimensões nunca vistas, tal bactéria mostra-se totalmente diferente das demais quanto ao processo de divisão celular, que ao invés de ser por fissão binária, envolve um provável tipo de reprodução vivíparo, levando à formação de pequenos “glóbulos”, que correspondem às células filhas.

Comparação entre o tamanho de uma célula de Epulopiscium e 4 paramécios (Adaptado do livro Brock Biology of Microorganisms, 10 Ed., 2003)

Mais recentemente, em 1999, outro relato descreve o isolamento de uma bactéria ainda maior, isolada na costa da Namíbia. Esta, denominada Thiomargarita namibiensis, pode ser visualizada a olho nú, atingindo até cerca de 0,8 mm de comprimento e 0,1 a 0,3 mm de largura.

Microscopia de

luz

polarizada,

revelando

os

grânulos de enxôfre no

interior

bactéria Thiomargarita

namibiensis.

da

Comparação entre

a

bactéria

Thiomargarita namibiensis e uma Drosophila.

(Adaptado

de

Schulz, H. N. et al. (1999).

Science,

284:493-495 Clique

no

autor,

caso deseje ler o artigo original)

Como

analisar

a

questão

do

tamanho

dos

microrganismos? Durante muito tempo se acreditava que o tamanho das bactérias era imposto pelo seu próprio metabolismo, ou seja, se a bactéria aumentasse muito em tamanho, ela seria incapaz de se manter viável e morreria. Tal fato decorre da seguinte dedução: A área superficial da membrana citoplasmática seria o fator limitante para a eficiência das trocas com o meio externo. Sabendo-se que a área de uma esfera é calculada pela fórmula que o volume de uma esfera é obtido pela fórmula

e

, a medida que a

área aumenta, seu volume aumenta muito mais rapidamente. Assim, se uma bactéria

começasse

a

crescer,

aumentando

sua

área,

a

proporção

área/volume diminuiria. Isto faria com que a célula passasse a apresentar um volume muito grande, sendo que sua área superficial seria insuficiente, em termos de trocas através da membrana, para manter sua viabilidade. A partir dos isolados de bactérias “gigantes”, o conceito da limitação de tamanho bacteriano vem sendo abandonado, pois não há mais como questionar a existência e viabilidade destas bactérias e, possivelmente, novos relatos serão incorporados, deixando de ser meras curiosidades.

Uma das explicações mais prováveis para tal fato reside na existência de grandes mesossomos nestes tipos bacterianos, refutando assim a hipótese de que tais estruturas seriam meros artefatos de microscopia. Novos estudos vêm sendo realizados, os quais estão trazendo informações sobre outras estratégias desenvolvidas pelos microrganismos para que sobrevivam, quando apresentam dimensões extremamente maiores que os microrganismos "convencionais".

Microrganismos atuando como seres multicelulares Outro aspecto que vem sendo demonstrado refere-se ao caráter “multicelular” das

bactérias. Embora

estas

exibam a capacidade

de

sobreviver como uma célula única, realizando os processos metabólicos necessários

à

sua

perpetuação,

quando

as

bactérias

encontram-se

associadas, formando colônias, ou biofilmes (estruturas rígidas, adesivas, de natureza

geralmente

polissacarídica,

que

encontram-se

fortemente

ancoradas às superfícies, criando um ambiente protegido que possibilita o crescimento microbiano), estas passam a se comportar de forma social, exibindo divisão de tarefas e alterando seu perfil fisiológico de forma a apresentar uma cooperação que reflete-se em diferentes níveis metabólicos. Sabe-se que muitos genes de virulência são expressos somente quando a densidade populacional atinge um determinado ponto. Da mesma forma, a capacidade de captar DNA do meio externo, a bioluminescência, etc, envolvem a percepção da densidade populacional por parte das bactérias. Este tipo de mecanismo de comunicação é denominado “sensor de quorum” (quorum sensing) e vem sendo amplamente estudado nas mais diferentes áreas da Microbiologia, uma vez que foi descrito tanto para bactérias como para fungos.

Estudos com bactérias primitivas Ainda em relação às novas pesquisas desenvolvidas na área de Microbiologia, temos o cultivo de bactérias pré-históricas, visando a busca de compostos com atividade antimicrobiana ou de interesse comercial. Neste sentido,

empresas

foram

criadas

(“Ambergene”),

especializadas

na

reativação de formas bacterianas latentes, isoladas de insetos preservados em âmbar. Os resultados obtidos revelam a reativação de mais de 1200 espécies bacterianas, apresentando de 2 a até 135 milhões de anos. Em 2000, foi publicado um relato descrevendo o isolamento e cultivo de uma espécie bacteriana a partir do líquido contido em um cristal de sal de 250 milhões de anos. Os estudos de seqüenciamento do DNA que codifica o RNA ribossomal 16S indicam que o organismo pertence ao gênero Bacillus, uma bactéria em forma de bastonete, Gram positiva, com a capacidade de formar endósporos. Até o momento, esta corresponde à espécie bacteriana mais antiga.

Inseto retirada

de

onde

a

foi

bactéria

(provavelmente Bacillus), de 135 milhões de anos

Aspecto crescidas

em

das meio

colônias sólido

(Adaptado de Cano et al., (1995) Science, 268:1060-1064)

A questão da vida em marte Em 1997, foram publicados relatos de expedições da NASA a Marte, sugerindo a presença de possíveis microrganismos (“nanobactérias”) em espécimes minerais, sendo que achados semelhantes foram também detectados em partículas de meteoritos de Marte, que atingiram a Terra. A favor desta hipótese há o achado de microrganismos que decompõem minerais, frequentemente isolados das profundezas marinhas (A cerca de 1,5 km abaixo do solo). Os meteoritos apresentam carbono, fósforo, nitrogênio, além da presença de água. Já em relação às condições ambientais de Marte (muito frio), temos como contra-argumento o isolamento de Archaea a partir de ambientes

absolutamente

inóspitos,

inicialmente

comsiderados

como

inadequados à vida. De acordo com alguns pesquisadores, não é absurdo considerar que a vida surgiu em Marte, pois estudos com o meteorito Nakhla, que caiu em 1911 no Egito, com aparentemente de 1,3 bilhões de anos, revelam a presença de elementos cocóides, potenciais fósseis bacterianos, variando de 0,25 a 2,0 µm de tamanho, o que seria correspondente ao tamanho médio atual das bactérias. Curiosamente, estas formas ovais apresentam um teor maior de carbono no seu interior que nas áreas ao seu redor. Além disso, exibem também um elevado teor de óxido de ferro, um composto comum em células fossilizadas. Recentemente, a NASA enviou outra sonda para Marte e os dados recebidos reforçam cada vez mais a idéia da existência anterior de vida em Marte, devido aos achados da possível ocorrência de água naquele planeta.

Comparação entre possíveis "microrganismos" presentes em rochas de Marte e microrganismos que compõem a placa dental ho homem. (Adaptado de An Electronic Companion to Beginning Microbiology)

Assim, com base nestes novos achados e principalmente com estudos envolvendo as Archaea, a microbiologia vem levantando uma série de questões quanto à fisiologia e o metabolismo celular, além de questionar permanentemente

os

limites

das

condições

de

vida.

Ubiqüidade dos microrganismos Os

microrganismos

são

os

menores

seres

vivos

existentes,

encontrando-se em uma vasta diversidade de ambientes e desempenhando importantes

papéis

na

natureza.

Este

grupo

caracteriza-se

por

ser

completamente heterogêneo, tendo com única característica comum o pequeno tamanho dos organismos. Acredita-se que cerca de metade da biomassa do planeta seja constituída pelos microrganismos, sendo os 50% restantes distribuídos entre plantas (35%) e animais (15%). Em termos de habitat, os microrganismos são encontrados em quase todos os ambientes, tanto na superfície, como no mar e subsolo. Desta forma, podemos isolar microrganismos de fontes termais, com temperaturas atingindo até 130°C (clique aqui para ler o relato do isolamento de um procarioto cujo máximo de temperatura de crescimento foi definido como 130°C); de regiões polares, com temperaturas inferiores a -10°C; de

ambientes extremamente ácidos (pH=1) ou básicos (pH=13). Alguns sobrevivem

em

ambientes

extremamente

pobres

em

nutrientes,

assemelhando-se à água destilada. Há ainda aqueles encontrados no interior de rochas na Antártida. Em termos metabólicos, temos também os mais variados tipos, desde aqueles com vias metabólicas semelhantes a de eucariotos superiores, até outros que são capazes de produzir ácido sulfúrico, ou aqueles capazes de degradar compostos pouco usuais como cânfora, herbicidas, petróleo, etc. Uma vez que os microrganismos precederam o homem em bilhões de anos, pode-se dizer que nós evoluímos em seu mundo e eles em nosso. Desta forma, não é de se estranhar que a associação homem-microrganismo mostra-se com grande complexidade, com os microrganismos habitando nosso organismo, em locais tais como a pele, intestinos, cavidade oral, nariz, ouvidos e trato genitourinário. Embora a grande maioria destes microrganismos não causem qualquer dano, compondo a denominada “microbiota normal”, algumas vezes estes podem originar uma série de doenças, com maior ou menor gravidade. Nesta classe de organismos estão aqueles denominados patogênicos e potencialmente patogênicos. Sabe-se que em cerca de 1013 células de um ser humano podem ser encontradas, em média, cerca de 1014 células bacterianas. No homem, estas se encontram em várias superfícies, especialmente na cavidade oral e trato intestinal.

Principais funções dos microrganismos na natureza Além de seu importante papel como componentes da microbiota residente de animais e plantas, em nosso dia a dia convivemos com os mais diversos produtos microbiológicos “naturais” tais como: vinho, cerveja, queijo, picles, vinagre, antibióticos, pães, etc. Paralelamente, não pode ser deixada de lado a importância dos processos biotecnológicos, envolvendo

engenharia genética, que permitem a “criação” de novos microrganismos, com as mais diversas capacidades metabólicas. Os microrganismos desempenham também um importante papel nos processos geoquímicos, tais como o ciclo do carbono e do nitrogênio, sendo genericamente importantes nos processos de decomposição de substratos e sua reciclagem. Dentre os compostos utilizados como substrato temos, alguns de grande importância atualmente: DDT, outros pesticidas, cânfora, etc. O carbono encontra-se na atmosfera primariamente como CO2, sendo utilizado

pelos

organismos

fotossintetizantes,

para

sua

nutrição.

Virtualmente, a energia para o desenvolvimento da vida na Terra é derivada, em última análise, a partir da luz solar. Esta é captada pelas plantas e microrganismos fotossintetizantes (algas e bactérias), que convertem o CO2 em compostos orgânicos, através da reação: CO2 + H2O => (CH2O)n + O2 Os herbívoros alimentam-se de plantas e os carnívoros alimentam-se dos herbívoros. O CO2 atmosférico torna-se disponível para a utilização na fotossíntese origina-se de duas fontes biológicas principais: 1) 5 a 10% a partir de processos

de

respiração

e

2)

90

a

95%

oriundos

da

degradação

(decomposição ou mineralização) microbiana de compostos orgânicos. Em termos de ciclo global, há um balanço entre o consumo de CO2 na fotossíntese e sua produção através da mineralização e respiração. Este balanço, no entanto, vem sendo fortemente alterado por atividades humanas, tais como a queima de combustíveis fósseis, promovendo um aumento da qualntidade de CO2 atmosférico, resultando no conhecido “efeito estufa”.

A

celulose

existente

nas

plantas,

embora

seja

um

substrato

extremamente abundante na Terra, não é utilizável pela vasta maioria dos animais. Por outro lado, vários microrganismos, incluindo fungos, bactérias e protozoários

a

utilizam,

microrganismos,

muitos

como

fonte

encontram-se

de no

carbono trato

e

energia.

intestinal

de

Destes vários

herbívoros e nos cupins. Muitos compostos tóxicos podem ser degradados por microrganismos, dentre

eles,

policlorados,

DDT,

pesticidas.

Outra abordagem que tem se mostrado de grande valia para o homem refere-se à introdução de genes bacterianos em outros organismos (ditos transgênicos), tais como plantas. Assim, está em franco desenvolvimento a obtenção de plantas transgênicas resistentes a pesticidas ou ao ataque de insetos.

Microrganismos

como

agentes

de

doenças

Os microrganismos, eventualmente provocam doenças no homem, outros animais e plantas. Apesar dos enormes avanços em relação ao tratamento de doenças infecciosas, estas vêm se tornando novamente um tema preocupante, em virtude do crescente surgimento de linhagens bacterianas cada vez mais resistentes às drogas. Atualmente, a Organização Mundial da Saúde vem demonstrando crescente interesse nas doenças emergentes e reemergentes, de origem infecciosa. Abaixo apresentamos um quadro cronológico que deixa clara tais preocupações, em relação ao número de mortes provocadas por doenças infecciosas.

(Adaptado do livro Brock Biology of Microorganisms, 10 Ed., 2003)

Importância da Microbiologia É uma área da Biologia que tem grande importância seja como ciência básica

ou

aplicada.

Básica: estudos fisiológicos, bioquímicos e moleculares (modelo comparativo para

seres

superiores).

=>

Microbiologia

Molecular

Aplicada: processos industriais, controle de doenças, de pragas, produção de alimentos, etc. Áreas de estudo: Odontologia: Estudo de microrganismos associados à placa dental, cárie dental e doenças periodontais. Estudos com abordagem preventiva. Medicina

e

Enfermagem:

-

Doenças

-

Doenças

infecciosas

e

infecções

alimentos,

Controle

hospitalares. Nutrição:

transmitidas

por

de

qualidade de alimentos, Produção de alimentos (queijos, bebidas). Biologia:

-

Aspectos

básicos

e

biotecnológicos.

Produção

de

antibióticos, hormônios (insulina, GH), enzimas (lipases, celulases), insumos (ácidos, álcool), Despoluição (Herbicidas - Pseudomonas, Petróleo), Bio-filme (Acinetobacter), etc. BIOTECNOLOGIA

-

Uso

de

microrganismos

com

finalidades

industriais, como agentes de biodegradação, de limpeza ambiental, etc.

Um breve histórico da importância da microbiologia Efeitos Talvez

um

das dos

aspectos

doenças mais

negligenciados

nas quando

civilizações se

estuda

a

microbiologia refere-se às profundas mudanças que ocorreram no curso das

civilizações,

decorrentes

das

doenças

infecciosas.

De forma geral, as doenças provocavam um abatimento físico e moral da população e das tropas, muitas vezes influenciando no desenrolar e no resultado de um conflito. A própria mobilização de tropas, resultando em uma aglomeração, muitas vezes longa, de soldados, em ambientes onde as condições de higiene e de alimentação eram geralmente inadequadas, também colaborava na disseminação de doenças infecciosas, para as quais nnao exisitam recursos terapêuticos. Paralelamente, em áreas urbanas em franca expansão, os problemas mencionados acima eram também de grande importância, pois rapidamente as cidades cresciam, sendo que as instalações sanitárias geralmente eram completamente precárias. Com a prática do comércio entre as diferentes nações emergentes, passou a haver a disseminação dos organismos para outras populações, muitas

vezes

susceptíveis

a

aqueles

agentes

infecciosos.

Abaixo listaremos, brevemente, um pequeno histórico com alguns exemplos dos efeitos das doenças microbianas no desenvolvimento de diferentes civilizações. O declínio do Império Romano, com Justiniano (565 AC), foi acelerado por epidemias de peste bubônica e varíola. Muitos habitantes de Roma foram mortos, deixando a cidade com menos poder para suportar os ataques dos bárbaros,

que

terminaram

por

destruir

o

Império.

Durante a Idade Média varias novas epidemias se sucederam, sendo algumas amplamente disseminadas pelos diferentes continentes e outras mais localizadas. Dentre as principais moléstias pode-se citar: Tifo, varíola, sífilis, cólera e peste. Em 1346, a população da Europa, Norte da África e Oriente Médio era de cerca de 100 milhões de habitantes. Nesta época houve uma grande epidemia da peste, que disseminou-se através da “rota da seda” (a principal

rota mercante para a China), provocando um grande número de mortes na Ásia e posteriormente espalhando-se pela Europa, onde resultou em um total

de

cerca

de

25

milhões

de

pessoas,

em

poucos

anos.

Novas epidemias da peste ocorreram nos séculos XVI e XVII, sendo que no século XVIII (entre 1720 e 1722), uma última grande epidemia ocorreu na França, matando cerca de 60% da população de Marselha, de Toulon,. 44% em Arles, 30% em Aix e Avignon. A epidemia mais recente de peste originou-se na China, em 1892, disseminando-se

pela

Índia,

atingindo

Bombaim

em

1896,

sendo

responsável pela morte de cerca de 6 milhões de indivíduos, somente na Índia. Antes da II Guerra Mundial, o resultado das guerras era definido pelas armas, estratégias e “pestilência”, sendo esta última decisiva. Em 1566, Maximiliano II da Alemanha reuniu um exército de 80.000 homens para enfrentar o Sultão Soliman da Hungria. Devido a uma epidemia de tifo, o exército alemão foi profundamente dizimado, sendo necessária a dispersão dos sobrevivente, impedindo assim a expulsão das hordes de tribos orientais da Europa nesta época. Na guerra dos 30 anos (1618-1648), onde protestantes se revoltaram contra a opressão dos católicos, além do desgaste decorrente da longa duração do confronto, as doenças foram determinantes no resultado final. Na época de Napoleão, em 1812, seu exército foi quase que completamente dizimado por tifo, disenteria e pneumonia, durante campanha de retirada de Moscou. No ano seguinte, Napolãeo havia recrutado um exército de 500.000 jovens soldados, que foram reduzidos a 170.000, sendo cerca de 105.000 mortes decorrentes das batalhas e 220.000 decorrentes de doenças infecciosas. Em 1892, outra epidemia de peste bubônica, na China e Índia, foi responsável

pela

morte

de

6

milhões

de

pessoas.

Até a década de 30, este era quadro, quando Alexander Fleming, incidentalmente, descobriu um composto produzido por um fungo do gênero

Penicillium,

que

eliminava

bactérias

do

gênero

Staphylococcus,

um

organismo que pode produzir uma vasta gama de doenças no homem. este composto - denominado penicilina - teve um papel fundamental na desfecho da II Guerra Mundial, uma vez que passou a ser administrado às tropas aliadas, enquanto o exército alemão continuava a sofrer pesadas baixas no campo de batalha. Além destas epidemias, vale ressaltar a importância das diferentes epidemias de gripe que assolaram o mundo e que continuam a manifestarse de forma bastante intensa até hoje. Temos ainda o problema mundial envolvendo a AIDS, o retorno da tuberculose (17 milhões de casos no Brasil) e

do

aumento

antimicrobianos

progressivo que

vários

dos

níveis

grupos

de

de

resistência

bactérias

vêm

aos

agentes

apresentando

atualmente.

Morfologia e ultraestrutura bacterianas (Parte 1) Morfologia: Tamanho, forma e arranjos bacterianos As bactérias são extremamente variáveis quanto ao tamanho e formas que apresentam. Até recentemente acreditava-se que as menores bactérias apresentavam cerca de 0,3 µm (ex: Mycoplasma), entretanto, já existem relatos

de

células

menores,

denominadas

nanobactérias

ou

ultramicrobactérias, com tamanhos variando de 0,2 a 0,05 µm de diâmetro, sendo algumas inclusive já cultivadas em laboratório. Há ainda controvérsias quanto a este grupo, pois vários autores acreditam ser meros artefatos. Muitas bactérias medem de 2 a 6 µm de comprimento, por 1 a 2 µm de largura, mas certamente estes valores não podem ser definidos como absolutos, pois eventualmente encontramos bactérias de até 500 ou 800 µm,

como

no

caso

de

Epulopiscium

ou

Thiomargarita.

Em relação às formas, a maioria das bactérias estudadas seguem um padrão menos variável, embora existam vários tipos morfológicos distintos. De maneira geral, as bactérias podem ser agrupadas em três tipos morfológicos

gerais:

cocos,

bacilos

e

espiralados.

Os cocos correspondem a células arredondadas, podem se dividir sem um plano de orientação definido, o que leva a um grande número de arranjos diferentes.

Assim

pneumococos),

temos

tetracocos,

os

cocos

isolados,

sarcinas

(cubos

diplococos contendo

(Neisseria, 8

células),

estreptococos (cocos em cadeia) e estafilococos (cocos formando massas irregulares).

Microscopia óptica, corada pelo método de Gram, de cocos formando

cadeias,

um

arranjo

denominado estreptococos.

Microscopia eletrônica de varredura

das

células

apresentadas acima.

Microscopia óptica, corada pelo método de Gram, de cocos em

um

arranjo

denominado

estafilococos.

Microscopia varredura

eletrônica

das

apresentadas acima.

de

células

Os

bacilos

têm

forma

de

bastonetes,

podendo

apresentar

extremidades retas (Bacillus anthracis), arredondadas (Salmonella, E. coli), ou ainda afiladas (Fusobacterium). Como seu plano de divisão é fixo, ocorrendo sempre no menor eixo, os bacilos exibem uma menor variedade de arranjos, sendo via de regra encontrados isolados, como diplobacilos ou ainda como estreptobacilos. Há ainda um arranjo, denominado “em paliçada”, também denominado letras chinesas, que é típico do gênero Corynebacterium. Tal tipo de arranjo ocorre porque a parede celular desses organismos é dupla e no momento da divisão celular ocorre a ruptura de apenas uma das camadas, deixando as células unidas pela camada de parede que não se rompeu. Os bacilos podem ainda apresentar-se como pequenas

vírgulas

(Vibrio

cholerae)

ou

em

forma

de

meia

lua

(Selenomonas).

Microscopia

óptica,

corada

pelo método de Gram, de bacilos arranjados dois a dois (diplobacilos).

Microscopia transmissão,

de

eletrônica um

bacilo

de em

processo de divisão celular.

Espiralados: Sua nomenclatura é bastante controvertida ainda. Um tipo de classificação divide os espiralados em dois grupos, osespiroquetas, que apresentam

uma

forma

de

espiral

flexível,

possuindo

flagelos

periplasmáticos. O outro grupo são os espirilos, que exibem geralmente morfologia

de

espiral

incompleta

e

rígidos.

Geralmente os espiralados são microrganismos bastante afilados, de difícil observação por microscopia de campo claro, sendo muitas vezes analisados

por meio da microscopia de campo escuro, ou de técnicas de coloração empregando a impregnação por sais de prata.

Microscopia

óptica

de

fluorescência, de um organismo espiralado.

Microscopia

óptica,

utilizando um procedimento de impreganção com sais de prata, revelando a bactéria causadora da sífilis, Treponema pallidum (observe os grandes neutrófilos próximos às bactérias)

Micrografias eletrônicas colorizadas de diferentes bactérias. No sentido horário: Enterococcus (cocos ovalados), Francisella (bacilos pequenos, com a região central abaulada), Fusobacterium (longos bacilos, geralmente com extremidades mais afiladas) e Neisseria gonorrhoeae (diplococos em forma de rins). (Fotos obtidas de sites da internet)

Há

ainda

formas

intermediárias

como

os

cocobacilos;

formas

pleomórficas (quando o microrganismo não tem uma morfologia padrão), tal como Mycoplasma; ou ainda formas de involução, originadas quando o meio encontra-se desfavorável ao desenvolvimento. Nesses casos, como o organismo deixa de realizar os processos metabólicos (nutrição e divisão celular) Há

adequadamente,

também

bactérias

este

apresentando

sofre

alterações

apêndices,

tais

morfológicas. como

extensões

celulares na forma de longos tubos ou hastes (prostecas) (Rhodomicrobium vannielii). Além destas bactérias, estudos vêm revelando a ocorrência de bactérias com formas bastante peculiares, tais como células estreladas ou retangulares.

bactéria bactéria

com

com

morfologia

morfologia semelhante a uma estrela

retangular (Adaptado de Tortora et al., Microbiologia, 1998)

Bactéria pedunculada (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Ultraestrutra Bacteriana A ultraestrutura bacteriana começou a ser estudada em maiores detalhes nas décadas de 50 e 60, a partir do melhoramento das técnicas de microscopia eletrônica. Os procedimentos adotados incluíam a lise celular, seguida

de

centrifugação

para

promover

a

separação

dos

vários

componentes subcelulares, que podiam agora ser purificados e analisados bioquimicamente.

Parede Celular - Estrutura presente na maioria das bactérias conhecidas, exceto

em

micoplasmas

e

algumas

Archaea,

que

não

a

possuem.

Corresponde a uma das estruturas mais importantes nas células bacterianas, estando

localizada

na

porção

mais

externa,

acima

da

membrana

citoplasmática. Devido à sua grande rigidez, a parede celular é responsável pela manutenção da forma do microrganismo. Como o ambiente intracelular é bastante concentrado em relação ao meio externo, (variando de 2 a até 10 atm), a parede atua como uma barreira física rígida, que mantém a forma celular, impedindo que a célula estoure em decorrência do grande turgor. Além disso, a parede celular atua como uma barreira de proteção contra determinados agentes físicos e químicos externos, tais como o choque osmótico.

A

parede

pode

ainda

desempenhar

importante

papel

em

microrganismos patogênicos, em decorrência de presença de componentes que favorecem sua patogenicidade, tais como antígenos ou moléculas envolvidas no reconhecimento celular. Em 1884, Christian Gram desenvolveu um método de coloração de bactérias que permitia sua separação em dois grupos distintos, as Gram positivas (que coravam-se em roxo) e as Gram negativas (que coravam-se em vermelho). A partir do advento da microscopia eletrônica e do aperfeiçoamento

das

técnicas

de

análise

bioquímica

dos

diferentes

componentes celulares, foi verificado que esta diferença entre as bactérias Gram positivas e Gram negativas era, provavelmente, devida às diferenças de

composição

e

estrutura

das

paredes

celulares.

Assim, quando observadas sob microscopia eletrônica de transmissão, as bactérias Gram positivas apresentam uma parede celular espessa (de 20 a 80 nm), de aspecto homogêneo, enquanto as células Gram negativas exibem uma parede mais delgada (de 9 a 20 nm) e de aspecto bastante complexo,

aparentemente

apresentando

mais

de

uma

camada.

A

microscopia eletrônica de varredura revelou outras diferenças entre estes dois grupos de organismos. As Gram positivas exibiam a superfície mais lisa e homogênea, enquanto as Gram negativas apresentavam-se com maior complexidade superficial.

Aspecto das paredes celulares de organismos Gram positivos e negativos (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Composição da parede celular Peptideoglicano

(mureína

ou

mucopeptídeo):

Composto

exclusivamente encontrado no domínio Bacteria, sendo o responsável pela rigidez da parede celular. O peptideoglicano corresponde a um enorme polímero complexo que, em bactérias Gram positivas pode formar até 20 camadas, enquanto em células Gram negativas está presente, formando apenas uma ou duas camadas. O peptideoglicano corresponde a um esqueleto, formado por dois derivados

de

açúcares,

a

N-acetilglicosamina

(NAG)

e

o

ácido

N-

acetilmurâmico (NAM), unidos alternadamente, através de ligações do tipo ß-1,4.

O

grupo

carboxil

de

cada

molécula

de

NAM

liga-se

a

um

tetrapeptídeo, composto por aminoácidos que alternam-se nas configurações L e D. Destes aminoácidos, o D-glutamato, D-alanina e o ácido mesodiaminopimélico não são encontrados em qualquer outra proteína conhecida. Acredita-se que sua presença confira maior resistência da parede contra a maioria

das

peptidases.

Assim, em cada resíduo de NAM há um tetrapeptídeo associado. A enorme rigidez da da parede celular é resultante das ligações entre os tetrapeptídeos de cadeias adjacentes. Neste aspecto, há uma grande diferença entre as bactérias Gram positivas e negativas. Nas bactérias Gram negativas (AlaGlu-DAP-Ala), a ligação entre os tetrapepídeos é direta, ocorrendo entre o grupamento amino do DAP subterminal (posição 3) e o grupamento carboxi da D-Ala terminal (posição 4). Já nas Gram positivas (Ala-Glu-Lys-Ala), a ligação é indireta, sendo mediada por uma ponte interpeptídica de natureza variável (cinco glicinas em S. aureus). A análise das figuras abaixo deixa clara a grande estruturação do peptídeoglicano, em virtude das inúmeras ligações cruzadas existentes ao longo da molécula. Assim, devido a esta complexa estruturação física, o peptideoglicano confere rigidez à parede, embora exiba certo grau de elasticidade e também porosidade.

peptideoglicano

de

células

positivas

Gram

peptideoglicano

de

células

Gram

negativas

Nas bactérias Gram positivas, cerca de 90% da parede celular é composta pelo peptídeoglicano, que geralmente forma cerca de 20 camadas. O restante da parede é composto essencialmente por ácido teicóico. Nas bactérias Gram negativas, apenas cerca de 10% da parede corresponde ao peptideoglicano, existindo geralmente como uma camada única ou dupla. Os demais componentes da parede celular de bactérias Gram negativas serão analisados posteriormente.

Esquema ilustrando o espesso peptideoglicano de bactérias Gram positivas (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Ácidos Teicóicos: Juntamente com peptideoglicano, os ácidos teicóicos compõem a parede celular das bactérias Gram positivas. Estes compostos, presentes em grandes quantidades, correspondem a polímeros de glicerol ou ribitol ligados a açúcares ou aminoácidos e conectados entre si por meio de grupamentos Os

ácidos

fosfato.

teicóicos

associam-se

ao

peptideoglicano

pela

ligação

do

grupamento 6 hidroxil do ácido N-acetilmurâmico, podendo alternativamente associar-se aos lipídeos da membrana citoplasmática, quando passam a ser denominados de ácidos lipoteicóicos. Devido à sua carga negativa, os ácidos teicóicos contribuem com o caráter negativo da superfície celular de Gram positivas. Seu papel fisiológico é ainda desconhecido, mas especula-se que estes possam participar nos processos de passagem de íons pela parede, ou ligar-se

a

prótons,

mantendo

um

pH

celular

relativamente

baixo.

Em casos de escassez de fosfato, os ácidos teicóicos podem ser substituídos por ácidos teicurônicos, deixando assim os fosfatos livres para comporem ATP ou DNA, por exemplo.

Fórmula de um ácido teicóico, contendo ribitol (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

O componente adicional da Parede Celular de Gram negativos Membrana Externa: Esta, embora denominada "membrana"externa é um componente da parede celular, presente apenas nas bactérias Gram negativas. A membrana externa corresponde a uma segunda bicamada lipídica

(semelhante

à

membrana

plasmática),

localizada

acima

do

peptideoglicano, contendo fosfolipídeos, lipoproteínas, proteínas e também lipopolissacarídeos. Quando comparada à membrana citoplasmática, a membrana externa exibe maior permeabilidade a pequenas moléculas, tais como

glicose

ou

outros

monossacarídeos.

Sua face interna geralmente é rica em pequenas lipoproteínas (7,2 kDa), denominadas lipoproteínas de Braun, que ligam-se covalentemente ao peptideoglicano, ancorando firmemente a membrana externa à camada de peptideoglicano. Estudos indicam que a membrana externa e a membrana citoplasmática mantém contato em algumas discretas regiões celulares, denominadas sítios de adesão. Acredita-se que estas regiões de junção podem conferir maior

rigidez à parede celular das bactéria Gram negativas, além de fixar melhor a membrana

externa,

não

deixando-a

frouxa,

associada

somente

ao

peptideoglicano. Os sítio de adesão foram também denominados junções de Bayer e acredita-se que possam ser importantes locais de passagem de compostos citoplasmáticos, seja componentes envolvidos na síntese da membrana externa ou diferentes nutrientes.

Esquema da parede celular de organismos Gram negativos (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

A face externa da membrana externa é rica em lipopolissacarídeos (LPS), inexistentes na membrana citoplasmática. Estes componentes são também denominados de endotoxina, uma vez que provocam febre, choque e eventualmente morte, quando injetados em animais. O LPS é uma molécula

complexa,

composta

por

3

regiões

distintas:

lipídeo

A,

polissacarídeo central e cadeia polissacarídica lateral O, ou Antígeno O.

Esquema do lipopolissacarídeo, encontrado na face externa da membrana externa (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

O lipídeo A corresponde à porção mais interna da molécula, ancorando o LPS à porção hidrofóbica da membrana externa. Este componente corresponde à porção tóxica do LPS e geralmente é composto por ácido esteárico, palmítico, mirístico, láurico ou capróico. Estes ácidos graxos estão ligados a um dissacarídeo de NAcGlicosamina-P. A porção polissacarídica localiza-se acima do lipídeo A, em direção ao exterior, sendo composta por duas regiões, o polissacarídeo central e polissacarídeo O, que é mais externo, de natureza repetitiva. Em Salmonella, o cerne é composto por 10 açúcares pouco usuais. Conectado ao cerne, há o Ag O, que geralmente é composto por 3 a 5 açúcares bastante peculiares e variáveis. A natureza destes açúcares pode ser modificada pelos microrganismos, resultando em um mecanismo de evasão do sistema imune. O LPS também confere carga nagativa

à

superfície

celular.

O LPS se associa a proteínas, formando a face externa da unidade de membrana. A membrana externa apresenta um grupo especializado de proteínas, denominadas genericamente de porinas, que atuam como canais para a passagem de pequenas moléculas hidrofílicas, participando assim do processo de nutrição. As porinas podem ser específicas, contendo sítios de ligação para 1 ou mais substratos, ou inespecíficas, compondo canais aquosos. A maioria das porinas correspondem a proteínas transmembrânicas, com 3 subunidades idênticas, que formam orifícios de cerca de 1 nm, sendo que, aparentemente, possuem mecanismos para a abertura e fechamento. Para algumas

substâncias,

a

membrana

externa

é

mais

restritiva.

Compostos que afetam a Integridade da Parede Celular Ação da Lisozima na PC: Esta enzima, sintetizada por alguns organismos e por glândulas endócrinas do homem, age clivando as ligações do tipo β-1,4, presentes no peptideoglicano. Nas células Gram positivas, o tratamento com lisozima origina protoplastos (células sem parede celular), enquanto nas

Gram negativas, a lisozima origina esferoplastos (células com resquícios de parede

celular).

Ação da penicilina na PC: Este antibiótico impede a ligação dos tetrapeptídeos. A droga se liga irreversivelmente às PBPs, que são proteínas envolvidas no processo de biossíntese do peptideoglicano. Paralelamente, as autolisinas, que atuam em conjunto com a maquinaria de biossíntese, passam a degradar porções do peptideoglicano. Como a síntese está bloqueada, o resultado líquido é a formação de uma parede defeituosa.

A

Camada

S

Algumas bactérias e várias Archaea apresentam uma camada de natureza protéica ou glicoprotéica estruturada (como um piso de tacos), denominada camada S. Esta camada, as bactérias, encontra-se acima da parede celular e até o momento, suas funções não se encontram totalmente esclarecidas. Acredita-se que esta camada proteja a célula contra flutuações osmóticas, de pH e íons, além de auxiliar na manutenção da rigidez da parede. Alguns autores especulam que a camada S pode mediar a ligação dos orgnaismos a superfícies.

Microscopia eletrônica de uma célula contendo a camada S. (Adaptado de Prescott et al., 2002)

Morfologia e ultraestrutura bacterianas (Parte 2)

Cápsula, Glicocálix e camada limosa - A cápsula pode ser definida

como

uma

apresentando-se

camada

como

um

externa

material

à

parede

viscoso,

celular,

fortemente

geralmente associado

à

superfície celular, geralmente de natureza polissacarídica e raramente protéica. Por outro lado, o termo camada limosa é algumas vezes definido como uma uma zona difusa, contendo material pouco organizado, sendo facilmente

removida.

A presença da cápsula normalmente confere vantagens às bactérias, pois suas principais funções incluem: ligação às células do hospedeiro, fator de virulência por dificultar a fagocitose e também a proteção, seja aumentando a resistência ao dessecamento, uma vez que armazena grandes quantidades de água, fonte de nutrientes e proteção contra a infecção por bacteriófagos, ou

interação

com

anticorpos.

Em odontologia, a presença da cápsula pode ser considerada como um importante fator de virulência para o principal agente cariogênico - S. mutans, que sintetiza um cápsula composta por um homopolissacarídeo denominado glucano (produto da degradação da sacarose em glicose e frutose).

Tal

polímero

adere-se

firmemente

à

parede

celular

do

microrganismo e permite sua aderência ao esmalte, favorecendo sua colonização. Outros microrganismos apresentam cápsula de natureza heteropolimérica S.

pneumoniae.

Eventualmente,

a

cápsula

pode

ser

de

polipeptídica, como em B. anthracis (ácido glutâmico, na forma D).

natureza

Micrografia

Micrografia óptica, empregando a tácnica revelando

de

coloração células

negativa, transmissão, capsuladas. cápsula

(Adaptado de Tortora et al., Microbiologia, 1998)

eletrônica

revelando circudando

de

a

delgada

a

célula

(Adaptado de "An eletctronic companion to microbiology")

Fímbrias e Pili - Muitas bactérias Gram negativas apresentam apêndices finos (3 a 10 nm), retos e curtos, denominados fímbrias. Geralmente estas são bastante numerosas, podendo atingir números de 1000 ou mais por célula. Como são muito pequenas e delgadas, somente podem ser visualizadas pela microscopia eletrônica. As fímbrias s ão de natureza protéica, compostas por subunidades repetitivas de uma proteína denominada genericamente de pilina. As fímbrias possuem, geralmente em sua extremidade, e algumas vezes ao longo da estrutura, proteínas distintas, denominadas adesinas, as quais mediam a adesão específica da célula bacteriana a diferentes substratos.

Micrografia varredura

de

eletrônica bacilos

de

apresentando

fímbrias

Esquema ilustrando a organização estrutural de uma fímbria, assinalando a presença de moléculas do tipo adesina, situadas na extremidade da estrutura

(Adaptado de An Electronic Companion to Microbiology)

Muitas

bactérias

podem

ainda

apresentar

outro

tipo

de

apêndice,

denominado pilus F ou fímbria sexual, o qual exibe semlhanças estruturais com as fímbrias. No entanto, este tipo de fímbra é normalmente encontrado em um menor número nas células, variando de 1 a 10. O pilus F corresponde a uma estrutura bastante longa e menos rígida que as fímbrias convencionais, estando envolvido no reconhecimento de outras bactérias, em um processo de transferência de genes denominado conjugação.

Micrografia

eletrônica

colorizada,

revelando

a

longa

fímbria

sexual

(pilus

F).

Observar também a presença de fímbrias.

Atualmente,

diferentes

tipos

diferentes

de

fímbrias vêm

sendo

descritos, sendo vários destes associados à adesão, ou à virulência. Bactérias Gram positivas podem, muitas vezes, apresentar estruturas fibrilares (diferentes de fímbrias) em sua superfície, provavelmente também

envolvidas

nos

processos

de

adesão

a

substratos.

Flagelos - Estruturas longas, delgadas e relativamente rígidas, apresentando cerca de 20 nm de espessura e 15 a 20 µm de comprimento, responsáveis

pela

locomoção

das

bactérias.

Devido

à

sua

pequena

espessura, os flagelos somente podem ser visualizados por meio de colorações específicas, microscopia de campo escuro, ou por icroscopia eletrônica. De acordo com o número e distribuição dos flagelos, as bactérias podem ser classificadas como: atríquias (sem flagelos), monotríquias (um único flagelo), anfitríquias (um flagelo em cada extremidade) , lofotríquias (um tufo de flagelos em uma, ou ambas as extremidades) e peritríquias (apresentando flagelos ao longo de todo o corpo bacteriano).

Bactéria (Adaptado

monotríquia Bactéria de

Atlas,

1997

-

Principles

anfitríquia

of (Adaptado de Tortora et al., 1998 - Microbiology)

Microbiology)

Bactéria (Adaptado

lofotríquia de

Microbiology)

Tortora

et

al.,

1998

-

Bactéria (Adaptado

lofotríquia de

Microbiology)

Atlas,

1997

-

Principles

of

Bactéria (Adaptado

peritríquia Bactéria de

Tortora

et

al.,

1998

peritríquia

- (Adaptado de Tortora et al., 1998 - Microbiology)

Microbiology)

Estrutura - Estruturalmente, o flagelo pode ser subdivido em 3 regiões: filamento, corpo basal e gancho, sendo estas duas últimas importantes para a inserção e movimentão do filamento. O filamento dos flagelos apresenta estrutura helicoidal, com comprimento de onda constante para cada espécie. Este corresponde a um cilindro longo e oco, composto por unidades repetitivas de uma proteína denominada genericamente de flagelina, que pode variar de 30 a 60 kDa, dependendo do microrganismo. Sua extremidade distal é revestida por uma proteína seladora. Algumas bactérias apresentam bainhas de diferentes naturezas revestindo o filamento, tal como em Vibrio cholerae, ou Bdellovibrio. O gancho apresenta maior espessura que o filamento, sendo composto por diferentes subunidades protéicas. O corpo basal corresponde à porção mais complexa do flagelo, apresentando 4 anéis ligados a um bastão central em bactérias Gram negativas, enquanto em Gram positivas são observados apenas 2 anéis. Os anéis externos L e P associam-se ao LPS e peptidioglicano, respectivamente, enquanto os anéis S e M estão associados à membrana citoplasmática.

Esquema

da

estrutura

dos

flagelos

bacterianos,

em

células

Gram

negativas

(à

esquerda)

e

Gram

positivas

(à

direita)

Gram

negativas

(Adaptado de Prescott et al., Microbiology, 2000)

Detalhe

ampliado

da

estrutura

de

um

flagelo

de

células

(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Síntese flagelar - Muitos genes estão envolvidos na síntese do flagelo e na mobilidade celular. Em E. coli e Salmonella foram identificados mais de 40 genes

(fla),

que

codificam

proteínas

estruturais,

de

exportação

de

componentes para o exterior e de regulação de muitos eventos bioquímicos envolvidos na síntese de novos flagelos. A síntese de flagelos é fortemente regulada, tanto por fatores metabólicos como por sinais emitidos durante a divisão

celular.

Acredita-se

que

as

subunidades

de

flagelina

sejam

transportadas ao longo do filamento e se autoarranjam espontaneamente, quando

atingem

a

ponta.

Movimentação - A movimentação dos flagelos ocorre através de um mecanismo de rotação do filamento, em velocidades que podem atingir até 270 ou 1100 rps, o que permite uma locomoção de até 100 µm/segundo, correspondendo a 100 vezes o seu comprimento/minuto. Os flagelos atuariam de maneira análoga a propulsores de um barco, sendo o sentido da rotação importante para o tipo de movimentação resultante. Em muitas células

monotríquias,

a

rotação

no

sentido

anti-horário

promove

a

movimentação para frente, enquanto a rotação no sentido horário faz com que

a

célula

se

locomova

no

sentido

oposto.

Em outras monotríquias, quando o flagelo gira no sentido horário promove a locomoção.

Tipos

de

movimentação

de

células

monotríquias

(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

No caso de bactérias peritríquias, quando os flagelos giram no sentido antihorário as células se movem para frente. Estes dobram seus ganchos e seus filamentos se agrupam, formando um feixe, que gira e propele a célula. Quando a rotação ocorre no sentido horário, os flagelos se separam e a bactéria passa a vibrar somente, até que os flagelos voltem a girar no sentido

anti-horário,

impulsionando

novamente

a

célula

para

frente.

Para que haja a movimentação, o bastão localizado entre o gancho e o anel M tem a capacidade de rodar livremente na membrana citoplasmática. Acredita-se que o anel S esteja fixo na parede celular, sem a possibilidade de rodar. Os anéis P e L sustentariam o bastão. Há evidências que o corpo basal atuaria como uma estrutura passiva que giraria no interior de um complexo proteíco inserido na membrana, semelhante a um rotor de um motor elétrico, que gira no centro de um anel de eletromagnetos (estator). A energia necessária para a rotação é provida pela força próton motiva. A dissipação do gradiente de prótons cria uma força que gira o flagelo no sentido anti-horário, impelindo o microrganismo. O rotor seria composto pelo bastão central, pelo anel M e por um anel C, ligado ao M através da membrana citoplasmática. Estes anéis são formados por várias proteínas, sendo a FliG bastante importante. No estator, temos as proteínas MotA e

MotB, que formam um canal de prótons, sendo que MotB também ancora o complexo ao peptideoglicano.

Esquema

ilustrando

a

movimentação

de

bactérias

peritríquias

(Adaptado de Tortora et al., 1998 - Microbiology)

Flagelos periplasmáticos - Estes flagelos são encontrados apenas nos espiroquetas (sendo muitas vezes denominados de filamentos axiais). Como o prórpio nome indica, estes flagelos situam-se no periplasma, localizandose

abaixo

da

membrana

externa

destas

bactérias.

Os

flagelos

periplasmáticos originam-se a partir dos polos celulares, voltando-se em direção ao centro da célula, envolvendo a membrana citoplasmática do corpo bacteriano.

Micrografia Micrografia eletrônica flagelos

colorizada,

revelando

periplasmáticos

os

(amarelo)

(Adaptado de Tortora et al., 1998 Microbiology)

eletrônica

revelando

o

flagelo

periplasmático, situado abaixo da membrana externa (Adaptado de An Electronic Companion to Microbiology)

Movimentação

por

meio

de

deslizamento

Muitos procariotos são móveis, apesar de não possuírem flagelos. Estas bactérias são capazes de se movimentar sobre superfícies sólidas, por um processo denominado deslizamento. A motilidade por deslizamento é apresentada por vários membros de Bacteria, sendo, no entanto, estudada somente

em

alguns

poucos

grupos.

O

movimento

deslizante

é

consideravelmente mais lento – 10 µm/seg para algumas bactérias, quando comparado às velocidades atingidas pelo movimento flagelar mas, da mesma forma, permite a locomoção das bactérias em seus habitats. Mecanismos

da

Motilidade

Por

Deslizamento

Embora até o momento nenhum mecanismo de deslizamento tenha sido comprovado, existem alguns modelos definindo o processo, além de evidências sugerindo a existência de mais de um tipo de mecanismo. Em cianobactérias,

à

medida

que

as

células

deslizam,

secretam

um

polissacarídeo limoso em sua superfície externa. Aparentemente, este polissacarídeo estabelece o contato entre a superfície celular e a superfície sólida, contra a qual a célula desliza. À medida que o polissacarídeo limoso excretado se adere à superfície, a célula é gradativamente puxada. Esta hipótese é sustentada pela observação de poros excretores de compostos limosos na superfície de várias cianobactérias filamentosas. Em Flavobacterium johnsoniae, provavelmente o mecanismo

de

deslizamento envolve a movimentação de proteínas na superfície celular. De acordo com este modelo, proteínas específicas de motilidade, ancoradas nas membranas citoplasmática e externa, parecem propelir a célula para frente por um mecanismo de cremalheira contínua. Ao que parece, o movimento das proteínas da membrana citoplasmática é promovido pela liberação de energia oriunda da força próton motiva que, de alguma maneira, transmite esta energia às proteínas da membrana externa, localizadas ao longo de uma “pista de corrida” na superfície celular. Acredita-se que o movimento

das proteínas da pista de corrida contra uma superfície sólida, literalmente empurre a célula para frente. Assim como as outras formas de motilidade, o deslizamento apresenta grande relevância ecológica. Este movimento permite que a célula explore novos recursos, ou interaja com outras células, de maneira benéfica.

Esquema proposto para a movimentação deslizante de Flavobacterium (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Morfologia e ultraestrutura bacterianas (Parte 3) Periplasma (gel periplasmático) - Corresponde a um espaço situado entre a membrana externa e membrana citoplasmática, encontrado em células Gram negativas. Embora questionáveis, relatos esporádicos descrevem a existência de um espaço observado entre o peptideoglicano e a membrana citoplasmática de organismos Gram positivos. O periplasma apresenta consistência de gel, provavelmente devido ao grande número de proteínas presentes nesta região. Em virtude disto, este "espaço" passou a ser denominado gel

periplasmático. O periplasma pode atingir de 1 a cerca de 70 nm de espessura, correspondendo a até 40% do volume total da célula. Em Gram negativas, tem grande importância, pois várias enzimas e outras proteínas estão localizadas, incluindo hidrolases, proteínas de ligação envolvidas no transporte e quimiorreceptores. Bactérias quimiolitotróficas e denitrifcantes apresentam muitas vezes proteínas transportadoras de elétrons no periplasma, outras apresentam enzimas envolvidas na síntese de peptideoglicano. A presença do periplasma bactérias Gram positivas é ainda motivo de controvérsias, devido ao enorme potencial secretor que este grupo apresenta. Membrana Citoplasmática - Estrutura delgada, com cerca de 8 nm, composta por uma bicamada fosfolipídica (podendo apresentar 7 tipos de fosfolipídeos diferentes), entremeada de proteínas (cerca de 200 tipos distintos), atuando como importante barreira osmótica, altamente seletiva. Normalmente, as membranas de organismos procariotos apresentam maiores concentrações de proteínas que as membranas eucarióticas, tendo em vista a ausência de organelas citoplasmáticas nas bactérias. A bicamada fosfolipídica é composta por glicerol ligado a duas cadeias de ácidos graxos, através de ligações do tipo éster, com proteínas entremeadas. Tanto as proteínas como os fosfolipídeos podem mover-se lateralmente ao longo da membrana. Esta é estabilizada principalmente por interações hidrofóbicas e por pontes de H. Paralelamente, os íons Ca+2 e Mg+2 também participam, interagindo ionicamente com as cargas

negativas

dos

fosfolipídeos.

Via de regra, os fosfolipídeos bacterianos contém ácidos graxos com cadeias não ramificadas de 16 a 18 átomos de carbono. Esta composição pode ser variável, de acordo com as condições ambientais. Assim, quando cultivadas em temperaturas baixas, há um aumento da proporção de ácidos graxos insaturados, aumentando consequentemente a fluidez da membrana. Por outro lado, aumetando o grau de saturação, as cadeias tornam-se mais rígidas, pois as moléculas têm maior capacidade de associação.

Esquema

da

membrana

citoplasmática

bacteriana

(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003) Via de regra, exceto no caso dos micoplasma (bactérias desprovidas de parede celular), micoplasmas, as membranas procarióticas não apresentam esteróis, como observado em eucariotos. Entretanto, muitas bactérias apresentam moléculas pentacíclicas, semelhantes a esteróis, denominadas hopanóides, talvez conferindo maior rigidez à membrana. A presença de esteróis na membrana citplasmática de micoplasmas pode ser justificada pela ausência da parece celular, neste grupo de organismos.

Similaridade estrutural entre os esteróis (a), colesterol (b) e hopanóides (c) (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Mesossomos - correpondem a extensas invaginações da membrana citoplasmática, em forma de vesículas, lamelas ou túbulos. Geralmente são encontrados com maior abundância em Gram positivos, mas também presentes em Gram negativos. Até hoje, sua existência e funções são ainda debatidas pelos pesquisadores. Diversas funções têm sido atribuídas aos mesossomos, tais como a participação na segregação dos cromossomos durante a divisão, papel respiratório, papel na esporulação, ou até mesmo como sendo um mero artefato decorrente dos procedimentos utilizados para a preparação microscópica dos espécimes. A partir do acahado de extensos mesossomos em bactérias de grandes dimensões, acredita-se que sua principal função seja de aumentar a superfície da membrana, aumentando assim o conteúdo enzimático das células. Matriz Citoplasmática - É composta por cerca de 70% de água, além dos demais compostos celulares, tais como o DNA, inclusões e plasmídeos. Caracteristicamente, o

citoplasma celular apresenta um grande concentração de ribossomos e proteínas, tais como proteínas atuando como um sistema de citoesqueleto. Nucleóide e plasmídeos- Os procariotos são organismoshaplóides, geralmente apresentando apenas 1 único cromossomo não envolto por carioteca. Eventualmente, algumas bactérias podem apresentar 2 ou 3 cromossomos. O cromossomo bacteriano é normalmente cirucular e encontra-se bastante enovelado, em uma região celular denominada nucleóide. Em bactérias, o cromossomo não apresenta-se associado a histonas, sendo estabilizado por outras proteínas de natureza básica. Geralmente o DNA cromossomal corresponde a uma molécula bastante grande, podendo ser 1000 vezes maior que a própria célula. Em E. coli, o DNA possui cerca de 4,7 Mb, exibindo aproximadamente 1 mm de comprimento, quando linearizado.

(Adaptado

de

An

Electronic

Companion

to

Microbiology)

Várias

bactérias

apresentam

também

moléculas

de

DNA

extracromossomal,

denominadas plasmídeos, as quais são geralmente circulares, contendo muitas vezes genes que conferem características adaptativas vantajosas ao microrganismo. Seu número e dimensões são bastante variáveis. Corpúsculos de inclusão - São grânulos de armazenagem, de diferentes naturezas, sendo geralmente utilizados como fonte de material de reserva ou energia, muitas vezes insolúveis. Estes podem apresentar-se sem qualquer envoltório ou envoltos por uma única camada lipídica delgada (diferente de uma membrana), ou por proteínas. Dentre os compostos orgânicos armazenados temos o glicogênio, o amido e poliidroxibutirato. Já dentre os inorgânicos temos polifosfatos (volutina ou metacromáticos) e enxofre.

Grânulos de poliidroxibutirato (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Os magnetossomos são partículas intracelulares de magnetita (Fe3O4), que originam um dipolo magnético na célula, que pode responder aos campos geomagnéticos. Estes foram descritos em algumas bactérias aquáticas e algas. Outras bactérias aquáticas apresentam vesículas de gás, que conferem mobilidade nas diferentes camadas de água. São estruturas em forma de fuso, ocas, compostas por proteínas, tendo tamanhos variáveis (30 - 300 nm de diâmetro e até 1000 nm de comprimento). Consistem de um orifício oco envolto por uma membrana (armação) protéica extremamente delgada (2 nm). Nesta membrana encontram-se por 2 tipos de proteínas que originam uma estrutura rígida, impermeável à agua e permeável a gases. A proteína predominante tem cerca de 7.5 kDa, contendo Å 50% de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos (Ala, Val, Leu, Ile), provavelmente voltados para o interior da partícula, evitando a entrada de água.

Células apresentando magnetossomos em seu interior (corpúsculos negros enfileirados) (Adaptado de Prescott et al., Microbiology, 2000)

Preparação de magnetossomos (Adaptado de Prescott et al., Microbiology, 2000)

Esquema de uma vesícula de ar, indicando como as proteínas que a formam se associam Bactérias se movendo em direção a um campo magnético

(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

(Adaptado de Prescott et al., Microbiology, 2000)

Domínio Archaea Considerações Gerais Por volta da década de 70, vários organismos procarióticos foram isolados a partir de uma série de ambientes considerados extremamente inóspitos, quase que incompatíveis com a presença de seres vivos. Estes ambientes naturais caracterizavam-se por apresentar temperaturas bastante elevadas (próximas a 100ºC), extrema acidez (pH próximo a 2), altas salinidades (cerca de 10 a 15%) e, muitas vezes, ausência completa de oxigênio. Como várias destas características correspondiam às possíveis condições encontradas na Terra primitiva, os pesquisadores acreditavam que os organismos procarióticos presentes nestes ambientes deveriam corresponder a células primitivas, talvez "fósseis vivos", representando as formas de vida ancestrais das bactérias modernas. Por esta razão, estes organismos foram denominados "arqueobactérias". No entanto, a partir dos trabalhos de Carl Woese e colaboradores (há cerca de 25 anos), realizando estudos comparativos de sequências de DNA que codificavam rRNA (16S e 23S) de diferentes organismos, foram definidos 3 grandes domínios compreendendo todos os seres vivos. Assim, de acordo com a proposta de Woese, os seres vivos poderiam ser agrupados em três grandes domínios: Bacteria (anteriormente denominadas eubactérias), Archaea (as "arqueobactérias") e Eucarya (Eucariotos). Estes três domínios teriam derivado de um hipotético ancestral comum de todas as células. A análise da árvore filogenética apresentada abaixo, revela como a denominação "arqueobactérias" é inadequada e quão obsoleta é a idéia de que as "arqueobactérias" seriam

os ancestrais das bactérias atuais, pois estes organismos não correspondem aos ancestrais da bactérias atualmente conhecidas.

Árvore filogenética universal, apresentando os três domínios da vida (Adaptado de Madigan et al., 2003 - Brock Biology of Microorganisms)

Esta árvore revela claramente que as "arqueobactérias" não correspondem aos ancestrais das bactérias atuais, visto que sua possível origem ocorre quase que concomitantemente à origem das bactérias mais primitivas. Outro aspecto que a árvore permite deduzir é o fato das "arqueobactérias" ocuparem uma posição intermediária entre os domínios Bacteria e Eucarya, sugerindo que estas correspondem a um grupo de organismos diferentes de bactérias e de células eucarióticas. De fato, estudos genéticos e fisiológicos posteriormente revelaram que tais organismos apresentam características de bactérias, de eucariotos, além de características exclusivas, não encontradas em qualquer outro domínio. Por esta razão, deixaram de ser denominadas "arqueobactérias", recebendo a denominação archaea. Uma questão ainda não elucidada refere-se ao porquê de encontrar-se um grande variedade de archaea extremófilas, habitanto ambientes de altas temperaturas, salinidade, ou extremos de pH. Por outro lado, o acúmulo de conhecimentos sobre este grupo vem mostrando que as archaea podem ser encontradas nos mais diversos ecossistemas, desde ambientes aquáticos frios, sistema digestório do homem e outros animais, em tecidos vegetais. Certamente não é absurdo cogitar que no futuro sejam descobertas archaea patogênicas ao homem ou outros seres vivos.

As características apresentadas por alguns dos membros deste domínio parecem refletir as condições primitivas da Terra, quando tal domínio começou a evoluir como um ramo filogenéticio distinto. Ao que parece, várias archaea conservaram mais do que as eubactérias estas características fisiológicas primitivas, o que seria responsável pela distribuição atual no planeta. Assim, as archaea compreendem um grupo heterogêneo de microrganismos que podem ser caracterizados, em sua maioria, como habitantes de ambientes inóspitos, geralmente crescendo em condições consideradas até então como extremas e limítrofes para a vida. Classificação das Archaea Atualmente, considera-se que este domínio apresente três filos: Crenarchaeota, Euryarchaeota e Korarchaeota.

Árvore filogenética do domínio Archaea (Adaptado de Madigan et al., 2003 - Brock Biology of Microorganisms)

O filo Crenarchaeota, separa-se muito próximo da raiz da árvore universal, sendo composto por organismos hipertermófilos (Thermoproteus, Pyrolobus e Pyrodictium), compreendendo os organismos capazes de crescer nas maiores temperaturas conhecidas. Estes hipertermófilos são, em sua maioria, quimiolitotróficos autotróficos, sendo então classificados como produtores primários. Neste grupo há também organismos isolados (mas ainda não cultivados em laboratório) de ambientes frios, tais como águas oceânicas.

Lagoa

quente,

rica

em

enxofre, que é convertido a ácido sulfúrico, por espécies de archaea.

Sulfolobus, exemplo de uma archaea do filo Crenarchaeota, habitante da lagoa ilustrada acima.

(Adaptado de Madigan et al., 2003 - Brock Biology of Microorganisms)

O filo Euryarchaeota é um grupo fisiologicamente diverso, sendo composto por dois grupos: 1) as archaea metanogênicas, que são anaeróbias, (Methanococcus, Methanobacterium e Methanosarcina), encontradas em ambientes de condições extremas, e 2) as halofílicas extremas, que são aeróbias (Halobacterium, Halococcus). As metanogênicas compreendem os organismos mais anaeróbios conhecidos, ou seja, o oxigênio mesmo em concentrações baixíssimas, exerce um efeito extremamente letal sobre estes organismos. Neste filo há ainda o gênero Thermoplasma, composto por bactérias acidófilas, termofílicas, que não apresentam parede celular. As halofílicas geralmente coram-se como Gram negativas, não apresentam esporos e, em sua maioria, são imóveis, geralmente apresentando grandes plasmídeos, contendo cerca de 25 a 30% do DNA da célula. Dentre as metanogênicas, encontra-se o gênero Methanopyrus, que cresce em temperaturas de até 110°C.

Lago hipersalino no Egito, rico em carbonato de sódio. O pH destas águas encontra-se na faixa de 10,

sendo

halófilas

habitado extremas,

por tais

archaea como

Halobacterium salinarum. A coloração vermelha é decorrente da presença de pigmentos carotenóides, presentes nestes organismos.

Pilha de refugo da mineração de Thermoplasma, uma archaea desprovida de parede celular. carvão, que muitas vezes sofre autocombustão.

Hábitat

da

archaea

Thermoplasma. (Adaptado de Madigan et al., 2003 - Brock Biology of Microorganisms)

O filo Korarchaeota é composto quase que somente por isolados identificados apenas a partir do sequenciamento de 16S rRNA, sendo considerado um grupo de hipertermófilos. Até o momento, poucos espécimes de Korarchaeota foram cultivados em laboratório. Pesquisas realizadas em uma fenda termal localizada no fundo do mar da Islândia, em 2002, levaram à identificação de uma nova espécie de archaea apresentando características bastante distintas, quando comparada aos demais membros desse domínio. A espécie Nanoarchaeum equitans diferencia-se das demais archaea por ser aparentemente muito primitiva (ou modificada), sendo encontrada em associação com outra archaea (Igniococcus sp.). Este organismo de morfologia arredondada é bastante diminuto, apresentando cerca de 400 nm de diâmetro e um pequeno genoma, de 0,5 Megabases. De acordo com seus descobridores, as grandes diferenças apresentadas por Nanorachaeum em relação à seqüência de RNA ribossomal, sugerem que tal organismo seja classificado em um novo filo, proposto como Nanoarchaeota.

Micrografia de fluorescência, empregando um corante específico para DNA, revelando as células de Igniococcus

(maiores)

e

de

Nanoarchaeum equitans (menores). No

quadro

eletrônica

à

direita,

evidenciando

micrografia a

estreita

associação das duas archaea. Boucher

&

Doolittle

(2002)

Nature,

417:27-28

(clique no autor, caso deseje ver o artigo original)

Micrografia

de

fluorescência

empregando corantes específicos para os rRNAs de

Igniococcus

(verde)

e

Nanoarchaeum

(vermelho)

Huber

et

al.

(2002)

Nature,

417:63-67.

(clique no autor, caso deseje ver o artigo original)

Estrutura

celular

das

Archaea

Quanto à morfologia, podem ser esféricas, bacilares, espiraladas, achatadas, quadradas, discóides e muitas vezes de morfologia irregular ou pleomórficas. Suas dimensões são extremamente variáveis, de 0,1 a 15 µm, com alguns filamentosos atingindo 200 µm. As

archaea

apresentam

várias

características

especiais,

que

permitem

seu

desenvolvimento em uma vasta gama de ambientes. Estas incluem alterações de composição de membrana, composição variada de paredes celulares, presença de proteínas tipo histonas, íntrons, mecanismos de splicing, entre outros. Parede celular: Apresenta composição e estruturação extremamente variáveis neste grupo de microrganismos. Esta variabilidade sugere que o ancestral comum seria desprovido de parede, sendo as diversas paredes resultantes de evolução independente, de acordo com os diferentes ambientes e grupos de archaea.

Diferentes composições de parede celular presentes em archaea. (Adaptado de Atlas, R.M. (1997) - Principles of microbiology)

Quando coradas pelo método de Gram, algumas archaea comportam-se como Gram positivas e outras como Gram negativas, embora suas paredes sejam completamente distintas daquelas de eubactérias. Como observado na figura acima, suas paredes celulares apresentam uma grande diversidade quanto à composição química e, diferentemente das eubactérias, não apresentam peptideoglicano. Além disso, existem também outras archaea que não exibem parede celular (Thermoplasma). O gênero Thermoplasma cresce bem em temperaturas de 55°C e pH 2, em meios complexos. Estes organismos apresentam a membrana citoplasmática bastante diferente, contendo compostos semelhantes a lipopolissacarídeos, contendo ligações tetraéter. Um outro gênero, filogeneticamente relacionado a Thermoplasma, é Picrophilus, que cresce em pHs de 0,06 a 0,7. Várias archaea exibem uma parede espessa, rígida, semelhante à parede Gram positiva (Methanobacterium, Methanopyrus, Halococcus), entretanto, os polímeros que compõem a estrutura podem ser: pseudopeptideoglicano ou metanocondroitina. O pseudopeptideoglicano diferencia-se do peptideoglicano pela ocorrência de ácido talosaminurônico em substituição ao murâmico, pela ligação do tipo b-1,3 ao invés de b-1,4 entre os açúcares e pela ausência de D-aminoácidos nas porções peptídicas da molécula. Nestas bactérias, a lisozima não exibe qualquer atividade de degradação da parede, uma vez que seu sítio de ação são as ligações b-1,4. Da mesma forma, a penicilina é ineficaz contra estes organismos porque o mecanismo de síntese de parede é distinto nas archaea.

A metanocondroitina é um polímero de 4 açúcares (galactosamina, ácido glucorônico, N-acetil-galactosamina e glicose), muito semelhante ao tecido conectivo animal, composto por sulfato de condroitina. Aquelas archaea que coram-se como Gram negativas podem ter paredes compostas por proteínas, polissacarídeos ou glicoproteínas. As paredes protéicas podem variar entre si, podendo ser do tipo monocamada de natureza cristalina, ou policamadas, de proteínas tubulares. As glicoproteínas são também comuns, muitas vezes contendo grandes quantidades de aminoácidos carregados negativamente. As halobactérias são um exemplo do modelo descrito acima, onde as cargas negativas da parede interagem com os íons Na+ do ambiente, estabilizando a parede. O

gênero

Halococcus

apresenta

a

parede

celular

composta

por

um

heteropolissacarídeo altamente sulfatado, nunca observado em qualquer outro ser vivo. Eventualmente, algumas archaea exibem uma camada protéica adicional ao redor da parede celular, ou compondo a própria parede, denominada “camada S”, em um estado cristalizado.

Membrana Citoplasmática: corresponde a uma estrutura única, apresentando composição química e arranjo totalmente diferentes das membranas citoplasmáticas de quase todas as bactérias e de todos eucariotos. Membrana

Bacteria

Archaea

Eucarya

Conteúdo protéico

alto

alto

baixo

Sulfolipídeos, glicolipídeos, Composição lipídica

fosfolipídeos

Fosfolipídeos

hidrocarbonetos ramificados, isoprenoides, fosfolipídeos

Estrutura dos lipídeos Ligação dos lipídeos

cadeia linear

cadeia ramificada

cadeia linear

éster

éter (di e tetraeter)

éster

As membranas de archaea geralmente apresentam um alto conteúdo protéico e vários lipídeos: glicolipídeos, sulfolipídeos, fosfolipídeos (raros) e lipídeos apolares do tipo isopreno. A presença de hidrocarbonetos ramificados aumenta a fluidez da membrana, uma vez que dificultam a formação de estruturas cristalinas. Dentre os principais lipídeos estão aqueles do tipo

glicerol-éter-isopreno

(hidrocarbonetos

de

20,

25

ou

40

Carbonos).

Uma característica da porção lipídica da membrana é o fato desta não ser composta por ácidos graxos convencionais. Em seu lugar encontram-se longas cadeias de hidrocarboneto ramificadas. Os hidrocarbonetos ligam-se ao glicerol por ligações do tipo éter (ao invés de éster) e podem apresentar-se como bicamadas (como em todas as membranas) ou como monocamadas. Quando formam bicamadas, denominam-se glicerol diéter e quando originam monocamadas,

diglicerol

tetraéter.

Quando há a monocamada, esta modula sua fluidez através da ciclização de alguns elementos da

cadeia

de

hidrocarboneto,

formando

anéis

pentacíclicos.

As proteínas de membrana podem ser também bastante diferentes daquelas observadas em outros tipos celulares.

Estrutura e composição da membrana presente em várias archaea. (Adaptado de Madigan et al., 2003 - Brock Biology of Microorganisms)

Cromossomo: É bastante semelhante ao cromossomo das eubactérias, uma vez que é único e, na maioria dos casos, circular. Por outro lado, sua organização é semelhante aos eucariotos, uma vez que observam-se proteínas (do tipo histona) associando-se ao DNA, atuando na manutenção da estrutura do DNA, afetando também a expressão gênica. Foi observado que em muitos hipertermófilos a associação das proteínas ao DNA promove um enovelamente do tipo positivo no DNA, enquanto em eucariotos, este é negativo.

Foi também relatada a presença de introns no cromossomo de Archaea, em genes de RNA de hipertermófilos e halófilos, sendo processado através de endonucleases. Transcrição: Em relação aos promotores, aparentemente sua estrutura tem maior semelhança com promotores de eucariotos que de procariotos. A RNA polimerase é mais complexa que a de bactérias, podendo ser composta por 8 polipeptídeos em metanogênicas e halofílicas (enquanto em Bacteria são 4). Nas hipertermófilas, podem existir 10 polipeptídeos distintos (assemelhando-se à RNA polimerase de eucariotos). Ribossomos: São do tipo 70S, semelhantes aos de bactérias, entretanto, sua composição protéica é bastante distinta, tornando-os resistentes aos antibióticos que afetam a síntese protéica bacteriana. A tradução também é diferentes das Bacteria, assemelhando-se mais aos Eucarya, sem a participação da formil-metionina no início do processo. A toxina diftérica, que inibe a tradução de células eucarióticas também inibe o processo em Archaea. Flagelos: Muitas archaea, inclusive aquelas sem parede celular, podem apresentar flagelos. Estes diferem totalmente dos flagelos bacterianos, uma vez que não apresentam a estruturação em corpo basal, gancho e filamento. Nas Archaea, o flagelo não apresenta os anéis observados nas bactérias e, geralmente, é composto por vários tipos de “flagelina”, que exibe composição similar a várias fímbrias. Ao que parece, o flagelo é composto por flagelina, que se organiza a partir da membrana citoplasmática, projetando-se para o exterior da célula. Metabolismo As

archaea

quimiorganotróficas,

apresentam com

uma

metabolismo

enorme

diversidade

semelhante

às

metabólica.

demais

células,

Muitas

são

outras

são

quimiolitotróficas, utilizando o H2 como doador de elétrons nas reações de oxi-redução. Várias archaea são anaeróbias e geralmente termófilas e suas vias para obtenção de energia geralmente envolvem 1) Redução do CO2 a metano ou conversão do acetato a CO2 e então metano; sendo incorporado

pela

via

do

Acetil-Coa

CO2 + 4H2 k CH4 + 2H2O nas metanogênicas 2)

Redução

de

SO4

a

H2S;

SO42- + H+ + 4H2 k HS- + 4H2O 3)

Redução -

+

S + H2 k HS + H

de

Enxôfre

elementar

a

H2S.

Assim, pode-se notar que muitas archaea exibem metabolismo quimioautotrófico. Ecologia de archaea Embora inicialmente fossem consideradas organismos restritos a ambientes extremos, muitas archaea vêm sendo isoladas de ambientes favoráveis aos demais organismos procarióticos e eucarióticos. No entanto, dentre as várias archaea descritas até o momento, a maioria é encontrada em poucos ambientes especializados terrestres e aquáticos, tais como lagos extremamente salinos, ambientes estritamente anaeróbios e/ou ambientes extremamente quentes. Até pouco tempo, a menor temperatura onde foi possível se fazer o cultivo “in vitro” de archaea era de 30°C. Dados recentes indicam, por outro lado, que este grupo de microrganismos pode também ser isolado de ambientes frios. Atualmente sabemos que estes organismos são importantes membros da microbiota aquática de regiões frias do planeta. Ao que parece, as archaea podem corresponder a até 34% da biomassa procariótica das águas costeiras superficiais da Antártida. De maneira geral, e pelo fato da maioria das archaea conhecidas serem isoladas de ambientes quentes, salinos e/ou anaeróbios, este domínio é didaticamente dividido em três grandes grupos: termofílicos, halófilos e metanogênicos. No entanto, vale ressaltar mais uma vez que dados mais recentes comprvam a ampla distribuição geográfica e ecológica desse grupo de organismos. Termofilia: Sabe-se que várias archaea têm temperatura ótima superior a 80°C e temperatura máxima de crescimento acima de 100°C (Pyrodictium brockii tem ótimo de 105°C e Pyrolobus fumarii de 106°C, embora cresça em até 113°C). Ainda não se sabe até onde pode ir esta faixa de temperatura. Pyrolobus fumarii foi isolado de uma fenda no Oceano Atlântico, a uma profundidade de 3.650 metros, crescendo em uma faixa de temperatura de 90 a 113°C, pH de 4 a 6.5 e concentrações de NaCl variando de 1 a 4%. Experimentos realizados em laboratório mostram que culturas na fase exponencial de crescimento sobrevivem ao tratamento em autoclave (121°C) por 1 hora. A termofilia requer adaptações fisiológicas especializadas, pois as proteínas e ácidos nucléicos não podem ser desnaturados e a membrana deve manter-se funcional nestas temperaturas.

Curiosamente, a estrutura primária (seqüência de aminoácidos) de várias proteínas de Archaea não exibem diferenças significativas quando comparada a outros organismos. Provavelmente, o principal fator para esta característica seja o dobramento destas proteínas. Uma característica das proteínas de termofílicos refere-se à substituição de aminoácidos mais flexíveis por aqueles que conferem maior rigidez à molécula. Além disso, foi sugerido que as proteínas poderiam ser estabilizadas pela presença de altos teores de aminoácidos hidrofóbicos. As archaea termófilas também exibem um enorme número de chaperonas, que garantem o dobramento correto das proteínas nas temperaturas mais elevadas. Em termos de genoma, observa-se muitas vezes valores maiores de G+C nas hipertermófilas, estabilizando assim os ácidos nucléicos. Entretanto, tal característica não pode ser considerada como regra. Muitas termofílicas apresentam altas concentração de 2,3difosfoglicerato cíclico, um composto que protege contra a depurinização. Várias outras produzem uma DNA girase reversa, que enovela o DNA no sentido positivo, que é mais estável que o negativo, o qual é encontrado na maioria das outras células. Além disso, muitas vezes são encontradas proteínas do tipo histona ou outras, que se ligam fortemente ao DNA, protegendo-o. Quanto à membrana, sua funcionalidade é decorrente da presença de isopreno e da ciclização de seus componentes, além da alta frequência de membranas do tipo tetraéter. As termófilas podem ser encontradas em fontes geotérmicas, fontes vulcânicas (que expelem vapores e compostos sulfurados), fontes termais marinhas, onde erupções vulcânicas elevam a temperatura para mais de 100°C. Nestes casos, estas bactérias requerem, adicionalmente, pressões elevadas para o seu desenvolvimento. Estes organismos são muito utilizados em biodigestores de esgoto e também como fonte de insumos laboratoriais (Taq pol). Halofilia: Este grupo de archaea habita locais denominados hipersalinos, requerendo grandes quantidades de sal para seu desenvolvimento. Um halófilo extremo requer pelo menos 1,5M de NaCl (9%), podendo variar de 2 a 4M (12 a 23%) para outras espécies. Foram descritos organismos capazes de crescer na presença de 5,5M de NaCl, o que equivale a 32%, correspondendo ao limite de saturação para este sal. Embora ambientes salinos sejam comuns, os hipersalinos são raros, encontrando-se em áreas quentes e secas do mundo (lagos salgados, salinas, mar morto). Nestes ambientes, as células tenderiam a perdem água, devido à elevada concentração externa de sal. Entretanto, exibem uma adaptação fisiológica que corresponde ao acúmulo de sais ou íons em seu citoplasma, ou pela síntese de compostos orgânicos intracelulares, denominados solutos compatíveis. Assim, o gênero de halófilos Halobacterium bombeia grandes quantidade de K+

para o interior da célula, superando a concentração externa de Na+. Nestes organismos, as enzimas devem exibir maior tolerância ao sal, tendo em vista que seu funcionamento deverá ocorrer em um ambiente muito concentrado. Muitas apresentam bombas de cloro, que constantemente bombeiam este íon para o interior da célula. As paredes podem conter uma grande quantidade de aminoácidos carregados negativamente, ou polissacarídeos sulfatados, para interagir com íons Na+ presentes no meio, sendo esta interação essencial à integridade da parede. Metanogênicos: Este foi o primeiro grupo de archaea descrito, sendo único por sua capacidade de sintetizar metano. Sua distribuição geográfica é muito ampla, sendo encontrados no intestino de ruminantes, em cupins, em lagoas, lodos de esgoto, etc. Podem ser quimiolitotróficos ou quimiorganotróficos e, via de regra, são anaeróbio estritos, exibindo enorme sensibilidade ao oxigênio. Interações microbianas Ao que parece, as archaea interagem intensamente com outros organismos, embora sejam eventos menos frequentes que aqueles observados para as eubactérias. As archaea metanogênicas realizam associações com outros microrganismos, uma vez que necessitam de substrato (principalmente H) para a produção de metano. Assim, em processos de degradação anaeróbia de resíduos de indústrias de papel, que ocorrem em rios e lagos e também no intestino de ruminantes, pode-se observar a ocorrência de comunidades microbianas contendo metanogênicas, havendo a produção de metano e gás carbônico. Um dos principais produtos da fermentação de muitos anaeróbios é o H2, que é prontamente utilizado pelas metanogênicas, que associado ao CO2, origina o metano. O ácido fórmico pode também ser utilizado como doador de elétrons para a redução do CO2. A produção de metano, por sua vez, garante um ambiente anaeróbico. Já foi descrita a ocorrência de metanogênicas endossimbiontes em protozoários que habitam o rumen de vertebrados. Foi descrita a associação de archaea com animais e em alguns tecidos vegetais, embora até o momento não tenha sido comprovada a capacidade de invadir tecidos ou manifestar potencial patogênico nesses organismos. Em muitos casos a presença de metanogênicas no rumen pode levar a prejuízos ao gado, uma vez que competem pelo acetato produzido na fermentação da celulose. Há ainda um problema ambiental associado à produção de metano pelas archaea, pois este metano expelido pelas archaea contribui ao agravamento do efeito estufa. Estudos

recentes indicam que a quantidade de metano expelida pelas Archaea pode ser de 400 ton3/ano (cerca de 50 litros por dia). Dados recentes revelam a detecção de archaea em amostras de placa dental subgengival, embora nada tenha sido provado em relação ao potencial patogênico dos organismos isolados.

Nutrição de microrganismos Introdução Os microrganismos exibem os mais diversos mecanismos nutricionais. Em relação aos procariotos (Bacteria e Archaea), a nutrição ocorre predominantemente pela absorção, uma vez que a grande maioria destes organismos possui uma espessa parede celular, impossibilitando a realização de fagocitose. Os seres vivos podem ser classificados de acordo com as fontes de energia e de carbono que utilizam para seu crescimento. Assim, em relação às fontes de energia, tempos os organismos fototróficos (que utilizam a energia luminosa) e os quimiotróficos (que utilizam a energia proveniente de reações químicas). Em relação às fontes de carbono, temos os organismos autotróficos (fontes inorgânicas) e os heterotróficos (fontes orgânicas). Dentre os procariotos, iremos encontrar exemplos em todas as possíveis classes de organismos.

Classificação dos seres vivos, de acordo com as fontes de energia e carbono (Adaptado de Tortora et al., Microbiology - An Introduction, 1997)

Composição química da célula procariótica As células procarióticas são compostas, essencialmente por macromoléculas (proteínas, ácidos nucléicos, polissacarídeos e lipídeos), apresentando também uma menor quantidade de outros compostos orgânicos e inorgânicos. Além destes, encontramos íons e água. Relativamente, podemos consideram a célula como sendo ¼90% de água, ¼10% de macromoléculas e o restante compreendido pelos demais componentes. A maioria das pequenas moléculas é obtida a partir do meio, sendo as macromoléculas sintetizadas em seu interior.

Nutrientes Os nutrientes são definidos como as substâncias encontradas no ambiente, que participam do anabolismo e catabolismo celular, podendo ser divididos em dois grandes grupos: macronutrientes, que são necessários em grandes quantidades e micronutrientes, necessários em pequenas quantidades. Alguns nutrientes são utilizados como fonte de material para a biossíntese das moléculas, enquanto outros correspondem a fontes de energia, necessária aos processos biossintéticos e de manutenção dos organismos. Muitas vezes, diferentes nutrientes podem apresentar os dois papéis descritos acima. Principais Macronutrientes Carbono: corresponde à base de todas as moléculas orgânicas. Entre os procariotos melhor estudados até o momento, a maioria requer algum tipo de composto orgânico como fonte de carbono, o qual pode ser de diferentes variedades (aminoácidos, ácidos orgânicos, açúcares, bases nitrogenadas, etc). Nitrogênio: corresponde ao segundo elemento mais abundante nas células, compondo proteínas, ácidos nucléicos e peptideoglicano. Podemos encontrar o nitrogênio sob a forma de compostos orgânicos ou inorgânicos, sendo ambas as formas prontamente utilizadas por um

grande número de procariotos. Assim, a partir da degradação de proteínas e ácidos nucléicos, bem como a partir de amônia e nitrato, os organismos utilizam o nitrogênio presente na natureza. Embora o nitrogênio esteja em grandes concentrações na atmosfera, este não é amplamente utilizado, exceto por aqueles organismos denominados fixadores de N2. Hidrogênio: elemento presente em proteínas, açúcares e demais moléculas orgânicas. Fósforo: encontrado em compostos orgânicos (ácidos nucléicos) ou inorgânicos (fosfatos), sendo importante na composição de ácidos nucléicos e fosfolipídeos. Em sua maioria, os microrganismos utilizam o fósforo sob a forma de compostos inorgânicos. Enxofre: compondo a cisteína e metionina, estando presente também em várias vitaminas (tiamina, biotina). Na natureza, o enxofre sofre uma série de transformações, as quais são exclusivamente realizadas por microrganismos. A principal fonte de enxofre para os microrganismos corresponde aos sulfatos inorgânicos ou H2S. Potássio: necessário para todos os microrganismos, devido ao seu papel ativador de várias enzimas, tais como aquelas envolvidas na tradução. Magnésio: necessário geralmente em grandes quantidades, uma vez que tem papel na estabilização de ribossomos, membranas e ácidos nucléicos, sendo também importante para o funcionamento de diferentes enzimas, especialmente aquelas envolvidas na transferência de fosfato. Cálcio: embora não seja essencial ao crescimento da maioria dos microrganismos, tem papel de estabilização da parede celular e de termorresistência nos esporos. Sódio: importante, especialmente para microrganismos marinhos e certas archaea halófilas. Ferro: presente em um grande número de proteínas, especialmente aquelas envolvidas na respiração. Principais Micronutrientes: Embora necessários em pequenas quantidades, têm papel tão importante quanto os macronutrientes. Cobalto: necessário apenas para a formação da vitamina B12. Zinco: tem papel estrutural em várias enzimas (DNA e RNA polimerases) e outras proteínas de ligação ao DNA.

Molibdênio: presente em certas enzimas como a nitrato redutase assimilativa. Cobre: importante para enzimas respiratórias. Manganês: ativador de muitas enzimas. Níquel: presente em hidrogenases.

Fatores de crescimento: correspondem a compostos orgânicos específicos, que são necessários em quantidades muito pequenas devido à incapacidade das células os sintetizarem (vitaminas, aminoácidos, purinas e pirimidinas), os quais são geralmente fornecidos como componentes dos meios de cultura (peptonas, extrato de levedura) utilizados para o crescimento in vitro dos microrganismos. Na natureza, tais fatores são normalmente encontrados nos hábitats naturais dos microrganismos. Por exemplo, bactérias do gênero Porphyromonas requerem vitamina K como fator de crescimento, sendo esta fornecida pelo próprio hospedeiro eucarioto. As vitaminas correspondem ao fator de crescimento mais comum para os microrganismos. Estas são definidas como compostos orgânicos necessários em pequenas quantidades, para o crescimento e funções não relacionadas à nutrição, atuando na maioria das vezes como parte de coenzimas. Estão descritas abaixo algumas das funções desempenhadas pelas principais vitaminas requeridas pelos microrganismos: biotina - Biossíntese de ácidos graxos, b-decarboxilações, fixação de CO2; tiamina (B1) - a-decarboxilações e transcetolase piridoxina (B6) - transformações de aminoácidos e ceto ácidos

cobalamina (B12) - redução e transferência de fragmentos únicos de carbono, síntese de desoxirribose. As bactérias dos gêneros Streptococcus e Lactobacillus têm uma necessidade por vitaminas maior do que aquela exibida pelo homem. O processo de nutrição em procariotos Nos procariotos contendo parede celular os processos de nutrição ocorrem através da absorção dos nutientes, a partir do ambiente externo. Entretanto, devido às características diferenciais na composição e estrutura da parede celular dos organismos Gram positivos e Gram negativos, este processo apresenta algumas diferenças nestes dois grupos de organismos. Nutrição em Gram positivos: Estas bactérias caracterizam-se por sintetizar uma série de exoenzimas, as quais são liberadas no meio, clivando os nutrientes, que são capatados por proteínas transportadoras. Os fungos (células eucarióticas), posuem um sistema de nutrição semelhante ao das bactérias Gram positivas, nutrindo-se pela absorção, após a clivagem extracelular de compostos complexos. Nutrição em Gram negativos Papel da parede celular em Gram negativas A parede celular das bactérias Gram positivas é composta por várias camadas de peptídeoglicano, enquanto nas Gram negativas observa-se uma maior complexidade química e estrutural da parede, decorrente da presença de camadas lipoprotéica e lipopolissacarídica, localizadas externamente à camada de peptídeoglicano, originando a membrana externa. Estas diferenças, por si só, contribuem em grande parte às diferenças observadas na forma de captação dos nutrientes. Devido à presença de uma membrana externa de caráter hidrofóbico (LPS), as bactérias Gram negativas apresentam um grande número de porinas associadas à camada lipopolissacarídica. As porinas correspondem a proteínas, formadas por três subunidades idênticas, que originam um canal de cerca de 1 nm de diâmetro, cujo mecanismo de abertura e fechamento permanece ainda desconhecido. Desta forma, as porinas permitem a passagem de moléculas hidrofílicas, de baixa massa molecular.

Estas proteínas podem atuar de forma inespecífica, formando canais aquosos, ou específica, exibindo sítios de ligação para substratos de até 5 kDa, ou ainda, acopladas a proteínas transportadoras. Papel das proteínas periplasmáticas em bactérias Gram negativas O periplasma corresponde à porção celular localizada entre a membrana plasmática e a membrana externa, geralmente exibindo constituição gelatinosa, provavelmente devido ao grande número de enzimas e proteínas presentes, assim como pela própria presença do peptídeoglicano e lipoproteínas. De forma geral, são encontrados três tipos de proteínas no periplasma de células Gram negativas: hidrolases, que atuam na degradação inicial dos nutrientes; proteínas de ligação, que iniciam os processos de transporte e os quimioreceptores, envolvidos em processos de quimiotaxia. O transporte inicial das moléculas para o citoplasma, a partir do periplasma, é um processo que requer gasto energia, por meio da utilização de ATP. Papel da membrana citoplasmática na nutrição de Gram positivos e negativos A membrana citoplasmática, estrutura vital para qualquer tipo de célula, é uma barreira que separa o conteúdo celular do meio externo. A membrana corresponde a uma barreira altamente seletiva, permitindo que as células concentrem metabólitos específicos em seu interior. No domínio Bacteria, a membrana apresenta-se como uma bicamada fosfolipídica, contendo proteínas dispersas por toda sua superfície. A estutura global da membrana é estabilizada através de interações do tipo pontes de hidrogênio, interações hidrofóbicas e pela presença de íons Ca++ e Mg++, os quais se combinam com as cargas negativas dos fosfolípides. Embora em archaea, a membrana apresente estrutura totalmente distinta, podendo ser do tipo bicamada ou monocamada, muitas vezes desprovida de fosfolipídeos, tal estrutura desempenha os mesmo papéis fisológicos descritos para as membranas de qualquer ser vivo. Assim, a membrana tem papel essencial nos processos de nutrição procariótica, uma vez que todos os nutrientes e produtos de degradação devem atravessá-la. Devido à sua permeabilidade seletiva, a maioria das moléculas são incapazes de simplesmente atravessar a membrana de forma passiva. Ao contrário, estas devem ser ativamente transportadas através da membrana. O interior de uma célula procariótica consiste em uma solução aquosa hipertônica em relação à maioria dos hábitats onde os procariotos são geralmente encontrados. Assim, a água tem a capacidade de passar livremente para o citoplasma, pelo processo de osmose. Outros compostos, tais como pequenas substâncias apolares e lipossolúveis (ácidos graxos, álcoois, benzeno) são capazes de solubilizar-se na membrana e entrar na célula. Moléculas carregadas

como íons, aminoácidos, compostos polares, devem ser transportados especificamente uma vez que, devido à sua natureza, não são capazes de atravessar a membrana. Processos de transporte através da membrana A presença de proteínas transportadoras na membrana permite que a célula capte compostos que naturalmente não penetrariam na célula, devido à natureza semi-permeável da membrana. Estas proteínas podem ser agrupadas em três classes: uniportadoras, simportadoras e antiportadoras. As proteínas uniportadoras são aquelas que que transportam uma única substância de um lado para outro da membrana. As duas outras classes são descritas como cotransportadoras, uma vez que para transportar uma substância qualquer, necessitam transportar outra, concomitantemente. As simportadoras são aquelas que carreiam ambos os compostos em uma mesma direção enquanto nas antiportadoras o transporte se dá em direções opostas. Este tipo de transporte, mediado por proteínas, permite à célula apresentar concentrações internas de determinados compostos superiores àquelas encontradas no meio externo. Uma das principais características do processo de transporte mediado por proteínas reside na sua elevada especificidade, assim, determinados transportadores carreiam apenas um único tipo de molécula, embora a maioria apresente afinidade por uma classe de moléculas Tipos de transporte mediado por proteínas Difusão facilitada Neste tipo de processo, a ligação do nutriente à proteína transportadora induz uma mudança de conformação na proteína, formando um canal pelo qual o nutriente tem acesso ao citoplasma. Embora haja a participação de transportadores neste processo, a ação das leis das massas impede que ocorra a formação de um gradiente de concentração, mantendo assim as concentrações

intra

e

extracelular

semelhantes.

Este processo de difusão mediada por transportadores é denominado difusão facilitada, o qual não envolve gasto de energia. Os mecanismos descritos a seguir caracterizam-se por requerem um gasto de energia, uma vez que estes permitem um acúmulo dos compostos transportados no interior da célula. Desta forma, estes mecanismos envolvem o transporte contra um gradiente de concentração,

sendo a energia necessária para o bombeamente dos compostos para o interior da célula. Nestes casos, a energia pode advir da clivagem de ATP ou pela dissipação de gradientes de prótons ou íons Na+ através da membrana. Este gradiente iônico é estabelecido durante reações que liberam energia e podem ser utilizados como fonte potencial de energia para a captação de nutrientes contra um gradiente de concentração. Translocação de grupo Neste tipo de transporte, o nutriente sofre uma alteração química durante sua passagem através da membrana. Uma vez que o produto translocado para o interior da célula é agora diferente daquele presente no meio externo, não há a formação de um gradiente de concentração. Moléculas de açúcares tais como glicose, frutose, N-acetilglicosamina, purinas e pirimidinas são exemplos de translocação de grupo, sendo fosforiladas durante o processo pelo sistema fosfotransferase. Em E. coli, o sistema fosfotransferase é composto por 24 proteínas, sendo 4 necessárias

para

o

transporte

de

um

dado

açúcar.

O sistema fosfotransferase tem também papel na regulação do transporte dos açúcares, uma vez que na presença de glicose e outro açúcar, o sistema fosforila preferencialmente as moléculas de glicose. Tranporte ativo Alguns açúcares, a maioria dos aminoácidos, vários íons inorgânicos e ácidos orgânicos são transportados através deste tipo de mecanismo. A energia necessária para efetuar os processos advém ou do ATP ou, mais comumente, da formação de um gradiente de prótons (íons hidrogênio) por toda a membrana, denominado força próton motiva. Como resultado, a membrana fica energizada e este potencial eletroquímico é responsável pela captação dos nutrientes. Cada transportador tem sítios específicos tanto para o substrato como para os prótons. Com a entrada do nutriente, o próton também atravessa e membrana e com isso vai diminuindo o

gradiente +

Cátions tipo K

e

a

força

motiva.

podem ser transportados ativamente por uniportadores, em resposta à

diferença de cargas, uma vez que o interior da célula fica carregado negativamente. Os

ânions

provavelmente

são

transportados

juntamente

com

prótons,

por

simportadores. Moléculas não carregadas, como aminoácidos ou açúcares, são transportadas também

por

simportadores,

juntamente

com

um

ou

mais

prótons.

Além da força motora resultante do gradiente de prótons, o transporte ativo também pode ser executado utilizando a energia liberada pela hidrólise de ATP, como no caso do transporte de maltose em E. coli. A Cultura de microrganismos in vitro: A partir do conhecimento dos requerimentos nutricionais, podem ser confeccionados meios que permitam o crescimento microbiano in vitro. Cultura pura: corresponde a uma cultura contendo um único tipo de organismo. Esta é importante, uma vez que permite o estudo dos microrganismos isoladamente. Para isso, precisamos conhecer as necessidades nutricionais e ambientais dos microrganismos. Os meios de cultura consistem em meios aquosos, adicionados de nutrientes e, eventualmente, ágar (polissacarídeo = éster sulfato de galactana, retirado de algas - Gelidium), caso se deseje a consistência sólida. Há duas classes de meios: os quimicamente definidos (sintéticos) e os indefinidos (complexos). Tipos de meios em relação à consistência: Líquidos, Semi-sólidos e Sólidosn Tipos de meios, quanto à composição: Simples, Enriquecidos, Seletivos, Diferenciais.

Crescimento microbiano Introdução ao Crescimento Microbiano Em microbiologia, o termo crescimento refere-se a um aumento do número de células e não ao aumento das dimensões celulares. Crescimento Populacional: é definido como o aumento do número, ou da massa microbiana. A taxa de crescimento é a variação no número ou massa por unidade de tempo. O tempo de geração é o intervalo de tempo necessário para que uma célula se duplique. O tempo de geração é variável para os diferentes organismos, podendo ser de 10 a 20 minutos até dias, sendo que em muitos dos organismos conhecidos, este varia de 1 a 3 horas. O tempo de geração não corresponde a um parâmetro absoluto, uma vez que é dependente de fatores genéticos e nutricionais, indicando o estado fisiológico da cultura. O tempo de geração pode ser calculado quando uma cultura encontra-se em fase exponencial, pela fórmula abaixo: N=No.2n, onde N= número final de células, No= número inicial de células, n= número de gerações.

n=

log(N)

-

log(No)/0.301

t

g = /n , onde g= tmpo de geração, t= tempo de crescimento e n= determinado acima. Medidas do crescimento microbiano O crescimento dos microrganismos pode ser mensurado por diferentes técnicas, tais como pelo acompanhamento da variação no número ou peso de células, por exemplo. Dentre as diferentes técnicas utilizadas, descreveremos alguns exemplos. Contagem total de células: esta metodologia envolve a contagem direta das células em um microscópio, seja de amostras fixadas (e coradas) ou analisadas a fresco, (sendo aplicados cerca de 10 µl da suspensão, na maioria dos casos), utilizando-se câmaras de contagem. A contagem direta é uma técnica rápida, mas tem como principais limitações a impossibilidade de distinção entre células vivas e mortas (o que pode ser contornado pelo uso de corantes vitais, para leveduras) e contagens errôneas, devido às pequenas dimensões de algumas células, ou pela formação de agregados celulares. Em preparações não coradas, deve-se utilizar microscópio de contraste de fase, o qual deve ser empregado apenas quando as células não estão muito diluídas ( Ganho de elétrons (ou átomos de hidrogênio) de um átomo ou molécula. Tal definição decorre do fato de que frequentemente, estas reações envolvem a transferência não somente de elétrons, mas sim de átomos de hidrogênio (na forma de H+). Como os elétrons não podem ficar isolados, “soltos”, estes devem fazer parte de átomos ou moléculas. Assim, toda reação de oxidação requer acoplada uma redução. Assim, o composto que foi oxidado denomina-se de doador de elétrons, enquanto aquele reduzido é o aceptor de elétrons. Mecanismos de geração de ATP Os organismos apresentam três mecanismos de fosforilação para a geração de ATP: 1) Fosforilação em nível de substrato: onde o ATP é gerado pela transferência de um grupamento fosfato de alta energia a partir de um composto fosforilado ao ADP. Esta ligação rica em energia geralmente foi adquirida na reação onde o substrato foi oxidado. 2) Fosforilação oxidativa: Neste caso, os elétrons são tranferidos do composto orgânico, através de uma série de carreadores a um aceptor final, sendo que a transferência dos elétrons entre os diferentes carreadores libera energia, onde parte é utilizada na geração de ATP, pela quimiosmose. 3) Fotosforilação: que ocorre em células que contém pigmentos que absorvem luz. Neste caso, a energia luminosa, é convertida em ATP e NADPH, que serão utilizados para a biossíntese, empregando também uma cadeia de transporte de elétrons.

Processos onde há a produção de energia, em quimiotróficos A produção de energia nos organismos quimiotróficos: pode, a grosso modo, ser dividida em três categorias: fermentação, respiração aeróbia e respiração anaróbia. - Fermentação: processo que ocorre na ausência de aceptores finais (anaeróbio). - Respiração: oxigênio ou outro agente oxidante atua como aceptor final (aeróbia ou anaeróbia). Uma vez que estes três processos envolvem reações de oxirredução, podemos diferenciá-los genericamente, de acordo com os doadores inciais e aceptores finais de elétrons. Assim, temos: Fermentação: processo onde o doador inicial e o aceptor final de elétrons correspondem a moléculas orgânicas. Desta forma, a fermentação é um processo onde ocorre oxidação parcial dos compostos orgânicos, que podem ser açúcares, proteínas, ácidos, entre outros. Como o processo é parcial, há apenas uma pequena fração de energia liberada. Nas fermentações, o ATP é gerado a partir da fosforilação em nível de substrato. Por exemplo, após a quebra da glicose, originando ácido pirúvico, este pode ser convertido a outro composto orgânico, por um processo de fermentação. Assim, a fermentação é um processo que não depende do ciclo de Krebs, ou da cadeia de transporte de elétrons. Neste tipo de reação, os elétrons são transferidos das coenzimas reduzidas (NADH, NADPH) ao ácido pirúvico ou derivados, regenerando-os para novos ciclos de glicólise. Vários tipos de fermentação são observados em diferentes microrganismos, sendo os exemplos mais conhecidos a fermentação alcoólica e a fermentação lática. Tipos básicos de fermentação: Lática (homo ou heterolática) => ácidos lático, acético, fórmico, etanol (Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc). Propiônica:

Propiônico,

acético

e

CO2

(Propionibacterium,

Veillonella).

Acetona-Butírica: ácido butírico, acetona, butanol, isopropanol, ácido acético, ácido fórmico, etanol, H2 e CO2 (Clostridium, Eubacterium, Bacillus).

Acética:

acético,

glucônico

(Acetobacter).

Aerogenes-coli-tífico: Fórmico, acético, lático, succínico, etanol, 2,3-butilenoglicol, H2 e CO2 (Escherichia, Enterobacter, Salmonella).

Exemplos de fermentações (Adaptado de Tortora et al., Microbiology, an introduction, 1996)

Respiração: Processo onde o doador inicial de elétrons é oxidado, tendo como aceptor final de elétrons é um composto inorgânico. Quando o aceptor final é o oxigênio, a respiração é denominada aeróbia e quando o aceptor é outro composto (Sulfato, nitrato), é denominada anaeróbia. Em todos os processos de respiração temos a participação de uma cadeia de transporte de elétrons. Respiração Aeróbia Após a glicólise, o ácido pirúvico é convertido a actil-CoA, que entra no ciclo de Krebs, onde ocorrem uma série de reações de oxirredução, que transferem a energia para coenzimas, principalmente NAD+, reduzindo-as. Esta energia armazenada será transferida, levando à formação de ATP, pela cadeia de transporte de elétrons, localizada na membrana citoplasmática. Esta cadeia de transporte corresponde a uma série de moléculas transportadoras (flavoproteínas, citocromos e ubiquinonas), que sofrem reações de oxirredução, as quais promovem uma gradual liberação de energia, que dirigirá a geração quimiostática de ATP.

As cadeias de transporte snao bastante variáveis nas diferentes bactérias e uma mesma

bactéria

pode

apresentar

diferentes

cadeias

de

transporte

de

elétrons.

Durante o transporte há a produção de ATP, através da fosforilação oxidativa, que está ligada ao

estabelecimento

de

um

gradiente

de

prótons

através

da

membrana.

Quimiosmose: Estas proteínas transportadoras de prótons estão orientadas na membrana de tal forma que possibilita a separação entre prótons e elétrons, sendo os elétrons mandados para a face citoplasmática da membrana, por transportadores específicos e os prótons para o lado de fora da célula. Ao final do processo, os elétrons são carreados ao aceptor final (O2 na respiração aeróbia), que é reduzido, formando água. Para formar água, precisa de íons H+ do citoplasma, vindos da dissociação da água. Em decorrência destes processos, é gerada uma formação líquida de OH- no interior da célula, resultando em um gradiente de pH e um potencial elétrico ao longo da membrana (dentro fica negativo e alcalino e fora, positivo e ácido). A membrana fica então energizada (força motora de prótons). Esta energia elétrica pode então ser utilizada transporte de íons, movimentação flagelar ou na formação de ATP. Formação de ATP: A enzima ATPase (um canal para o transporte de prótons), ligada à membrana, possui 2 partes: uma cabeça em multi-subunidades, presente na face interna, e uma cauda, condutora de prótons, que atravessa a membrana. Ela cataliza a reação entre ATP e ADP + Pi. Atuando em uma direção, ela cataliza a formação de ATP (fosforilação oxidativa) pela entrada controlada de prótons (a formação do gradiente é dada com gasto de energia, enquanto sua dissipação controlada libera energia).

Exemplos da respiração aeróbia (Adaptado de Tortora et al., Microbiology, an introduction, 1996)

Respiração anaeróbia: Neste processo, o aceptor final de elétrons não é o oxigênio, sendo substituído por nitrato, sulfato ou carbonato. Uma vez que parte do ciclo de Krebs não é funcional em condições de anaerobiose, e também pelo menor número de moléculas transportadoras de elétrons presentes, este processo rende menor quantidade de energia, mas ainda fornece mais que na fermentação. Eventualmente, ocorre em organismos que realizam respiração aeróbia. Fotossíntese: Um dos processos mais importantes na terra, realizado por organismos autotróficos, que possibilita a conversão da energia luminosa em energia química, a qual é então utilizada para a conversão do CO2 da atmosfera em compostos de carbono reduzidos, especialmente açúcares. Neste processo, os elétrons são obtidos a partir dos átomos de hidrogênio da água. A fotossíntese pode ser dividida em duas etapas: fase clara a energia luminosa é utilizada na conversão de ADP a ATP e na redução de NADP a NADPH. Há ainda a fase escura, os elétrons são utilizados, juntamente com o ATP, para reduzir o CO2 a compostos orgânicos. Reações luminosas: correspondem à fotofosforilação, onde a energia luminosa é absorvida pelos pigmentos (clorofila, bacterioclorofila), excitando os elétrons, que passam para a primeira de uma série de moléculas transportadoras, semelhante à cadeia de transporte de elétrons. Com isso, há a passagem de prótons pela membrana, com a conversão de ADP em ATP. A fotofosforilação pode ser de dois tipos: cíclica e acíclica. No processo cíclico, o elétron retorna à clorofila, enquanto na acíclica, processo mais comum, os elétrons liberados não retornam à clorofila, sendo incorporados ao NADPH. Os elétrons perdidos são subsituídos por outros, provenientes da água ou outro composto oxidável, tal como H2S. (Na cíclica, quanto há a absorção dos quanta pela bacterioclorofila, a molécula se excita, perdendo um elétron, tornando-se um agente oxidante potente. O elétron é transferido num processo semelhante a CTE (Ferredoxina-ubiquinona-cit b-cit f) e retorna à bacterioclorofila. Entre b e f há a produção de ATP. Na acíclica (algas) há dois sistemas de pigmentos que também perdem elétrons, passam por um processo semelhante à CTE, mas o elétron é usado para reduzir o NADP a NADPH). Reações escuras: não requerem a luz, para que ocorram e incluem o ciclo de Calvin-Benson, onde o CO2 é fixado.

Exemplos da fotossíntese (Adaptado de Tortora et al., Microbiology, an introduction, 1996)

Outros tipos metabólicos Fotoautotróficos: Utilização de compostos inorgânicos como doadores: Ocorre nos quimiolitotróficos, sendo as fontes o H2S, H2 e NH3. Os processos são similares à respiração aeróbia. A fonte de carbono é geralmente o CO2. Quimiolitotróficos: O CO2 é reduzido a gliceraldeído 3P (fixação), que será metabolizado via o ciclo de Calvin. A energia para a realização destes processos advém da oxidação

de

compostos

inorgânicos

(H2,

NH4,

NO3).

As bactérias púrpuras e verdes usam a luz para produzir ATP; produzem NADPH a partir da oxidação de H2S ou compostos orgânicos (fotossíntese anoxigênica). As algas e cianobactérias geralmente obtém o NADPH pela hidrólise da água, sendo um evento mediado pela luz (oxigênica).

Biofilmes Microbianos Introdução Nossa percepção de bactérias como organismos unicelulares baseia-se essencialmente no conceito de culturas puras, nas quais as células podem ser diluídas e estudadas a partir de culturas líquidas. Como praticamente todos os conceitos e conhecimentos microbiológicos foram adquiridos a partir do estudo de organismos em culturas puras, somente há alguns anos começamos a entender que, na realidade, a maioria das bactérias se encontra na natureza vivendo em comunidades, de maior ou menor estruturação. O tipo de "ecologia" que imaginávamos em relação aos procariotos, ou seja, células individuais crescendo de maneira planctônica (livres, em suspensão), raramente é encontrado na natureza. Sabe-se atualmente que, quando em seus habitats naturais, via de regra as bactérias são encontradas em comunidades de diferentes graus de complexidade, associadas a superfícies diversas, geralmente compondo um biofilme, isto é, um ecossistema estruturado altamente dinâmico, que atua de maneira coordenada. Assim, embora possam ter uma existência planctônica independente, este tipo de vida parece ser eventual. Os biofilmes, complexos ecossistemas microbianos, podem ser formados por populações desenvolvidas a partir de uma única, ou de múltiplas espécies, podendo ser encontrados em uma variedade de superfícies bióticas e/ou abióticas. Desta maneira, muitos autores definem biofilmes como associações de microrganismos e de seus produtos extracelulares, que se encontram aderidos a superfícies bióticas ou abióticas. Geralmente, a dinâmica de formação de um biofilme ocorre em etapas distintas. Inicialmente temos or organismos denominados colonizadores primários, que se aderem a uma superfície, geralmente contendo proteínas ou outros compostos orgânicos. As células aderidas passam

a

se

desenvolver,

originando

microcolônias

que

sintetizam

uma

matriz

exopolissacarídica (EPS), que passam a atuar como substrato para a aderência de microrganismos denominados colonizadores secundários. Estes colonizadores secundários podem se aderir diretamente aos primários, ou promoverem a formação de coagregados com outros microrganisos e então se aderirem aos primários.

(Adaptado de Rickard et al., Trends Microbiol., 11:94-100, 2003)

Desenvolvimento de um biofilme. (a) Colonização primária de um substrato; (b) crescimento, divisão celular e produção do exopolissacarídeo (EPS), com o desenvolvimento de microcolônias; (c) coadesão de células individuais, de células coagregadas e grupos de células idênticas, originando um biofilme jovem, de múltiplas espécies; (d) maturação e formação de mosaicos clonais no biofilme maduro. Assim, o biofilme corresponde a uma "entidade" dinâmica pois, de acordo com os microrganismos que o compõem, teremos consições físicas, químicas e biológicas distintas. Estas alterações fazem com que cada biofilme seja único, de acordo com os microrganismos presentes. Neste sentido, ao longo do tempo a composição microbiana dos biofilmes geralmente sofre alterações significativas. A figura abaixo ilustra não somente a estruturação fisico-química de um biofilme, mas também sua evolução e amadurecimento, dependendo das relações estabelecidas pelos microrganismos presentes.

Estágios de formação e vida de um biofilme, determinados por fatores físicos, biológicos e ambientais (Adaptado de Jenkinson & Lappin-Scott, Trends Microbiol., 9:9-10, 2001)

Comportamento coletivo Há várias décadas, foi proposto que as bactérias poderiam corresponder a organismos interativos, capazes de atuar coletivamente, facilitando sua adaptação às alterações ambientais. Para que um biofilme de uma ou várias espécies seja formado, é necessário o estabelecimento de um comportamento multicelular, que se reflete em atividades coordenadas de interação e comunicação dos vários organismos. Assim, os biofilmes não são simples camadas viscosas contendo organismos. Estes representam sistemas biológicos altamente organizados, onde as bactérias estabelecem comunidades funcionais estruturadas e coordenadas. Um dos mecanismos de comunicação interbacteriana que vem se mostrando extremamente importante na formação e desenvolvimento de biofilmes corresponde ao quorum sensing. Comunidades associadas às superfícies Os procariotos podem habitar qualquer ambiente adequado às formas de vida superiores, assim como vários ambientes inóspitos à maioria das formas de vida. Tal fato é decorrente de sua inigualável diversidade metabólica e plasticidade fenotípica. Um dos importantes aspectos associados a esta ubiqüidade está relacionado à capacidade destes organismos migrarem para diferentes nichos, onde podem se propagar. O mecanismo mais comum que permite a migração dos procariotos corresponde à motilidade, seja de origem flagelar, deslizante, ou de outro tipo. No entanto, são conhecidos mecanismos que também permitem a migração bacteriana.

Por exemplo, algumas espécies podem sintetizar celulose, originando uma película que mantém as células próximas à interface ár-água, ou na superfície de plantas. Bactérias fotossintetizantes podem se posicionar nas colunas de água, em resposta à intensidade luminosa, pela produção de vesículas de gás. Outras, apresentam magnetossomos,permitindo movimentações ao longo dos campos magnéticos da Terra. Um importante mecanismo na formação de comunidades corresponde à agregação ou aderência, que otimiza tanto as interações celulares como também as taxas de sedimentação dos organismos. As comunidades bacterianas têm importantes papéis na natureza, seja na produção e degradação de matéria orgânica, na degradação de poluentes, ou na reciclagem de nitrogênio, enxofre e vários metais. A maioria destes processos requer o esforço coletivo de organismos com diferentes capacidades metabólicas. Assim, os biofilmes participam metabolizando esgotos e águas contaminadas com petróleo, na nitrificação, na reciclagem de enxofre oriundo de drenados ácidos de minas (onde o pH é 0) e em vários outros processos. Outro tipo de biofilme está associado às partículas em suspensão, muitas vezes denominadas neve marinha, extremamente importante nas transformações biogeoquímicas do carbono em ambientes pelágicos, na metanogênese, fixação de nitrogênio e produção de enxofre. Estes achados revelam que nos biofilmes podem ser criadas condições de anaerobiose, em ambientes normalmente aeróbios.

(Adaptado de Davey & O’Toole, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64:847-867, 2000)

Exemplo da ecologia de comunidades microbianas. As quatro microcolônias centrais correspondem a organismos que geram e consomem hidrogênio. Os fermentadores utilizam açúcares e produzem ácidos orgânicos, utilizados pelos produtores de hidrogênio. Além das

interações metabólicas, a comunicação intra e intercelular pode ser mediada por moléculas sinalizadoras.

As interações que permitem a agregação de diferentes espécies, ou mesmo gêneros microbianos em um biofilme geralmente envolvem a participação de adesinas (moléculas de adesão presentes em fímbrias ou dispersar ao longo da superfície celular), que reconhcem receptores específicos na superfície de outras células, ou em diversos tipos de substratos. Assim, a figura abaixo esquematiza a formação de um biofilme aquático, revelando a complexidade tanto estrutural como temporal deste ecossistema. As horas correspondem ao tempo médio necessário à adesão dos diferentes microrganismos, revelando a dinâmica de formação e estruturação deste biofilme.

Esquema de coagregações envolvendo bactérias aquáticas. (Adaptado de Rickard et al., Trends Microbiol., 11:94-100, 2003)

Estrutura dos Biofilmes A maioria dos biofilmes exibe uma certa heterogeneidade, existindo conjuntos de agregados celulares distribuídos ao longo da matriz exopolissacarídica, que exibem densidades variáveis, originando aberturas e canais por onde a água pode trafegar.

Corte lateral, revelando a estrutura de um biofilme artificial de V. cholerae. A intensidade da cor está associada à densidade celular. (Adaptado de Davey & O’Toole, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64:847-867, 2000)

As microcolônias que compõem um biofilme podem ser de uma ou várias espécies, dependendo das condições ambientais. Por exemplo, em locais de grande stress mecanico, tais como a superfície dental, o biofilme é bastante compactado e estratificado. Os espaços intersticiais (canais) também são parte importante dos biofilme, pois permitem a circulação de nutrientes e a troca de metabólitos. Por que formar um biofilme? Acredita-se que a formação de biofilmes esteja associada, por exemplo, à proteção contra o ambiente, ou seja, bactérias em um biofilme encontram-se abrigadas e em relativa homeostase, graças à presença da matriz exopolissacarídica. A matriz contém vários componentes: exopolissacarídeo, proteínas, ácidos nucléicos, entre outros. O exopolissacarídeo é secretado para o meio externo, sendo de diferentes composições. Ao que parece, o EPS tem diferentes estruturas e funções, dependendo das comunidades e/ou condições ambientais. Este polímero pode impedir fisicamente a penetração de agentes antimicrobianos no biofilme, principalmente aqueles hidrofílicos e carregados positivamente. Em alguns casos o EPS é capaz de sequestrar cátions, metais e toxinas. Por estas razões, os biofilmes podem corresponder a excelentes mecanismos de transferência de metais nos ecossistemas, pois vários organismos marinhos pastadores se alimentam de biofilmes. Foi também descrito que o EPS teria papel de proteção contra radiações UV, alterações de pH, choques osmóticos e dessecação. Disponibilidade de nutrientes e cooperatividade metabólica Os canais aquosos dos biofilmes podem ser comparados a um sistema circulatório primitivo, permitindo a troca de nutrientes e metabólitos, assim como a remoção de metabótilos potencialmente tóxicos. Em um biofilme, torna-se possível a cooperação metabólica. Por exemplo, a degradação de compostos orgânicos complexos, originando metano e CO2 durante

uma digestão anaeróbia, requer pelo menos três grupos de organismos. As bactérias fermentativas iniciam o processo, gerando ácidos e álcoois, que são utilizados por bactérias acetogênicas. Finalmente, as metanogênicas convertem o acetato, CO2 e hidrogênio, produzindo metano. Os biofilmes são ambientes ideais para o desenvolvimento de relaçoes sintróficas, que é um tipo de simbiose onde dois tipos de organismos metabolicamente distintos dependem um do outro para utilizarem certos substratos, na produção de energia.

Sintrofia em um grânulo de lodo de um reator metanogênico. Corantes fluorescentes revelam organismos metanogênicos (em verde) e bactérias que oxidam propionato (em vermelho). A cor amarela resulta da combinação verde e vermelho, revelando microcolônias

sintróficas

interligadas

a

cadeias

de

metanogênicos.

(Adaptado de Davey & O’Toole, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64:847-867, 2000)

Aquisição de novas características genéticas Várias bactérias possuem plasmídeos, conferindo as mais diversas características. Estes podem ser transferidos horizontalmente por conjugação, para diferentes espécies presentes em um bioflme. Estudo foram realizados com placas dentais artificiais, formadas inicialmente por bactérias do gênero Streptococcus. Uma linhagem de Bacillus, contendo um transposon conjugativo albergando genes de resistência à tetraciclina, foi inserida no sistema e transferiu este transposon para células de Streptococcus. A transdução pode, teoricamente, ser responsável pela transferência horizontal de genes em biofilmes. Tal hipótese baseia-se no fato de sistemas marinhos e de água doce

contêm uma enorme abundância de bacteriófagos (cerca de 108/ml), sendo responsáveis pela lise de um grande número de bactérias. Diariamente, de 10 a 20% da população bacteriana é lisada por fagos, os quais têm relevante impacto na cadeia alimentar microbiana uma vez que podem aumentar as taxas de mortalidade e/ou reduzir as taxas de crescimento em todos os níveis tróficos. Estudos recentes revelam que os fagos podem estruturar ou restruturar comunidades microbianas. Em uma análise, onde uma população de cianobactérias foi praticamente exterminada pelos fagos, observou-se a presença de novas espécies capazes de degradas os compostos orgânicos que surgiram. Papel dos biofilmes nas doenças Até o momento, a vasta maioria das doenças infecciosas vem sendo tratada eficientemente com antibióticos entretanto, de acordo com as pesquisas mais recentes, sabemos que tal tipo de estratégia pode ser ineficaz em duas situações: 1) com organismos exibindo resistência inata à droga e 2) em bactérias presentes em biofilmes. Em um biofilme, as bactérias podem ser 1000 vezes mais resistente a um antibiótico, quando comparadas às mesmas células planctônicas, embora os mecanismos envolvidos nesta resistência sejam ainda pouco conhecidos. Dentre os possíveis mecanismos, acredita-se que possa haver a inativação da droga por polímeros ou enzimas extracelulares, ou a ineficiência da droga em decorrência de taxas de crescimento muito lentas no interior dos biofilmes.

Infecções assciadas a biofilmes geralmente são de natureza recorrente, visto que as terapias antimicrobianas convencionais eliminam predominantemente as formas planctônicas, deixando as células sésseis livres para se reproduzir e propagar no biofilme após o tratamento. Para tornar o quadro ainda mais grave, as bactérias presentes nos biofilmes encontram-se mais protegidas contra o sistema imune do hospedeiro. Exemplos típicos de doenças associadas a biofilmes incluem as infecções de implantes tais

como

válvulas

cardíacas,

catéteres,

lentes

de

contato,

etc.

Os biofilmes podem ainda promover doenças se formados em tecidos, tais como nas infecções pulmonares provocadas por Pseudomonas aeruginosa, em pacientes com fibrose cística, que são suscetíveis a infecções crônicas por esta bactéria. A periodontite é outro exemplo de doença provocada por biofilmes. O principal microrganismo associado a esta doença, Porphyromonas gingivalis, coloniza uma grande de superfícies orais direta ou indiretamente, sendo então capaz de invadir as células das mucosas e liberar toxinas.

Biofilmes e resistência às drogas, devido à densidade e tipos celulares, exclusão física da droga, expressão de genes de resistência, quorum sensing e alterações da superfície celular. (Adaptado de Mah & O’Toole, Trends Microbiol., 9:34-39, 2001)

Esquema do desenvolvimento temporal de uma placa dental. (Adaptado de Rickard et al., Trends Microbiol., 11:94-100, 2003)

Genética da formação dos biofilmes Quatro organismos, P. aeruginosa, P. fluorescens, E. coli e V. cholerae, vêm sendo intensamente estudados, como modelos na formação de biofilmes de espécies únicas. Este processo pode ser subdivido em etapas: a) Aderência inicial à superfície, b) Formação das microcolônias, c) maturação das microcolônias em um biofilme contendo a matriz de EPS.

Estudo microscópico da formação de um biofilme por

V.

(Adaptado

de

Watnick

cholerae &

Kolter,

J.

Bacteriol., Etapas que uma nova espécie bacteriana realiza, durante

182:2675–2679, 2000)

sua

incorporação

em

um

biofilme

(Adaptado de Watnick & Kolter, J. Bacteriol., 182:2675– 2679, 2000)

Ao que parece, o processo se inicia quando as bactérias percebem determinadas condições ambientais, que disparam o fenômeno de transição de células planctônicas em sésseis. Assim, Pseudomonas aeruginosa e P. fluorescens parecem ser capazes de formar bioflmes sob quase todas as condições, enquanto E. coli somente os forma se estiver em meios mínimos suplementados com aminoácidos, ou em meios pobres em nutrientes. Diferentes vias genéticas podem ser utilizadas na formação de biofilmes. Por exemplo, V. cholerae parece ter diferentes vias para realizar a aderência inicial, dependendo da superfície. Assim, quando no intestino, este organismo utiliza a fímbria Tcp para realizar a colonização, embora tal estrutura não tenha papel na etapa inicial de formação de biofilmes em superfícies abióticas, sendo o processo mediado por um outro tipo de fímbria, denominada Msh. Início de formação do biofilme A partir de estudos com linhagens mutantes de P. aeruginosa, foi relatado que, quando as células não sintetizam flagelos, são incapazes de realizar as interações iniciais com as

superfícies. Mutantes que não produzem a fímbria tipo IV (associada à movimentação das células em uma superfície) são capazes de se aderir formando uma monocamada, ao invés de microcolônias. Existem uma proteína, denominada Crc que, além de atuar regulando o metabolismo das células, também regula a expressão de dois genes que codificam proteínas importantes na montagem da fímbria tipo IV. O LPS da membrana externa também tem papel na adesão inicial. Em E. coli, os flagelos também são importantes nesta primeira etapa de formação do biofilme. Há ainda a participação de fímbrias do tipo I, uma proteína de membrana externa, Ag43 e do LPS. Em V. chloreae acredita-se que o processo seja bastante similar ao de E. coli. Maturação

do

biofilme

Após a etapa de interações iniciais, começa a haver a formação das microcolônias, normalmente associada à produção de EPS. Outra etapa importante corresponde à organização da arquitetura do biofilme que, em P. aeruginosa parece ter a participação do "quorum sensing".

Estágios iniciais na formação de biofilmes de Gram negativos (P. aeruginosa, E. coli, e V. cholerae). (A) Em P. aeruginosa, os flagelos são necessários para aproximar a bactéria da superfície, enquanto o LPS media as primeiras interações, havendo talvez a participação de proteínas da membrana externa. Quando formam monocamadas, fímbrias tipo IV mediam o

movimento pulsante, necessário à formação de microcolônias. A produção destas fímbrias é regulada, em parte, por sinais nutricionais (Crc), havendo ainda a ativação de genes envolvidos na síntese de alginato e repressão de genes flagelares. A formação do biofilme maduro envolve a participação de homoserina lactonas sinalizadoras. (B) Em E. coli, os flagelos aproximam as células do substrato, enquanto as primeiras interações são mediadas por fímbris tipo I e a proteína de membrana externa Ag43. O EPS, ácido colânico é resonsável pela arquitetura do biofilme. (C) V. cholerae, também usa os flagelos na aproximação, sendo a ligação mediada por fímbrias

MshA

e

talvez

outras

proteínas.

(Adaptado de Davey & O’Toole, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64:847-867, 2000)

Dispersão Em determinados momentos, os biofilmes sofrem dispersão, liberando microrganismos que podem vir a colonizar novos ambientes. Ós mecanismos genéticos associados à dispersão não

são

ainda

bem

conhecidos.

Existem três tipos de processos de dispersão: expansiva, quando parte das células de uma microcolônia sofrem lise e outras retomam a motilidade, sendo então liberadas da estrutura. Outro tipo de dispersão envolve a fragmentação do biofilme, onde porções de matriz extracelular associadas a microrganismos são liberadas. Finalmente, o terceiro tipo de dispersão, denominada superficial, ocorre pelo crescimento do próprio biofilme como um todo.

Quorum Sensing Introdução

O quorum sensing (sensor de quorum) corresponde a um processo de comunicação intra e interespécies microbianas, que permite aos microrganismos apresentarem alterações fenotípicas marcantes quando estes se encontram em altas densidades populacionais. A descoberta deste tipo de interação microbiana tornou evidente o conceito que, embora geneticamente e estruturalmente mais simples, os microrganismos têm a capacidade de se comportar como organismos complexos, capazes de se comunicar e agir coordenadamente, respondendo a diferentes estímulos de modo unificado. Este interessante processo foi descoberto em bactérias luminescentes marinhas, habitantes de orgãos luminescentes de lulas e certos peixes.

Lula exibindo luminescência

Há muitos anos conhecia-se a existência de bactérias marinhas (por exemplo Vibrio fischeri) capazes de emitir luminescência. No entanto, este fenômeno era apenas observado quando os microrganismos encontravam-se confinados nos orgãos de luz dos animais. Quando tais bactérias encontravam-se livres na água do mar, a luminescência não era observada. Estudos posteriores revelaram que durante o dia as lulas expeliam as bactérias de seus orgãos de luz mas, à medida que a noite se aproximava, estas passavam a acumumular os microrganismos, que após um determinado período de tempo tornavam-se luminescentes. Em outras palavras, a emissão de luminescência estava associada à densidade populacional bacteriana. Posteriormente o processo que resultava na luminescência foi esclarecido, sendo denominado quorum sensing, uma vez que correspondia a um mecanismo de comunicação onde os microrganismos monitoravam sua densidade populacional. O mecanismo de Quorum Sensing Atualmente está bem definido que este sensoriamento populacional é realizado por meio de pequenas moléculas, denominadas autoindutores (AI). Os autoindutores podem ser de diferentes naturezas químicas: em organismos Gram negativos, via de regra os autoindutores são do tipo N-acil homoserina lactonas (AHL), que correspondem a pequenas moléculas que se difundem livremente para dentro e para fora das células. Em Gram positivos, normalmente os autoindutores correspondem a pequenos petídeos (hepta ou octapeptídeos) que se ligam a receptores localizados na superfície das células bacterianas. Nos diferentes organismos que realizam o quorum sensing, o processo segue, essencilamente, as mesmas etapas.

Durante o crescimento microbiano, todas as células produzem e liberam uma pequena quantidade de autoindutores. Quando a população se encontra no meio da fase logarítmica ou no início da fase estacionária de crescimentno, a quantidade de autoindutor produzido alcança uma concentração limite, suficiente para disparr o processo de alteração da expressão gênica. Em termos bastante simples: os autoindutores se ligam a proteínas receptoras que são então ativadas, promovendo a ativação da expressão de certos genes, podendo ainda inibir a expressão de outros genes que se encontravam ativos. Assim, o quorum sensing é ativado quando a concentração de autoindutor atinge um nível tal que sua ligação a uma proteína receptora é eficiente, permitindo a ativação transcricional de uma série de genes. Regulação da bioluminescência em Vibrio fischeri Para melhor ilustrar o mecanismo de quorum sensing, descreveremos o fenômeno de bioluminescência

apresentado

por

Vibrio

fischeri.

Nealson et al., (1970) revelaram que o sobrenadante de culturas densas de V. fischeri continha um composto capaz de induzir a luminescência em culturas de baixa densidade, sendo por isso denominado "autoindutor". Este autoindutor (VAI - Vibrio AutoIndutor) foi identificado em 1981, como uma N-(3-oxohexanoil)homoserina lactona (OHHL), enquanto os genes regulatórios e estruturais necessários ao processo de luminescência (regulon lux) foram descritos em 1984, estando localizados em um segmento de DNA de 9 kb. O regulon lux é composto por dois operons que são transcritos em direçoes opostas, sendo separados por uma região intergênica regulatória. O operon da esquerda contém o gene luxR, que codifica o ativador transcricional LuxR, que também atua como receptor do autoindutor. O operon da direita contém o gene luxI, que codifica a OHHL sintase. Abaixo do gene luxI, encontram-se os genes estruturais luxCDABE, que codificam as proteínas necessárias ao desenvolvimento da bioluminescência (subunidades a e b da luciferase - luxA e luxB, a redutase - luxC, transferase - luxD e sintetase - luxE). Assim, em qualquer etapa de seu ciclo de vida, as células de V. fischeri estão produzindo pequenas quantidades do autoindutor (VAI), que se difunde livremente através das membranas da bactéria. Nestes estágios onde a população microbiana ainda é pequena, está ocorrendo a ligação do VAI ao seu receptor, LuxR, no entanto, tal ligação é ainda transiente. No entanto, à medida que a população aumenta, a quantidade de VAI também aumenta, até que atinge uma concentração limiar, que dispara o processo, resultando na ativação da tanscrição dos operons lux. A proteína LuxR é modular, sendo constituída por um domínio C-terminal de ligação ao DNA e um domínio N-terminal de ligação à OHHL. A OHHL, produzida pelo gene luxI, liga-se à

proteína LuxR, ativando-a. Esta quando ativada liga-se ao DNA, em um sítio específico, denominado lux box, que corresponde a uma região de 20 nucleotídeos invertidos repetidos, situada

entre

os

dois

operons

lux.

O complexo VAI-LuxR liga-se ao lux box e estimula a transcrição dos operons, promovendo uma maior síntese de autoindutor, de proteína LuxR e de todo o aparato necessário à luminescência.

Regulação do operon lux pelo autoindutor de V. fischeri

Outras atividades microbianas associadas ao Quorum Sensing Atualmente são conhecidas centenas de espécies microbianas que realizam o processo de quorum sensing, revelando que tal tipo de comunicação resulta em uma série de alterações fenotípicas apresentadas pelas culturas. Dentre as principais atividades microbianas associadas ao quorum sensing temos: - produção de antibióticos - expressão de fatores de virulência - aquisição do estado de competência (a capacidade de captar DNA do meio) - transferência de DNA para outros organismos - fixação de nitrogênio Além destas atividades, cada vez mais está se tornando claro o papel ecológico desempenhado pelo quorum sensing. Sabe-se que os microrganismos sintetizam autoindutores bastante específicos, reconhecidos apenas por membros da mesma espécie. No entanto, pesquisas revelam que organismos de espécies próximas podem sintetizar autoindutores

semelhantes, capazes de interferir no quorum sensing de outros organismos. Por exemplo, Staphylococcus epidermidis, um habitante da microbiota normal, sintetiza autoindutores que interferem no quorum sensing de S. aureus, um microrgnaismo potencialmente patogênico. Acredita-se que este tipo de interferência tenha como principal função impedir ou dificultar a colonização do hospedeiro por organismos invasores. Há alguns anos foi descoberto um segundo tipo de autoindutor, denominado AI-2, que parece estar envolvido em um processo mais "geral" de cominucação microbiana. Este AI-2 seria reconhecido por um grande número de espécies, talvez atuando como uma molécula que sinaliza aos diferentes organismos a presença de outros microrganismos. Este seria um tipo de molécula que realizaria um "censo" geral da população. A descoberta do quorum sensing trouxe novas e interessantes perspectivas para o controle microbiano, especialmente no que se refere ao tratamento de doenças infecciosas.

Controle Microbiano Definições Esterilização: Destruição ou remoção de todas as formas de vida de um objeto ou habitat. Desinfecção: Processo que promove a inibição, morte ou remoção de vários microrganismos patogênicos e saprófitas, sem eliminar todas as formas de vida. Sanitização: Processo que leva à redução dos microrganismos, a níveis seguros, de acordo com os padrões de saúde pública (elimina 99,9% das formas vegetativas). Anti-séptico: Produto que evita a infecção em tecidos, seja inibindo ou matando os microrganismos. Como são aplicados em tecidos vivos, os anti-sépticos são, geralmente, menos tóxicos que os desinfetantes (agentes aplicadas em materiais inanimados). Germicida: mata microrganismos, mas não endosporos. “Cida”: Qualquer agente que promova a morte (ex: bactericida, fungicida, algicida) “Stático”: Qualquer agente que promova a inibição do crescimento (ex: bacteriostático, fungistático) Padrão

de

morte

microbiana

Da mesma forma que no crescimento, a morte microbiana é um evento que ocorre de forma exponencial. Assim, após uma rápida redução do número, a taxa de morte pode tornarse mais lenta, devido à sobrevivência de células mais resistentes. Condições que afetam a atividade de um agente antimicrobiano, especialmente se tal agente é de natureza química. 1. Tamanho da população: Quanto maior a população, maior o tempo necessário à sua eliminação. 2. Natureza da população: Se nesta população de microrganismos existirem endosporos, os quais são muito mais resistente que formas vegetativas, sua eliminação não ocorrerá tão facilmente. No caso de células em diferentes estágios de crescimento - células mais jovens tendem a ser mais suscetíveis que células em fase estacionária. Havendo a presença de membros do gênero Mycobacterium, sua eliminação é mais difícil que de outras bactérias não esporuladas, etc. 3. Concentração do agente: Geralmente, quanto mais concentrado, melhor (exceto álcool). A relação entre a concentração e a eficiência via de regra não é linear. 4. Tempo de exposição: De acordo com normas da OMS, o tempo mínimo de exposição deve ser de 30 minutos. Em casos de agentes esterilizantes, a exposição deve ser tal que a chance de haver sobreviventes é de 1 em 106. 5. Temperatura: Dentro de limites, o aumento da temperatura torna o processo mais eficiente. Para agentes químicos, geralmente o aumento de 1°C da temperatura aumenta em 10 vezes a eficiência do processo, o que também permite a diluição do agente. 6. Condições "ambientais": pH do meio - quando é ácido, favorece a eliminação térmica; presença de matéria orgânica - dificulta a ação do produto (necessidade de lavagens dos materiais antes do controle por agentes químicos), seja por proteger o microrganismo ou competir pelo produto em uso. Altas concentrações de açúcar, proteínas ou lipídeos diminuem a penetrabilidade do calor, enquanto o sal pode aumentar ou diminuir a resistência ao calor. A consistência do material ou solução também interfere. Controle microbiano por agente físicos Os principais agentes físicos que promovem o controle microbiano são: Calor, Filtração e Radiações. Eventualmente, outros agentes, tais como as baixas temperaturas, dessecação, podem ser utilizados.

CALOR - Uso disseminado desde épocas remotas, correspondendo ainda um dos agentes físicos mais práticos e eficientes para a esterilização e/ou desinfecção. O calor pode ser empregado sob duas formas: seco e úmido, tendo a vantagem de apresentar, basicamente, apenas 2 parâmetros a serem controlados: tempo e temperatura. Para todos os organismos são definidas as temperaturas cardeais, ou seja, as temperaturas mínima, máxima e ótima de crescimento. Assim, quando estes são submetidos a temperaturas superiores à temperatura máxima de crescimento, os efeitos letais tornam-se aparentes. A morte é um fenômeno que ocorre de forma exponencial, sendo proporcional apenas à concentração inicial da população. Já o tempo para uma determinada fração da população a ser morta é independente da população inicial. Processos empregando calor: A morte se dá pela oxidação de constituintes celulares e desnaturação de proteínas e ácidos nucléicos. Não é a melhor maneira de utilização do calor, uma vez que o ar é menos condutor da temperatura que a água. Calor seco Incineração (E): processo drástico de eliminação de microrganismos, que destrói o produto. Ao rubro (E): processo onde os materiis são levados à incadescência, promovendo a destruição de todos os microrganismos. Flambagem (D): processo onde o material é submetido diretamente ao fogo, seja seco ou embebido em álcool. Bastante utilizado na desinfecção de alças de vidro. Estufa esterilizante (E: 160†C/2 hs ou 180°C/1 h). Amplamente utilizado para vidrarias e outros materiais. Calor úmido - Como mencionado anteriormente, é um processo mais eficiente devido ao maior poder de penetração do vapor d’água. A morte é decorrente da desnaturação de ácidos nucléicos e proteínas, podendo também romper membranas. Além disso, o vapor tem maior capacidade de romper as pontes de hidrogênio. Autoclave (E - 121°C/20 min./1 atm) - Destrói esporos, em um pequeno volume, em 10 a 12 minutos. Com volumes maiores, o tempo é maior (5 litros => 70 minutos). Frequentemente são utilizados indicadores da eficiência de esterilização, por exemplo, ampolas contendo esporos de B. stearotermophilus ou de Clostridium PA3679, os quais são inoculados em meios

de cultura após o processo de esterilização. Caso haja o desenvolvimento de células vegetativas, o processo não foi realizado adequadamente, uma vez que não houve a esterilzação. Água

em

ebulição

(D

-

100°C/30

min.)

A título de comparação, a eliminação de esporos de C. botulinum pela fervura, requer cerca de 5,5 horas. Por outro lado, a 120°C, estes esporos são eliminados após 4 a 5 minutos. Pasteurização (D - 62,8°C/30 min - pasteurização lenta, ou 71,7°C/15 seg pasteurização rápida) UHT (E): 141°C/2 segundos - processo bastante utilizado para o leite e outros alimentos líquidos. FILTRAÇÃO - Processo muito útil na esterilização de materiais termolábeis, sendo empregado para líquidos e gases. Estes filtros são geralmente compostos por celulose, acetato, policarbonato, teflon, ou outro material sintético. Embora o diâmetro dos poros possa variar, os mais utilizados são aqueles de 0,2 µm, que removem os microrganismos (exceto vírus) das soluções e do ar. Dentre os principais tipos de filtros podemos citar: Filtros de profundidade: Correspondem aos filtros mais antigos, constituídos de malha fibrosa ou granular, à base de papel, asbestos ou fibra de vidro, arranjados de forma a criar uma série de camadas aleatórias sobrepostas, formando pequenos canais sinuosos. Assim, os microrganismos ficam retidos nas malhas e/ou adsorvidos à superfície do material. Estes filtros são feitos também de terra de diatomáceas (Berkefield) ou porcelana (Chamberlain). Na prática, são usados como pré-filtros, para a remoção de partículas maiores. Muitas vezes são também usados na filtração de ar. Membranas Filtrantes: Correspondem ao tipo mais comum de filtro esterilizante, em microbiologia. São membranas porosas de acetato de celulose, nitrocelulose ou policarbonato, tendo espessura de ≈ 0,2 mm, contendo poros variando de ≈ 0,1 a 0,5 µm de diâmetro, que ocupam cerca de 80 a 85% da membrana. Filtros Isopore® (nucleopore): Correspondem a filmes extremamente delgados de policarbonato (10 µm de espessura) que são tratados com radiação nuclear, seguida de cauterização (marcação) química. A radiação provoca danos localizados na membrana e o tratamento químico aumenta essas falhas, formando orifícios, cujo tamanho pode ser controlado pela força da solução cauterizadora e pelo tempo de tratamento. Estes filtros

funcionam como verdadeiras peneiras, removendo todas as partículas maiores que os orifícios. Têm, entretanto, baixa porosidade, sendo muito usados na preparação de amostras para a microscopia de varredura, onde os organismos são retidos no filtro, sendo mantidos em um plano uniforme, no topo do filtro. O ar também pode ser filtrado, em fluxos laminares contendo filtros HEPA (High Efficiency Particulate Air filters), que removem 99,97% de partículas de 0,3 µm.

Bactérias retidas na superfície de um filtro do tipo Isopore® (Adaptado de Prescott et al., Microbiology, 1997)

RADIAÇÕES - Ionizante e não ionizante Radiação Não-Ionizante: A radiação ultravioleta (de 4 a 400 nm - sendo 260 nm o comprimento mais eficiente) é bastante letal, mas exibe baixa penetrabilidade, não atravessando vidros, filmes sujos e outro materiais. Assim, a radiação UV é extremamente eficiente na eliminação de microrganismos presentes em superfícies. Como sua maior eficiência se dá a 260 nm, que corresponde ao comprimento de onda onde se dá a maior absorção pelo DNA, a radiação UV afeta primariamente este tipo de molécula. Sua ação é principalmente decorrente da formação de dímeros de pirimidinas (timina), efeito este que pode ser revertido por sistemas de fotorreativação (enzima de reparo ativada pela luz) ou por sistema de reativação independente da luz (polimerase). Por outro lado, não podem ser descartados outros efeitos deletérios do UV, uma vez que quando a 340 nm, observa-se dano celular, sem estar primariamente relacionado às mutações, uma vez que neste comprimento de onda os ácidos nucléicos não têm mais uma grande capacidade de absorver este tipo de radiação. Radiação Ionizante: Radiações de pequeno comprimento de onda, portanto, de altíssima energia e penetrabilidade. Os dois principais tipos são a radiação gama e os Raios X. Estas, são bastante eficientes, uma vez que promovem a ionização de átomos, fazendo-os

perderem elétrons. Como consequência são gerados radicais livres extremamente reativos, que podem destruir pontes de hidrogênio, duplas ligações, estruturas em anel. Quando na presença de oxigênio, geram radicais hidroxila livres, absolutamente tóxicos para as células. A radiação gama é originada geralmente a partir de fontes de

60

Co ou

137

Ce.

Estas radiações vêm sendo amplamente utilizadas em produtos termolábeis, tais como plásticos e alguns tipos de alimentos (frutas, vegetais, alimentos marinhos). Nos alimentos seu uso é interessante, uma vez que inativam enzimas autocatalíticas que participam do processo de degradação natural. Outros

agentes

Físicos

de

controle

Baixas temperaturas: A refrigeração ou o congelamento são amplamente utilizados no controle microbiano de alimentos e produtos biológicos, pois levam a uma diminuição ou interrupção do metabolismo. Como, na maioria dos casos, os microrganismos patogênicos ao homem são mesofílicos, estas baixas temperaturas são eficientes no controle. Entretanto, deve-se ter cuidado porque células de Clostridium botulinum, quando incubadas a 5°C, são ainda capazes de produzir e secretar a toxina do tipo E. Dessecação: Liofilização ou dessecamento natural, que atua diferentemente nos organismos, dependendo do tipo de meio, do material dessecado e da intensidade do processo. Via de regra, os cocos Gram negativos são mais sensíveis que os Gram positivos, sendo M. tuberculosis um dos exemplos clássicos de organismo resistente à dessecação (várias semanas em escarro seco). Pressão osmótica: conservas com altos teores de sal ou açúcar. Controle de Microrganismos por Agentes Químicos Durante muito tempo foram mais empregados em processos de desinfecção e antisepsia, entretanto, atualmente estes vem sendo cada vez mais amplamente utilizados em processos de esterilização. Cuidados prévios: lavagem adequada do material, garantia de pleno contato com o agente. Características de um agente químico ideal: boa atividade antimicrobiana, toxicidade seletiva, solubilidade, estabilidade, inocuidade, não interação com a matéria orgânica, temperatura de ação adequada, alto poder de penetração, sem poder corrosivo ou tintorial,

desprovido

de

ação

danosa

ao

meio

ambiente.

Principais Tipos de Agentes Químicos: 1) Compostos orgânicos: Fenóis e derivados (cresóis (metil-fenol), xilenóis): Primeiros a serem usados (Lister, 1867 - salas de cirugia). O fenol não é mais usado como desinfetante ou anti-séptico devido à sua toxicidade para os tecidos. Os derivados fenólicos (hexaclorofeno, hexilresorcinol) são empregados principalmente como anti-sépticos ou desinfetantes hospitalares. Estes atuam desnaturando proteínas e rompendo membranas. São tuberculocidas, efetivos na presença de matéria orgânica, permanecem ativos por muito tempo. Entretanto tem odor desagradável e são irritantes para pele. Hexaclorofeno -associação de fenol a halogênio (Cl) que é bastante eficaz, sendo bastante usado em pastas dentifrícias e sabões. No passado, pesquisas indicaram que tal composto era cumulativo e carcinogênico. Álcoois: Muito usados, efetivos, confiáveis e baratos, atuando como bactericidas, fungicidas e contra vírus envelopados. Os mais usados são etanol e isopropanol, nas concentrações entre 70 e 80%. Atuam desnaturando proteínas e dissolvendo lipídeos de membrana. Compostos Quaternários de Amônio: são detergentes catiônicos, moléculas orgânicas derivadas de gorduras, atuando como umectantes e emulsificadores. Apenas os detergentes catiônicos são detergentes efetivos, que desnaturam proteínas (Ex: cloreto de benzalcônio, que mata a maioria das bactérias). 2) Halogênios: Iodo: anti-séptico para a pele a 2%, ou em solução água-etanol de iodeto de potássio, para procedimentos pré-operatórios. Eficaz contra bactérias, fungos, vírus e protozoários parasitas. Atua oxidando componentes celulares e iodinando proteínas. Em concentrações elevadas elimina esporos. Tem como desvantagens: danos à pele, manchar e alergênico. Iodóforos: Complexação de iodo a carreador orgânico (agentes tensioativos, como a PVP). São solúveis em água, estáveis, sem propriedades tintoriais, liberando o iodo lentamente, minimizando a irritação cutânea. Usado na assepsia pré-operatória e também como desinfetante.

Cloro: Muito utilizado no tratamento de águas e nas indústrias de laticínios e alimentos. Pode ser aplicado na forma de gás, hipoclorito de sódio ou de cálcio, que geraácido hipocloroso e então O2, promovendo a oxidação de materiais celulares e causando a morte em cerca de 30 minutos. Eficaz contra fungos, bactérias e vírus, com a desvantagem ser descorar alguns materiais. É eficiente, barato, de fácil uso, mas altamente reativo com a matéria orgânica. Como desvantagem, o uso do cloro em águas pode produzir pequenas quantidades de compostos organoclorados, particularmente o trihalometano (THM), um possível agente carcinogênico. Como alternativa pode ser usada a cloramina (monocloramina), que reduz drasticamente os níveis de THM. A monocloramina pode ser gerada diretamente na água pela adição simultânea de amônio e cloro ou hipoclorito. O tratamento da água presente nas torres de resfriamento de aparelhos ar condicionado é

extremamente

importante

para

o

controle

de

Legionella

pneumophila.

3) Metais Pesados: Foram muito usados no passado como germicidas (prata, mercúrio, zinco e cobre), sendo atualmente substituídos por compostos menos tóxicos. Os mais usados são compostos orgânicos de mercúrio, prata, cobre e zinco. Nitrato de prata: usado em solução 1%, para prevenir a oftalmia neonatorum, sendo substituído em vários hospitais pela eritromicina (que protege contra Chlamydia também). Temos ainda o Mercurocromo e mertiolate, usados como como preservantes de soros e vacinas. O sulfato de cobre é usado na desinfecção de águas, especialmente contra algas. Estes atuam combinando-se com proteínas, geralmente nos grupos SH, inativando-as. 4) Outros Peróxidos: principalmente água oxigenada, sobre organismos anaeróbios, atuando pela sua ação oxidante. Ozônio: Vem sendo empregado na desinfecção de água, com sucesso, na Europa e Estados Unidos. Embora seja um tratamento mais caro, tem a vantagem de não produzir compostos organoclorados. Por outro lado, devido à sua instabilidade, a água submetida a este tipo de tratamento está mais sujeita à contaminação que quando clorada. Corantes: dividem-se em dois grupos, acridina (que interage com o DNA) e derivados de rosanilina (Cristal violeta, verde malaquita), que atuam inibindo G+, Candida e Trichomonas.

Tem ação aparentemente ao nível da parede celular das bactérias.

Comparação da eficiência de diferentes anti-sépticos (Adaptado de Prescott et al., Microbiology, 1997)

Agentes Químicos Esterilizantes: Aldeídos: Formaldeído e Glutaraldeído, moléculas muito reativas, combinam-se com proteínas, inativando-as. Formaldeído 8% dissolvido em água ou álcool (irritante e deixa resíduos) e glutaraldeído 2% (menos irritante). Em 12 horas, destroem esporos. Gases esterilizantes: Óxido de etileno, atua pela interação com proteínas, com alta capacidade de penetração. Como é explosivo, é dissolvido em misturas de 10 a 20% com CO2 ou freon. Importante a presença de umidade no ambiente e também temperatura. Condições: 38°C/5-8 hs ou 54°C/3-4 hs, com 50% de umidade e EtO de 400 a 800 mg/litro. Betapropiolactona: eventualmente usado. Não penetra tão bem e pode ser carcinogênico. Atua em concentrações muito menores que o EtO. Abaixo temos uma tabela, listando alguns dos principais agentes químicos utilizados no controle microbiano.

Antibióticos e Quimioterápicos Introdução Os antibióticos são produtos de enorme importância não apenas na área de saúde, como também na economia, visto que apenas nos Estados Unidos, cerca de 100.000 toneladas são produzidas anualmente. Embora aproximadamente 8000 substâncias com atividade antimicrobiana sejam conhecidas e, a cada ano, centenas de novas substâncias sejam descobertas, pouquíssimas são efetivamente aproveitadas e utilizadas como agentes antimicrobianos, visto que muitas destas não atendem aos requisitos mínimos para seu emprego terapêutico. Paralelamente, não podemos deixar de mencionar o crescente problema em relação ao surgimento de espécies bacterianas resistentes aos diferentes antibióticos. Este talvez corresponda ao principal desafio dos pesquisadores, visto que a multirresistência vem se tornando diariamente mais disseminada nas populações microbianas, sejam patogênicas ou não. Mais recentemente, outro aspecto que vem sendo cada vez mais levado em consideração refere-se à ocorrência dos biofilmes e sua importância na terapêutica antimicrobiana, pois o conhecimento sobre a ocorrência de biofilmes microbianos em nosso organismo levou a uma quebra do paradigma de tratamento das doenças infecciosas. Certamente, para que os antibióticos possam ser empregados de forma mais eficaz, será necessário um maior conhecimento acerca dos biofilmes formados naturalmente em nosso organismo. Pois, somente a partir da elucidação da ecologia dos biofilmes naturais do homem,

teremos maiores chances de tratar de forma adequada as várias doenças infecciosas.

Conceitos • Agente Antimicrobiano: Composto químico que mata ou inibe o crescimento de microrganismos, podendo ser natural ou sintético. • Agentes Quimioterápicos (Antimicróbicos): Agentes químicos, naturais ou sintéticos, usados no tratamento de doenças. Atuam matando ou inibindo o desenvolvimento dos microrganismos, em concentrações baixas o suficiente para evitar efeitos danosos ao paciente. • Antibióticos: Grupo de agentes quimioterápicos (maioria), que constituem-se em produtos microbianos ou derivados. São produtos do metabolismo secundário (quando a célula entra em fase estacionária), não essenciais para o crescimento ou reprodução, sendo sua síntese dependente da composição do meio (podem ser super produzidos). São geralmente compostos complexos, cuja síntese envolve várias etapas enzimáticas, sendo as enzimas reguladas separadamente das do metabolismo primário. Via de regra, a produção de antibióticos está associada ao fenômeno de quorum sensing. • Quimioterápico: Agente químico sintético, exibindo as mesmas atividades de um antibiótico.

Histórico dos antibióticos e descobertas relacionadas Paul Ehrlich (1854 - 1915): Desenvolveu o conceito de toxicidade seletiva, indicando que determinado agente exibia uma ação danosa aos microrganismos, sem afetar as células do hospedeiro. Tal conceito tem importante reflexo prático, pois indica se um agente pode, teoricamente, ser útil no tratamento de doenças infecciosas. Este pesquisador trabalhava com corantes e técnicas de coloração de microrganismos, quando verificou que alguns compostos coravam os microrganismos, mas não os tecidos animais. Esperava encontrar um corante tóxico aos microrganismos ("bala mágica"). 1904 - Uso prático do vermelho de tripan, composto ativo contra o tripanossoma que causava a doença africana do sono. Ehrlich & Hata: realização de testes com compostos arsenicais, em coelhos com sífilis. Descobriram que o composto 606, arsfenamida, era ativo => Em 1910, foi lançado o medicamento Salvarsan (nome comercial da arsfenamida), para o tratamento da sífilis.

1927 - Na I. G. Farbenindustrie (Bayer) - G. Domagk: testava corantes e outros compostos químicos, quanto à ação em microrganismos e toxicidade em animais. 1935 - Vermelho Prontosil: inócuo para animais, protegendo camundongos contra estafilococos e estreptococos patogênicos. Neste mesmo ano, foi descoberto que o prontosil era clivado no organismo, originando a sulfanilamida como um dos produtos. Na realidade, a droga eficaz era a sulfanilamida. 1939 - Nobel para Domagk 1896 - E. Duchesne: descobriu a penicilina, mas raramente tal pesquisador é citado, pois seus achados nunca foram devidamente publicados ou notificados, sendo esquecids durante vários anos. A. Fleming: Busca de um tratamento eficaz para os feridos na II Guerra Mundial. Foi o "segundo" descobridor da penicilina e tentou, sem sucesso, purificá-la em quantidades suficientes para ser utilizada como medicamento. 1939 - H. Florey & E. Chain - testavam atividade bactericida de várias substâncias (lisozima, sulfonamidas). Obtiveram a cultura de fungo isolada inicialmente por Fleming, passando a trabalhar na purificação da penicilina. Injetarama penicilina em camundongos infectados com estafilococos ou estreptococos e observaram que quase todos sobreviveram. (Trabalho publicado em 1940). 1945 - Nobel para Florey, Chain e Fleming 1944 - S. Waksman: descobrimento da estreptomicina (Streptomyces griseus), a partir do teste de cerca de 10.000 linhagens de bactérias e fungos do solo. 1952 - Nobel para Waksman. Até 1953 - Isolamento de microrganismos produtores de cloranfenicol, neomicina, terramicina e tetraciclina. A partir de 1953 - a indústria investiu centenas de milhares de dólares na busca de novas drogas antimicrobianas, sendo que tal linha de pesquisa perdura até hoje em todo o mundo,

empregando

Características

diversos

gerais

tipos

das

drogas

de

abordagens.

antimicrobianas

• Toxicidade Seletiva: característica que todo antimicrobiano deveria apresentar, pois reflete-se na capacidade de atuar seleivamente sobre o microrganismo, sem provocar danos ao hospedeiro. Esta é expressa em termos do índice terapêutico: relação B/A, onde A) Dose terapêutica: concentração p/ tratamento B)

Dose

tóxica:

concentração

a

partir

da

qual

é

tóxica

Drogas que atuem sobre funções microbianas inexistentes em eucariotos geralmente tem maior toxicidade seletiva e índice terapêutico (Penicilina). • Espectro de ação: Refere-se à diversidade de organismos afetados pelo agente. Geralmente os antimicrobianos são de pequeno ou de amplo espectro. Atualmente, uma série de laboratórios vem trabalhando em busca de isolar e purificar antimicrobianos de espectro restrito, que atuam especificamente sobre um ou um pequeno número de microrganismos. No entanto, atualmente os antibióticos comercializados enquadram-se nas categorias de pequeno e amplo espectro de ação.

Exemplos de diferentes drogas antimicrobianas, classificadas de acordo com o espectro de ação. (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

•

Quanto

à

síntese:

Microbiana,

química

ou

semi-sintética

Microbiana - geralmente por uma ou poucas bactérias (actinomicetos) e vários tipos de fungos filamentosos. Geralmente correspondem a produtos do metabolismo secundário. Química - Sulfonamidas, Trimetoprim, Cloranfenicol, Isoniazida além de outros antivirais e antiprotozoários.

Semi-sintéticos - são antibióticos naturais, modificados pela adição de grupamentos químicos, tornando-os menos suscetíveis à inativação pelos microrganismos (ampicilina, carbencilina,

meticilina).

• Quanto à ação: "státicos" ou "cidas" Os "cidas" podem ser "státicos" dependendo da concentração, ou do tipo de organismo. Os

"staticos"

tem

sua

ação

vinculada

à

resistência

do

hospedeiro.

• CMI e CML: 2 parâmetros que indicam a eficiência da droga. A droga "cida" geralmente elimina o agente em concentrações de 2 a 4 vezes maior que a "stática", sendo o inverso falso. • Atingir concentrações efetivas nos tecidos e entrar em contato com o microrganismo. •

Não

alterar

os

mecanismos

naturais

de

defesa

do

hospedeiro.

Mecanismos de ação dos antimicrobianos Vários são os possíveis alvos para os agentes antimicrobianos. O conhecimento dos mecanismos de ação destes agentes permite entender sua natureza e o grau de toxicidade seletiva de cada droga.

Exemplos das principais estruturas ou etapas metabólicas afetadas por antibióticos (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

1) Inibição da síntese da Parede Celular: estes agentes antimicrobianos correspondem

aos

mais

seletivos,

apresentando

um

elevado

índice

terapêutico.

penicilinas, ampicilina e cefalosporinas: contém em sua estrutura um anel b-lactâmico, que interage com proteínas denominadas PBPs (Penicillin Binding Protein), inibindo a enzima envolvida na transpeptidação, responsável pela ligação entre as cadeias de tetrapeptídeos do peptideoglicano. Com isso, há o impedimento da formação das ligações entre os tetrapeptídeos de cadeias adjacentes de peptideoglicano, ocasionando uma perda na rigidez da parede celular. Acredita-se também que tais drogas podem atuar promovendo a ativação de enzimas autolíticas, resultando na degradação da parede.

Mecanismo de ação dos antibióticos b-lactâmicos (Adaptado de Atlas, R.M., Principles of Microbiology, 1997)

bacitracina: Interfere com a ação do carreador lipídico que transporta os precursores da parede pela mebrana. Resulta na não formação das ligações entre o NAM e NAG. vancomicina: liga-se diretamente à porção tetrapeptídica do peptideoglicano. É ainda a droga de escolha para linhagens resistentes de S. aureus. 2) Ligação à Membrana Citoplasmática: são agentes antimicrobianos que muitas vezes

exibem

menor

grau

de

toxicidade

seletiva.

polimixinas: Ligam-se à membrana, entre os fosfolipídeos, alterando sua permeabilidade (detergentes). São extremamente eficientes contra Gram negativos, pois afetam tanto a membrana

citoplasmática

como

a

membrana

externa.

Ionóforos: Moléculas hidrofóbicas que se imiscuem na Membrana citoplasmática, permitindo a difusão passiva de compostos ionizados para dentro ou fora da célula.

Exemplo de um antibiótico que atua como ionóforo (Adaptado de Atlas, R.M., Principles of Microbiology, 1997)

3) Inibição da síntese de ácidos nucléicos: seletividade variável. Novobiocina: se liga a DNA girase, afetando o desenovelamento do DNA, impedindo sua replicação. quinolonas: Inibem a DNA girase, afetando a replicação, transcrição e reparo. Rifampicina: Ligação à RNA polimerase DNA-dependente, bloqueando a transcrição.

4) Inibição da tradução: São geralmente bastante seletivos. Correspondem a um dos principais grupos de agentes antimicrobianos, uma vez que a síntese protéica corresponde a processo altamente complexo, envolvend várias etapas e diversas moléculas e estruturas.

Diferentes etapas da tradução que podem ser afetadas por agentes antimicrobianos (Adaptado de Atlas, R.M., Principles of Microbiology, 1997)

estreptomicina e gentamicina: Liga-se à subunidade ribossomal 30S, bloqueando-a e promovendo erros na leitura do mRNA. Interferem com a formação do complexo de iniciação. tetraciclina: Liga-se à subunidade ribossomal 30S (sítio A), impedindo a ligação do aminoacil-tRNA. cloranfenicol: Liga-se à subunidade ribossomal 50S e inibe a ligação do tRNA e da peptidil transferase, inibindo a elongação. eritromicina: Liga-se à subunidade ribossomal 50S e inibe a elongação.

Exemplos de drogas que interferem com a síntese protéica (Adaptado de Atlas, R.M., Principles of Microbiology, 1997)

5) Antagonismo metabólico: geralmente ocorre por um mecanismo deinibição competitiva. Sulfas e derivados: inibição da síntese do ácido fólico, pela competição com o PABA. Trimetoprim: bloqueio da síntese do tetrahidrofolato, inibindo a dihidrofolato redutase.

Similaridade estrutural entre a sulfanilamida e o PABA (importante precursor da síntese de purinas) (Adaptado de Atlas, R.M., Principles of Microbiology, 1997)

Isoniazida: afeta o metabolismo do NAD ou piridoxal, inibe a síntese do ácido micólico "fator corda". Resistência microbiana Este tema tornou-se um motivo de preocupação crescente entre os profissionais da área de saúde, pois a cada ano observamos o aumento de linhagens resistentes aos mais diversos agentes antimicrobianos.

Proporção

de

bactérias

indivíduos

normais,

fecais,

resistentes

antibióticos.

isoladas aos

de

diferentes

Aumento

na

proporção

de

linhagens

de

N.

gonorrhoaea resistentes à penicilina.

(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

A resistência microbiana aos antimicrobianos pode ser de dois tipos: • Natural: ausência da estrutura, ou via metabólica alvo.

• Adquirida: Através de mutações espontâneas e seleção, ou por recombinação após transferência de genes. Dentre os principais mecanismos de resistência podemos citar: Impermeabilidade à droga: Muitas bactérias Gram negativas são resistentes à penicilina G por serem impermeáveis à droga, ou por apresentarem alterações em proteínas de ligação à penicilina. No caso das sulfonamidas, o microrganismo pode também apresentar uma menor permeabilidade à droga.

Inativação: muitas drogas são inativadas por enzimas codificadas pelos microrganismos. Por exemplo, a penicilinase (b-lactamase) é uma enzima que cliva o anel b-lactâmico inativando a droga. Outras drogas podem ser inativadas em decorrência de modificações introduzidas pelo microrganismo, tais como a adição de grupamentos químicos. Assim, muitos microrganismos são capazes de promover a fosforilação ou acetilação de antibióticos. Modificação de enzima ou estrutura alvo: Por exemplo, alterações na molécula do rRNA 23S (no caso de resistência à eritromicina e cloranfenicol), alteração da enzima, no caso de drogas que atuam no metabolismo, ou uso de vias metabólicas alternativas. Bombeamento para o meio: Efluxo da droga - No caso da resistência às tetraciclinas, em bactérias entéricas.

Processos de transferência de genes entre bactérias Introdução Sabemos que, embora as mutações sejam responsáveis pela expressão de várias novas características por uma célula, muitos dos fenótipos expressos pelos microrganismos procarióticos são decorrentes da aquisição de novos fragmentos de DNA, por meio de processos de transferência horizontal de genes. Três processos de transferência genética entre bactérias são bastante conhecidos: transformação, conjugação e transdução. Há ainda um quarto processo, a conversão lisogênica, que envolve a transferência de DNA de uma partícula viral para uma bactéria, sendo um evento importante na aquisição de genes muitas vezes associados à virulência. Transformação - É definida como um processo de incorporação de DNA na forma livre, geralmente decorrente da lise celular. A partir de seu descobrimento, foi demonstrado formalmente que o DNA era a molécula envolvida na hereditariedade (experimentos iniciados por F. Griffith, 1928). Várias bactérias Gram positivas e negativas são naturalmente transformáveis, entretanto, dentro de um gênero, nem todas as espécies o são. Na natureza, o processo ocorre quando uma célula sofre lise, liberando seu DNA. Este, por ser de grande tamanho tende a sofrer quebras, originando centenas fragmentos de aproximadamente 15 kb (o equivalente a cerca de 15 genes, em Bacillus subtilis). Como uma célula absorve poucos fragmentos, apenas uma pequena proporção de genes podem ser transferidos.

Inicialmente, para que o processo ocorra, é necessário que a cél. encontre-se competente, isto é, deve apresentar sítios de superfície para a ligação do DNA da célula doadora e apresentar a membrana em uma condição que permita a passagem deste DNA. Esta propriedade é, provavelmente, uma característica inerente de certas linhagens e, ao que parece, envolve o mecanismo de quorum sensing. O estabelecimento da competência é um fenômeno controlado, envolvendo a participação de diferentes proteínas (proteína de ligação ao DNA, presente na membrana, autolisinas, nucleases), sendo um processo variável entre os microrganismos. Aparentemente, o número de sítios disponíveis para a ligação do DNA é limitado. Esta captação parece estar relacionada a uma pequena sequência, de 10 a 12 pares de bases, presente no DNA exógeno. Em Haemophilus, foi demostrada a presença de uma proteína que reconhece e liga-se a uma sequência 5’ - AAGTGGGTCA - 3’, muito comum no genoma deste microrganismo, garantindo que somente ocorrerá a captação de DNA de espécies muito similares. A competência é um processo que depende de várias condições distintas nos diferentes microrganismos. Sabe-se que a fase de crescimento e as condições ambientais desempenham um papel de extrema importância no processo. Além destes, a temperatura e a concentração de cátions também influenciam a eficiência do processo. A captação do DNA também é diferente entre Gram positivos (G+) e Gram negativos (G-): Nas G+ o DNA é captado como dupla hélice e absorvido como fita simples, sendo uma das fitas degradadas. Nas G-, o DNA é absorvido como fita dupla, embora apenas uma das fitas participe do processo de recombinação. Independente do tipo celular, a ligação do DNA à célula é mais eficiente quando está como fita dupla. Ligação do DNA: inicialmente é reversível, tornando-se irreversível depois. As células competententes ligam o DNA com muito mais eficiência que células não competentes (1000 vezes mais). Streptococcus pneumoniae é capaz de ligar apenas cerca de 10 moléculas de DNA de dupla fita, de 15 a 20 kb. Quando são absorvidas, como DNA de fita simples, estas passam para cerca de 8 kb. Em Haemophilus influenzae, é necessário que o DNA tenha uma sequência específica de

11

pb,

para

que

haja

a

ligação

irreversível

e

o

DNA

seja

captado.

Integração do DNA: O DNA liga-se a proteínas na superfície celular, sendo em seguida absorvido ou tendo uma de suas fitas degradadas por nucleases antes da absorção. À medida que o DNA é absorvido no interior da célula, este se associa a proteínas de ligação ao DNA de fita simples, protegendo-o de degradação. A proteína RecA também participa deste processo,

associando-se à fita e promovendo a recombinação. Há então a degradação do que resta da fita simples e formação de um DNA híbrido, que na replicação originará uma molécula parental e outra recombinante.

Esquema dos eventos envolvidos na transformação em Streptococcus, um organismo Gram positivo. O autoindutor (1) ao encontrar o receptor (2) interage com este, promovendo a ativação de vários genes (3, 4 e 5) dentre eles as autolisinas, nucleases e proteína de ligação ao DNA. Uma das fitas do DNA passa a ser captada pela célula, enquanto a outra é degradada (6). Ao penetrar na célula a fita simples é protegida por proteínas. Caso este DNa encontre uma região complementar, a proteína RecA auxiliará sua recombinação com o DNA endógeno (7). Conjugação - Processo de transferência de DNA de uma bactéria para outra, envolvendo o contato entre as duas células (descoberta por Tatum & Lederberg, 1946). A conjugação está associada à presença de plasmídeos de natureza F. Estes plasmídeos contêm

genes que permitem a transferência do DNA plasmidial de uma célula para outra ou, em outras palavras, a capacidade conjugativa. Quando a célula porta um plasmídeo de natureza F é denominada F+, doadora, ou macho, enquanto células desprovidas de tais plasmídeos são denominadas F-, receptoras, ou fêmeas. A capacidade conjugativa está associada à presença de determinados genes localizados em um operon denominado tra. Estes genes conferem uma série de características envolvidas na conjugação tais como a síntese do pilus F, responsável pelo reconhecimento e contato entre as células, assim como a transferência do DNA plasmidial. Eventualmente, os plasmídeos podem ser integrados no cromossomo, sendo este processo mediado por pequenas seqüências de DNA denominadas IS (insertion sequences). As células apresentados tais plasmídeos integrados são denominadas Hfr (do inglês High Frequency of Recombination). Quando integrados, esses plasmídeos podem mobilizar a transferência de genes cromossomais também.

Exemplo de um plasmídeo do tipo F

Em gram negativos, a conjugação pode ser de dois tipos: entre células F+ e F-, resultando em duas células F+ e entre células Hfr e F-, resultando em uma célula Hfr e outra F. Nos dois processos, acredita-se que o mecanismo provável de transferência do DNA seja pelo círculo rolante, onde apenas uma das fitas é transferida, sendo a fita complementar sintetizada pela célula receptora. Provavelmente, o estímulo para o disparo do processo seja o contato das células. Assim, a conjugação envolve a passagem de DNA de uma célula F+ para outra F-, que torna-se então F+ também.

Quando o plasmídeo encontra-se incorporado ao cromosso, a conjugação passa a envolver a transferência de genes cromossomais, sendo que nestes casos, a célula receptora permanece F-, porque a região tra é a última a ser transferida, o que raramente ocorre na natureza. Nestes casos, passam grandes blocos de DNA da célula Hfr para a receptora, promovendo extensas recombinações.

(b) (a)

(c) (d)

Esquema dos eventos associados à conjugação entre células F+ e F-.

Eventos associados à conjugação entre uma célula Hfr e outra F-. Observe que a célula F- permanece como receptora, uma vez que a região tra normalmente não é transferida.

Transdução: (Lederberg & Zinder, 1952) transferência mediada por vírus, podendo ser generalizada (qualquer fragmento de DNA) ou especializada (determinados genes, passados por fagos temperados). Transdução generalizada: Descoberta em Salmonella typhimurium com o fago P22, embora este processo também ocorra em outras bactérias, tais como E. coli. Este tipo de processo requer a ocorrência de um ciclo lítico, onde eventualmente pode haver o empacotamento de fragmentos de DNA da célula hospedeira, gerando partículas denominadas partículas transdutoras, que correspondem ao capsídeo viral contendo em seu interior DNA bacteriano. Embora não possam ser descritas como vírus, as partículas transdutoras exibem a capacidade de adsorção à superfície de outras células bacterianas. A frequência com que um determinado gene é transferido é baixa uma vez que cada partícula transdutora leva apenas um determinado fragmento de DNA (1 em 106 ou 108 cél. recebem um determinado gene).

Transdução generalizada: durante um ciclo lítico, pode haver a incorporação de DNA bacteriano no capsídeo viral. Este DNA poderá ser transferido para outra bactéria, pois os processos de adsorção e injeção de DNA dependem da estrutura do vírus, independente do tipo de DNA contido em seu interior. Transdução especializada: Evento raro, embora bastante eficiente. O exemplo melhor conhecido e primeiramente descoberto foi a transferência de um genes que codificam produtos envolvidos

na

degradação

de

galactose

pelo

fago

l

de

E.

coli.

A etapa inicial no processo corresponde à infecção e lisogenização do fago, que ocorre em sítios específicos do genoma. Neste caso, a integração do fago ocorre adjacente ao conjunto de genes envolvidos na utilização de galactose. Pela ação de algum indutor (ex: UV) há a separação do fago do genoma (integração reversa), que normalmente ocorre perfeitamente. Entretanto, em alguns casos, essa separação é defeituosa, promovendo a remoção de genes bacterianos e deixando parte do genoma viral na célula. Essas partículas podem ser de dois tipos: aquelas que carregam genes gal e outras que carregam genes bio. Aquelas partículas levando genes gal são denominadas ldgal (defectivas, contendo o gene gal), porque são incapazes de formar partículas virais maduras (porque deixam no hospedeiro o gene que codifica a proteína integrase). Quando estas partículas infectam novas células, juntamente com

fagos normais (helper), pode haver a transferência de genes gal, a partir da infecção e lisogenização dos dois fagos.

Transdução especializada: este processo é dependente da ocorrência de um ciclo lisogênico. O fago integra seu DNA ao DNA bacteriano e após um determinado período de tempo e de acordo com certos estímulos, este fago pode iniciar um ciclo lítico. Caso a excisão do DNA viral ocorra de maneira defeituosa, poderá haver a transferência de um pequeno fragmento de DNA bacteriano (porque parte do DNA viral ficará incorporado ao genoma bacteriano). Este vírus "defeituoso" poderá transferir o DNA bacteriano para outras células. Conversão lisogênica: Transferência de genes de fagos para bactérias. A própria lisogenização torna a bactéria imune a outras infecções por este fago, mas além disso, outros fenótipos podem ser adquiridos. O exemplo mais clássico consiste na conversão de células

atoxigênicas de Corynebacterium diphtheriae em toxigênicas, pelo fago ß. Assim, a bactéria recebe um gene que codifica uma toxina, sendo este gene de origem viral.