Introduccion a La Ingenieria Bioquimica Alberto Duarte Torres

r

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]NTRODUCCION A LA INGENIERIA BIOOU]MICA

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¡

s-^ B

1

v

¡NTRODUCCION A LA INGENIERIA BIOOUIMICA

w UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE INGENIERIA DEPARTAMENTO DE INGENIERIA OUIMICA INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA

I

ALBERTO DUARTE TORRES

{

Profesor Titular

¡

I

:

SANTAFE DE BOGOTA, JULIO DE 1995

-

TABLA DE CONTENIDO

Frólogo

...xvii

1. ¡NTRODUCCTON I.,t LA CELULA

-

!i

1.1,1 Tiposbásicosdecélulas ... .1.2 La información genética

1.2.1

i..,.

..,...

.2.1.1

2

3

.... ¿

Procesos de prodgcción de 1

i

2

1

1.2 METABOLISMOMICROBIA1

,

,r .

5

energfq,

Glucólisis

1.2.1.1.1 Ruta metabólica

7

I Embden

Meyerhof-Parnas.. 1.2.1.1.2 Ruta metaból¡ca del fosfato-pentosa . 1 .2.1.1.3 Ruta mstabólica Eatner-Doudoroff 1.2.1 .2 Respiración

I 11

12 13

1.2.1.2.1 Ciclo del ácido

... fosforilaciónoxidativa,..... tricarboxílico

1

13

.2.1.2.2 Transporte electrón¡co y

., 1.2.1.2.3

16

Reacciones de

oxidación-reducción

16

1.3

APLICACIONES DE LA INGENIERIA BIOOU]MICA .

1.4

CONSIDERACIONES GENERALES SOBRE EL DISEÑO PRELIMINAR DE UN BIOPROCESO .

.

.

22

.

29

.

1.4.1 El biocatalizador 1.4.2 Cultivos de células y tejidos 1.4.3 El biorreactor 1.4.4 Esterilización

30

.

31

1.4.4.1 Esterilización de equrpo 1.4.4.2 Esterilización de medios 1.4.4.3 Esterilización de aire

1.4.5

35

;

.

Separación y purificación de productos de la ingenierla bioqufmica. . .

1.4.5.1

1.4.5.2

Separacióñdecélulas'..... Rupturadecélulas . . . . . . . i.

Productosextracelulares....;

1.4.5.3 Purificación final del

producto

1.4.5.3.1 Filtración de células

36 37

38

Productosint¡acelulares....i..

1.4.5.1.1 1.4.5,1.2

39 39

40 40 41

a

'través dé membranas 1 .4.5.3.2 Extracción líquido-líquido de antibióticos 1.4.5.3.3 Recuperáción de ' ant¡bióticos y protelnas mediante intercambio iónico

1.5

33 35

....;.

41

42

42

APLICACION DE LOS LENGUAJES DE

SIMULACIONENINGENIERIA..¡.J.II";

43

Etapas'en el planteamiento y la solución de un modelo' . . Lenguajes de simulación continua

43 45

1.5.1 1.5.2

BIBLIOGRAFIA.. .:...

46

2 2.1

BALANCE DE MATERIALES

52

BALANCE GENERAL DE MATERIALES

2.2 BALANCE DE ELEMENTOS OUIMICOS

53 54

.

2.2.1

Velocidad específica de consumo de sustrato, crecimiento de biomasa y formación de producto. 2.2.2 Balances de carbono y oxígeno

'

Ejemplo

2.1 Balance de elementos químicos enunafermentaciónanaerobia . . . . .. . . .

2.3 BALANCE POR EL METODO DE ELECTRONES DISPONIBLES

2.3.1 Grado de reducción 2.3.2 Bdance de electrones disponibles 2.3.3 Ecuación de crecimiento Ejemplo

2.2

Ejemplo

2.3

Determinación en un proceso Determinación en un proceso

de la ecuación de crecimiento aerobio de la ecuación de crecimiento anaerobio . . . .

Ejemplo 2.4. Determinación de la composición de un microorganismo

Ejemplo

2.5 Equivalencia de los factores

Ejemplo

2.6 Factores de rendimiento

62 64 66

70

70 70 71

.

71

de rendimiento

2.5.5 2.5.6

57

69

2.5 FACTORES DE RENDIMIENTO Rendimiento de sustrato en biomasa . . . Rendimiento de oxígeno en'biomasa Rend¡miento de electrones en biomasa . . Factores de rendimiento en el crecimiento aerobio

56

58 58 59

.

2.4 COMPOSICION ELEMENTAL DE LOS MICROORGANISMOS

2.5.1 2.5.2 2.5.3 2.5.4

54 55

en el crecimiento aerobio de S. cerevisiae .

Rend¡m¡ento de sustrato en producto Rendim¡ento máximo de sustrato en producto

72

.

.

74 75 76 ilt

2.5.7 2.5.8 2.5.9

2.6

77

Coeticiente de rendimiento verdadero en medios mínimos Rendimiento verdadero en medios complejos ...:... Rendimientoverdadero del oxígeno

78 79 79

FORMULACION DE ECUACIONES CTNETICAS Á PRNTIR OET BALANCE DE MATERIALES DE UN CULTIVO CONTINUO . .

Ejemplo

2.7

2.7

Evaluación del rendimiento máximo en la producción de ácido cltrico

Ejemplo

....

. . . . . 80

2.8 Formulación

de las ecuaciones cinét¡cas requeridas para el control de un cultivo continuo de células de S. cerevisiae.

80

88*

DISEÑO DE MEDIOS DE CRECIMIENTO Y PRODUCCION

2.7.1

88-

Requerimientos nutrimentales 2.7.1

.1

Requerimiento de elementos

89

gg

2.7.1.2 Fuentes de carbono y energía 2.7.1.3 Requerimientosmínimos . . . 2.7.1.4 Requerimiento de nutrimentos

90

específicos

92

2.7.2 Requerimiento de energía 2.7.3 Requerimientosambientales 2.7.4 Consideraciones técnico-económicas

2.7.5Agua 2.T.6Fuentesdecarbono 2.7.6.1 2.7.6.2 2.7.6.3 2.7.6.4 2.7.6.5

2.7.7

Hidrocarburos

2.7.7.2 Torta de soya 2.7.7.3 Licor de papa . tv

..:......:......97 ......98

Melazas, cebada.y extracto de malta Licor de sulfito Alcoholes sintéticos Aceites vegetales

Fuentes de nitrógeno inorgánicas y

......

sintéticas

93 94 94

98,100 100 101 101 101

1O2

'lO2

¡f

2.7

.7.4

2.7.7.5

Extracto fermentado de salvado y aceite de semillas Extracto de levadura

104 105

2.7.8 Medios de cultivo definidos 2.7.9 Control ambiental . .

106 107

.

2.8 FORMULACION DE MEDIOS Ejemplo

108

DE CULTIVO

2,9 Diseño preliminar

de un medio

PROBLEMAS... BTBLTOGRAFT1

3

1'14

..

116

120

TERMODINAMICA DE LOS PROCESOS BIOOUIMICOS

3.1 PRINCIPIOS DE LA TERMODINAMICA 3.1 3.1

.1 Conservación .2 Entalpfa

120 "t21

de energfa

123 124 124

libre 3.1 .4 Entropfa 3.1.3

Energla

3.2 ANALISIS TERMODINAMICO DEL METABOLISMO MICROBIAL . . 3.3 ENERGIA LIBRE ESTANDAR

3.3.1 3.3.2 3.3.3 3.3.4 3.3.5

3.1

132 133 134 137 138

Eficiencia de la célula en el proceso de captura de energfa en la reducción del piruvato hasta lactato . .

3.4 EVALUACION DE ENTALPIA Y CALOR

126 130

Energía libre estándar de hidrólisis de algunos compuestos fosforilados Energla libre estándar de algunas reacciones biológicamente importantes Ciclo energético de las células Energía libre estándar de hidrólisis del ATP Principio del intermediario qufmico común

Ejemplo

.

DE COMBUSTION

139

. . ..

140

3.4.1 3.4.2

Datos termod¡námicos de algunos compuestos representativos Calor de combustión

140 142

3.5 CALOR DE REACCION

145

3.6 DISIPACION DE ENERGIA Y EFICIENCIA TERMODINAMICA

146

3.6.1 3.6.2

Disipacióndeenergía termodinámica

.......r.

Eficiencia

146 146

'i

3.7 EFIC]ENCIA ENERGETICA DEL CRECIMIENTO MICROBIAL Ejemplo

149

3.2

Determinación del calor de combustión de las células y del calor generado por mol de O, consumido . Ejemplo 3.3 'Determinación de los calores de combustión de la biomasa y otros compuestos orgánicos. Ejemplo 3.4 Determinación de la producción de calor bajo represión por glucosa

3.8

FACTORES DE RENDIMIENTO DE ENERGIA EN BIOMASA

3.8.1

3.8.3

lbl 153

. . . . . . 154

Factores de rendimiento basados en el.calor producido

duranteel crecimientomicrobial

3.8.2

1S0

....

1Ss

Factores de rendimiento basados en la Factores de rendimiento basados en la

energíaliberadaporcatabolismo.,.:..

Ejemplo

1Sg

3.5 Evaluación de rendímientos basados en

energía

1

59

3,8.4

Factores de rendimiento basados en la generación de ATP 3.8.5 Factor de rendimiento de ATP en biomasa en el crecimiento asociado a la energía. 3.8.6 Rendimiento de ATP en biomasa en el crecimiento no asocíado a la energfá '3.8.7 Coeficiente de rendimiento verdadero 3.8.8 Rendimiento máximo de Afp en cétulas

vt

161 161

162 163 163

3.9 BALANCE DE ENERGIA

164

Balance general de energía Calor generado por la actividad rnetabólica . Calor generado por el metabolismo aerobio Calor generado por metabolismo aerobio en un reactor por lotes . 3.e.5 Calor generado por metabolismo

164 166 167

's,s.o aerobioenunreactorcontinuo

168

3.9,1 3.9.2 3.9.3 3.9.4

.

........

Evaluación experimental del calor generado por el metabolismo

Ejemplo

3,6 Balance

Ejemplo

3.7

"171

Balance de energía del proceso

anaerobio de obtención de etanol a partir de glucosa

174 178

PROBLEMAS

.,,.i..

BIBLIOGRAFIA..

CINETICA DE LAS REACCIONES CATALIZADAS POR ENZIMAS

4.1

.1 Cofactores y coenzimas . .

4.1.2 4.1 4.1

lsoenzimas y enzimas

alostéricas

.3 Clasificación .4 lmportancia industrial

4.2 ACTIVIDAD ENZIMATICA. 4.2.1

185

186 187 187 1 88 191

Velocidad inicial de una reacción catal¡zada por una enzima.

Ejemplo

4.2.2

181

185

INTRODUCCION 4.1

169

de energla del proceso aerobio de producción de levadura a partir de

glucosa

4

167

4.1

Determinación de la actividad de la enzima B-glucosidasa

Número de

recambio

191

192 193

vil

4.2

Ejemplo

4.2.3

Determinación del nÚmero de

recambio , .

196

lnfluencia de los factores ambientales

4.2.3.1 pH 4.2.3.2 Temperatura

4.3

Ejemplo

4.3 MODELOS POR

194

i

196 196

.

Determinación de las energías de activación e inactivación de un sistema enzimático.

198

CINETICOS DE LAS REACCIONES CATALIZADAS

ENZTMAS

200

4.3.1 ModelodeMichaelis-Menten i"., 4.3.1.1

Ejemplo

4.4

Evaluación gráfica de los parámetros de la ecuación de Michaelis-Menten.

2O4

Evaluación de los parámetros de la ecuación de Michaelis Menten para la hidrólisis del almidón.

206

4.3.1.2 ModelodeBriggs-Haldane 4,3.1.3 Simulación del modelo

vilt

2Og

212

Modelo tipo Michaelis-Menten para una reacción enzimática reversible

215

Ejemplo

4.5

Ejemplo

4.6

4.3.3 4.3.4

. . . .;.

Menten.

de Michaelis

4.3.2

2OO

Determinación de la relación entre el caudal y el grado de conversión, en la isomerización de glucosa, en un reactor empacado. Determinación de la relación entre la concentración de sustrato y el .. t¡empo de reacción, en un reactor por lotes, empacado con enzima

Modelo de inhibición competit¡va Modelo de inhibición no compet¡tiva. .

,

217

223 225

Ejemplo

4.7 Determinación

del tipo de reacción y enzimática evaluaci6n de las

constantescaracterísticas... 4.3.5

4.4

Modelo de inhibición por

REACTORES

4.4.1 4.4.2

ENZIMATICOS

Reactor por

lotes

Reactor continuo de flujo

Ejemplo

sustrato

4.8 Simulación

tapón

i....

ENZIMATICA EN FASE HETEROGENEA

4.5.1 lnmovilización por métodos qufmicos 4.5.2 Métodosfísicos :.... 4,5.3 Enzimas inmovilizadas sobre la superficie de una partlcula insoluble 4.5.4 Enzimas inmovilizadas Por copolimerización o microencapsulación 4,5.5 Balance de materia 4.5.6 Consumo de sustrato de acuerdo con la c¡nét¡ca de Michaelis-Menten

4.9

Determinación de la variación de la concentración de sustrato con respecto a la distancia radial para diferentes valores d'el modulo de Thiele. Efecto del modulo de Thiele sobre el factor de efectividad Para Paftlculas

esféricasinmovilizadas.

4.5.7 4.5.8

234 234

de la hidrólisis del

enzima¡nvertasa.

Ejemplo

231

233

azúcar de caña por acción de la

4.5 CATALISIS

226

".

Consumo de sustrato propol'cional"a la concentración de sustrato Consumo constante de sustrato

235 239

240 242 243 245 245 246

249 252 254

PROBLEMAS

255

BIBLIOGRAFIA

259

lx

ts

crNETrcA DEL cREC¡MrENTo DE BroMAsA, coNsuMo DE SUSTRATO Y FORMACION DE PRODUCTOS

5.1

263

CRECIMIENTO DE BIOMASA EN UN CULTIVO POR LOTES

264

Densidad de la biomasa Etapas del crecimiento 5.1.2 5.1 .3 Velocidad específica

264 264 266

5.1 .1

Ejemplo

5.1

Determinación de las velocidades especfficas de una fermentación.

267

Velocidad de crecimiento Período de replicación de bacterias y levaduras 5.1.6 Perlodo de replicación de los organismos f¡lamentosos

5.1.4 5.1.5

5.2

INFLUENCIA DE LAS CONDICIONES AMBIENTALES SOBRE LA VELOCIDAD ESPECIFICA DE CREC]MIENTO

269 271 27

.:. . .

..i..,. 5.2.1 Temperatura . .i.! . . r . . .,,. . .,, 5.2.2 Energfadeactivación. ./. . .,, ...., 5.2.3 Actividaddel agua 5.2.4 Tonicidad, osmolalidad y osmolaridad. . . 5.2.5 pH i.....

1

272

.

272 274 275 276 278

5.2.5.1 Efectos del pH del medio sobre 5.2.5.2

la velocidad de crecimiento de algunas bacterias. lnfluencia del pH del medio sobre la velocidad de un bioproceso

5.3 MODELOS CINETICOS NO ESTRUCTURADOS PARA CRECIMIENTO DE BIOMASA, CONSUMO DE SUSTRATO Y FORMACION DE PRODUCTO.

5.3,1

lnfluencia de la comBosición del medio sobre la velocidad específica de crecimiento. 5.3.1 .1 Modelo de Monod 5.3.1 .2 Modelo de Moser 5.3.1 .3 Modelo de Contois y Fujimoto

28O

281

282

283 283 285 246

286 286 287

5.3.1.4 Modelo de Teissier 5.3.1,5 Modelo de Konak 5.3.1,6 Modelo de Kargi y Shufer

5.3.2

lnfluencia de la concentración de biomasa sobre la velocidad específica de crecimiento: Modelo de Meyrath. 5.3.8 Período de adaptación: Modelo de Hinshelwood 5.3,4 Fase estacionaria: Modelo de La Motta 5.3.5 Fase de muerte microbial.

5.3.6

5.4

288 288 289 289

5.3.5.1 Modelo de Chiu 5.3.5.2 Modelo de Moser y Steiner

29O

endógeno

290

Metabolismo

289

MODELOS CINETICOS PARA LA INHIBICION DEL CRECIMIENTO

5.4.1 lnhibición por

.

sustrato

292

292 293 294 295

Efecto de'la fuente de carbono. 5.4.1.2 Efecto de la fuente de nitrógeno 5.4.1 .3 Modelo de Andrews 5.4.1.4 Modelo de Tseng y Waymann 5.4.1.1

5.4.2 lnhibición

por

producto

5.4.2.1 ModelodeHolzberg 5.4.2.2 Modelo de Ghose y Tyagi 5.4.2.3 Modelo de Jerusalimsky . . 5.4.2.4 Modelo de Bazua y Wilkie

5.4.3

5,5

Represión catabólica

..

,'....'i

.

aMODELOS CINETICOS PARA LA FORMACION DE PRODUCTO 5.5.1 5.5.2

Clasificación de los productos Modelos cinét¡cos .

5.5.2.1 Formación de producto asociada al crecimiento microbial, 5.5.2.2 Formación de producto no asociada al crecimiento microbial

292

.

295 295 296 296 296 297

. . . 297 298 299 299 300 xt

5.5.2.3 Formación de producto parcialmente asociada al crecimiento: modelo de Luedeking y Piret

5.6 EVALUACION DE PAR,AMETROS CINETICOS A PARTIR DE DATOS EXPER]MENTALES

5.6.1 5.6.2

Método integral de análisis Método diferencial de análisis . .

Ejemplo

5.7

Evaluación de los paiámetroi cinéticos de la Ecuación de Monod a part¡r de datos experimentales.

Reactor por

Ejemplo

5.3

lotes

3OB

322

de Aerobacter cloacae

.

lotes.

5.7.2 Reactor continuo de flujo tapón 5.7.3 Reactor continuo de mezcla completa (CSTR) 5.7.4 Productividadygradodeconversión . ... 5.7,5 Reactor por lotes con alimentación continua. Ejemplo

5.7.6

5.4

Simulación del crecimiento de Aerobacter cloacae en un reactor por lotes con alimentación continua.

Reactor continuo de mgzcla completa con recirculación

5.7.7Fe¡mentadoresenseriei.... 5.7.8

Columnas de burbujeo y reactores con circulación líquida inducida

PROBLEMAS . . BIBLIOGRAFIA

xil

302 305

Simulación del crecimiento en un.reactor por

' '

301

CONSIDERACIONES GENERALES SOBRE BALANCE DE MATERIALES, 322 CINETICA Y SIMULACION DE FERMENTAqORES

5.7.1

.

5.2

.

301

.

323 327 328 330 334

335 338 342 343 347 351

\

6

ESTERILIZACION

.

356

6,1 TNTRODUCCION

356

6.2 CINETICA DE LA DESTRUCCION MEDIANTE CALOR

6.2.1 6.2.2

.,. , . .

357

Energía de activación y coeficiente

deArrhenius....

359

Reducción fraccional de la población de microorganismos.

362

LOTES

369

6.3 ESTERIL]ZACION

6.3.1 6.3.2

DE MICROORGANISMOS

HUMEDO.

POR

Selección de! microorganismo de diseño. Diseño de ciclos de esterilización

Ejemplo

6.1 Determinación

Ejemplo

6.2 Determinación

Ejemplo

6.3

del perlodo de sostenimiento en una fermentación 371

por lotes, de la influencia del período de calentam¡ento sobre el período de sostenimiento. Determinación de la influencia del volumen del caldo sobre el perfodo de sostenimiento,

374 375

6.4 ESTERILIZACION CONTINUA 6.4.1 Esterilización mediante calentamiento directo por ínyección de vapor. Ejemplo

370 370

6.4 Esterilización cont¡nua

376

vaPor

mediante inyección de

6.5 ESTERILIZACION DE AIRE

375

380

,

384

6.5.1

Condiciones del aire reqüerido por la industria b¡oqufmica . . 6.5.2 Esterilización de aire por calor

6.5.2.1 Compresión politrópica 6.5.2.2 Calentamiento directo 6.5.2.3 Calentamiento ind¡recto con gasescombustibles, .

385

386 386 388

i!..,

388 xlil

6.5.3

Filtración

388

6.5.3.1 Filtros empacados 6.5.3.2 Filtros de vela 6.5.3.3 Filtros de'membrana

6.6 EFICIENCIA 6.6,1

389 391

392

DE LOS FILTROS FIBROSOS

393

Eficiencia de fibra

Ejemplo

6,6.2

393

6.5 Espesor

de un lecho empacado con fibras de vidrio

396

Determinación de la pérdida de presión en los filtros de fibra de vidrio

Ejemplo

398

6.6 Determinación

de la pérdida de presión del aire en un filtro de fibras de vidrio

399

PROBLEMAS

400

BIBLIOGRAFIA

402

7

FENOMENOS DE TRANSPORTE EN

BIOPROCESOS

7.1 REOLOGTADELCALDO

.....

7.1.1 FluidosNewtonianos.... 7.1.2 Plásticos Bingham 7.1.3 Comportamiento pseudoplást¡co .,,. 7.1.4 CuerpodeCasson.. .

7.2.1

potencia i entregada al fluido ! .:., ! , Evaluación de la

7.2.1

.1

7.2.1.2

7.2.2 xlv

Dispersión de

Agitación

.......,. ...:.

i

4Og 4Og

4,lO

:

41O

... ,i !

;....

406

4Ol

....,,,.

gases

Agitación de fluidos Newtonianos

nogaseados

406

.

412 413

...416

7.2.3 Agitación

de fluidos Newtonianos

gaseados

Ejemplo

7.2.4

t.2.5

7.1

4'19

Consurno de potencia por

..

422

Agitación de fluidos gaseados

.

423

TRANSFERENCIA DE CALOR EN FERMENTACION

424

7.3.1 Area de transferencia de calor 7.3.2 Balance de energfa . . . ¡ . 7.3,3 Coeficiente de transferencia de calor

425 428 429

7.3.4 7.3.5 7.3.6 7.3.7 7.3.8 7.3.9

'

.

Reactoresequipadosconcamisa

Reactores equipados coh serpentfn . . . Reactores equipados con tubos verticales Reactores con serpentines de placa vertical lntercambiadores de superficie raspada Transferencia de calor en condiciones inestables en recipientes agitados

Ejemplo

7.4

421

Agitación de fluidos no Newtonianos

nogaseados

no Newtonianos

7.3

agitación

7.2

T¡ansferencia de calor en un reactor aeróbico

...,.

431 433 434 435 435

436 437

TRANSFERENCIA DE MASA

444

7.4.1 lntroduccién 7.4.2 Determinación

444

experimental del coeficiente de transferencia de oxlgeno

450

7.4.2.1

Método de oxidación de una solución de sulfito de sodio 7.4.2.2.Método del balance de oxlgeno 7.4.2.3 Método estát¡co 7.4.2.4 Método dinámico

Coeficiente de transferencia de masa Evaluación del coeficiente de transferencia de masa . 7.4.5 F¡acción volumétrica del gas en la fase dispersa.

7.4.3 7.4.4

450 451

452 455 457

460 462

7.4.5.1 7.4.5.2

7.3

Ejemplo

7.4.6

Dispers.ión de aire en

sistemas sin agitación mecánica Dispersión de aire en sistemas con agitación rrrecánica

Transferencia de masa en un reactor aeróbico . .

463

,

Evaluación de los gases producidos durante la fermentación en reactores a escala de laboratorio . . .

7.4

Ejemplo

7.4.7

467

...r?.

Transporte de oxfgeno en biorrggctoles

paraelcultivodeteiidosanimales .

7.4.7.1 Condiciones ambientales 7.4.7

.2

Sistemas de

cultivo

468

,

.,. ;.

.

;

7.5 Difusión 7.4.7

de oxígeno en frascos

.2.3

7.4.7.2.4 CAMBIO DE ESCALA

7.5.1 7,5.2 7.5.3

.

Transferencia de Transferencia de

Ejemplo

7.6

T..

Difusión de oxígeno a través de capilares

Microencapsulación

.

Agitación

480

típicas

7.4.7.2.1 Reactores agitados 7.4.7.2.2 Difusién de oxígeno en frascos T . . Ejemplo

465

Toma de muestras llquidas y gaseosas y evaluación de! caudal de gases producidos durante la fermentación

aceto'butllica,.....

7.5

462

480 481

.

482 482 485

487 490 4g1

calor masa

.....

492 493 496

Estudio del comportamiento de algunas variables en el procedimiento de

cambiodeescala

¡.i.r

498

.PROBLEMAS

502

BIBLIOGRAFIA

505

xvr

PROLOGO

Algunos problemas del hombre moderno tales como la alimentación, la recuperación y preservación de ecosistemas y el desarrollo de industrias no cOntaminantes, son Susceptibles de manejo o tratamiento con técnicas biológicas. Una porción crec¡ente de la tecnologla del próximo futuro dependerá de la utilización de recursos naturales renovables mediante el empleo de sistemas vivos, sus productos metabólicos o sus componentes.

salud, la

La lngenierfa Bioquímica integra la Bioqufmica y Eiología con la estrategia y metodología de la lngeniería Ouímica, aprovecha las capacidades degradantes

y sintéticas de los microorganismos, y aplica estos conocimientos en la producción, procesamiento y conserváción de materiales de valor económico, mediante agentes biológicos tales como microorganismos, células, enzimas, anticuerpos y tejidos animales y vegetales. El presente volumen está escr¡to como material didáctico para el curso

introductorio en lngeniería Bioquímica de la línea de profundización en bioprocesos del nuevo plan curricular de lngeniería Ouímica. Los estudiantes que siguen esta línea desarrollan normalmente su proyecto de grado en las áreas de lngeniería Ambiental, lngeniería de Alimentos o en lngeniería Bioqufmica.

Los principios de la lngeniería Ouímica son aplicables en todos los procesos que incluyen fenómenos de transporte, termodinámica y cinética' La mayorla de los textos tradicionales de lngenierla Oufmica están fundamentados en ejemplos recopilados de la industria petroquímica y los principales textos de lngeniería Bioquímica disponen de muy pocos ejemplos o carecen de ellos. y analizar información dispersa en físicos, químicos y biolÓgicos integrar los fenómenos una abundante literatura, y contr¡buir al desarrollo de la Biotecnología en nuestro medio, Más de cuarenta ejemplos resueltos y un número mayor de problemas de final de capítulo tienen el propósito de reforzar la experiencia del aprendizaie mediante una práctica guiada y detallada una vez expuesto cada nuevo principio. El objetivo de este libro es recopilar

xvil

Después de una introducción de los aspectos de la lngeniéria Bioqúimica el texto se divide en capltulos y secciones, algunos de los cuales corresponden

con otras asignaturas del plan de estudios tales como balance de materiales, balance de energía, termodinámica, cinética y fenómenos de transporte con el objeto de enfatizar las analogías y aplicaciones de la lngeniería ouímica en lngeniería Bioquímica. Asf, por ejemplo, la cinética de las reacciones catalizadas por enzimas y su aplicación en el diseño de reactores, la sección sobre catálisis enzimática en fase heterogénea y el efecto de la resistencia a la transferencia de masa, las secciones sobre agitación, aeración y dispersión, las secciones de transferencia de calor y transferencia de masa, la sección sobre difusión de oxlgeno en cultivos de tejidos animales y la sección sobre estrategias de cambio de escala, demuestran al lector la aplicación de los principios de la lngeniería Ouímica en el campo de la Biotecnología. La aplicación de los lenguajes de simulación digital constituye uno de los aspectos más importantes de la moderna educación en lngenierla, La disciplina lograda mediante el análisis de un comportamiento complejo, de acuerdo con la teoría disponible, expresada en forma de ecuaciones matemáticas, constituye

un medio valioso para entender la interacc¡ón entre causa y efecto en

un

sistema real. Este volumen incluye varios programas, algunos en lSlM, utilizado como ejemplo de uno de los lenguajes de simulación continua. Sin embargo, como su disponibilidad es bastante restringida comparada con la universalidad de otros lenguajes como el BASlc, los ejemplos en lSlM presentados-en este texto, excepto uno, son desarrollados simultáneañente en GWBASIC, con el objeto de confrontal estas dos herramientas de cálculo, facilitar el estudio de algunos de los modelos más importantes en lngeniería Bioquímica y motivar al lector hacia el desarrollo de nuevos programas. Esta obra es fruto de la ¡nteracción entre el Departamento de lngeniería Ouímica y el lnstituto de Biotecnología de la Universidad Nacionalde Colombia, y del Seininario sobre Biotecnología que ininterrumpidamente se ha desarrollado desde el año de 1983. Las diferentes llneas de investigación del lnstituto de

Biotecnologfa

y del Departamento de lngeniería

Ouímica han apoyado la

realización de numerosos proyectos de grado y constituyen la base del programa actual de postgrado en lngeniería Ouímica con área de énfasis en lngeniería Bioquímica.

XVIII

,

Agradezco a Myriam, mi esposa, y a mis hiios Alejandra, Ximena y Felipe por su paciencia y su estimulo mientras escribla este l¡bro. Tampoco serla posible esta obra sin la permanente colaboración de la Doctora Dolly Montoya Castaño, directora del lnstituto de Biotecnologla, del lngeniero Gustavo Buitrago Hurtado, subdirector del lnstituto de Biotecnologla, del lngeniero Luis A. Caicedo M., con quien comparto el curso de postgrado en lngenierfa Bioquímica, de todos los profesores del Departamento de lngenierfa Oufmica, de los profesores e investigadores del tnstituto de Biotecnologfa, y de los estud¡antes de los cursos pregrado y postgrado de lngeniería Ouímica quienes ayudaron a corregir y enriquecer los borradores del presente texto. Extiendo mis agradecimientos a los siguientes profesores, quienes a través de cursos y eventos nacionales e internacignales contribuyeron a mi formación en el área: Dr. Enrique Galindo Fentanes, Dr. Agfrstfn Lopez Munguia Canales, Dr. Rodolfo Ouintero Ramirez, Dr. Tonatiuh Ramirez, y demás profesores e investigadores del lnst¡tuto de Biotecnologla de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), Al Dr' Carlos Rolz, investigador titular, y demás profesores e investigadores del lnstituto Centroamericano de lnvestigación y Tecnología lndustrial (lCAlTl) de Guatemala. Al Dr. Fernando Acevedo Bonzi, Dr. Andres lllanes V., y demás profesores e investigadores de la Universidad Católica de Valparafso, Chile.

Alberto Duarte Torres

xtx

CAPITULO

1

INTRODUCCION

La lngeniería Bioquímica integra los conocim¡entos de bioquímica y'biología con la estrategia y metodología de la lngenierla Ouímica, aprovecha las capacidades

degradantes y s¡ntét¡cas de los microorganismos y aplica estos conocimientos en la producción, procesamiento y conservación de materiales de valor económico, mediante agentes biológicos tales como microorganismos, células, enzimas y anticuerpos.

,."aro. químicos tradicionales principalmente en la sensibilidad de los reacfivos y los productos hacia las condiLos procesos bioquímicos difieren de los

cionss afñb¡Htales:y en la complejidad de las reacciones bioqulmicas que normalmente solo toleran pequeñisimos cambios de temperatura, pH e intensidad iónica. Cuando se examina el crecimiento de células separadas del organismo vivo tal como un cultivo de células vegetales, de células animales, o de organismos unicelulares, se.encueñfia que,lasaesfieohas oond¡cioñé§Arnbientales proporcio-

nada§ porel'organismo.vivo deben §ér-,pfovistas.Et*ficialrnente. Y aunque muchos reactores comerciales no requieren un control con estos limitados márgenes de tolerancia, las células deben ser protegidas de cambios repentinos en las condiciones ambientales, de los elevados esfuerzos cortantes producidos por la agitación del caldo y de los microorganismos extraños.

1.1 LA CELULA

La célula es la manifestación más sencilla de la vida. En la célula se unen átomos para formar moléculas, se conectan moléculas para formar estructuras, y se coordinan'estructuras para producir mas células. La célula crea y mant¡ene orden, organización, y complejidad.

De acuerdo con la §egunda Ley de la Termodinámica, la.éntropía aumenta invariablemente en cualquier lugar del universo. La estrategia de la vida es afrontar esta tendencia de la naturaleza hacia el azar y generar orden mediante la creación de estados inestables. Estos procesos requieren energía, ya sea directamente de la luz solar o de las sustancias nutritivas que rodean la célula.

1

.1

.1

Tipos básicos de células

Los dos t¡pos bás¡cos de células, Émaario(es : y eucdrjotesj d¡fieren en la complejidad de su organización celular (Figura 1.1). Las células eucarióticas tienen estructuras intracelulares limitadas por membranas, denominadas

Entre los orgánulos está el núcleo (contiene el genoma celularJ, los mitocondrios (sitio de sfntesis y tr'ansporte de energíaf , los lisosomas {eontienen las enzimas

degradantesl,

y los cloroplastos en los organismos fotosintéticos.

El úniiÉo

orgánulo común a procariotes y eucariotes es el ribosoma (s¡tio de síntesis de las proteínas). En la Tabla 1 .1 se presenta la clasificación de los microorganismos del reino prot¡sta. El reino de los protistas está formado por organismos dotados de una organización biológica muy simple comparada con la de las plantas y animales. Pertenecen a este reino fodos los organisrnos unicelulares, y los multicelulares formados por células del mismo tipo.

Figura 1.1 Representación esquemát¡ca de células "tfpicas". AI componentes de una célula tfp¡ca; Bl Paramecium, microorganismo, tipo animal, de una sola célula; Cl Euglena, microorganismo tipo vegetal, unicelular; D) Célula bacteriana. lPelczat, et al., 19771, CuerDo

de

GolQ¡

\

Lrgsma

-Membraña celular

Rel¡curo

tleliculo

end@lásnrco

ercoo¡ásmico

:

B

Svrco bucal

Mrcronúc¡eo '

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Cromosoma Núqleo

ilt em bra na

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\Qo v(,

Vacuolas axrenttcias Crloprqio

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Tnc@§lo

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'-

M[EÚÉriá

Olostoma

c¡r,**--¡l\u,\tlt¡l¡,r,

r rrrrrr,-r,, "^.,onú"tí/"újrrrrr,. o r ri fij !!*, '

Ves¡cula

prn6rlós¡ca

Vacuola

o"

Vacuola

contráclil conlráct¡¡

Veslibulo. Eslrgma de

p¡gren¡o Gránulo de azulÉ

\

Pa¡ed celúla¡ Membrana aloplasmrca

Flib6omás

Gránulo lrgld¡co Gránu¡os de volulina

1.1.2

La información genét¡ca

E! ácido desoxirribonucleico, ADN, es

el depositario de la informaeión

que instruye a la célula sobre la disposición correcta de sus átomos; rnoléculas, cadenas y estructuras, para convertirse en una célula completa, transmitirse de generación en generación, y volver a iniciar el proceso. El ADN e una larga

cadena molecular formada por cuatro tipos de eslabones; adenina, guanina, citosina, y t¡m¡na. Estas cuatro bases, o letras, se unen formando secueñcias, o palabras, con las cuales puede escribirse el número infinito de frases que constituyen la información genética.

Tabla

1.1

Clasificación de microorganismos del reino Protista. (Bailey y Ollis, 1986).

Todas las cétulas contienen unos orgánulos denominadqs ribosomas.donde se copian fragment6s, o genes, de la información del ADN, con la ayuda de una proteína, enzima, que actúa como catalizador. Esta copia de la información es el ácido ribonucleico mensajero, ARN^. Es un mensajero porque transporta el mensaje de los genes, desde el núcleo, donde se encuentta el ADN, hasta el

citoplasma, espacio celular alrededor del nÚcleo, donde se encuentran los ribosomas. Las moléculas de ARN, más cortas que las de ADN, contienen uracilo en lugar de timina. En el ribosoma se lee la secuencia de los nucleótidos del ARN^ y se produce una proteína. Enzimas muy específicas unen cada aminoácido con una molécula pequeñá de ácido ribonucleico de transferencia, ARN. El ribosoma selecciona cada ARM con su aminoácido agregado, de acuerdo con el orden indicado en el ARN^ lefdo en ese momento. De esta manera, cada nuevo aminoácido, y su correspondiente .ARlú,, entran en el ribosoma y se sitúan de modo que diCho aminoácidO queda químicamente ligado con el arninoácidO que le precede en el ribosoma. Así, los eslabones quedan unidos secuencialmente, y cuando termina la lectura de la cadena del ARN^, se libera la cadena,protefn¡ca. Cada gene codifica una proteína.

4

Las proteínas son cadenas moleculares formadas por veinte clases de eslabones, los aminoácidos. El orden, o secuencia de los aminoácidos en la cadena es

exacto y determina eltipo de protefna. Cada proteína tiene funciones biológicas especiales. Así, por ejemplo, la hemoglobina es una protelna que se pliega según una configuración tridimensional, la única capaz de aceptar y liberar eloxígeno.

1.2

METABOLISMO MICROBIAL

La energía obtenida por la célula a part¡r de las sustancias nutritivas del entorno,

oife la luz solar, es utilizada en la realización de trabajo qufmico, en la biosfntesis de las proteínas, ácidos nucleicos, lfpidos, pbfisacáridos y demás componentes celulares importantes para su desarrollo y replicación. Tarnkién se requiere energía para la realización de trabajo osmótico, en el transporte de sustancias nutritivas a través de la membrana celular y en el trabajo mecánico de contracción y locomoción. Metabolismo es el conjunto de todas las secuencias de reacciones catalizadas ehzimáticamente que ocurren en la'célufa. Cada secuencia se conoce como ruta metabólica y los productos de estas reacciones son los metabolitos. un adecuado conocimiento de la estequiometrfa de las diferentes rutas metabólicas facilita la aplicación del análisis estadístico en la evaluación de los datos obtenidos durante el desarrollo de una fermentacióñ, Tsai y Lee, 1987. Algunos subproductos del metabolismo celular tales como alcohóles, ácidos orgánicos y los aminoácidos, son aparentemente innecesarios para la función celular, otros, como los ant¡biót¡cos y enzimas extracelulares, satisfacen un propósito. Desde el punto de vista de la Ingeniería Bioqufmica son importantes aquellas réácciones ceJulares biológicarñénté ' ineficientes' que producen sustancias bióiiulmicas en cantidades sulieriores a lds necesidades de lá célula. lnnumerables reacciones mantienen la vida'celular, en la Tabla 1.2 se presenta, a manera de ejemplo, un resumen de la actividad biosintética del Escherichía coli. En un medio de crecimiento rico en nutrientes y bajo condiciones ambientales apropiadas esta bacteria tiene un ciclo de replicación de veinte minutos, perlodo durante elcual ocurren con gran precisión, equilibrio y productividad, numerosas reacciones.

Catabolismo es Ja-fase dégradenterdet metabofismo.-Las moléculas o,rgánie6 nutcitiuas tales como hidratos de oarbono, hpidos y.p_roteínas, son,degradadds hasta productos firÍM.fdes como¡áeido láctico, áci_d_o,aeético, CO,2;jamoníaco y urea, En las reacciones oxidativas del catabol¡smo se !ibera la energía inherente a la compleja estructura de las macromoléculas orgánicas en la forma de trifosfáto de adenosine ATP.

Anabolismo es la fase de construcción,i las moléculas pequeñas de los precu rsores son ordenadas para f ormar.'lo§ com poFtenteso¡¡rolectfla resvelative rnenteglandes de la célula tales como polisacáridos, ácidos nucleicos, protefnas y lípidos. Las reacciones de biosíntesis del anabolismo requieren la energía libre aportada por la escisiín del ATP. El catabolismo se puede describir en tres fases tal como se muestra en la Figura

.2.-En la fase l, loq polisacáridos son degradados hasta pentosas o hexosas; los lípidos hasta ácidos grasos, glicerina y otros componentes, y las proteínas liberan, mediante hidrólisis, sus veinte aminoácidos componentes. Generalmente, los productos de la fase I son degradados en la fase ll hasta acetil-coenzima A. En la fase lll, el grupo acet¡lo del acetil-Co/ se incorpora al ciclo del ácido tricarboxílico y se oxida hasta CO, y agua. 1

anabolismo también ocurre en tres fases a partir de las unidades estructurales provenientes de la fase lll del metabolismo. La síntesis de las proteínas se inicia El

en la fase lll con la formación de o-oxácidos y otros precursores de los aminoácidos. En la fase ll los a-oxácidos son transtormados en o-aminoácidos, los cuales forman, en la Fase l, las cadenas polipeptídicas de muchas proteínas diferentes. Análogarnente, los gr:upos acet¡lo provenientes de la fase lll son transformados, en la fase ll, en ácidos grasos, con los cuales se construyen los diversos lípidos, Asf como las rutas catabólicas §on convergentes, las anabóticas son divergentes. Cada fase delcatabolismo o delanabolismo de una determinada biomolécula es catali.zada por un sistema multienzimático diferente. Generalmente la ruta catabólica, y la correspondiente, aunque opuesta, ruta anabólica, entre precursor y producto, difieren en sus metabolitos y en las enzimas catalizadoras de las. etapas intermedias. La fase lll del metabolismo es amfibólica, funciona catabólicamente en la degradación de las moléculas producidas en la fase ll, o anabólicamente en la formación de moléculas precursoras de la biosíntesis de las macromoléculas celulares.

6

Tabla

1.2 Actividad

biosíntetica durante los veinte minutos del ciclo de replicación de E. coli. (Lehninger, 19711

Componente

químico

Poreentaj de peso

e

geco

Peso

molecular aproximado

Número de mo1écu1as

por cé1uIa

¿,¡I

E

2-O0O.000-000

1

¿RN

10

1.000.000

15 - 000

Proteínas

70

60.000

1 .700 . 000

Lfpidos

10

1-000

15.000.000

200.000

39 - 000

Po]-igácáridos

Componente

qulmieo

ittolécuIas

sintetizadae por eegundo 0,00083

Protefnae

LÍpidos PoIi-sacáridos

Porcentaj e de Ia energría biosintética total

2,5

75 .000

3,1

1.400

2.120.OO0

88,0

12 .500

87.500

3,7

65.000

2,'7

'

ARN

Moiéculas de ATP, gintetizadas por segundo 60.000

ADN

1.2.1

.

5

1-2,5

2'

tr

Procesos de producción de energía

Las funciones espécff¡cas del metabolismo son: ohtei$d.éBéiOÉ WfraíGá del de les'§f,nítáncia§,éSgánic᧠nutritivaso¡& +a h¡z sotar;'tünvert¡r t''e¡óoÉniÑ, I éfiffiú :,"estruefti f alé§ ; dé' {bs

¡trtitffi

r

ebñrF6ñente§rinácród}oléeü]&gi€á iras 'céIulas; Éünir.:bé precffiúbré§'itáfa formar protelnas, ácidos nucle¡cos, lfpidos, pókácáiíüé§i} Otros ccñrB4*üñtés

€

celulafes; formar y degradar las biomoléculas necesarias para las funciones celulares especializadas. El propósito de esta Sección es presentar un resumen de los principales procesos mediante los cuales la célula obtiene energía.

1.2.1.1

Glucólisis

La glucólisis es una de las diversas rutas empleadas por diferentes especies dd

organisrtos para degradar anaeróbicaments h glucosa hasta ácidó iáct¡co,'üon: elobieto de obtener energía qufmica, Los carbohidratos constituyen la clase más importante de sustancias carbonaceas nutritivas para los microorganismos. Algunas especies metabolizan también aminoácidos, hidrocarburos, grasas y aceites. La mayoría de los microorganismos que metabolizan carbohidratos, fermentan la glucosa, según las rutas conocidas como Embden-Meyerhof:ty del fosfato pent6a. Otro tipo de fermentación anaerobia es la fermentación alcohólica, donde las levaduras degr:adan la glucosa hasta etanol y dióxido de carbono. Los organismos facultativos después de catabolizar la glucosa oxidan aeróbicamente los productos de la fermentación. La ruta anaerobia de escisión de la glucosa precede a la fase aerobia de la respiración. Este proceso es caracterlstico, no sólo de muchas bacterias, levaduras y hongos, sino también de las células aerobias de la mayor pafte de los animales superiores y de las plantas.

1.2.1.1.1 Ruta metabólica Embden-Meyerhof-Parnas

En la Figura 1 .3 se representa la ruta metabólica Embden-Meyerhof-Parnas, EMP, conocida también como la ruta del difosfato hexosa o ruta de la glucólisis. El piruvato formado en la ruta EMP es una fuente de precursores anabólicos claves y para los organismos aerobios constituye también un sustrato para la oxidación. Para los organismos anaerobios, el piruvato, o los productos de su transformación, constituyen los agentes reoxidantes de la forma reducida del nicotinamid-adenln-dinucleótido, NADH.

B

Figura

1.2

Fases del catabolismo y del anabolismo. Las rutas catabólicas son

representadas con flechas descendentes y las anabólicas mediante flechas ascendentes. La fase lll es amfibólica, constituye la ruta finalde la degradación de los alimentOs hasta COz la cual proporciona las sustancias precursoras de pequeño peso molecular para el anabolismo'

Polisacáridos

Protefnas

hexosas

aminoácidos

II

Fasel

il

pentosas

1t

lt

gliceraldehldo

3-fosfato

rt

fosfoenolpiruvato

Fase ll

Itr

piruvato

1l

Fase

lll

llr tt fumarato

succinatcí

CO,

La ecuación global de la glucólisis por la ruta EMP es:

t1 .11

2Hro'ao +2NADII +2ATP +2H2O +2H

Figura

1.3

Ruta metaból¡ca EMP. (Ratledge,

tg87)

l

i

Símbolos; Pr,ion fosfato; Pr fosfato; Pr:difosfato. Los pasos 6-10, incluyen 2 rholes deireactivos y productos por'mol.de:glucosa utilizada. Las enzimas que actúan en la ruta EMPson: (1)hexoqujnasa, (2) glucosa fosfato isomeraea, (31 fosfofructqquinasa, (4) aldolasa, (5) triosa fosfato isomerasa, (6) gliceraldehÍdo fosfato' deshidtogenasa, (7) 3-fosfoglicerato quinasa, (8) fosfo-gt¡ceromutasa,.

ATP

t2t

glucosa

glucosa 6-P

=...--

fructosa 6-P

ADP ATP

dihidroxiacetona 1-P

(s)

fructosa 1,6-P2

NAD*

ADP

(6)

gliceraldehído 3-P

glicerato 1,3-P2

NADH

+

HT

(9)

fosfoenol piruvato

+

H2O

glicerato 2-P ADP 110)

ATP

10

prruvato

glicerato 3-P

_

1.2.1.1.2 Ruta metabólica del fosfato-pentosa

La mayoría de los microorganismos metabol¡zan entre el 66Yo V 80% de la glucosa por la vla EMP y el resto por la ruta del fosfato pentosa, o ruta del monofosfato' hexosa. En la Figura 1.4 se muestran los pasos de !a ruta del fosfato pentosa.

Figura

1.4

Ruta metabólica del fosfato pentosa.

Símbolos: P, fosfato. Las enzimas que actúan en la ruta del fosfato pentosa son: (1) hexoquinasa, (2) glucosa 6 fosfato deshidrogenasa, (3) fosfogluconato deshidrogenasa, (41 isomerasa, (51 epimerasa, (6) transquetolasa, (7)transaldolasa, (81 transquetolasa. (Ratledge, 1987) NADP (1)

glucosa

glucosa 6-P

ribosa 5-P

ribulosa 5-P

gluconato 6-P

I

xilulosa 5-P fructosa 6-P eritrosa 4-P piruvato

11

1.2.1.2

Respiración

La célula microbial tiene la capacidad de reproducirse a partir de sustancias nutrit¡vas simples. El número de rutas metabólicas utilizadas por una célula para lograr su reproducción es muy grande. Probablemente una célula bacterial contiene aproximadamente unas mil enzimas díferentes, y una célula eucariótica el doble. En todas las rutas metabólicas diversos sistemas enzimáticos transforman los sustratos con o sin cambio del esqueleto carbonado y los convierten en aminoácidos, lípidos, vitaminas y muchos otros componentes celulares y productos del metabolismo. Resulta imposible en un texto de nivel introductorio, describir las numerosas rutas metabólicas, su estudio corresponde a la bioqufmica general. Las principales rutas catabólicas descritas en la sección anterior conducen hacia la formación de piruvato y funcionan también durante la respiración. Las

reacciones tfpicas de la respiración parten de piruvato, como sustrato de la oxidación y como fuente de precursores anabólicos fundamentales. En la Tabla 1.3 se presenta una lista de algunos agentes oxidantes y reductores y de los correspondientes organismos que realizan la respiración. En ausencia de oxígeno e! proceso se denomina respiración anaerobia.

1.2.1.2.1 Giclo del ácido tricarboxílico

En la Figura 1.2 se muestra la admisión, a la Fase lll del catabolismo, de los grupos acetilo. obtenidos en la Fase ll, a partir de los carbohidratos, lfpidos y aminoácidos. La Fase lll está constituida por un sistema multienzimático, catal¡zador delciclo delácido tricarboxílico (Figura 1.61. Este ciclo se desarrolla en tres etapas: En la primera se forma Acetil-Co-A, a partir de la oxidación de piruvato, ácidos grasos y aminoácidos. En la segunda se producen CO, y átomos de hidrógeno mediante la degradación de los restos acetilo en el ciclo del ácido tricarboxílico. En la tercera etapa, los electrones equivalentes a los átomos de hidrógeno, son transportados mediante la fosforilación del ADP, hasta el oxígeno molecular.

13

Tabla

i .

1.3

Reductores y oxidantes en las respiracioneg bacteriales. (Sistrom, 1969),

Reductor

Oxidante P¡oductos

H2

02

'

(SO4)'?-

H2

Compuestos O,

orgánicos

, i'.

Oz '

NH,

,,

9rganlsmo

.' Bacter:ia§ de1

Hro

:"hidrógeno HrO

+ 52-

,QO,

+

Desulfovibrlo

ltrrO

(NOr) - + HrO

Muchas bacEerias todas 1as plant.as y animales ij

I ,

::i

:

Bacterias .'' ni,trifipant.es

ir,r,, ..,j

(NO;)- '

O,

CompuesEos (NO3) orgánicos

(NO3);-:'

t.

+ fLO

N, + CO,

Bacterias

denitrificantes :.

(Fe)

2t

02

Baeterias nitrif icanEes ';.. "'

1Fe)'*

- i-

¡

FerrobaciTLus (bacteria del

hierro)

s2-

02

(so{)'?- +

.

Hro,

rhiobaciflus ,(bgceeria de1 a.zufre) ii

La'reposición de los intbrmeUiarios del ciclo se reálizá' mediante reacciones eiri¡mát¡cas,¡üenoininada,é anapleróficas. Si se remüeve un iótermediario; no se sintetiza oxalacetáto. n¡ se régenera c¡trato. La reacción anaplerótica más amportánte es te carboxilación del piÍuvató para formar oxalacetato, poi acción de la enzima piruvato carboxilasa 14

En los organismos que se desarrollan con acetato, como única fuente carbona-

da, entra en juego la derivación del acido glioxflico (lfnea a trazos de la Figura y otros 1 .6), una variante del ciclo del ácido tricarboxflico, formándose succinato 'Muchas para ruta de otra disponen células intermediarios, a partir de acetato. receptor degradar glucosa, conocida como ruta del foSfogluconato, El electrónico de estas reacciones es el nicotinamid-adenfn-dinucleÓtido-fosfato, NADP. Su forma reducida el NADPH, es uno de los principales reductores en la sfntesis de moléculas ricas en hidrógeno tales como los ácidos grasos y el colesterol.

Figura 1.6 Ciclo del ácido tricarboxílico. (Ratledge, 1987).

Slmbolos: Las líneas a trazos corresponden a la derivaciÓn glioxilato; FAD, FADHr: flavin adenfn dinucleótido y su forma reducida; NAD, NADH: nicotinamid-adenín dinucleótido y su forma reducida; GDP, GTP: nucleótidos de la guanosina, difosfato y tr¡fosfato, respectivamente; ADP, ATP: adenosin difosfato y adenosin trifosfato, respectivamente; Co-A: coenzima A'

fosfoenolpiruvato

--->

azúcares

ATP (13)

malato

(10)

aconitrato

oxal-

acetato

(3)

NADH I (1 1

fumarato

FADI I

I

isocitrato

NADH CO,

Co-A

","",1',,,i1o'[ t7t

)

I

succinilCo-A

l(6) NAD*

15

Las,enzimas que intervienen en el ciclo del ácido tricarboxílico son; (1) citrqto

sintetasa; (2) y {3): aconitasa; (a} v {5) ,isocitrato deshidrogenasa; (6} 2 oxogluconato deshidrogenasa; (7) succinato tioquinasa; (8) succinato deshidrogenasa; (9) fumarasa; (10) malato deshidrogenasa; (,1,1) isocitrato liasa; (12) malato'sintasa; (1 3) fosfoenol piruvato carboquinasa.

1.2.1.2.2 Transporte electrónico y fosforilación oxidativa

y la fosforilación oxidativa representan la última fase de la oxidación biológica. Los electrones, separados de los intermediarios del ciclo del ácido tiicarbbxílics, fluyen por una cadena de múltiples eslabones, coiistituidos por las enzimas de transporte electrónico con niveles de energfa El transporte electrónico

'sucesiVamente menores, hasta alcanzar el oxígeno molecular, últ¡mo aceptante electrón¡co en la respiración. En este proceso se conserva la mayor parte de la energía libre de los electrones

mediante el proceso de fosforilación oxidativa, como energfa asociada al enlace fosfato del ATP. En los tejidos animales y vegetales, las enzimas catalizadoras del transporte electrónico y la fosforilación oxidativa están local¡zadas en los mitocondrios.

1.2.1.2.3 Reacciones de oxidac¡ón-reducc¡ón a

Numerosos procesos biológicos de conversión de energía incluyen reacciones de oxidación-reducción, Oxidación es una pérdida de electrones y ieducción es una ganahcia de electrones. Un sistema tfp¡co de oxidación-reducción (O,9) se puede expresar como: 11.2t

Donde, n: número de electrones transferidos en la reacción. si un electrodo de 16

metal inerte (platino o plata) se sumerge en un sistema OR, se establece una diferencia de potencial entre los electrones en la solución y los del metal, conocida como potencial de electrodo :

E = Eo

*

R'T ,nlox'l

n.F

t1.31

lred.l

Donde, Eo, es una constante espec¡al para un sistema dado, conocida como potencial de electrodo patrón, o fuerza electromotriz patrón; R : 8,314 J.(mol.K)-1: constante de los gases; F:96,485 kJ.(mol.V)'l: constante de Faraday; r: temperatura absoluta, Ki lox.l y lred.l: concentraciones de las formas oxidada y reducida del sistema Un electrodo sumergido en una solución de un sistema OR forma lo que se conoce como semipila, cuya diferencia de potencial es imposible de medir, ya que se trata de un electrodo simple. Para medirla se combina con otra semipila, obteniéndose entonces una pila completa. La diferencia de potencial entre ambas semipilas se mide con un potenciómetro. En la determinación del potencial de electrodo de un compuesto se requiere un

electrodo de hidrógeno como patrón de referencia cuyo potencial es arbitrariamente definido como cero. En lugar del electrodo de hidrógeno puede utilizarse un electrodo de construcción más sencilla, como el de calomelano, cuya diferencia de potencial con relación a la semipila de hidrógeno se conoce exactamente, Por consiguiente hay necesidad de definir un nuevo símbolo: En, donde h indica que elelectrodo de comparación ha sido calibrado con respecto al de hidrógeno:

En=E'Es

I1.41

Donde E, es el potenc¡al de electrodo del hidrógeno que, por definición, es cero.

Por tanto, la ecuación general para calcular el potencial de electrodo de un sistema OP es:

E¡=Eo.yr:*+H

t1.51

"t7

El valor.de E^ varía de acuerdo con el valor de la relación entre las concentrac¡ones de la forma oxidada y la forma reducida. Cuando estas concentraciones son

iguales: E¡

:

Eo.

Sí se conoce el valor de Eo, se puede calcular el potencial de electrodo del sistema en cualquier grado de oxidación o reducción. Por otro lado, el grado de oxidación se puede obtener a part¡r de la medición del potencial de electrodo. EI término E" se refiere a mediciones realizadas a pH cero. una condición difícil de lograr en la práctica. El término Eo' se utiliza Bara indicar. que el potenciat de electrodo patrón fue establecido a un dado valo|de pH.

El potencial de reducción de una media reacción, en la cual las formas oxidada y reducida están presentes en concentraciones no patrón, se calcula a partir de la ecuación de Nernst:

E=

E'* R'r ,n lox'l n.F lred.l

[1,6] .

Otra forma de la Ecuación [1.6] es:

-

(n.F.AE)) =

- n.T.ln K,

11.7t

Donde K. es la constante de equilibrio. El término de la derecha de la Ecuación [1.7] coincide con el mismo término de la Ecuación t1.31, portanto;

LG; =

-

n.F.A,E',

t1.81

Donde, n: número de electrones transferidos; F: constante de Faraday [F : 96,5 kJ.(mol.V)-l]; AEo': cambio de potencial estándar, V; AG"': cambio de energía !ibre estándar, kJ/mol. En la Ecuación [1.8] el valor de AE"'debe ser positivo, con el propósito de obtener un AG"'negativo, o sea, un valor positivo de AEo' indica una reacción

espontánea. De acuerdo con la Ecuación [1.8] el cambio de ener,gía libre estándar de una reacción puede calcularse a part¡r de la diferencia entre los valores de Eo'. De igual manera, puedecalcularse una variación deenergía libre para sistemas individuales y, de esos datos, calcularse una variación de energía libre de los sistemas combinados: 1B

^G;=^GA-^G;2

t1.91

En las reacciones de transferencia electrónica, como las que ocurren en la cadena respiratoria, los electrones son transferidos desde un donante, o reductor, hasta un aceptante, u oxidante. En algunas reacciones la transferencia se efectúa mediante átomos de hidrógeno. En este caso deshidrogenación equivale a oxidación e hidrogenación equivale a reducción.

- Reacciones ácido-base: Donanúe de Ptonnes

H

(===)

tl.101

+ Aceptanfc de protorus

- Reacciones de oxido-reducción:

tl.11I

e-

+ Acepttrúe de electrones

L" t"nd"n"ia de un reductor a perder electrones se expresa

mediante el potencial de reducción estándar, definido como la fuerza electromotriz, en Voltios, suministrada por un electrodo en una disolución de un reductor y de su oxidante conjugado, cuando la concentración de ambos es 1 M, a 25oC y pH 7,O. En la Tabla 1.4 se presenta un resumen de los potenciales de oxirreducción de algunas reacciones bioquímicas. En esta Tabla se observa que et acetaldehído tiene una tendencia muy alta a perder electrones y oxidarse hasta ácido acético, mientras que el agua tiene muy poca tendencia a perder electrones y formar oxfgeno molecular,

Cualquier sistema Or? puede ser oxidado por un sistema más positivo, esto es, situado en una posición más baja en la escala, Debe tenerse presente que frecuentemente se requiere un catalizador con el propósito de lograr una reacción entre ambos sistemas. La mayoría de los pares electrónicos que ingresan a la cadena resp¡ratoria proviene de algunas enzimas conocidas como deshidrogenasas ligadas a la piridina, catalizadoras de las siguientes reacciones generales:

19

susffato redrcifu + NAD'

(===) a1.12)

§/istrato oxidado + NADH + H.

t1'13I s'ustrato oxidado + NADPH +

.

r

H'

''';i

;-

Donde, NAD, NADH: nicotinamid-adenín-dinucleótido y sq.correspond¡ente forma reduc¡da; NADP, NADPH: fosfato de nicotinamid-adenfn-dinucleótido y su correspondiente forma reducida.

Tabla

1.4

Potencial de reducción estándar de algunas reacciones bioqufmicas, (Lehninger, 1973)

Reacción

Actividad unitaria de todos los componentes, Eo' pH: 7,0 éxcepto el H*. cuya concentraciOn'es tO:TM. Voltios .. Gases: 1 atmosfera de presión. acetato + CO, acetato

+

+ 2H* + 2e ->

zH.',

+

'2e

!..

ferredoxina- Fe*3

+

piruvato

-> acetaldehfdo

1e

+

2H*

+ 2e-->

electrones

- O,7O -

0;60

a

--> ferredoxina-Fe*z - 0,432

H*+1e--)O,5H, CO,

Dirección flrjo

- 0,42 formato

co-A " + 2H' + 2e--> malato

- 0,42

acetil-co-A + 2.H* + 2e--> acetaldehfdo +

- o,41

piruvato + CO,

-.9,33 Continúa

20

Tabla 1.4 (Continuación) Reacción

Actividad unitaria de todos los componentes, excepto gf H* cuya concentración es 10-7 M. Gases: 1 at¡nosfera de presión.

acetaldehído NADPT

+ 2H* + 2e -->

+

NAD*

+ 2H* + 2e -->

2H*

piruvato +

H-

oxaloacetato

-

r;,;,j*r.,""

+ 2H* + 2 e-->

+ 2H* + 2e--)

ubiquinona + .?H. crotonil-Co-A

-i*,o

malato

-,.o.32

-

ubiquinona-H,

+ 2 H* + 2e ->

butiril-Co-A

o,14

- 0,102 -

succinato

+ 2e -->

63

- 0,19

FADH2

+ 2H* + 2e -->

O,1

0,06

+ 0,03 + 0,10

+ 0,19

citocromo c-Fe*3

+

1e

->

citocromo c-Fe*2

. + 0,25

citocromo a-Fe*3

+

1e

->

citocromo a-Fe*2

+ p,29

:

:1'

0,5 02 + HrO + 2e --> HrO, Fe*3

+ 1 e-->

O,5 02

Dirección flujo electrones

- o,32

2H* + 2e --> lactato _NHs

fumarato

+

+ 2E--> NADH + H*

o-cetosrutarato r

FAD

¡-

etanol

NADPH

,Eo'. pH: 7,0 Voltios

Fe*2

+ 2H* + 2e --)

HrO

+ 0,30 +

O,771

+

O,816

21

Otras enzimas asociadas al transporte electrónico son las deshidrogenasas ligadas a la flavina, constituidas por flavin-adenín-dinucleótido IFADI o flavinmono-nucleótido IFMM. Los electrones y átomos de hidrógeno, participantes en las oxido-reducciones, son conocidos como equivalentes de reducción. La coenzima O, conocida como ubiguinona, por su ubicuidad en todas las células, es el aceptante de los equivalentes de reducción de las deshidrogenasas ligadás a la flavina. Lob electrones aportados por las flavin-deshidrogenasas son recogidos por la coenzima O. La velocidad de transporte electrónico se controla mediante las concentraciones de ATP

y ADP. Los citocrornos, grupo de

ferroproteínas responsables de la transferencia de electrones en las células aerobias, actúan secuencialmente en el transporte de electrones desde la coenzima O hasta el oxígeno molecular. Todos los componentes de la cadena respiratoria aceptan electrones de los compuestos precedentes en la cadena y los transfieren al siguiente eslabón.

1.3 APLICACIONES DE LA INGENIERIA BIOOUIMICA

Las aplicaciones de la ingeniería bioquímica son numerosas. En las Tablas 1.5

y 1.6 se presenta una lista de algunos productos industriales, diferentes de los antib¡ót¡cos, producidos por bacterias (Tabla 1,5), y por hongos (Tabla 1.61. En el Capítulo 4, se presenta una lista de aplicaciones industriales de las enzimas. La Tabla 1.7 es una lista de algunos productos, obtenidos a partir de bacterias y hongos, útiles comó ant¡b¡óticos.

Otros productos farmacéuticos obtenidos por biotecnología son: antígenos (sustancias que est¡mulan la respuesta de los anticuerpos); sustancias para diagnostico; endorfinas (neurotransmisores); gammaglobulina (prevención de infecciones); hormona de crecimiento humano; seroalbúmina humana (tratamiento de trauma físico); reguladores inmunitarios,insulina, interferón (tratamiento de infecciones); interleuquinas, limfoquinas (modulación de la reacción inmunitarial; anticuerpos monoclonales (diagnóstico y liberación de drogas); péptidos neuroactivos, vacunas, etc.

22

Algunas aplicaciones de la biotecnología en agricultura son: desarrollo de plantas

con mayor capacidad de fotosíntesis y fijación de nitrógeno; desarrollo de insecticidas biológicos, pesticidas, fungicidas y herbicidas, Algunas aplicaciones industriales de la biotecnología son: producción de ácido acético, acetona, butanol, etanol, gas carbónico, h'idrógeno, aminoácidos, enzimas, vitaminas, lfpidos, bebidas dlcohólicas, proteína unicelular, edulcorantes y biopolímeros; separación de minerales¿ coñc€fltración de metales; control de la contaminación; degradación de residuos tóxicos; recuperación de derrames de petróleo; producción de biosensores.

Tabla

1.5 Algunos productos industr¡ales,

diferentes de los antibióticos, producidos por bacterias. Pelczar, et a|.,1977.

PRODUCTO

MICROORGANISMO USOS

Butanolacetona

Clostrídium acetobutylicu¡n y otros

química

2,3 Butanodiol

Bacillus polimixa, Ent. aerogenes

Solvente, fiumectante, intermediario químico

Micrococcus

Ad¡tivo de alimentos

Lisina

Solventes, manufactura

glutamicus Dihidroxiacetona

G. suboxydans

Producto qulmico fino

Acido láctico

Lactobacillus delbruecckii

Productos alimenticios, text¡les y lavanderías, manufactura qufmica, curt¡do de pieles

Amilasa bacteriana

Bacillus subtilis

Modificador de almidones, encolado de papel, desencolado de textiles

Proteasa bacteriana

B. subtilis

Laminado de pieles, desencolado de fibras, quitamanchas, ablandador de carnes Continúa

23

Tabla

1.5

Continuación

PRODUCTO

MICRORGANISMO

usos

Dextrán

L.mesenteroides

Estabilizador de al¡mentos, sustituto del plasma sanguÍneo

Sorbosa

G.suboxydans

Manufactura ácido ascórbico

Cobalamina

olivaceus; Propioni' bacterium freuden-

reichii

Tratamiento de la anemia perniciosa; suplemento alimenticio

Acido glutám¡co

Brevibaéterium sg.

Aditivo de alimentos

Estreptoquinasaestreptodornasa

Streptococcus

Disolvente de coágulos sanguíneos

Tabla

S.

hemolyticus

1.6 Algunos productos industriales,

diferentes de los antibióticos, (Pelczar, et al, 19771 deriVados de los hongos.

PRODUCTO

M¡CROORGANISMO

Acido cítrico

Aspergillus niger

A.wentii

usos Productos alimenticios, citratos medicinales, en sangre p'ara transfusiones

Acido fumárico

Rhizopus nigricans

Manufactura de resinas alquÉ dicas, agentes humectantes

Acido glucónico

A.niger

Productos farmacéuticos, textiles, curtido de cueros, fotograffa

Acido itacónico

24

A. terreus

Manufactura de resinas alqufasentes nr."".¿:1";r"

Tabla

1.6

Continuación

USOS

PRODUCTO

MICROORGANISMO

Pectinasas

A.

1-y-hidroxiprogesterona

R. Arrhizus, Rhizopus

nigricans, olros

Acido giberélico

Fusarium monoliforme Guarnición de frutas, producción de semillas

Acido láctico

R. orizae

1

Tabla

1.7

wentii

A. aurcus

Agentes clarificantes en la industr¡a de jugos de frutas

lntermediario para 17 -yhidroxicorticoesterona

Alimentos y productos farmacéuticos

Productos metabólicos de bacterias y hongos Útiles como

ant¡bióticos (Pelczar, et al,, 19771

ANTIBIOTICO

DERIVACION

ESPECTRO

MODO DE

PRODUCIDO

MICROBIANA

PRIMARIO

ACCTON

Ampicilina

Penicillium sp

Bacterias gram positivas y gramnegativas

lnhibe sfntesis de la pared celular

Streptomyces nodosus

Varias micosis causadas por hongos

lnterfiere la función de la

Bacillus

Bacterias

subtilis

grampositivas

lnhibe síntesis de la pared celular

S. halstedii

Rickettsias, bacterias grampositivas

Amfotéricina

I

Bacitracina

Carbomicina (Magnamicina)

membrana

lnhibe la síntesís de protefnas Cqntinúa

25

Tabla 1.7 (Continuaciónl

ANTIBIOTICO

DER¡VACION

ESPECTRO

MODO DE

PRODUCIDO

MICROBIANA

PRIMARIO

ACCTON

Cefalosporina C

Cephalosporium

Bacterias

lnhibe síntes¡s

sp.

grampositivas

de la pared celular

Cloramfenicol (Cloromicetina)

S. venezuelae

Amplio espectro

lnterfiere síntesis de protefnas

Clortetraciclina (Aureomicína)

s_

Amplio espectro

lnterfiere sfntesis de proteínas

Colistín

B. colistinus

Pseudomonas spp.

Deteriora la

aureofaciens

(Colimicina)

membrana

celular Cicloheximida (actidiona)

S. griseus

Hongos,

lnhibe sfntesis

especialmente micosis de las

o" ,ro.r=tn". .

plantas,*'Cicloserina

Dimetil

:

S.orchidaceus, S. lavendulae

Mycobacterium tuberculosis

lnhibe síntgsis de la pared celular

S. aureofaciens

Amplio espectro

lnterfiere la sfntesis de proteínas

tetraciclina

mutant

Eritromicina (lloticina)

S. erythraeus,

Fumagilina

Aspergillus fumigatus

(Amebacilina)

Rickettsias, bacterias grampositivas Amebas

,

,'

,

lnterfiere la sfntesis de proteínas

lnterfiere la síntesis de proteínas Continúa

26

Tabla 1.7 (Continuación)

ANTIBIOTICO

DERIVAC¡ON

ESPECTRO

MODO DE

PRODUCIDO

MICHOBIANA

PRIMARIO

ACCrOñr

Griseofulvina

Streptomyces griseus

Hongos patógenos

lnterfiere la sfntesis de la pared celular del hongo y del ácido nucleico

Kanamicina

J. kanomyceticus

Myco-

lnduce slntesis de proteínas anormales

bacterium tuberculosis

Bacterias

Lincomicina

gramposit¡vas Meticilina

lnhibe slntesis de proteínas

Estafilococos'

lnhibe síntes¡s de la.pared celular

Bacterias gram positivas y gramnegativas; M. tuberculosis

lnduce síntesis de proteínas anormales

Bacterias

lnhibe polimerización

Neomicina

S. fradiae

Novobiocina (Catomicina)

S. griseus; S. niveus S.,spheroides

grampositivas

S. noursei

Candida

Daña la

intestinal; hongos

membrana celular

Rickettsias; bacterias grampositivas

lnhibe síntesis de proteínas

Nistatina

Oleandomicina

s. Antibioticus

del

ADN

Continúa 27

Tabla 1.7 (Continuación)

t ANTIBIOT]CO,

DERIVACION

ESPECT8O

MoDooE

PRODUCIDO

MICROBIANA

PRIMARIO

ACCTON

Oxitetrocielina

S. rimosus

Amplio espectro

(terramicinal'

Penicllina G

Polimixina B.

Estreptom¡oiña, '

Vancornicina

BacteriaS"' grampositivas

lnhibe síntes¡s de la pared celular

B. polymixa

Bacterias'"

gramnegativas

Deteiioiá la pared celular

Bacterias gram

lnduce i'

positivas y

protefnas

gramnegat¡vasi M. tubercülo:si§

anormales

S,

griseus

i'

S. aureofaciens

S. o¡Entalis

Amplio espectro

Bactdrias

grampos¡t¡vas

Neisseria, tetani('

Cl.

Viomicina

28

lnterfiere la síntesis de proteínas

chrysogemtm

P.

-{.1

Tetraciclina

,'

S. floridae

lnterfiere la síntesis de proteínas

lnhibe " síntesis de la pared celular

M.

lnterfiere la

tuberculosis

slntesis de protefnas

:

1.4 CONSIDERAC¡ONES

GENERALES SOBRE EL DISEÑO PRELIMINAR DE UN BIOPROCESO

Generalmente

un proceso bioquímico se puede descomponer en

etapas:

Breparacióñ dé materias primas; éster¡lización del e@po, del medio de fermentaóiOn y dei aire; biosíntesis; séfraraciórt y'PuÍificaciüh O" los pioducios di la fermentaCión; tratamiento de agua para consumo; tratam¡ento de aguas residuales, y tratamiento de los residuos sólidos y del aire efluente de la planta.

Los balances de materiales y de energía facilitan, en el caso de productos con rutas bioqufmicas conocidas o estudiadas, la evaluación de los rendimientos de sustrato en células, y de sustrato en producto, los requerimientos de oxígeno, y la formulación de los medios de crecimiento y producción, con el propésito de satisfacer las necesidades de formación de biomasa y de productos' Las velocidades de consumo de §ustrato y formación.de producto dependen del microorganismo especffi'co'y de lás condiciones dé crecimiento. Estas velocidád es geneialmenté son eva luada,s *Iyartir de datos experiinentaÍé§' o-tñecliante' l a analogía con procesos sirhitáre3. El rendimiento de sustrato en producto es afectado por el carácter lábil de las

biomoléculas suscept¡bles de degradarse en la etapa de separación y purificación, La baja concentración de producto en el efluente del reactor y la naturaleza

y

concentración de los contaminantes influyen desfavorablemente en

el

rendimiento del proceso. Una vez producida la ruptura de las células, si el proceso es intracelular, el producto aparece mezclado con otras biomoléculas con propiedades muy similares a las del producto final, lo cual dificulta su recuperación. La pureza inicial del producto depende de su localización intra o extracelular.Los altos requerimientos de pureza, en el casO de algunos productos farmacéuticos, pOr ejemplo, se traducen en un creciente nÚmero de etapas

y por consiguiente,

en un menor rendimiento del proceso.

29

1.4.1

El biocatalizador

Los recientes avances en genética

y

bioqufmica facilitan

la utilización de

enzimas, célulás y tejidos animales y vegetales para la producción de moléculas biológicamente activas. Uno de los aspectos fundamentales en el diseño de un bioproceso es el desarrollo de cepas de producción, Una cepa hiperproductora

crece usualmente a menor velocidad que una silvestre y generalmente es eliminada en el ambiente natural altamente competitivo. Además la célula esta sometida a estr¡ctos controles de tipo inhibitorio y represivo con el propósito de prevenir la sobreproducción de metabolitos y conservar los recursos para funciones más qsenciales tales como la reproducción, El desarrollo de nuevas cepas requiere la comprensión de los sistemas de control celular y el empleo de algunas herramientas de la biología molecular tales como genes mutadores, transposones y mutagénesis en sitios especlficos. Generalmente el biocatalizador seleccionado es una enzima cuando la conversión

de las mater¡as primas en productos útiles sólo requiere una o dos reacciones simples. Se prefieren enzimas solubles, si no son costosas o no es necesaria su remoción del producto final, como en el caso de la hidrólisis del almidón con o amilasa y glucoamilasa. En el caso contrario se prefiere la utilización de enzimas inmovilizadas, La población celular se mantiene en estado de crecimiento cuando el producto deseado es biomasa, como en el caso de producción de levadura de panadería o de protelna unicelular, o cuaQdo el producto es extracelular o cuando la forma-

ción de producto está asociada al crecimiento. Si hay necesidad de limitar la cantidad de materia prima, para facilitar la recuperación de producto, conviene utilizar una población celular en crecimiento estable o en crecimiento deten¡do. En este caso las células pueden inmovilizarse sobre soportes adecuados, Generalmente, si la formación de producto puede ser independizada completa o parcialmente del crecimiento, como en el caso de los cultivos con poblaciones bacteriales mezcladas en las plantas de tratamiento de agua, o.en la producción de etanol a pArt¡r de levaduras, se utiliza un reactor donde la población celular pueda mantenerse en un estado de crecimiento detenido con el propósito de disminuir el requerimiento de materias primas, facilitar la recuperación de producto y lograr mayores productividades.

30

1.4.2 Cultivos de células y tei¡dos

Las células inmOvilizadas de tejidos animales y vegetales pueden cultivarse y aumentar en número y tamaño fuera del cuerpo donante. Feder y Tolbert, 1 983, presentan algunas de las principales diferencias entre los cultivos de tejidos y los cultivos de microorganismos:

- Las células de tejldos animales y vegetales son de mayor tamaño que las células de bacterias y hongos. El metabolismo de las células animales y vegetales es más complejo y lento que el de las células microbiales, lo cual se traduce en una menor productividad

-

y en períodos más prolongados de esterilización. - Las células de tejidos de plantas y animales son más sensibles a los esfuerzos cortantes (agitación) que las células microbiales. Las células animales están envueltas en una delicada membrana plasmática. Generalmente estas células sólo crecen adheridas a una superficie.

Las células de tejidos animales y vegetales forman parte de un tejido organizado y no pueden considerarse como un organismo celular individual''

-

- Las células animales no metabolizan nitrógeno inorgánico y sus requerimientos nutricionales son más exigentes que los de los microorganismos' El medio de

cultivo requiere aminoácidos, vitaminas, hormonas, factores de crecirniento, sales minerales y glucosa. Uno de los medios más utilizados es el suero de Sangre, pero eS costoso y puede Ser fuente de Contaminación con virus y micoplasma. La naturaleza química del suero varía de uno a otro lote y la presencia de tantas protefnas diferentes en este medio complica los procesos de

separación y purificación del producto'

Los cultivos de tejidos de mamíferos son utilizados para la producción de Sustancias bioquímicas tales como la hormona de crecimiento, interferÓn, vacunas antivirales y ant¡cuerpos monoclonales. Algunas de estas sustancias inicialmente eran extrafdas de animales vivos y de cadáveres'

31

- .?

Cuando una sustancia extraña entra al cuerpo de un anirnal vertebrado, sus linfocitos segregan proteínas denominadas inmunoglobulinas o anticuerpos con la propiedad de reconocer algunos sitios de la sustancia extraña, los antígenos. El anticuerpo se liga al antígeno para neutralizar y eliminar la sustancia extraña. Los anticuerpos constituyen una herramienta poderosa en la identificación y detección de drogas, Broductos bacteriales y virales, hormonas y otros anticuerpos en muestras de sangre, Los cultivos,de tejidos vegetales constituyen una fuente valiosa de metabolitos secundarios. Estas sustancias facilitan la interacción de la planta con el medio ambiente y le permiten defenderse de 'microorganismos y predadores. Mientras los metabolitos secundarios son producidos en trazas, los metabolitos primarios tales como carbohidratos, aceites vegetales, proteínas y ácidos grasos son

producidos en grandes volúmenes.

Algunos metabolitos secundarios de interés comercial, obtenidos a part¡r de tejidos vegetales (Shuler, 1981, Sahai y Knuth, 1985) son;

- Colorantes : azafrán, antocianinas, betacianinas. - Edulcorantes: miraculina, monelina, taumattna. - Aceites esenciales: jazmín,limón, menta, naranja, ajo. =

Sabores: albaricoque, banano, cacao, durazno, frambuesa, fresa, manzana, piña, vainilla, uva, ceteza, espárrago, apto.

- Especias: cardamomo, canela, romero, safvia.

- Alcaloides: ajmalacina, atropina, codeína, Or,nina, morfina, escopolamina, serpenttna.

- Esteroides: digitoxina, digoxina, diosgenrna. - Otros: shikonina, saponina, ubiquinona.

'

Sustancias químicas para la agricultura: p¡retrinas, rotenona, sustancia químicas alopáticas.

32

1.4.3

El biorreactor

Los principios de la lngeniería Ouímica const¡tuyen el fundamento del análisis, díseñO y operación de los biorreactores. Sin embargo, deben tenerse presentes las siguientes restr¡cciones:

-

El caldo del fermentador es una mezcla relativamente compleja, durante'el proceso son sintetizados los catalizadores y generalmente hay un incremento de la biomasa microbial.

- La densidad aparente de las células y la del sustrato es usualmente slmilar a la del medio. El tamaño de las células es muy pequeño comparado con los catatizadores químicos. En condicíones normales las velocidades de flujo entre las fases continua y dispersa son relativamente peqÜeñas y difícilmente se logran condiciones de transferencia en flujo turbulento. - Los sustratos, poliméricos en algunos casos, los metabolitos y el crecimiento micelial de muchos microorganismos producen una mezcla viscosa de carácter no newtoniano que restringe apreciablemente la dinámica de fluio en el reactor. El crecimiento micelial de algunos microorganismos origina la formación de agregados celulares que dificultan la transférencia de masa y conducen al agota-

-

miento parcial de nutrientes y a la intoxicación por producto,

- Los biorreactores operan bajo condiciones moderadas de temperatura,

pH,

intensidad ionica y presión, pero estas condiciones deben controlarse cuidadosamente para prevenir daños en las células vivas y demás componentes lábiles esenc¡ales para el Proceso.

- La concentración de sustratos y productos es sustancialmente baja. consiguiente, se requieren grandes volúmenes

y

Por prolongados períodos de

retención. - La necesidad de mantener un solo tipo de microorganismo y eliminar todos los microorganismos indeseables impone restricciones adicionales al diseño del reactor.

33

Una de las etapas en el diseño de un biorreactor es la selección de las especificaciones del sistema: sistema viable o un sistema enzimático no vivo; sistema aeróbico o anaeróbico; condiciones asépticas o no asépticas; cultivos simptes o mezclados; células simples o agregados multicelulares; medios simples

o multisustrato.

Otra etapa es la selección del modo de operación: células suspendidas

,o

inmovilizadas; enzimas disueltas o inmovilizadas; sustratos_solubles o insolubles; sustratos monoméricos o poliméricos; operación continua o por lotes; procesamiento en tanque agitado o en flujo tapón; sistema sencillo o de multietapa; operación en corriente sencilla o con recirculación. Uno de los reactores más ampliamente utilizados en la industria bioquímica es

el reactor de mezcla completa (SIR) operado en forma continua (CSIR)

o

discontinua ldCSTRl. También son muy utilizados los reactores de lecho fijo en diferentes configuraciones tales como lecho empacado, el reactor con lecho formado por placas o láminas y el disco rotatorio. Los reactores impulsados por aire " airlift" utilizan aire para satisfacer la demanda

bioquímica de oxfgeno DBO,la demanda química de oxlgeno DOO, impulsar el contenido del reactor y satisfacer las necesidades de aeración y agitación en los cultivos aeróbicos,

Los reactores de lecho fijo y los de flujo tapón (PFB) son apropiados para aquellas reacciones inhibidas por la formación de producto. Los reactores agitados mantienen una concentración uniforme de sustrato y son apropiados para aquellas reacciones inhibidas por sustrato. Los reactores pueden ser operados en for'ma cont¡nua o por lotes y como lechos fijos, lechos fluidizados y tanques agitados. Los reactores operados en rnodo continuo conducen a una mayor productividad y a una util¡zación más eficiente

de¡ sustrato para la producción de biomasa, pero menos eficiente para la obtención de productos, cuandO se confrontan con los reactores operados por lotes.

Generalmente las plantas continuas funcionan óptimamente cuando Son diseñadas para un sólo producto. Las plantas multipropósito en la industria bioquímica son operadas por lotes. En algunos casos se ut¡l¡za una operación semicontinua por lotes alimentados lfedbatchl.

34

Algunos procesos requieren la recirculación del contenido del reactor. Las células son separadas del caldo mediante centrifugación, sedimentación y filtración y luego devueltas al reactor para mantener una elevada concentración celular.

Los reactores enzimáticos cqn enzimas inmovilizadas son operados de manera

similar a los reactores químicos catalíticos heterogéneos. En este caso es necesario determinar la vida media de la enzima y su desactivación en función del tiempo y los efectos de la transferencia de masa y de calor comg consecuencia de su inmovilización. La productividad de un biorreactor depende delt¡po de operación del reactor y de las velocidades de crecimiento de biomasa y de

formación de producto.

1.4.4

Esterilización

1.4.4.1

Ester¡l¡zación de equipo

Generalmente el equipo se esteriliza con vapor de agua a presión. Cuando las limitaciones de temperatura impiden la utilización de este método se emplean agéntes químicos líquidos y gaseosos de acuerdo con las circunstancias. La luz ultravioleta, las radiaciones ionizantes y las vibraciones ultrasónicas encuentran aplicación como agentes auxiliares potenciadores de otros procesos esterilizantes. Una combinación de diferentes métodos tal como vapor de agua, agentes químicos y radiación, es eficiente. En algunos casos una esterilización por etapas, donde se utilizan diferentes agentes esteril¡zantes en cada lote, puede

ser más eficaz que'cuando se empléan los mismos agentes. En cada caso especlfico deben óonsiderarse la naturaleza del equipo, los requerimientos de la esterilización y la economía del proceso. El agente o la condición esterilizante debe actuar eficientemente durante el proceso de esterilización pero una vez finalizado este proceso no debe presentarse una acción residual. En el caso de una fermentación industrial una posible acción residual puede ser tanto o más perjudicial para el proceso que la presencia de ciertos contaminantes.

35

1.4.4.2

Esterilización de medios

El objetivo de la esterilización de un medio es la remoción o eliminación de toda forma de vida animal o vegetal, macroscópica o microscópica, saprófita o no, existente en el medio. El grado de esterilización de un medio depende del proceso, Algunas aplicaciones como la fermentación láctica de hortalizas o el tratamientd biológico de residuos no requieren esterilización. En otros procesos las condiciones del medio favorecen la actividad del microorganismo deseado y afectan la'actividad de los contaminantes. Este es el caso de la fermentación alcohólica donde las condiciones normales de asepsia permiten eldesarrollo del proceso sin una reducción apreciable del rendimiento, En el caso de la producción de levadura para panificación, gracias al bajo pH requerido, basta una simple ebullición de la melaza y su posterior dilución con agua de buena calidad para una fermentación normal.

Por el contrario, hay procesos muy exigentes como los de producción de antibióticos, enzimas, vitaminas, acetona y butanol. La penicilina, por ejemplo, puede ser parcial o completamente destruida por la acción de la enzima penicilinasa producida por microorganismos contaminantes. Otro ejemplo es la fermentación de la melaza con Clostridium acetobutilicum para la producción de solventes: etanol, butanol, acetona, y gases: CO, y Hr. En este caso el microorganismo además de ser un anaerobio estricto es muy sensible a la acción de los bacteriófagos. La esterilización de medios a nivel industrial se realiza preferiblemente mediante

calentamiento con vapor de agua en los propios reactores o por separado.

En

el primer caso se esteriliza el equipo mediarite un proceso discontinuo de esterilización, y también el medio, con el propósito de evitar los riesgos de contaminación durante la transferencia del medio hacia el reactor. En la esterilización discontinua la temperatura del vapor de agua, del orden de 121 oC a 1 atmósfera de sobrepresión, garantiza la destrucción de las esporas. Sin embargo, el calentamiento del medio a elevadas temperaturas por períodos prolongados favorece la descomposición de los nutrientes. El proceso continuo de esterilización se realiza a mayores temperaturas, tlpicarnente entre 1 30 y 165 oC. El menor tiempo de esterilización se traduce en una menqr descomposición de nutrientes, una rnayor productividad del proceso, y un menor requerimiento de agua de refrigeración.

36

La esterilización continua se puede realizar mediante inyección directa de vapor

de agua a una presión entre 6,8 y 8 atmósferas, o mediante intercambiadores de placas o de tubos. En el primer caso debe preverse la dilución del medio, entre 10 y 15 o/o, por la condensación del vapor inyectado. El enfriamiento del medio esterilizado se logra en forma indirecta mediante camisas, serpentines o intercambiadores de calor.

1.4.4.3 Esterilización de aire

El punto de partida de la producción de ant¡b¡óticos, vitaminas y enzimas y muchos otros procesos de importancia industrial es una fermentación aeróbica donde se requiere un suministro continuo de aire libre de contaminantes que varia tlpicamente entre 0.5 y 1 volumen de aire por volumen de licor cada minuto. Todos los métodos de esterilización de medios pueden ser empleados con aire. Sin embargo, la esterilización de aire mediante calor no sólo es impráctica sino ineficiente debido a los bajos valores de la capacidad calorffica y de la conductividad térm¡ca del aire. Uno de los métodos más eficientes es la esterilización de aire con filtros fibrosos y filtros membrana. Se han ensayado diferentes tapos de materiales fittrantes tales como algodón, carbón, lana de vidrio, papel, nylon, teflón, polialcohol de vinilo, ésteres de celulosa, vidrio sinterizado, bronce sinterizado y materiales cerámicos. Actualmente los filtros más empleados son los de polialcohol de vinilo, formados por placas de I cm de espesor, de altura y diámetro variable desde 5 hasta 1 1O cm; los

filtros de placas de acetato de celulosa; los filtros de vela o cartucho de cerámica porosa y vidrio sinterizado; los filtros de membranas porosas de ésteres de celulosa, y los filtros de microfibras cillndricas de borosilicato envueltas en malias de polipropileno, En la práctica, el dimensionamiento de un filtro para un determinado caudal de aire, incluye la evaluación del espesor y área transversal del lecho, y la pérdida de presión del aire. Esta pérdida se relaciona con el consumo de la energía eléctrica requerida para comprimir el aire. En el caso de filtros empacados con lana de vidrio siempre existe la posibilidad de utilizar diferentes diámetros de fíbra, menor diámetro de fibra significa menor espesor del lecho. Por otra parte un aumento del grado de compactación de las fibras disminuye el espesor del lecho pero aumenta la pérdida de presión.

37

La vida media de un lecho depende de las condiciones de operación del filtro. Cada cuatro meses, aproximadamente, debe ejecutarse el cambio de lecho, Este costo adicional debe tenerse presente si se considera que el objetivo final del diseño el lograr el mejor filtro al menor precto.

1.4.5

Separación y pur¡f¡cac¡ón de productos de la ingeniería bioquímica

La aplicación comercialde los productos de la lngeniería Bioqulmica requiere uñ cuidadosa purificación qon el propósito de eliminar la actividad indeseable de

otras sustancias contaminantes. Generalmente las reacciones catalizadas por células y enzimas ocurren en una solución acuosa diluida, el producto se encuentra en muy baja concentración, en muchos casos de sólo partes por millón, y su separación requiere la remoción de grandes cant¡dades de agua, Usualmente la corriente afluente a la etapa de bioqeparación es la corriente efluente del biorreactor constituida por una mezcla diluida y compleia de dos o más fases formada por células, un líquido acuoso, nutrientes y productos del metabolismo celular. Los requerimientos de pureza del producto y la naturaleza de las materias primas

empleadas constituye la príncipal diferencia entre una bioseparación y una separación"en la lngeniería Ouímica tradicional. El gradq deseable de pureza de los productos bioquímicos significa su separasión de otros contaminantes de estructura química similar. , En algunos casos la obtención de una proteína particular significa su separación de una mezcla compuesta por las centenares

de proteínas normalmente producidas por la célula, La dificultad aumenta cuando hay necesidad de distinguir entre.estereoisómeros para obtener una preparación ópticamente pur.aLa ausencia de modelos predictivos para la mayoría de las operaciones unitarias y el gran número de alternativas disponibles, dificulta la selección de un modelo apropiado para la separación y purificación de productos. La selección del

diagrama de flujo de las etapas de separación generalmente en los.siguientes enfoques:

38

y purificación

se fundamenta

- Remover primero el contaminante más abundante. - Separar primero el contaminante más fácil de remover. - Dejar para el final del proceso las.operaciones más diffciles y costosas., - Seleccionar, el proceso basado en las mayores diferencias entre las propiedades

del producto y las de sus contaminantes,

El producto deseado puede ser intracelular o extracelular, usualmente los productos extracelulares son de bajo peso molecular (1 00 - 700 : aminoácidos, antibíóticos, esteroides), o de alto peso molecular (1000 - 100000: péptidos y enzimas), y están acompañados de una menor cantidad de contam[nantes.

1.4.5.1 Productos ¡ntracelulares

Generalmente la mayoría de las protelnas producidas por bacterias manipuladas genéticarnente no son excretadas al licor sino que precipitan dentro de la célula. Los lfpidos y algunos antib¡ót¡cos también púeden ser productoS intracelulares.

1

-4.5.1 .1 Separación de células

El criterio empleado con mayor frecuencia para la recuperación de células es la

remoción inicial del componente más abundante. La centrifugación és una operación unitaria eficiente en la separación de partículas de tamaño mayor que 5 /m y densidad ligeramente mayor que la del agua. En el caso de partfculas más pequeñas pueden usarse técn¡cas de coagulación y flocul'ád¡On. Las pérdida de células durante Ia centrifugación varfa entre 1 y 5'o/o. La filtración recupera todas las célu'las, excepto cuando hay ruptura o lisis. Generalmente las células son separadas mediante centrífugas de disco, microfiltros y ultrafiltros.

39

1.4.5.1.2 Ruptura de células

Las proteínas intracelulares pueden estar presentes en forma natural

o

desnaturalizadas. Los productos desnatural¡zados generalmente son insolubles. Algunos productos intracelulares están localizados en el espacio periplásmico

entre la membrana

y la pared celular. La ruptura de las células se logra

mediante homogenizadores de alta presión (500 de bolas, o choque osmótico.

-

1000 atmósferas), molinos

Después de romper las células y liberar el producto se requiere la remoción de

los restos celulares mediante una o varias de las siguientes operaciones unitarias: centrífugación, microfiltración, ultrafiltración, destilación y filtración (filtro rotatorio, filtro prensa). Si el producto es soluble se recupera del efluente de la centrífuga o delfiltrado. Si el producto es insoluble generalmente hay necesidad de resuspender y centrifugar repetidamente la fase pesada. Cuando no es Suficiente el lavado con agua se emplean detergentes en Solución para remover simultáneamente otros contaminantes.

1.4.5.2 Productos extracelulares

Uno de los criterios empleados con mayor frecuencia para la recuperación de productos extracelulares es la remoción inicial de contam¡nante más fácil de separar. Los productos extracelulares usualmente son separados mediante

centrffuga de discos, filtro rotatorio al vacío, microfiltración, ultrafiltración y flotación. En algunos casos la separación del oroducto eh un filtro rotatorio requiere la utilización de ayudas filtrantes y la formación de una precapa. En algunos casos la cantidad de ayuda filtrante es igual o mayor que la cantidad de producto recuperado. El principal inconveniente del filtro rotatorio es la separación o la disposición final de la mezcla de precapa y producto. La centrífuga produce usualmente una pasta formada por 57 - 70 o/o en volumen de sólidos y el resto líquido. El producto se recupera mediante sucesivos lavados y centrifugaciones. .40

1.4.5.3 Purificación final del ptoducto

Las etapas de purificación depbnden del grado de pureza requerido. Generalmente los productos'farmacéuticos requieren alta pureza. En otros casos la purificación final se límita a un secado o a una remo6ión de solventes'

Los procesos.y operacioneS unitarias empleados usualmente en lngeniería BioquíÍrica en la purificación de productos son: filtración, microfiltración, ultrafiltración, ósmosis inversa, evaporación, destilación, deshidratación, extracción, inteicambio iónico, adsorCión, Separaciones cromatográficas, esterilización y estabil¡zación del producto.

1.4.5.3.1 Filtración de células

a través de membranas

Las membranas const¡tuyen una alternativa a la separación de células mediante centrifugación. Entre los tipos de células separados usualmente por membranas están los virus, hongos, levaduras y células de tejidos animales. El flujo de una

suspensión a través de una membrana puede ser perpendicular o tangencial a la superficie filtrante. La filtración con propósitos de esterilización se realiza generalmente mediante flujo perpendicular y las partículas de mayor tamaño quedan retenidas sobre la superficie del filtro'

En la filtración en flujo tangencial el fluido se desplaza paralélamente a la superficie filtrante. Las partículas de tamaño mayor que el diámetro de poro al ser arrastradas por el fluido limpian la superficie del filtro, En la remoción de cétulas se logran caudales entre'1O0 y 1'000 veces mayores en flujo tangencial que en flujo perpendicular. La filtración a través de membrana§ es un sistema hermético ritil para ptevenir la formación de aerosoles en el sitio de la operación, aspecto muy importante cuando se manejan microorganismos patógenos O recombinantes,

41

1.4.5.3.2 Extracc¡ón líquido-líquido de antibióticos

Una etapa importante en la producción de antibióticos es la recuperación del producto presénte en el caldo de fermentación. La extracción líquido-líquido es un método efectivo y económicp para la recuperación y concentración de un número importante de antibióticos. Estas separpciones son realizadas en unidades dg contacto centrífugo como el extractor de Podbielniak diseñado para manejar en condiciones de hermeticidad sistemas altamente ernulsificados y líquidos con pequeñas diferencias de densidad. Los cortos tiempos de residenc¡a característicos de estos equipos, previenen el riesgo de degradación del producto por acción del calor, por hidrólisis, o por reacciones enzimáticas indeseables durante la operación de extracción.

1.4.5.3.3 Recuperación de ant¡b¡óticos y proteínas med¡ante ¡ntercambio iónico

La secuencia de operaciones para tra recuperación de antibióticos y proteínas mediante intercambio iónico en lechos fijos o en lechos fluidizados es similar a la empleada en la industria qufmica: Después de cargar el intercambiador y realiza¡ el contacto con el caldo de fermentación se remueve et caldo residual

mediante lavado, A continuación, una o varias etapas de contacto con el solvente apropiado remueven el antibiótico, El solvente residual se remueve media.nte lavado. Finalmente se regenera el intercambiador para emplearlo en,un nuevo ciclo después de un nuevo lavado para remover el medio regenerante. Los intercambiadores ionicos ut¡l¡zados normalmente en la remoción.de antibióticos y proteínas son macromoléculas hidrofílicas basadas sobre celulosa natural regenerada o modificada tales como carboximetil, dietilaminoetil, sulfopropil y derivados cuaternarios.

42

1.5

APTICACION DE LOS LENGUAJES DE SIMUTACION EN INGENIER!A

La aplicación de los lenguajes de simulación digital constituye uno de los aspectos m᧠imilortantes de la moderna éducación en ingeniería. El estudiante plantea las ecuaciones de balance de materiales, balance de energfa, cinét¡ca y fenómenos de transporte, que a su juicio, representan mejor el comportamiento de un proceso, El lenguaje de simulación provee medios simples y directos para resolver los conjuntos de ecuaciones simultáneas que conforman el modelo básico.

Aunque los resultados de una simulación constituyen probablemente sólo una primera aproximación del comportamiento del sistema real, estos resultados confrontados con los datos experimentales, aumentan el grado de comprensión del sistema real y ayudan a mejorar el modelo. Además la disciplina lograda mediante el análisis de un comportamiento complejo, de acuerdo Con Ia teoría disponible, expresada en forma de ecuaciones matemáticas, constituye una herramienta poderosa para entender las interacciones entre causa y efecto en un sistema real. El éxito de esta metodología se basa en la posibilidad de obtener una solución numérica inmediata, los detalles del procedimiento numérico son manejados por el computador, mientras el usuario concentra su atención en los aspectos relevantes del problema real de ingeniería'

1.5.1

Etapas en el planteam¡ento y Ia solución de un modelo

El procedimiento de formulación

y

simulación de un modelo comprende

usualmente las siguientes ot¡pas: - Definir los límites de la región de

control. Estos límites pueden ser las paredes

del recipiente o una superficie de separación entre fases. - Examinar diferentes modelos físicos y especificar los objetivos del proceso de simulación con el propósito de plantear el problema.

43

-

Expresar:

la tegría disponible mediante relaciones matemát¡cas tales como

ecuaciones diferenciales simultáneas y ecuaciones algebraicas. Estas ecuaciones son generalmente ecuaciones de balance para cada una de las propiedades extensivas del sistema tales como masa, energía, o elementos químicos; ecuaciones de velocidad de transferencia de masa, de energía y de flujo de componentes individuales a través de los límites de la región de control; ecuaciones d.e generación o de consumo de especies individuales dentro de la región de control; y ecuaciones que relacionan las propiedades termodinámicas tales como presión, temperatura, densidad y concentración ya sea dentro de la región de control, ,como en el caso de las leyes de los gases, o a uno u otro lado de un llmite entre fases, como en el caso de la ley de Henry.

- Especificar el conjgnto de variables del modelo. Estas variables corresponden a las del problema pero están restring¡das de manera que sólo pueden cambiar de acuerdo con las ecuaciones del modelo.

- Verificar la validez de los datos producidos por el computador, en forma de tablas o de gráficas, con los valores teóricos o experimentales expresados, La validez de la solución obtenida depende de la conformidad del modelo con el sistema real.

La solución de ecuaciones por simulación digital se realiza med¡ante

una

secuencia de operaciones lógicas y aritmét¡cas sobre lps variables del proceso. La solución de ecuaciones diferenciales se asocia con métodos numéricos de integración y rutinas tales como las de Runge-Kutta-Merson, Gill y Gear, etc. El usuario del lenguaje de simulación, de acuerdo con la dificultad del problema, selecciona la rutina adecuada. Durante el proceso de integración son evaluadas simultáneamente las velocidades diferenciales de cambio de todas las variables del modelo, con el propósito de obtener nuevos valores de las variables mediante pequeños incrementos en el tiempo o en la longitud de la etapa de integiación. Generalmente las fallas del procedimiento de integración están relacionadas con el tamaño de esta etapa, ajustable de acuerdo con algún criterio de error.

44

1.5.2

Lenguajes de simulación continua

La mayoría de los lenguajes de simulación digital están constituidos por los nombres de las variables y conjuntos de operadores FORTRAN, BASIC, qASCAL. Estos lenguajes de simulación continua IACSLI provéen al programador de la potencialidad del lenguaje estandarizado de alto nivel, junto con las características de cada lenguaje part¡cular.

El lenguaje /S/M, (lSlM, 1983. Simulation Sciences, 36 Ladybridge, Ave' Worsley, Manchester M28 5 BP. Salford University Business Serv Ltd. lnglaterra), utilizado en algunos ejemplos de simulación en este texto, es un lenguaje similar al FORTRAIy', con la estiuctura básica de un lenguaje ACSL caracterizado por tres regiones: lNlTlAL, DYNAMIC V TERMINAI, además de una región opcionalde control. En la región lNlTlAL se anotan los valores de las constantes y se efectúan los cálculos previos a cada ejecución del programa, Las ecuaciones del modelo se escriben en la región DYNAMIC, y en la región TERMTNAL se desarrollan los cálculos y se obtienen resultados en forma gráfica

mediante el comando GRAPH, o tabular, mediante el comando ouTPUT.

El programa tSlM resuelve ecuaciones diferenciales por diferentes métodos seleccionables con el comando ALGO. Así, ALGO : 0: corresponde al método de Runge-Kutta de 5o orden de intervalo variable; ALGO : 1: Runge-Kutta de 40 orden de intervalo fiio; ALGO : 2: Runge-Kutta de 20 orden, intervalo fiio; ALGO : 3: Runge-Kutta de 2o orden implícito. En la solución de algunos de los ejemplos desarrollados en este libro se utilizan simuftáneamente los programas lSlM V GWBASIC con el propósito de confrontar estas dos herramientas de calculo, facilitar el estudio del comportamiento de

algunos de los modblos más importantes en lngeniería Bioquímica y mot¡var al lector hacia el desarrollo de nuevos pfosFamas' La discusión de algunos temas como la evaluación de parámetros cinéticos a partir de datos experimentales, en el Capftulo 5, perderfa su enfoque práctico sin la ayuda de programas como el tStM, GWBAS|C y AUATTRO.

45

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51

-t

CAPITULO 2

BALANCE DE MATERIALES

Las consideraciones estequiométricas constituyen elfundamento del diseño

mdios de-c*ecimienb del @ntrol de

bioproeesos Bor computador,

é:¡

y de los

requerimientos de.transf_erencia de,cakmy d,e r.R_asa,.{Cooney et a|.,1977}. Un adecuado conocimiento del metabol¡smo conduce a la determinación de los compuestos que intervienen en el balance de materiales de un bioproceso. Las reacciones,,del anabolismo ut¡l¡zan los materlales producidos en el catabolismo de la fuente de carbono. Los átomos de los diferentes elementos son reordenados en los procesos metabólicos y la cant¡dad total de cada elemento, incorporada en la célula, es igual a la cantidad removida del ambiente.

En la concentración de células generalmente están incluidas las grandes moléculas complejas formadas en el anabolismo. La concentración de biomasa es el punto de partida para la evaluación del consumo de sustrato. Todos los elementos requeridos para la formación de compuestos tales como ADN (ácido desoxirribonucleico) y ARN (ácido ribonucleico), o para la formación de productos, o de subproductos part¡culares del metabolismo, deben tenerse en cuenta én la ecuación de balance. 52

,<

2.1

BALANCE GENERAL DE MATER¡ALES

l-a ecuación general de balance para los componentes representados en la Figura

2.1, es: (velocidad de act¡mulación de componente i) = (velocidad de entrada de i al s¡stema) - (velocidad de salida de i del sistema) + (velocidad de generación de ... a2.11 componente il - (velocidad de consumo de componente i)

Figura

2.1

Corrientes utilizadas en los balances de masa y energía de un reactor microbial.

Blomosq

Fuente de corbono

Pnoducto cu2

0xigeno

La aplicación de la Ecuación [2.1] requiere el conocimiento de todas las reacciones metabóticas que ocurren en la célula. Esta dificultad desaparece si en el balance se ut¡lizan elementos, con la ventaja de que estos no se pueden generar ni consumir:

(velocidad de acumulación del elemento i) = (velocidad de entrada de i a! ..-12.21 sistema) - (velocidad de salida de i de! sistema) En el caso dL procesos continuos, o de procesos por lotes a una escala de t¡empo mayor gue un lote, la ecuación anter¡or se convierte en, (Burns, 1989): (velocidad de entrada de elementos al sistema) = (velocidad de salida de elementos del

sistema)

-.-12-31

53

-r 2.2

-

BALANCE DE ETEMENTOS.OUIMICOS

Aunque las células contienen muchos elementos, un análiqis elemental demuestra que el 95o/o del flujo de materia puede explicarse únicamente con cuatro elemenros: c, N, H y o, {Roels, 1980) . El azufre y el fósforo entran en el balance de mater¡ales de los procesos donde se forman prodqctos consti-

tuidos por cantidades,apreciables de estos elementos.

2.2.1

Velocidades específicas de consumo.de sustrato, crec¡m¡ento de biomasa y formación de producto

'r

Las siguiente ecuación, válida para medios mínimos, donde.la fuente de carbono

es ut¡lizada en la producción de biomasa y energía, reemplaza las ecuaciones estequiométricas globales (Ecuaciones 2.1, 2.2 y 2.3]r:

As+AOz=Lr+ACO2+Lp

12.4'l

Donde, s, Or, x, CO2, pi concentración de sustrato, oxfgeno, células, COr, y t producto, respectivamente.

t4;7frr-1dx'+1dco2*L@x & x ú Í & x ú x, & .

t2.s1 ..:-

Los diferentes térm¡nos de la Ecuación t2.51 son conocidos como velocidddes especlficas:

1ds v,=;e

12.61

Donde, ¡r.: velocidad específica de consumo de sustrato, (moles sustrato).(mol células.h)-1, o en (g sustrato).(g cél.hora)-1. . l

1 doz .. lro" = ; dt 54

fz.7.l

v

.r Donde, plOzi: velocidad especlfica de consumo de oxfgeno, (mol Or).(mol células.hora)-1

,

1dx ,r=;A Donde,

t2.81

pr: velocidad especffica de crecimiento de biomasa, hora-l. llcoz =

1 ;

dCOz

t2.91

d,

Donde, U(.COrl: velocidad especlfica de producción de COr, (mol COr).(mol células.horal-1

.

1do pr=iá Donde,

/r:

12.101

velocidad especffica deformacióh de préducto, (mol producto).(rnol

células. hora)-1.

Cuando las velocidades especfficas, definidas en las ecuaciones anteriores, son reemplazadas en la Ecuación [2.5], se obtiene la siguiente expresión para el balance de materiales; Fs

2.2.2

.t l¡o, = l¡¡ * Vco, +

Fe

12.111

Balances de carbono y oxígeno

El balance de carbono, expresado en términos de la Ecuación 12.1 11, es: ds.F.y =

dx.lrx + uc,fco¿ + cr.l¡r

12.121

Donde, os, oy, o¿, opi carbono en el §ustrato,'en las células, en el CO, y en los

pfoducto§, respeclivamente, g c/mot,

55

El balance de oxfgeno, expresado en térm¡nos de la Ecuación f2.1 11,. es:

[or=A.Vs -B.Fx -C.ltp

t2.131

Donde,4: oxfgeno requerido para la combustión del sustrato hasta CO, HrO y NH, si el sustrato contiene nitrógeno. mol O./mol sustrato; 8: oxlgeno requerido para la combustión de las células:,secas hasta CO2, H2O y NH3, mol Orlmol células; C: oxlgeno requerido para la combust¡ón de los productos hasta COr, H! y NH., si los productos contienen nitrógeno, mol Orlmol producto, La Ecuación t2.131 es útilpara conocer un cociente metabólico no determinado éxperimentalmente, Por ejemplo, puede calcularse la velocidad de consumo de

sustrato de un microorganismo, si se conocen

Ejemplo

lx

y /(Oz) cuando /p es cero.

2.1 Balance de elementos quím¡cos

en una fermentación

anaerob¡a

En la producción de etanol mediante cultivo continuo entran al reactor glucosa

y amonlaco en condiciones estériles y salen biomasa y etanol. Las células crecen y se reproducen continuamente para reponer la biomasa retirada. Determinar los requerimientos mfnimos de amonfaco y glucosa, para producir 7666 litros/dfa de etanol, (densidad: p : 789 kg/m3). Suponer que un mol de . glucosa se convierte en

0,7 moles de producto y en biomasa, CO, y

Suponer que la fórmula de los microorganismos es

agua,

CH1,e4Oo,2eNo,2E.

Solución:

- La ecuación de balance de biomasa es: aC.H,rOu.+

bNHr:

cCH,,roOo,rnNo,r,

+

dCH3CHTOH

+ eCO2 + f H2O

- La velocidad de flujo molar de etanol es:

¿=

da ms 7gg&- not T6ñtuo dla W s 1000 linos ¡s O,W kg d

56

= 1,522 mol etanol/s

,,, .

De acuerdo con las condiciones del problema:

: i -

1

tr

iai

,, _---_t

.,

d

,52210,7 :'2,174 mol glucosa/s.

-

0,7 a. Por consiguiente: a

:

- Ecuaciones de balance de elementos quím¡cos:

C: H: O: N:

.

Y-

'

6a: c+zd+e 12a+ 3b:1,94c+6d+2f 6a=O,29c+d +2e+f b:0,25c b : 1,839 mol amonfaco/s c:7,356mo1 células/s e : 2,644 mol COrls

,

. ''lr

L'

2.3 BALANCE POR EL METODO DE ELECTRONES DISPONIBLES

'¡/

Los eleegones disponib.les para la transfesencia de oxfgeno en la combustióa de un o@rnpuesto hasta C0r;.1ügua y amonlaco, son los ocupantes de los orbitales'electrónicos externos; los de mayor energfa, en el átomo. Estos electrones son intercambiados eh las reaeciones qufmicas normales. En términos generales, los microorganismbs, en condiciones estables, obtienen

carbono, nitrógeno y energia, del ambiente.'Además, en el crecimiento aerobio los microorganismos óbtienen del ambiente un aceptante electrónico oxidado, el oxfgeno.

Lq energía requerida para impulsar el proceso de la vida es geneiada por el aceptante de los electrones, al recibir los electrones provenientes del sustrato, fuente de carboho y energía, o de la fuente de nitrógeno, para luego retornarlos al ambiente en una fqrma reducida.

57

Además, p!99g-g-u,onerse que er número totar de electrones_exter.os se conserva' por tanto, er número de equivarentes erectrón¡"o. ¿Lpo^;;,r;; ,; fórmula de un compuesto orgánico es 4 para C, 1 para H, _ 2 para Oy _ 3 para

//. El número de erectrones disponibres es una medida der contenido de energfa de un compuesto,

2'3'1

Grado de reducción de un compuesto orgánico

El grado de reducción de un

compu ae#fjtrefumO el número de equivalentes de#trones disponibles por cons¡gu,"^i", ., dB# ," fórmula elementar de un compuesto es : c"HnooNn,,,entonces ,

Nu El

gradodo,r.e&rccisry

er número de

Nro, es:

f,

=

4.c + ht2-o - 3.n

,

12.141

de este compuesto hipotétíco es:

))"

2.3.2 Balance de electrones

12.151

disponibles

El balance de electrones disponibles de un proceso aerobio sín formación de prciductos no celulares tal como el proceso aerobio de obtención de levadura de panaderla a.partir de glucoSa,.se expresa como:

0¡.I5 * 0o.Io Donde, Q5, o6,

ó*-I, J

t2.16I

16 CO, + 16 HrO

- 9784,5 133

3.3.3 Ciclo eirergético dé'las"células

tos tres núcleótidos: ATP, ADP Y AM? representados en la Figura 3.2, están presentes en todas'las células. La suma de sus concentraciones es relativamente constante, en la niayorfa de las células varía entre 5 y 15 mM.

Figura

3.2 ATP, ADP v AMP,

a pFt ZO. Los enlaces ricos en energfa apárecen representados por el sirñbOlo -,(Lehninger, 1973).

o- o-

o-

o1l

oil

llt o-P,-.o-P:o_cH, -g-Poil

1.,

K.,H

OH

O}I

ATP

Complejo de

Mg" y ATP

,MS:'

ttr

-O-P - O-P - O-P-O-

llillr ooo

Ribosa-Adenina

sin embargo, las proporciones relativas de ATp, ADp

y AMp en la célula varían considerablemente de acuerdo con su estado metaból¡co. Los nucleótidos ATp y ADP están presentes en la célula como complejos: MgATp2- y MgADp-, a causa de la afinidad de los grupos pirofosfato por los cationes divalentes y por la elevada'concentrac¡ón de Mg2* en el fluido intracelular.

134

Un indicativo útil del estado energético de una célula es la carga energética (Atkinson, 19771: corga energéti* =

¡3.271

ffi

Asl, por eiehplo, una célula "plenamente cargada" con ATP como

único

nucleótido tiene una carga energética de 1,0. Si las concentraciones de los tres nucleótidos son iguales:

\ATPI:IADP):IAMP) y la carga de energía es 0,5, (Bu'lock y Krístiansen, 1987). ,l En la mayorfa de las células el valor de la carga energética varía entre 0,87 y 0,94. La carga energética alcanza su mfnimo valor cuando las células están en la fase exponencial del crecimiento, en este caso el ATP es ut¡lizado tan pronto como se forma. A medida que la velocidad de crecimiento disminuye, aumenta la cantidad relativa de ATP, y la máxima carga eriergét¡ca se alcanza cuando las células termidan su crecimiento y todo su ADP y AMP es convert¡do en ATP. La posición intermedia del trifosfato de adenosina, ATP, en la escala termodiná'

mica de energÍas del enlace fosfato (Tabla 3.1) y la especificidad de las enzimas

de transferencia del fosfato hacia el difosfato de adenosina, ADP, o hacia el ATP, demuestran que el sistema ADP-A IP es el intermediario común obligatorio en el transporte de los grupos fosfato, desde los fosfatos de elevado ninel energético formados durante el catabolismo, hasta los receptores de fosfato de baio nivel energético. El 1 ,3 difosfoglieerato y el fosfoenolpiruvato, formados durante la degradación

anaerobia de la glucosa hasta ácido láctico, en lugar de experimentar hidrólisis en la célula intacta, ceden su grupo fosfato mediante enzimas especlficas, para forma¡ ATP:

l,3difosfoglicerato + ADP

fosfoenolpiruvato

(:=)

+ADP (::)

3fosfoglicerato + ATP

aG"':-18,9kJ

t3.281

piruvato +ATP AGo'

= - 31,39 kJ

I3'29I

135

Donde la reacción t3.281 es catalizada por la enzima fosfoglicerato-quinasa y la t3.291 por la piruvato quinasa. La.energfa liberada por los ésteres fosfórjcos provicrie, no de los enlaces que se rornpen, sino del hecho de que los produc,tos tidm¡i,'rnenor energíb lhre flotafi¡iie tos reactivos ,. ,t Q o'1o v z ty't a cr Hay muchas enzimas que catal¡zan la transferencia de un grupo fosfato, desde el ATP hasta aceptantes específicos de fosfato; para formar compuestos de ba.io contefl¡do de energía:

ATP + glicerina --gliceroguinasa--> ADP + l-glicero-3-fosfato

...AG"': -21,3kJ ATP + D-glucosa --hexoquinasa--->

t3.301

ADP + D - glucoso-G-fosfato ...4G"': - 16,7 kJ t3.311

La variación de la energÍa libre total de una reacción es la diferencia entre las energfas libres estandarizadas de hidrólisis de los reactivos y de los productos. Así, por ejemplo, en el caso de la reacción [3.28], los valores de AG"' para 1,3 difosfo glicerato y ATP, son respectivamente, - 49,4 y - 30,5 kJ/mol, (Tabla 3.1). Por consiguiente, el cambio de energía libre de esta reacción es: - 49,4 (- 30,51 = - 18,9 kJ.

y D-glucoso-6(Tabla fosfato, son respectivamente 30,5 y 13,8 kJ,(mol)-J, 3.1). Por consiEn el caso de la reacción t3.311, los valores de AG"' paraATP

guiente, el cambio de energía libre de esta reacción es: - 30,5 -(- 13,81

:

-16,7

KJ,

Generalmente el ADP es el producto de las reacciones gue utilizan ATP en la célula, y el ADP es el aceptante direqto del fosfato en las reacciones que ceden energía. Algunas reacciones utilizan ATP y dan lugar.a la formación de monofosfato de adenina ÁMn y pirofosfato lPPil, como en el casode la activación enzimática de un ácido graso para formar su éster con el coenzima/:

+ CoA-SH+ATP (::> ácido coenzima graso A

R.COOH

136

AMP+PPi +

R-CO-S-CoA

Acil-CoA del ácido

graso ---l

...t3.321

El pirofosfato inorgánico experimenta h¡dról¡sis, por acción de la pirofosfatasa,

y forma dos moléculas de ortofosfato inorgánico:

PPi

+ H2O ---> 2 Pi

En las reacciones de biosfntesis el .4 TP cede energía med¡ante la liberación de un grupo ortofosfato, Pi, o de un grupo pirofosfato, PPi, para convertirse en ADP o en AMP, respectivamente. El AMP se refosforila hasta ADP por acción de la enzima adenilato-quinasa, conocida también como mioquinasa:

AMP+ATP ADP + Pi

...AG'' = - 30,5

kJ/mol

a la

t3.351

Análogamente, la hidrólisis del ADP da lugar a la formaci6n de AMP y su fosfato inorgánico Pi:

ADP + HOH.> AMP + Pi

...4G"'= -30,5 kJ/mol

t3.361

Donde el valor de la energía libre estándar de hidrótisis del ATP, o del ADP, LG' : - 30,5 kJ/mol, supone que el pH es 7 ,O; la temperatura 37 oC; que hay iones Mg2* en exceso, y que los reactivos y productos están presentes en concentración lM. EI valor estándar de AGo' = - 30,5 kJ, no es aplicable en las condiciones de la célula ¡ntacta, donde el pH y la concentración de Mg2* difieren

de las condiciones estándar. Además, las concentraciones de ATP, ADP y

'137

fosfato en la célula intacta no son 1 M. El valor de la energta libre de hidrólisis delATP en una célula intacta, en condiciones reales, es - 52,31 kJ, (Lehninger, 1973l., valor obtenido después de efectuar las correcciones para pH, y concentraciones de Mg2*, ATP, ADP y fosfato, en elfluido intracelular. La energía libre de hidrólisis del ATP no es constante sino que varía con la edad y el sitio dentro de la célula y con las concentraciones locales de Mg2* , ADp y fosfato,

3.3.5 Principio de! intermediario químico común

ATP actúa en la célula como un intermediario qufmico común al conectar las reacciones liberatorias de energla con las reacciones que la precisan. Este mécanismo se muestra en las dos ecuaciones siguientes, donde Xrepresenta un donante de grupos fosfato, I es un aceptante, Er y E, son las enzimas específicas que transfieren fosfato, y P representa el grupo fosfato: El

--) X + ATP

t3.371

ATP + Y --E, --> ADP + Y-P

t3.381

X-P + ADP -- E1

La ecuación t3.351 muestra que la hidrólisis del ATP libera una elevada cantidad de energfa libre y, al invertir la reacción y añadir fosfato al ADp, se almacena energía libre para ser util¡zada posteriormentg. El concepto de intermediario qufmico común se ilustra a continuación mediante

un ejemplo tomado de la ruta Etnbden-Meyerhof-Parnas (Figura 1.3). En este caso se utiliza la oxidación de un aldehído, en medio acuoso, hasta ácido carboxílico, reacción que produce un cambio de energía libre de 29,3 kJ/mol, energía qufmica que sería disipada en una solución aislada:

R-CHO

138

+

HOH

--> 2H + R-COO-+ H* ..AGo' = - 29,3 kJ/mol t3.39I

Esta reacción no ocurre en la célula viva, En la oxidación bioquímica, cuando el 3 fosfogliceraldehído se convierte en ácido carboxflico (3 fosfoglicerato), se recupera enzimáticamente ATP a parltir del ADP. Por consiguiente, la oxidación del aldehfdo hasta ácido carboxílico se realiza prácticamente sin cambio de energfa libre:

R-CHO

+

H{PO4)2-

+

ADP3'

---> 2H + RCOO +

ATP4-

AG'': 0

t3,4OI

La energía capturada por la célula se obtiene al restar la Ecuación 13.391 de la Ecuación t3.401: ADP3-

Ejemplo

3.1

+

H(PO4)2-+ H*

-->

+ HOH AG"': + 29,3 kJ/mol ..t3,41I

ATP4-

Eficiencia de la célula en el proceso de captura de energía en la reducción de pituvato hasta lactato

Los microorganismos obt¡enen energía mediante la degradación delácido láctico,

en el proceso anaerobio de reducción del piruvato hasta lactato, por acción de la enzima lactato deshidr"ogenasa:

2 Piruvato + 2 NADH

+2H'->

2Lactato + 2 NAD*

...13.421

Calcular la eficiencia de la célula en el proceso de captura de energía.

Solución:

- La ecuación global de la glucólisis por la ruta EMP es: Glucosa

+'2 NAD* + 2 ADP + 2 Pi ---> 2 Piruvato + 2 NADH + 2 ATP + 2'H2O + 2Ht

...t3.431

139

- La ecuación global hasta lactato es la suma de las dos ecuaciones anteriores:

Glucosa

+ 2ADP + 2Pi --> 2Acidoláctico + 2ATP + 2H,O AG"': - 135,6 kJ.(mol glu.)

1

...f3.441

- Esta ecuqción se descompone en dos procesos: a- degradación de la glucosa:

Glucosa

--> 2 Acido láctico AGo'= - 196,7 kJ.(mol glu.)1

...t3.45I

b- energía capturada por la célula:

2Pi + 2ADP-> 2ATP + ZHrO AG"': + 61,1 kJ'(mol glu.)-l ..'t3.461 Aparentemente la ef¡ciencia de la célula para capturar energla es: (61 ,11196,71x100 = 31 ,1 o/ó. La eficiencia real del proceso és, aproximadamente, 53 o/o. Este valor se obtiene mediante la corrección de los datos de energía libre para las concentraciones y pH predominantes en el sistema vivo. (Bailey y Ollis, 1986).

3.4

EVALUACION DE ENTALPIA Y CALOR DE COMBUSTION

3.4.1 Datos termod¡námico5 de algunos compuestos repf esentativos

La evaluación numérica del balance de energía de un proceso bioqufmico sólo es posible mediante datos de entalpfa y contenido de entalpía libre de los compuestos que participan en el metabolismo. En numerosas aplicaciones del

balance de energía se util¡zan valores de las cantidades termodinámicas en qondiciones estándar de temperatura y presión (generalmente 298,1 5 K y 140

101,325 kPa, respectivamente) con los reactivos en concentración 1 M' Estas

condiciones. no son apropiadas para describir la energfa de un sistema microbial, donde las concentraciones del ion H* y la del agua difieren ampliamente del

valor 1 M.

Tabla

3.3

Datos termodinámicos de algunos compuestos representativo§' (Roels, 1987). ago

Compuesto

ago

kJ/mol

Acido fórmico Acido acético Acido palmftsico Acido ]áctico Acido glucónico Acido oxáIico Acido succfnico acido máIico Acido cftrico Glucosa Metano Etano Pentano Metanol

cH2o2

28L

CxHaO2

8

94,

c]6H3202

9800

c3H603

L377 2667

c6Ha2o.7

327 1599

c2H2o4 c4H604

L444 2L47 2872

c4H6os c6H8o7 c6H12o6

8L8

CHn

1467 3385 693

CrH.

CrH., cH4o

EtanoI

c2H6o

13 19

GIiceroI

c3H803

l-643

Amonio

NHnt

Acido nitroso Acido nÍtrico Sulfuro de H Acido sulfuroso Acido sulfúrico

HNO,

Biomasa

cHl,

355

8L,4 7,3

HN03

323

H,S

-249 -507

H2S03 H2SO4 8oo . sNo

,2

54L

236 844 9583 L322

255 876 9989 1359

2593

238 1500 1345 1998 2843 813 14 5 8 3367 682 1308 1629 316 41

246 1493

7329 ]-963 2807 892 1-562

3533 728

1369 1663 383

,5

- 32,5 243 -329 -587 536

-

30

247

-329 -602 56 0

141

Los datos termodinámicos basados en cant¡dades molares parciales no son una propiedad de una sustancia dada. Estos datos están relacionados con las propiedades de una mezcla integral y con las concentraciones de los componentes presentes en el punto donde ocurren las reacciones químicas. Por consigu¡ente, en diversas aplicaciones, las condiciones estándar son modificadas de manera que la entalpía libre y la entalpía del agua son evaluadas como las correspondientes al agua líquida libre, y para la concentrac¡ón de ion hidrógeno se utiliza el valor correspondiente a pH 7,0. Estas consideraciones sólo afectan los cambios de entalpfa libre, ya que los cambios de entalpla son menos dependientes de la concentrac¡ón de los reactivos involucrados. En la Tabla 3.3 se presenta un resumen de datos termodinámicos de algunos compuestos representativos. En la Tabla: ago, es la entalpía libre de combustión referida a condiciones estandarizadas en el sentido estricto, kJ.{mol) 1; ago', es

la entalpía libre referida a las concentraciones modificadas de ion H* y agua; AHo, es el calor de combustión evaluado bajo condiciones estándar.

3.4.2

Calor de combustión

Diferentes autores (Erickson, 1980; Ho y payne,lg.7g), han observado que el calor de combustión de la biomasa microbial por electrón disponible, aHr,r, es prácticamente constante. Ho y Payne (1 979), informaron un valor promedio de - 26,8 (kcal)/(electrón equivalente), (- 112,2 kJ/electrón), dentro de un intervalo entre - 26 y - 31 kcal/electrón. En ausencia de datos experimentales, el calor de combustión de las cétulas y el

de otros compuestos orgánicos, se calcula como la energla obtenida por la transferencia de electrones, desde un compuesto con grado de reducción l-, hasta compuestos como el co, y el agua con grado de reducción cero. Roels (1987), presenta las siguientes ecuaciones para estimar datos termodinámicos con una razonable aproximación:

kl

^fl,=-(115)r mol C

142

kI AII"=-(115).lVEd ' 'molfucompucsto

^c:=La

Ecuació

(94,¿.f + 86,6) k/ t¡wl C e¡ cl comptusto

n ,r.OT expresa la proporcionalidad

13.471

t3.48I

directa entre el calor

de

combustión del compuesto (por mol de carbono) y sus respectivo grado de reducción, o sus respectivos electrones disponibles, Nro. La Ecuación t3.481 permite calcular la entalpfa libre de combustión (por mol de

C en el compuesto). Estas ecuaciones indican que las entalplas libres de combustión de los compuestos con menor grado de reducción, como la del ácido oxálico, exceden los respectivos calores de combustión, mientras que lo contrario ocurre con los compuestos con alto grado de reducción, como en el caso del metano. Este comportamiento se explica por la contribución de la entropía a la entalpía libre de combustión (Ecuación 3.211.

El calor de combustión de las células y de otros compuestos orgánicos se calcula a partir del oxígeno requerido para su combustión, según los conceptos mencionados anteriormente sobre energla disponible por electrón equivalente:

r, _

A rlzt6

A

4E

L,H^ 'v=

26,8 keal

112,2kJ

el¿ct¡ón

electrón

t3_49I

kJ .l_*"t gn* - 112,2 elcct¡ón mol O,

t3.50I

LHo =

- ffi,74

H mol O, consumido

Donde, AHo: es el calor de combustión evaluado sobre la base del oxígeno consumido.

[3.50], es un valor promedio, similar a los 443,7 valores teór¡cos informados: v 452,1 kJ.(mol Orl-'y cercano del valor determirrado experimentalmente: 5'19,1 kJ.(mol Or)'', (Nagai, 1 979). El valor de AHo dado por la Ecuación

143

L~s. Ecuaciones [3.491 y [3.501 expresan el calor producido en cualquier clase de cultivo, sumergido o. semisólido, cuando 'en el proceso únicamente se produce biomasa sin la formación de productos no celulares .

.

Servizi y Bogan ( 1961 ), observaron que la energía estándar libre de combustión, t.Gº, de numerosos compuestos tales como carbohidratos, intermediarios del ciclo del ácido tricarboxílico y algunos productos de la glucólisis, es:

AG"

= -

(485,6).M0

kJ

(3.51J

mol sustrato

()onde, M 0 : moles de oxígeno requeridos _para la oxidación completa de 1 mol de su~trato. La energía estándar libre de combustión de los compuestos aromáticos, alcohóles y ácidos alifáticos, es:

AG" = - (435,3).M0

kJ

(3.52]

mol sustrato

Según Hattori (1973), el valor de M 0 es:

Mo=~ 32

(3.53)

Donde, DQO: demanda química de oxígeno, gramos de oxígeno por mol de sustrato. La energía estándar libre promedio de sustratos combinados se calcula mediante la siguiente ecuación: [3.54) s se calcula a panir de reducción de la Donde: M;: moles del i-ésimo sustrato; t.Gº;: energía completa del sustrato i.

144

(A HJc =

3,5

CALOR DE REACCION

cultivo industrial es un ya que este calor y fermentador, un de operación diseño aspecto importante del para mantener la temperatura óptima de crecidebe removerse continuamente miento. Sin embargo, la determinación experimental del calor producido en una El conocimiento previo de la producción de calor en-un

fermentación sólo es posible a pequeña escala, debido prácticas del análisis calorimétrico'

a las dificultades

*'1'J ni"L-{"< (ti'""l r,:4l'irl,#7, 7a; 'o@fot

'¿'

producido'durante el )%?ra" La determinación indirecta del calor de reacción, aa¡lian+a .,^ l..atan¡a ¡la entalpía: anfrlnía' a) -^^l:-^ - -- -r-.-'---L^^ de un balance se realiza mediante crecimiento microbial, -:^-^L:^l

A

HR =

A I¡,.(-As)

- »AEP.AP -

AII,,AX

t3.s5I

Donde, AH^: calor de reacción qeatoñp¡edr*c(o.durantael-clecirnieotQ, kJ.l-1; y AH*: calor de combustión del sustrato, los productos y las células, aHs, ^Hp respect¡varnente, kJ/mol; As, Ap y Ax: concentración del sustrato, los productos y las células, respectivamente, mol/litro. La ecuación [ 3.55], escrita sobre ia base de 1 mol de C en el sustrato, se convierte en: (^

nJ.

=

(A

¡rJ. - (rpd". (a Ep), - (yxd". (L rr )"

13.561

Donde, (AH*)": calor producido durante el crecimiento microbial, o calor de reacción, evaluado sobre la base de 1 mol C en el sustrato, kJ.(mol C en el sustrato)-1. (Y*,.t": rendimiento de sustrato en células, mol C en cél.(mol C en el sustratol-1; (Yr,r)": rendimiento de sustrato en producto, mol C en producto.(mol C en el sustrato)'1; (AHs)", calor de combustión del sustrato, kJ'(mol C en el sustrato)'l; (AHr)": calor de combustiÓn del producto, kJ.(mol C en producto)-1, {valores de la Tabla 3.3 divididos por el número de átomos de C en el respectivo compuestoli AHxr = -26,8 (kcal)/electrón: -112,2 kJ/electrón; (AH*)": Calor de combustión de las células en kJ.(mol Cen cél)'1. El calor de combustión de las células se calcula a partir de la Ecuación [3.49] y el grado de reducción de Ia biomasa:

(^ H)" = -

112,2

#r-

elcctrón

mol C cél

t3.571

145

f t'

\

il' J

3.6

§

3.6.1

D¡SIPACION DE ENERGIA Y EFICIENCIA TERMODINAMICA

Disipación de energía

f( ,L,V

r\

(.

Los electrones no'conservados en la biomasa constituyen la fuente de energfa disipada en el proceso de crecim¡ento (Roels, 1987):

<

{ \ { \ *

T.tr, = (a c'')r¿.(0r.I,

-

0x.Ix

'Á*.) )'A-'

t3.581

Donde, nr: producción de entropla, kJ.K'1.s'1; (Ag"')ro: cambio de entalpía libre para la transferencia de un mól de electrones entre el sustrato y e¡ aceptante de

los electrones, kJ.(mol electrón)'1, (Tabla 3.4); T: temperatura absoluta, K. Roels (1987)¡-define la energfa,disipada en el proceso de crecimiento mediante la función de disipación D:

D=+=(Le")r¿.

t3.59I

Donde, D: función de disipación, kJ.(rnol C en cél)-1; tD*: velocidad de flujo de células, mol cé|, s-1; M,.: peso moíeiular de las células, (g cé|. secas).(mol C en cél)-r; Y*,..: factor de rendimiento de los electronps disponibles, g cé|.(mol electrOnl¿lrJfcuación 2.331; l-^: grado de reducción de la biomasa: electrones dispgnibles (mol C en células)'1.

3.6.2

Eficiencia termod¡nám¡ca

flujos de materia que abandonan un sistema no puede exceder la entalpía libre de los flujos combinados de materia que entran al sistema. La energla y una función de estado derivada, tal como la entalpfa libre, no tienen un valor único y sólo pueden determinarse con respecto a un nivel de referencia. El contenido de entalpía libre de los

146

Una base realista para el nivel de referencia de los microorganismos, es la energfa contenida en una mezcla deCO", HzO, N2 y Oz, ya que en ausencia de otras formas de energía,- diferentes de la energla qulmica, los organismos no pueden obtener energla útil de tal mezcla para su metabol¡smo. La entalpla libre o contenido de entalpfa de un compuesto qufmico con respecto a este nivel de referencia es, por tanto, igual a la entalpía libre o entalpla (calorl de combustíón hasta COr, HrO, y Nr. Una vez definido el sistema de referencia, la eficiencia termodinámica se define como la relación entre la entalpía libre de fós flujos de materia que salen del sistema y la correspondiente entalpía libre de los flujos combinados de materia que entran al sistema. Roels (1987), define la eficiencia termodinámica, con respecto a la producción

de biomasa, como:

rlr

(Le') =

(ag")",

cx

t3.601

+D

Donde, (Ag"').*: entalpía libre de combustión por mol de C en la biomasa, kJ.(mol C en cél)-1, (Ecuación 3.48); D: función de'disipación, kJ.(mol C en célulasl-1, (Ecuación 3.59). En la Tabla 3.4 se observa, en el caso de crecimiento aerobio, que el cambio de entalpla libre por la transferencÍa de un mol de electrones, Ago'¡¿, es prácticamente igual al cambio de entalpfa (calor de combustiónl, (Ah"').¿. La producción de calor es casi iguaf a la disipación de energía libre y un tratamiento en funcién

de calores de combustión es suficientemente exacto, En el

crecimiento anaerobio, los valores de (Ag"'le¿ son mayores que los de (Ah"')e¿, (Tabla 3.4). Si además se considera que la disipación total es similar, tanto en los procesos aerobios como en los anaerobios, entonces la producción de calor por unidad de

biomasa producida es menor en los procesos anaerob¡os. En la Tabla 3.4 también se observa que el crecimiento aerobio sobre sustratos altamente reducidos tales como metano, metanol y etanol, se desarrolla con mayor producción de calor y por consiguiente con menor eficiencia termodinámica,

147

Tabla,3.4 Disipación de calor y de entalpía libre, y rendimiento en biomasa de los electrones disponibles, para diversas combinaciones entre el sustrato y el aceptante de los electrones. (Ah")rr: disipación de calor bajo condiciones normalizadas de temperatura y presión con los reactivos en concentración 1 M; Yr,ro: rendimiento de los electrones en biomasa, g células. (electrón dísponiblel-1;

(Ag.'lro: cambio de entalpla libre baio condlciones modificadas (la entalpía del agua se toma como la del agua líquida libre y la concentración de H* es la corres-pondiente a pH 7; (Roels, 1987).

Sustrato

Aeeptante de Ios electroneg

o2

111,5 LzL ,3 ]-t4 ,1

u2

L18,I

Metano

o2

Metanol EtanoI

o2

icerol Acido Iáctico Gl

Glucosa

ecldo succfnico Acido cítrico Acido má1ico Acido fórmico Acido succÍnico lcido succfnico Acido succfnico

Affru kül (nol

o2 w2

o2 o2

o, ñ v2

(NO3)- --> (NO2)- -->

N2

114,1 1t6 ,7 L06 ,6 109,1 110,8 127,5 100,6

N2

A9"'¡.i

Y4¡a

electr6n) 9/e 101, 6 1]-3,7 109, 0 l]-6 ,4 110, 1 118,5 ]-07,L 111, 0

LL2,t 118,0 100,6 727,0 107,1

1

,56

2,27 , 2 ,l'7 3,55 ,26 ,84 2 ,90 3,09 , 3, 18 3 3

3,t7 2,28 2 ,77-

Glucosa, Glucosa Glucoga

CO, (etanol) * CO, (ácido láctico) CO, (propiónico/

2,9 2,9 7,6

t2,9

2,76 3,26 0,88 0,81 7,48

Glucosa

ácido acético) Co, (metano/ ácido acético)

6r7

i4 ,4

1, 63

-2 ,0

3,9

0,36 0, 91 0 ,27 0 ,4L

Gfuconato

Acido acético Metanol

Acido fórmico Acido propiónico

o2

106,6

7L7

o2

CO, (metano) CO, (metano) @, (métano) CO, (metano)

9r

8

l-5,0 -2 ,3

|I

9,5 8r3

t2;0 : 16,4 4,0

- Los productos del metabolismo anaerobio figuran entre paréntes¡s

148

3.7 EFICIENCIA ENERGET]CA DEL CRECIMIENTO MICROBIAL

La generación de calor por la actividad catabólica se define como:

LHar, = A¡Ir.(-As)

- E t'ttr't'P t3.611

AHor=Atrf¡+AHr'LX Donde, aH"or: calor generado por catabolismo, kJ/litro; aH^: calor de reacción, kJ.litro-l; aHx , aHs, AHr: calor de combustión de las células, sustrato y producto, respect¡vamente, kJ.(mol)-1; Ax, As, Ap: concentración de células, sustrato y producto, respectivamente, mol/litro. La ecuación t3,61lexpresada sobre la base de 1 mol Cse convierte en:

(LHc^)" = (AEJc

- E(yow)c.(A,rrr)c

13.621

La eficiencia energética del crecimiento microbial es la relación entre la energía

de enlace qufmico incorporada en las células y la energía de enlace químico disponible de los procesos catabólicos, (Lynd, 1989):

rlx

gs)"-(LH)c =

13.631

(r*d".(ÁHr)c + (AflJs El calor de reacción por mol de C en el susirato consumido depende de la eficiencia energét¡ca del crecimiento microbial y de la energía potencialmente disponible para crecimiento, (AH.or)":

(LH),

= (1

- ¡r)-(Aflc.J.

t3.64I

149

Ejemplo

3.2 Determinación del'calor de combustión de las células y del calor generado por mol de O, consumido

Las siguientes ecuaciones estequiométricas del crecimiento de Saccharomyces cerevisíae (Battley, 1960) sirven como ejemplo para 'analizar la producción de calor durante el crecimiento;

- Crecimiento anaerobio con glucosa como sustrato: C6H'2O6

+ O,12 NH3 : 0,59 CH1,7sOqorNo,, + 1.3 C2H6O

glucosa

células

etanol

r 0,43 CaH8O3 + 1,54 CO, + 96,3 kJ glicerol - Crecimiento aerobio con glucosa como sustrato: C6H,2O6

+ 3,84 O, +

O,29 NH3

=

1,95

..,t3.OSl

"

CHr,72Oo,ooNo,,r

células

+ 4,09 CO, + 4,72H2O + 2005,1 kJ ...t3.66I - Crecimiento aerobio con etanol como sustrato: C2H6O

+ 1,82 O, + O, 15 NH3 =

1,O3

CHr,72Oo,44No,r5

+ 0,97 CO, + 2,31 l-l20 + 853,9

kJ

...t3.67I

Calcular el calor de combustión de las células y el calor generado por mol de oxígeno corlsumido, en el crecimiento-de Saccharomyces cerevisr,ae, (Ecuaciones 3.65,.3.66 y 3.621. Solución: El calor de combustión de las células, según la Ecuación t3.551, es:

LHx

150

=

Aflr.(-As) - E ÁH".Ap - AH, A¡

El calor generado por mol de oxígeno consumido AHo es: a

¡no =

afl^

¡i

Donde, AH^: producción de calor durante el crecimiento; AO: moles de oxígeno consumido. En la Tabla 3.5 se presenta un resumen delprocedimiento seguido y los resultados obtenidos para As : (1 mol de sustrato).(litrol-l.

Ejemplo

3.3 Determinación

de los calores de combustión de la biomasa y otros compuestos ofgán¡cos

Calcular el cator dé combustión de la biomasa y el de los compuestos orgánicos que intervienen en las Ecuaciones de crecimiento [3.65], [3.66] y [3.67], y confrontar los resultados obtenidos, con los anotados en la Tabla 3'5.

Sotución: A continuación se presenta la muestra de cálculos para la biomasa en la Ecuación t3,671. Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 3.6.

- Número de electrones disponibles, Nro, (Ecuación 2.14}.: Ne¿

: 4 + 1,72 - l0,44ll2l

- (0,15)(3)

:

4,39

- Oxígeno requerido para la combustión de 1 mol de células hasta CO, y agua: CH1,72Oo,44No,.,u

*

1,1 Oz

= CO, + 0,15 NH3 + 0,635

H2O

- Calor de combustión de la biomasa, AH^, (Ecuación 3.471:

aHx

:

aH"

:

- (115)(4,39)

:

- 504,85 kJ/mol

- Calor de combustión de la biomasa, AH*, (Ecuación 3'50):

AHx: AHo:

-1448,74l'1',1,1)

= -493,6kJ/mol 151

: ,

Tabla 3.5 Determinación del calor de combustión de las células, AHr, y del calor

generado por mol de oxígeno consumido, en las ecuaciones de crecimiento Saccharomyces cerevisrae, [3.65], t3.661 y t3.671.

aH"

o1, Ecuacl.ón

kil,/mol

kü/1ttro .

6s]

96

,3

fa.bIa

aH,

aP

fu/mol

mo1,/1itro rnol/liEro

1359 J.663

1,3

3 .3

2807

0,59

.

[3

.56]

2005,1

2807

1, e5

13.67)

8s3,s

L369

1,03

PeEo

k,r/mol [3

.

6s]

36s

41:-;Z

[3.56] f.3

,9

.57)

s00

,

1

AH,

cé1u1ae

g/mo1 23

,7s

22,86 22

,86

kú

l1t

0,43

-\

AO

AHo

mol/litro

kü/¡ro1

15,41

L7,.99 I s,84

s22,2

21,,88

469 ,2

1.82

3.6

Determinación del calor de combust¡ón de las células compuestos orgánicos por d¡ferentes métodos, Ejemplo 3.3:

Tabla

Cou¡lueeto

N"o O, para Eeu. conbuetl6n: 12..L41

moleg : c.H,,o" 24 Etanol: C,H.O t2 Glicerol: C=H'O. 14 Gl-ucosa

Biomasa

152

3 3,5

y

otros

Calor de cobuEtión kü/nol

Ecu. t3 .471 27 50 .?807 1369 1380 7663 1610 Tabla 3

.3

Ecu. t3 .50I 2692

,4

L346,2

7570,6

.

cH1,r2oo,44No,1s

4'39

---

arr

[3

Eeuaclón At!

de

1'1

550

504'8

493'6

De acuerdo con Baileyry Ollis (1986), el peso de las células secas, evaluado experímentalmente, incluye aproximadamente un 10% de cenizas. Por tanto:

AHx

:

- (493,6)(0,9) = - 444,24 kJ/mol

AHx

:

l- 444,24 kJlmollll22,86 g.cé|./mol)

:

- 19,43 kJ/g

Según Kargi y Moo-Young (1985), los valores tlp¡cos de AH^ se encuentran entre 20 y 25 kJ/(g.células).

3.4

Eiemplo

Determinación de Ia producción de calor bajo repies¡ón por glucosa

El efecto de la represión por glucosa queda demostrado en el crecimiento aerobio de S. cerevisiae, en medios con altas concentraciones de azúcar, donde se forman productos no celulares aún en condiciones de plena aeración. En este

caso el sustrato es metabolizado por dos caminos separados: uno es la ruta gluculítica, donde se forman productos no celulares, tales como etanol, glicerol y COz, el otro es la ruta oxidativa donde el agua y el CO, son los productos finales. Evaluar la producción de calor bajo represión por glucosa en el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae, Ecuaciones [3.65] v t3.661. Solución: - El coeficiente estequiométrico y la fórmula de los microorganismos se ajustan a 0,61 CHr,72Oo.44No,1s, ofl la Ecuación [3.65], con el propósito de simplificar cálculos.

- La ecuación de crecimiento de S.cerevisiae, bajo represión por glucosa, es promedio aritmét¡co de las ecuaciones t3.651 y t3,661: C6H12O6

+

0,65

1,92 O, + 0,21

C2H6O

+ 0,215

NH. : 1,28 CH',rrOo,noNo,,u

C3HBO3

+ 2,82 CO, + 2,36

el

+

H2O

+

105O,7 kJ

't53

:l

- El calor generado en 9l proceso de crecimiento de S- cerevisiae, bajo represión por glucosa, puede calcularse como el promedio ar¡tmético de los calores de

reacción correspondientes a las Ecuaciones t3.651 y t3.661, (1050,7 kJ), o calcularse mediante la Ecuación t3.5SI: AHB

:

AH.

-

(AH.l.(-As) -

t

AHp.Ap - AHx.Ax

2807 - (0,65)(1369) - (0,215)(1663) glicerol

sustrato etanol - 1.28(365,9 +

41

1,2112

:

.-

AHR

:

1O62,26kJ

cé[ulas

Los calores de combustión del sustrato y demás compuestos orgánicos fueron tomados de la Tabla 3.3, El calor de combustión de las células es el promedio arimét¡co de los valores calculados para las Ecuaciones t3.6Sl y t3.661, tal como se muestra en la Tabla 3.5. El valor calculado 11062,26 kJ), coincide con el valor promedio (1OEO,7 kJ), obtenido de las Ecuaciones t3.651 y t3.661. por consiguiente la Ecuación t3.S5l

es apropiada para evaluar la producción de calor bajo represión por glucosa.

3.8

FACTORES DE RENDIMIENTO DE ENERGIA EN BIOMASA

Los balances de entalpla expresados en las ecuaciones t3.ssl

y t3.61I const¡tuyen la pase de los factores de rendimiento de energía en biomasa: LHR=

^flr.(-As)

-XL,Hr.h,p - AH,.Lx

LH"^, = Alls.(-As)

-t

[Ecu.3.55]

AHr.Áp t3.61I

Atn=AIl¡+LHx.Lx

154

Donde, AH^: calor de reacción o calor producido durantb el crecimiento, kJ.(litro) 1; AHs, AHp y AH*: calor de combustión del sustrato, los productos y las células, respectivamente, kJ/mol; As, Ap y Ax: concentración del sustrato, los productos y las células, respectivamente, mol/litro; AH.or: calor generado por catabolismo, kJ.(litro)-1.

3.8.1

Factores de rendimiento basados en e¡ calor producido durante el crecimiento m¡crobial

El factor de rendimiento basado en el calor de'reacción, o calor producido durante el crecimiento microbial, se define como: (Ynol^ =

*k t3.681

(Ynrl*

=

Lx

A¡rr.(-As) - E

tH,tp -

LH*.Ax

Donde, (Y*,rr)^: rendimiento basado en el calor de reacción, (g células secas)/kJ. En el caso de crecimiento aerobio sin formación de produetos no celulares, Ap 0, y la ecuación anterior se convierte en:

:

(Ysol*=ffi

t3.691

Esta ecuación también'se expresa como:

t3.70t

Donde, Yro: rendimiento del sustrato en célutas, (g células)'(mol sustrato)-1; AHr: calor de combustión del sustrato, kJ/(mol sustrato): AH,,: calor de combustión de las células, kJ.(g cél)-r, (Tabla 3.3).

155

Generalmente los hidrocarburos producen más calor que las especies parcialmente oxigenadas-. ,fsl, Oor ejemplo: (Yvrrl",rr^¡,o¡ ) (Y¡¡¡¡)ys1¡¡6 Por consiguiente, los reactores que contienen sustratos con mayor grado de reducción requieren mayores remociones de calor, aspecto muy importante en el estudio de factibilidad económica de un proceso (Bailey y Ollis, 1986). El calor de reacción,

o calor producido durante el crecimiento microbial, en

el

crecimiento aerobio sin formacíón de productos no celulares, puede calcularse, aproximádamente, a partir del oxígeno consumido (Ecuación 3.50):

.^HR = LHo.LOz

=

t3.71I

*ol o' kI - ffi.74 ' mol 02. Lo^' Iitro

3.8.2

Factores de rendimiento basados en la energía total disponible en el med¡o

El factor de rendimiento basado en la energía total disponible en el medio se

define como: (Y¿o),

Lx LHr,+ AHx.Lx

13.721

Donde, (Yr,*r)r: rendimiento basado en la energla total d¡sponible en el medio, (g células secas)/kJ. El primer término del denominador de esta ecuación expresa la energía liberada por catabolismo y el segundo la energía incorporada biosintéticamente en el material celular. Si la expresión para AH"o, (Ecuación 3.61) se remplaza en la ecuación anterior se obtiene:

"(Ytr),

156

=

A¡ LH*.Ax + AIls.(-As)

-»

LHp.LP

Yilt

t3.73I

L,II..Y4s a AtrI5 -» AHP.Y4I

Donde, Ax, As, Ap; concentración de células, sustrato y producto, respectivamente, g.litro-l; AHx, AHs, AHr: calor de combustión de las células, sustrato y producto, respect¡vamente, kJ.g-t; Yro, Yr,.: rendimiento de sustrato en cétulas y de sustrato en producto, respectivamente, g.(g sustratol'1, En un medio complejo prácticamente toda la fuente de carbono es util¡zada en la producción de energfa y una porción muy pequeña de la fuente de carbono es asimilada en células (Bauchop y Elsden, 1960). En un medio mfnimo una porción de la fuente de carbono es metabolizada por las vías b¡os¡ntéticas y el resto por las vfas catabólicas. La fracción del sustrato convertido en células es:

(As)ce¿ =

2 c1

f3.74t

^,

Donde, As"rrl sustrato convert¡do en células, (mol sustrato).(l¡tro)-1; Ax: concentración de células, (mol células). (litrol-1; o2i (g C en células). (mol células)-1 ; a1: (g Cen sustrato).(mo! sustrato)-t. La fracción del sustrato convertida en energfa, es:

(As)." = ' 'q

6t

r _ uz.Ax) c1.AsJ t

t3.751

¡1

El calor generado por las reacciones de catabolismo en un medio mínimo, (AH6¡1).., (Ecuación 3.61), se define como:

(LHc^)^= aas.as.(, -

Z "r,)

E,

ta,.tp

t3.761

157

Y el factor de rendimiento basado en la energía total disponible en el medio mfnimo es:

(Yxu),

A¡ AHur + L,H*.Ax

=

13.77t

yrt, AHx.Yx^ a

AII¡

I

l,\ar- I "o,) » !np.yils

3.8.3 Factores

de rendimiento basados en la energía liberada por catabolismo

Elfactor de rendimiento basado en la energía liberada por catabolismo se define como:

( Yrw )o,

=

Ax

AHr.(-As)-Etnr.tp

A.r

LII^ + AH*.Ax t3.781

Ynt

Afl, - E AHr.Y$ Donde, aH^: calor de reacción o calor producido durante el crecimiento, kJ.(l¡tro).1; AHs, AHp y AFlr: calor de combustión del sustrato, los productos y las células, respectivamente, kJ/mol; As, 4p y Ax; concentraeión del sustrato, los productos y las células, respectivamente, rnol/l; Y¡¡s, YpTs: rendimiento de sustrató en células y de sustrato en'producto, respectivamente, g. (g sustrato)-1 . El factor de rendimiento basado en la energía liberada por catabolismo, en el crecimiento aerobio sin formación de productos no celulares, se puede calcular a part¡rde la siguiente ecuación obtenida alreemplazar Ia Ecuación t3.71len la Ecuación t3.781:

158

(Ysr)"

,

=

LH^ A,H- + ------" ^ yrto

Donde, AHo: - 448,74 kJ.(mol O, consumidol en células, (g cél).(mol Or)1.

Ejemplo

3.5 Evaluación

'

t3.791

; Y*,o: rendimiento de oxígeno

de rend¡m¡entos basados en energía

Calcular los factores de rendimiento basados en energfa para el crecimiento aerobio de Saccharomyces cerevisiae en etanol. Suponer que la ecuación de crecimiento aplicable a este problema (Battley, 1960) es: C2H6O

+

1,82 O, + 0,15 NH3 : 1,03

CH1,72Oo,44No,ts

+ 0,97 CO, + 2,31

H2O

+

853,9. kJ

- Datos: - calor de combustión del sustrato:

aHs':

- Calor de combustión de las células: AH*

1-369 kJ/mol'

-

500,1 kJ/mol,

(Tabla 3.3) (Tabla 3.5)

- Producción de caibr durante el crecimiénto microbial calor de reacción: AHR

:

853,9 kJ/litro.

- Concentración del sustrato: As

=

1 mol/litro.

- Peso molecular de las células: 22,86 (g cél)/mol. - Concentración de células: Ax

Ax

:

=

1,03 mol/litro.

(1,03 mol/litrcl122,86 g/mol) : 23,54 g células/litro 159

-

Concentración de los productos: en este caso no se forman productos no

- Rendimiento del sustrato en células: Yxrs

=

1,03 mol cél/mol sustrato

- Rendimiento de oxlgeno en células: Yxro

:

(1,03/1

,821:0,567

mol céllmol O,

Solución:

-Rendimientobasadoenelcalorqueacompañaelcrecimientomicrobial,(calor de reacción), (Ecuación 3.68): (1,03 nnl

(Ynul^

cé04fi3

=O'O27699f ';

Este factor también se puede calcular a partir de la Ecuación [3.70]:

(Yno)*=

ffi.ou,

cél = O.O27S s = 1369(1,Gt).(22,86) (1,03).(500,1) H -

- Rendimiento basado en la energÍa total disponible en el medio. De acuerdo con la ecuación de crecimiento no se.forman productos no celulares,

(Ap = g¡. Por consigu¡ente, (Ecuación t3.731:

Yr{t tY \ -Vxlktlt LHx.Ygs * aIIs

_

160

(1,03).(22,86) (500,1).(1.03) +

= o.O12S

1369

s

cél

H

- Factor de rendimiento basado en la energfa liberada por catabol¡smo: forman productos no celulares' De acuerdo con la ecuación de crecimiento no se

(Ap = 0), Por consiguiente, (Ecuación [3'78]:

!r,t-Y"

Vr¿¡)am

-

LH"

(1,09).(22,86)

1369

-E

Aflr.yw

= O.OflZ

I

,c!l

kt

t3'791: Este factor también se puede calcular a part¡r de la Ecuación

(Y*,)o,

=

W,74 kJlmol 02 0,566 mol céltmol O"

(Yw\o,

= 7.73.10-a

(Yru\o, = O,O1T1

g.8.4

»,86

#

4

#

Factores de rendimiento basados en ¡a generac¡ón de ATP

y 12'6 (g células Bauchop y Elsden (1960), obtuvieron valores entre 8'3 generación de ATP en el secasl/(mol ATP), para los rendimientos basados en la donde prácticacrecimiento aerobio de microorganismos en medios complejos, producción de energfa' El mente toda la fuente de carbono es utilizada en la sustrato número de moles de ATP sintetizados por mol de carbono en el partir del conocimiento a calculable catabolizado, o ganancia de ATP, G¡1p, eS en un orden de la ruta catabólica. Los valores de GATP varían aproximadamente cada micro' de magnitud, segrfn el sustrato y el metabolismo de energfa de organismo. 161

3.8.5 Factor

de rendimiento de ATP en biomasa en el crecimiento asociado a la energía

Un término útil en la evaluación del rendimiento de sustrato en biomasa, Yr., es la relación'entre el carbono celular sintetizado y el AIP disponible de los procesos catabólicosi Y^r¡rr. Para numerosos procesos microbiales, se ha encontrado que la relación Y^,o-,

es constante, con algunas excepciones (Stouthamer, 1973), e igual a 10,5 (g células)/(mol ATPI, con una desviación estándar de + 0,3 g/mol. Además, si se ut¡l¡za un contenido representativo de carbono en la célula de 46,2 o/o, porcentaje en peso seco, con una desviación estándar de2,3 %o, se obt¡ene:

yxun =

to,s

ffi

.

@,4,2)

mol C

s

cét{.

12gc t3.801

=

3.8.6

El

mol C O.44 '

cél'

mol ATP

Rendimiento de ATP en biomasa en el crec¡m¡ento no asoc¡ado a la energía

factor limitativo de algunos procesos es la velocidad de formación de uno o

más compuestos esenciales para la bioslntesis celular, en lugar de la velocidad

de formación de ATP. El exceso de energla es desechado como calor y el crecimiento no está asociado a la energía. Es el caso del metabolismo anaerobio de carbohidratos, donde con frecuencia los microorganismos siguen utilizando los carbohidratos, aún despues de cesar su crecimiento. En la producción de sake a partir de aftoz,la producción de alcohol y ql consumo de sustrato prosiguen después de detenerse el crecimiento de S. cerevisiae y el' exceso de ATP es desechado como calor. En este caso el caldo se refrigera para favorecer la productividad de alcohol (Nagai, 1979).

162

3.8.7 Goeficiente de rendimiento verdadero

Las células consumen sustrato para asimilarlo en masa celular, proveer energla para la sfntesis celular y proveer energía para mantenimiento. El término mante-

nimiento expresa la energla requerida por la célula para satisfacer act¡vidades tales como transporte act¡vo de iones y otras especies a través de las membranas celulares, reemplazar los const¡tuyentes celulares degradables Y preservar el estado celular.

As =

As¡¡ua¿rcroN

+ ASro"*

* ASrum*',,,noo

t3'811

Donde, As: concentración del sustrato, g.litro-1 , Esta ecuación es válida para organismos quimiotrofos, que utilizan el mismo sustrato como fuente de carbono y de energía. Si la ecuación anterior se divide por la concentración de biomasa, Ax, en (g células secas)/litro, por ejemplo, se obtiene:

1_1*A"*4" (Yn), (r*rr), a*,

Ax*

Í3.821

Donde los subíndices: V, A, C, M, indican respectivamente, verdadero, asimilación, crecimiento y manten¡miento. En esta ecuación el término (Y"¡s)¡, es una cant¡dad relativamente constante, estequ¡ométricamente def inida, mientras (Yx/s),, el coeficiente de rendimiento vefdadero, no lo es. La distribuc¡ón de! sustrato en los tres componentes indicadoS en la Ecuación t3'811 es variable. Una población en rápido crecimiento consume más sustrato para asimilaCión y crecimiento, en tanto que una población en reposo con§ume una mayor proporción de sustrato para mantenimiento'

3.8.8

Rendimiento máximo de ATP en células

El factor de rendimiento de sustrato en ATP, Yorr,", se evalúa a partir de información sobre las rutas bioquímicas establec¡das" o se calcula a partir de datos experimentales sobre la fuente de energfa utilizada, o sobre los productos 163

finales formados. El rendimiento máximo de ATP en células, {Y*ro.r}ro, evalúa mediante la ecuación, (Nagai, 1979):

Qlw -

frATP +

t3.83I

Donde, (Y^,^rr)r^r: rendimiento máximo de ATP en células, (g cél)/(mol ATH; Oorr: velocidad específica de formación de ATP, mol ATPllg cél.hl; rr.t.qrp: coe'ficiente de mantenimiento basado en la geneiación de ATP, mol ATp lg' cél.h)-1; p: velocidad específica de crecimiento de biomasa, h-1.

3.9

BALANCE DE ENERGIA

Las células consumen los sustratos que proveen la energía y las materias primas requeridas para la síntesis de nueva masa adicional. La energía libre de las sustancias nutritivas utilizadas es mayor que la de las células y productos del meta-

bolismo, Las células utilizan eficientemente la energfa química, pero, como en todos los procesos reales, parte de la energla disponible en el sustrato es liberada como calor. El balance de energía de un proceso es uno de los aspectos importantes de la lngeniería Bioquímica por la necesidad de mantener una temperatura óptima para

crecimiento o para formación de productos. Las dificultades prácticas del análisis cálorimétrico, especialmente en cultivos aerobios, limitan la determináción experimental del calor generado a los procesos a escala de laboratorio y de planta piloto.

3.9.1 Balance general de energía

una forma de la ecuación general de balance de energía aplicada a un caldo de fermentación; es: 164

Qutt * Qrc = Qrc + 4wt + Qrut + Lsnt

t3.841

- e¡¡rriveloc¡dad de generación de calor por la act¡vidad metabólica, kW

(:

kJ.s-

'). El término qr* describe el calor asociado con el crecimiento y mantenimiento de los microorganismos y también con la formación de productos. - qoo: velocidad de generación de calor por agitación mecánica y por aspersión de gáses.

- qo": velocidad de acumulación de calor. En condiciones estables. Q¡c : 0. En condiciones inestables, la qiguiente ecuación general describe la velocidad de acumulación de calor en un reactor:

qrc=E

!!P

t3.85r

Donde, l/: volumen ocupado por el caldo, litros; c,: concentración de componente ¿ kg.litro-1; H,: entalpfa del componente i, kJ.(k0)'1; t: tiempo, s.

En el caso de un reactor por lotes, bien agitado, la ecuación anter¡or se convierte en:

e^, =

Mr(C)".#

t3.86I

Donde, M,: masa total del caldo de fermentación, kg; 7: temperatura, oC; (Cr)-; capacidad calorífica media del caldo, kJ.(kg.oC)-1. En el caso de un reactor continuo de mezcla completa

(CSIA

ta gcuac¡On t3.85I

se convierte en:

Q,tc=Fu.G)^.Fq-T4)

t3.871

Donde, Fr: velocidad de flujo de masa del caldo, kg.s-t; To,, Trr: Temperatura media, del afluente al reactor y del efluente, respectivamente, oC.

165

- qrNr: velocidad de transferencia de calor entre el reactor y los alrededores o entre el reactor y el intercambiador externo. En condiciones establesi gr¡¡r : Qrver

*

Q¡c.

- erv¡pi velocidad de pérdida de calor por evaporación. El térm¡no qruo, incluye las pérdidas de calor producidas por la evaporación del agua en el aire dispersado en,las fermentaciones aerobias. Estas pérdidas son apreciables, especialmente cuando el aire dispersado se seca durante la compresión. Este efecto se evalúa a partir del balance de entalpla del aire que pasa.por el fermentador. Las pérdidas por evaporación se pueden eliminar, en el caso de cultivos aerobios, mediante la utilización de aire saturado a la temperatura del caldo de fermentación.

-

Qseri úelocidad de cambio de la entalpía sensible de las corrientes líquidas y gaseosas que entran o salen del bioreactor a temperaturas diferentes de la de

fermentación. El término q"., incluye los efectos sobre el calor sensible del equipo producidos por los cambios de temperatura.

3.9.2

Galor generado por la actividad metaból¡ca

El calor generado por la actividad metabólica,

qrrr, se evalua part¡r de la Ecua-

cién t3.841, después de calcular la magnitud de los términos restantes. Otro procedimiento consiste en evaluar qr* mediante datos de entalpía y contenido de entalpla fibre de los compuestos presentes en el metabolismo:

eam =

»

(FMi.H)s

- D (FMi.H)p

t3.871

Donde, Fr,: velocidad de flujo de masa de componente 4 kg/s; H,: entalpía del i-ésimo componente, kJ.(kg)-l; Los subfndices s y p se refieren al sustrato y a los productos, respectivamente. Los productos pueden ser celulares (biomasa) y no celulares. La Ecuación [3.87], expresada en términos del calor de reacción, se convierte en:

166

husr =

V'AH*'r,

t3'88I

Donde, V: volumen del caldo de fermentación, litros; AH^: calor de reacción (Ecuación 3.64), kJ/(mol C en el sustrato); r": velocidaQ de consumo de sustrato, (mol C en el sustrato).litro-1.s-1.

3.9.3 Calor generado por e! metabolismo aerob¡o

1

La velocidad de producción de calor por el metabolisme aerobio ha sido relacionada con la velocidad de consumo de oxlgeno por Cooney et a|.,{.1968!., para elcrecimiento de numerosos microorganismos con diferentes sustratos, en cualquier clase de cultivo, sumergido o semisólido, cuando en el proceso sólo se produce biomasa sin la formación de productos no celulares (Ecuación 3.50): ea¿r = (ffi,74).Qo2

t3.89I

Donde, e(O)r: velocidad de consumo de oxígeno, (moles de O, consumido)/s; qr.r: calor generado por el metabolismo aerobio, kJ.s-1 .

3.9.4 Calor generado por metabolismo

aerob¡o en un reactor por

lotes

La velocidad instantánea de generación de calor por metabolismo aerobio en un reactor por lotes (Bailey y Ollis, 1986), es:

,wr

=

Y.lt.r.á

t3.90t

167

:2 '

Donde, (Yr,*r)*: rendimiento en células del calor producido durante el crecimiento .t aerobio (Ecuación t3.70l), g céll(kJ); qrur: velocidad instantánea de generación de caor en el metabolismo aerobio, kJ.sl; V: volumen del caldo de fermentación, litros; ¡r*: velocidad específica de crecimiento, s-l; x; concentración de biomasa, (g cé|. secasl/litro.

3.9-5 Calor generado por metabolismo,

-

-

aerob¡o en un reactor

cont¡nuo -a

La velocidad instantánea de generación de cálorpor metabolismo aerobio en un reactor continuo agitado (C.SfPl en condicíones de flu;jo estable, (Bailey y Ollis, 1

986) es: (Ydu)R.(cMÉr)

= V.tr*, t3.91I

= (",

- ").r.(Y¡,) -

xrk¡.V

Donde, (Y¡7rr)^: rendimiento en células del calor. próducido durante el crecimiento aerobio (Ecuación 3.70), (g células).(kJ)-1; qr.r: velocidad instantánea de genera-

ción de calor en el metabolismo aerobio. kJ.s-1; V: volumen del caldo de fermentación, litros; p^: velocidad específica de crecimiento, s-l ; x: concentración de biomasa, fg células secas)/litro; so, s: conóentración del sustrato en el afluente y en el reaCtor, respectivamente, (g sustrato).litro-1; Y*,.: rendimiento del sustrato en células, (g células).(g sustrato)-1; F: caudal afluente al reactor, litro/s; k.: velocidad específica de metabolismo endógeno, s-'. Otra forma de la ecuación anterior es:

ryY Donde,

168

= F,

- s)'D'(rrJ (Yao)*

D -- F/V : velocidad de dilución, s-l.

¡'ft,

r3.e21

t

-,

-

3.9.6 Evaluación experimental delcalor generado por metabolismo

El calor generado por metabolismo o calor de reacción puede calcularse a partir

de una serie de mediciones de la temperatura media del caldo dé fermentación en un reactor operado en condiciones inestables. En la Figura 3.3 se muestra esquemáticamente un montaje experimental para la evaluación del calor generado por metabolismo, qrrr. El reactor es un tanque provisto de agitador y sensor de temperatura. Las pérdidas de calor por radiación y evaporación son despreciables. El intercambiador de calor puede ser un serpentfn colocado dentro del tanque, o una camisa alrededor del tanque, o un ¡ntercambiador de doble tubo, o de coraza y tubos instalado fuera del tanque. En la Figura 3.4 se muestra esquemáticamente la variación de la temperatura del

reactor

y su contenido durante la fermentación. El sistema de reactor e

intercambiador funciona inicialmente en condiciones estables, fiT/dil = 0, en el perlodo comprendido entre los tiempos t = A y t : B. El intercambiador remueve el calor generado en el reactor, La ecuación de balance de energía, aplicable en esta etapa del ensayo es:

gucr + Qte = Qntr = Ftu.Cil.(To

- Tr)

t3.93I

Donde, Qrurr, Qre, q,nr: calor generado por metabolismo, calor generado por agitación y dispersión de gases y calor intercambiado, respectivamente, kW (: kJ.s'1); Fro: velocidad de flujo de masa de agua, kg.s-'; cro: calor especlfico del agua, kJ.kg-1 oC-l ' Trr, Tro: temperaturas del agua efluente y afluente, respectivamente, al intercambiador, oC. En el tiempo t = B se desconecta el intercambiador, q,* - 0. El calor generado por metabolismo se acumula en el sistema balance de energía, aplicable en esta etapa del ensayo es:

Qtur + Qrc'=

y la ecuación

de

Q,rc

t3.94I

dT V. = LIIn.ts Qtc = V.Cp. dt

169

Donde, qo":calor acumulado en elreactor, kw; dr/dt: variación de-la temperatura del caldo de fermentación con el tiempo, oc.s-t, es la pendiente de la curva de la Figura 3.3 entre t : B y t : c; cr: capacidad calorífica global del reacror, kJ.litro-l.o6-t, (Tabla 3.h; v: volumen delcaldo, litros; rr:velocidad de consumo de sustrato, (mol C en sustrato).litro-l.s-l; AH^: calorde reacción, kJ.(mol Cen sustrato)-1

.

La Ecuación [3.94], utilizada en la'determinación del calor de reacción, o dbt calor generado por el.,metabolismo, a partir de una serie de'mediciones de temperatura y tiempo, se conoce como.aproximación de uhlich; Moser (1g8Bl. El intercambiador se conecta nuevamente en el tiempo t i= tc, (Figura 3.4), el calor acumulado en el reactor es removido del sistema y la ecuación de balance de energía, aplicable en esta etapa del ensayo, inrnediatamente después de t :

t",

es:

{3.9st

Lrc=4m

3.7 Datos tlpicos de calor específico y capacidad qalorlfica en fermenta(Cooney ción. et al., 1968). Tabla

Medio,

Calor

Gapacidad

especlfico

calorlfica

kJ.(kg. "G1.1

kJ.(litro.9,C)-1

Caldo de fermentación

4,186

4,228

Material de vidrio

0,837

0,290

Material de acero

0,502

o,039

Valor global total

170

4,504

Figura 3.3 Montaje experimental utilizado en la evaluación del calor generado por metabolismo. T"o, Tro: Temperaturas de los fluidos, caliente (caldo) y frío (agua), respectivamente, afluentes al intercambiador; T"r, Trr: Temperaturas de los fluidos, caliente y frio, respectivamente, efluentes del intercambiador.

Figura 3.4 Variación de la temperatura, T, del caldo con el tiempo, f, del ensayo. El sistema de reactor e intercambiador funciona inicialmente en condicionesestables, @T/dil - O,entre lostiempost: Alt: B. Enel : : B el intercambiador se apaga; y en el tiempo t tiempo t C se prende nuevamente.

Reqctor

Intercqnblodor

Figura 3,3

c

Tierrpo

t

Figura 3.4

zH"rrl-r;L, , oHcv*¡o.,tün , 414a.t.c4b Ejemplo 3.6 Balance de energía delproceso aerob¡o de producción de levadura a part¡r de glucosa Realizar el balance de energía del proceso aerobio de producción de levadura a partir de glucosa, analizado en el Ejemplo 2.2 y calcular: el calor de reacción, el

calor generado por las reacciones de catabolismo, la eficiencia del crecimiento microbial, la eficiencia termodinámica y la disipación de energía, 171

Solución: 1- Eeuación de.órecimiento, (Ejemplo 2.2l,:

+ 1,05 O, + 1,08 NH3 :4,31

C6H'2O6

*

CH1,e4Oo,3No,ru

1,69

CO,

2- La ecuacíbn de crecimientó'iescrita sobre la base de 1 mol '0" C sustrato; es:

óHro + 0,r75 o, + 0,18

NH3

:

0,719 cH1,s4oo.3No,r,

*

0,281

"n

co2

3- El calor de reacción, o calor producido durante el crecimiento

...(11

A '' ...i.21

microbial

(Ecuación 3.56), es:

(aH*)": (aHs)"-(Yp/s)".(AHp)"-(Y¡¡5)",(AHxl" '

Donde:

(YxrJ: = O,7"19 (mol C en células).(mol C en glu.)1 (Yp¡s)"

{AHs)"

:

0: (no hay formación de productos)

: l-2807tül : - 467,83

kJ.(mol Cen glucosa)'1 (Tabla 3.3},

Grado de reducción de las células:

CHr,e4Oo,3No,2E

f* :'4 + 1,94 - (0,3).(2) - (0,25).(3) : Calor de combustión de las células, (Ecuación

4,59

3,49): ,

,

AH *,,

= - 26,8 kcal/electróñ = - 112,2kJlelectón

(AHx)"

= (- 1l2,2kJlelectrón).{4,59 electrón/mol

:

C)

- 515 kJ.(mol C en".cél)'.

Calor de reacción, Ecuación (3): (AtlR)"

172

l.

.

.rt

:

- 467,83 - {10,719).(- 515) = - 97'54 kJ.lmol Cen glu,)1

:

(- 97,54).(6)

-

- 585,24 kJ.(mol

glu)-1

..

..(gl

<

4- Calor generado por las reacciones del catabol¡smo (Ecuación 3.62):

(AHcAr)": (AH5}"-E(Yoys)".(AHpi).

.,.(4)

Si se considera que no se forman productos no celulares: (AHcAr)"

:

(AHs)"

= - 467,83 kJ.(mol

C en glucosa)

5 - Eficiencia del crecimiento microbial, (Ecuación 3.63):

(Y4)c'(^II)c ñ (rryJ..$H)" + (A,H)¿ 'l¡

(0,719),(515) =0.79 n'' _ (0,719).(510 + 97,il 6 - Rendimiento de electrones en biomasa: De acuerdo con la Ecuación (2). elrendimiento de sustrato en biomasa es: (Y¡,51,

= O,719

(mol C en cétulas), (mol C en glucosa)-1. Por tanto:

(yt), = 0.719 nul C cü nol C gb

4

2.,24 g cél mol C slt nol C cél 4 ct¿ct¡,

s cél elecúon dirynibl¿ por

nnl C cn gfu.

7 - Energla disipada en el proceso de crecimiento, (Ecuación 3.591:

D=+ =t^e\. (# D=

',)

- l1o,s .(?f - o,*) = - r14,e #;A

173

,r

_

114,9

mol C

W cél

0,719 mol

mol C

C cél

glu

82§

_

kJ

mol C glacosa

Donde, M,: peso molecular de las células, 22,24 (g cé|. secas).(mol C en cél)-l; Ag"': cambio de entalpía por la transferencia de un mol de electrones entre el sustrato y el oxfgeno: 118,5 kJ.(mol electrón)-1 (Tabla 3.4); Yr,ro: factor de rendimiento de los electrones dispo¡ibles, (4 g cél).(molelectrón)-1; l-r: grado de reducción de la biomasa: (4,59 electrones disponibles).(mol C en células)-1.

I

- Eficiencia termodinámica, (Ecuación 3.60):

rlr

=

(as')cx (Ago)"* + D

(Ag')cx = 94,4.fr *

86,6

(Ág')cx = (94,4).(4,59) + 86,6 =

.,.(Ecu- 3,481

-

519,9

519.9 n- = -------l-lJL" 519,9 + 114,9 = O-[lB.

Donde, (Ag"'1.*: entalpfa libre de combustión por mol C en la biomasa, kJ.(mot C en células)'l, (Ecuación 3.48); & función de disipación, 114,9 kJ.(mol C en células) t.

Ejemplo 3.7 Balance de energía delproceso de obtención de etanol a part¡r de glucosa

Realizar el balance de energfa del proceso anaerobio de obtención de etanol a partir de glucosa, analizado en el Ejemplo 2.3 y calcular: el calor de reacción, el

calor generado por las reacciones de catabolismo, la eficiencia del crecimiento microbial, la eficiencia termodinámica y la disipación de energía.

174

Solución: 1- La ecuación de crecimiento (Ejemplo 2.3), es: C6H12OB

+ O,179 NHr: O,714 CH;,rooo,.No,rt

+ 1 ,728 C2HEOH +' 1,83 CO2

.,

...(1

)

2- La ecuación de crecimiento, escrita gobre la base de 1 mol de C, es: CHrO + 0,0298 NH3 : 0,119

CHr,s4Oo,3No,2s

+ 0,576

3-

El calor de reacción, (Ecuación 3.56), es:

:

(AHB). Donde, (Yx,.l.

:

CH3O.,5

+ 0,305

CO2

...121

o calor producido durante el crecimiento microbial

(AHslc - (Yr/slc.(AHp)6 -

(Y¡¡s)6.(AHx)c

..(31

0,119 (mol C en céll.(mol C en glu.)'1;

:

(Yp,s)"

0,576 (mol C en etanol).(mol C en glr"osa)-;

Calores de combustión,. (Tabla 3.1):

(AHslc

: l- 2807til : - 467,83

(AHplc

= (- 1369/21 =,o.684,5 kJ.(mol

Grado de reducción de las células:

f^ :

4"

kJ'(mol C en glucosa)-l C en etanol)''

CH1,e4Oo,3No,2s

+ 1,94' (0,3).(2) - (0,25)'(3) =

4,59

Calor de combustión de las células,.lEcuación 3.49): AHxie

(AHx)c

:

(-

11

:

- 26,8 kcal/electróo = - 112,2kJlelectrÓn

2,2kJlelectrón){4,59 electrón/mol O

:

- 51 5 kJ.(mol Cen

cél}-1

175

Calor de reacción, Ecuación (3): (AHR).

: - 467,83 - 0,'119(- 515) - {- 684;5 x 0,5761

: - 12,27 kJ.{mol C en glucosal-1 : l- 12,27!.(6) :

- 73,64 kJ.(mol glucosa).1

4- Calor generado por las reacciones del catabolismo (Ecuación 3.62):

AHcAr)c

:

(AHs). - (Yp/s)c.(AHp)c

:

(AHnlc

+

(Yx/s).{AHxlc

"'l4l (AHcAr)c

:

: -

- 467,83 - [- (684,50. (0,576]l 73,56 kJ.(mol

: - 12,27 + t- (515).(0,119)I

Cl-1.

5 - Eficiencia del crecimiento microbial, {Ecuación 3.63):

t^ _

(Y$s) c.(^ Hx) c

(Yxs)c.$Hx)c + (Aa"¡"

(0,119).(515) =on?? - vr(,go

Rendimiento de electrones en biomasa De acuerdo con la Ecuación (2), el rendimiento de sustrato en biomasa es: (Y*,.)"

:

0,119 (mol C en cél).(mol C en glu.)-t. Por tanto:.

tv | vdBtc

0,119 mot

C

cél 22,24 g cél nol C gtt¿ ' r*t C cét 4 tnr. "t

y_ lDc-

176

O,ffigcél por nol C en glacosa

el¿ctrón disponiblc

: , '*

7 - Energía disipada en el proceso de crecimiento,(Ecuación 3.59):

,=+=(as.)uÍ# =

_

r4

H - 9.s - .(2''24 - 4.s9) = - 2TG.52 nolCcél \0,66 )

_

H . 0,119 mol C cél _ _ 32,9 H mol C cél mol C ght mol C ght. 276,52

Ago': cambio de entalpla por la transferencia de un mol de electrones entre el sustrato y el etanol: 9,5 kJ.(mol electrónl'1 {Tabla 3.4}; Yxeo: factor de rendim¡ento de los electrones disponibles, 0,66 (g cél).(mol electrónl-1; l-r: grado de

reducción de la biomasa: 4,59 (electrones disponibles).(mol C en células)-l.

8 - Eficiencia termodinámica, (Ecuación 3.60):

rr =

(Lgolcx

(A,g")"* + D

(Ás")cx = 9l,4.Ix *

86,6

.....(r¿¿. 3.¡18)

(Ag')r = (*,41.(4,59)+ 86,6 = - ,,ll*9,Y

=

,,=gffi=o'65 519.9

Donde, {Ag''}"r: ehtalpla libre de combustión por mol de C en la biomasa, (kJ).(molCen cél)-1, (Ecuación 3.481; D:función de disipación,276,52 (kJ).(mol C en cé1.) 1.

177

PROBLEMAS

3.1

Se utiliza un reactor de mezcla completa para producir en cultivo continuo (composición de las células: CH1,B1Oo,51No,zr) bajo condiciones anaeróbicas, 12 (kg de glicerol)/(hora), a partir de glucosa y amoníaco. Suponer que el rendi-

miento de glucosa en CO, es de 0,54 moles de CO, por mol de glucosa. Calcular el calor generado en kJ/(mol de glicerol).

3.2

Suponer en el problema anterior que el rendimiento de glucosa en células

es de 1,8 {mol de células}/(mol de §'lucosa}. Calcular el calor generado en kJ/(mol de glicerol).

3.3 Se utiliza un reactor

por lotes para producir 4800 kg de ácido cítr¡co a partir glucosa. El rendimiento de de sustrato en células es 0,22 (g célulasl/(g glucosa) y el de sustrato en producto 0,58 (g ecidoli(g glucosa). La aeración se realiza con aire estéril lT: 22 oC, presión : 16 psial. Calcular en el calor producido por el cultivo en kJ/lote. Este calor debe ser retirado por el sistema de enfriamiento del reactor.

3.4 Fermentación alcohólica:

La ecuación global,de la glucólisis por la ruta EMP

ES:

Glucosa

+ 2 NAD* + 2 ADP + 2Pi ---> 2 Piruvato + 2 NADH + 2 ATP +2H2O + 2H*

..,(1)

En el proceso de ferm.entación alcohólica las levaduras cultivadas inicialmente en un ambiente aerobio'son luego somet¡das a condiciones anaerobias para degradar la glucosa hasta etanol y COr. El piruvato formado por la vía EMP se convierte en acetaldehído, por acción de la enzima p¡ruvato descarboxilasa:

2 Piruvato ---> 2 Acetaldehído

't78

+ 2CO,

,,,121

Glucosa

+ 6O, +.38ADP + 38Pi--> 6CO, + 38ATP + 44H2O

,

,,,(21

Bajo condiciones anaerobias, el NADH y el piruvato, son totalmente consumidos

sin oxidación neta, y estos dos moles de ATP representan el máximo rendimiento alcanzado (fosforilación a nivel de sustratol. La Ecuación (1 ) puede descomponerse en dos procesos: a- oxidación de la glucosa: Glucosa

+ 6 O, ---> 6 CO2 +

b- energía capturada por la célula: 36 ADP

6H2O

+ 36 Pi ---> 36 ATp + 36 H2O

calcular la eficiencia de la célula en el proceso de captura de energía y confrontar el valor calculado con la eficiencía real del proceso lmavo¡ .que 7oo/o, Bailey y ollis, 1986) obtenida mediante la corrección de los datos de energía libre para las concentraciones y pH predominantes en,el sistema vivo, la energía restante se disipa como calor que debe retirarse del sistema para mantener la temperatura óptima requerida por las células.

3.6 Calcular el factor de rendimiento de glucosa en células, basado en la energía total disponible en el medio mínimo, a partir de la siguiente ecuación estequiornétrica del crecimiento anaerobio de Saccharomyces cerevisiae,lBattley, 1960):

CBH12O6

+

glucosa

O,12 NH,

-

0,59

Cl=ll,7sOo,ouNo,,

células + 0,43

CaHBO3

+ 1,3 C2H6O

+

etanol "1,54

CO, + 96,3 kJ

glicerol

3.7 En la Figura 3.5 se presentan datos obtenidos por de Vries et a\.,1970, en el crecimiento anaerobio de Lactobacillus casei, en un medio. complejo con glucosa como fuente de energía.

Calcular el coeficiente de mantenimiento, ffirrp máximo en la generación de ATP, lYy¡a,pl¡¡¡. 180

y el factor de rendimiento

y.

3.5

Representaiión gráfíca de la velocidad especffica de formación de ATP, o.¡1p, en función de la velocidad especlfica de crecimiento de eélulas, p,,, de Vries et al., 1970. Problema 3.7. Fígura

28

(mmol ATP) /(9. celulas.hora)

24

20 16 12

a 4

o

o

o,t

o,2

0,0

0,4

0,6

0,6

Velocldad especiflca de creclmlento, l/h

0,7

0,a

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I r :':

1184

:

CAPITULO 4

CINETICA DE LAS REACCIONES CATALIZADAS POR ENZIMAS

4.1

TNTRODUCCTON

Las enzimas son proteínas elaboradas por las células a paftir de aminoácidos. Cada enzima es una molécula especializada catalizadora únicamente de un t¡po específico de reacción química. Secuencias de reacciones enzimáticas son

catalizadas en fracciones de segundo con un rendimiento de 1OO 7o sin formación de subproductos. El propósito de este capítulo es realizar una descripción de las caracterlsticas generales de las reacciones catalizadas por enzrmas. El grado de especificidad de una enzima, con respecto a la reacción catalizada, o a la función de los react¡vos, depende de su función biológica. El sitio act¡vo de una enzima es una región tridimensional formada por unos pocos aminoácidos orientados en la dirección apropiada para permanecer biológicamente activos y ligarse con el respectivo sustrato. Generalmente aún no están completamente elucidados los mecanismos de enlace y la acción catalítica en el sitio activo, pero el concepto básico de formación de un complejo enzimasustrato es el fundamento de las ecuaciones de velocidad de muchas reacciones enzimáticas.

185

4.1.1 Cofactores y coenzirnas

Las enzimas son proteínas constituidas por una o más cadenas polipeptídicas,

algunas contienen otro componente químico necesario para su ,actividad, denominado cofactor, Tabla 4.1., o una molécula orgánica compleja, llamada coenzima. Algunas enzimas requieren cofactor y coenzima, Frecuentemente el cofactor está ligado con la porción proteica de la enzima, en cuyo caso recibe el nombre de grupo prostético. Las enzimas son los catallzadores de las millares de reacciones químicas, conocidas colectivamente como metabol¡smo intermediario de las células. Las enzimas denominadas con el mismo nombre, pero obtenidas de diferentes microorganismos, frecuentemente tienen distintas secuencias de aminoácidos y diferentes propiedades y activ¡dades catalíticas.

Tabla

4.1

Algunas enzimas que contienen o requieren iones metál¡cos como cofactores. (Bailey y Ollis, 1986)

o-Amilasa (páncreas de cerdo)

Ca2t

Colagenasa Lipasa

Nucleasa micrococal Co2 *

Cu2* (Cu*

Glucosa isomerasa lBacillus coagulansl (También requiere Mg" ) I

Fe2* o Fe3*

Galactosa oxidasa Catalasa

Citocromos Peroxidasa

Mg3t

Desoxirribonucleasa (páncreas .bovino)

Mn2*

Arginasa

Nat

ATPasa de la membrana del plasma (También requiete K* y Mg")

Zn2*

Alcohol deshidrogenasa Fosfatasa alcalina Carboxipeptidasa

186

4.1.2

lsoenzimas y enzimas alostéricas

Algunas enzimas existen en formas múltiples, llamadas isoenzimas. La forma de la isoenzima cambia durante el desarrollo del organismo y segÚn el téj¡do del cual formaft parte. Las enzimas poseen trna conformación tridimensional

especlfica que usualmente cambia durante el ciclo catalítico, somet¡endo la molécula a tensión, y haciéndola susceptible a la reacción. Las enzimas reguladoras o alostéricas son estimuladas o inhibidas por la unión con alguna molécula, el efector o modulador, generalmente un producto metabólico, cuya concentración en la célula es crltica.

4.1.3 Clasificación Crueger y Crueger, 1984, clasifica las enzimas disponibles comercialmente en: - Enzimas industriales tales como amilasas, proteasas, glucosa isomerasa, lipasa,

catalasas, y penicilin-acilasas.

-

Enzimas analíticas tales como glucosa oxidasa,. galactosa oxidasa, alcohol deshidrogenasa, hexoquinasa, muramidasa, y colesterol oxidasa'

- Enzimas médicas: asparaginasa, proteasas, lipasas, y estreptoquinasa. La Comisión lnternacional de enzimas clasificó en 1964 las enzimas en seis clases principales de acuerdo con la sustancia sobre la cual actÚan y con la naturaleza de la reacción catalizada, fabla 4.2. Cada clase principal puede contener subctases y sub-subclaseS. Por consiguiente, cada enzima es designada por un.,eódigo numérico. Así, por ejemplo, según Bohinski, 1970, la alcohol deshidrogenasa tiene el código 1 .1 .1 .1 : 1.1: La enzima actúa sobre el grupo de sustratos caracterizados por: :CH-OH' '1.1.1:La enzima requiere NAD* o NADP* como aceptante

d;l hidrógeno.

1.111.1: El sustrato específico de la enzima es el alcohol etílico. 187

Tabla

4.2

Clasificación internacional de las enzímas. (Lehninger, 1973l.

. Oxidoreductasas Reacciones de transferencia electrónica 2. Transferasas Transfieren gfupos funcionales 3. Hidrolasas Reacciones de hidrólisis 4. Liasas Adicién a los dobles enlaces 5. lsornerasas Reacciones de isomerización .Forrnacién 6. Ligasas de enlaces con escisión de ATP 1

4.1.4 lmportancia

industria!

En la Tabla 4,3 se presenta un resumen de las principales enzimas y sus aplicaciones industriales. Todas las enzimas son producidas a partir de organismos vivos, plantas, animales, o rñicrob¡os. .

Tbbla

4.3

Algunas enzimas de importancia industrial. (Arima, 19641

Nombre

Aplicación y comentarios

Fuente

Amilasas licuificadoras del almidón

Diastasa

Malta

Takadiastasa

Aspergillus

Ayuda digestiva; suplemento del pan; jarabes,.Tiene act¡vidad o-amilasa y actividad B-amilasa

orizae

Ayuda digestiva; suplemento del Ban; jarabes' Contiene muchas enzimas diferentes: proteasa, RNAsa

Amilasa

Bacillus subtil¡s

Desencolado de textiles; jarabes; industria de la fermentac¡ón de alcohóles; producción de glucosa. La preparación cruda contiene proteasa Continúa

188

Tabla 4.3 (Continuación) Nombre

Fuente

Aplicación y comentarios

Amilasa ácido resistente'

Aspergillus niger

Ayuda digestiva; pH óptimo: 4,5

Amilasas sacarificadoras del almidón

Amiloglucosidasa

Rhizopus niveus, A.niger. Endomicopsis fibuliger

Producción de glucosa

Tripsina

Páncreas de animal

Uso médico; ablandador de carne; remueve turbiedad de la cerveza

Pepsina

Estómago de

Ayuda digestiva; ablandador de

animal

carnes

Estómago de

Usos médicos

a-Ouimiotripsina

animal

Cuajo

Estómago de ternero

Manufactura de queso

Proteasa del páncreas

Páncreas de animal

Ayuda digestiva; limpieza; laminación de pieles; remoción de pelo; mejorador de alimentos

Papalna

Papaya

Ayuda digestiva; usos médicos; remoción de la turbiedad de la cerveza; ablandador de carnes

Bromelina,

Piña, higo

Ayuda digestiva; usos médicos; remoción de la turbiedad de la cerveza; ablandador de carnes

ficina Proteasas microbiales Proteasa

A.

Proteasa

A. niger

Álimentos para animales; ayuda digestiva. Resistente a los ácidos; pH óptimo: entre 2 y 3

Proteasa

B. subtilis

Detergentes; remoción de la gelatina de las pelfculas (recuperación de plata); ablandador de carnes; pH

orizae

Saborizante del sake; remocién de la turbiedad del sake

óptimo: 7,O

Continrla 189

Tabla 4.3 (Continuación) Nombre

Fuente

Aplicación y comentarios

Proteasa

SÜeptomyces gnseus

Detergentes; remoción de la gelatina de las películas (recuperaciónde plata);-ablandador de carnes; pH éptimo: 8,O

Varidasa

streptococcus sp.

Uso médico.Lederle

Estreptoquinasa Streptococcus sp.

Prof ibrinolísina

Algunas otras enzimas comerciales Lactobacillus brevís, Arthrobacter simplex,

Glucosa -->fructosa. Novo, lCl, Gist

Penicilinasa

B. subtilis, B. cereus

Remoción de penicilina. Takamine, Schenley

Glucosa oxidasa

Aspergillus niger, Dee O, Dee G

Remoción de oxígeno o de glucosa de diversos alimentos; indu§trialización del huevo seco. Takamine

Glucosa tsomerasa

Actinoplanes missourensis

Penicillium chrysogenum Hialuronidasa Lipasa

Determinación de glucosa. Nagase Co.

Animales, bacterias

Uso médico

Páncreas,

Ayuda digestiva; saborizante de productos lácteos

mohos lRhizopusl

Citocromo c

Brocades

Levadura

)

Uso médico. Sankyo Co.

lCandidal Catalasa

Esterilización de leche

Oueratinasa

Streptomyces fradiae

Remoción del pelo de las pieles. Merck Co.

b l-ostodi-esterasa

Penicillium citrínum; S. griseus B. subtilis

Manufactura de ácido inosínico y de ácido guanílico (5'nucleót¡dos). Yamasa Co., Takeda Co. :

Acido adenílico

A.

AMP --> lMP. En Takadiastasa.

orizae

deaminasa

Continúa 190

Tabla 4.3 (Continuación) Nombre

Fuente

Aplicación y comentarios

Cuajo mícrobial

Mucor sp.

Manufactura de queso. Meito Sangyo Co.

Naringinasa'

Aspergillus niger

Remoción del sabor amargo de los jugos cítricos. Rohm & Haas.

Laccasa

Coriolus versicolor

Secado de lacas.

Celulasa

Trichoderma koningi Trichoderma viride

Ayuda digestiva; pH óptimo: 4,6 Hidrólisis de la celulosa. Mezcla de enzrmas

lnvertasa

Saccharomyces cerevisiae

Confitería, previene la cristalización del azúcar; chocolates; melazas de alto grado

Pectinasa

Sclerotina libertina, Coniothyrium diplodiella

Clarificación de jugos; remoción de pectina; concentrac¡ón de café. Scrase (Sankyo);"Pectinol (Róhm & Haas); Takamine. Rohm & Haas; Takamine Pectinasa Clarasa (Takamine) Filtragol (1.G. Farben)

A. orizae A. niger A. flavus

4.2

ACTIVIDAD ENZIMATICA

4.2.1 Velocidad inicial de una reacc¡ón catal¡zada por una enz¡ma

Un experimento típ¡co para medir la velocidad de una reacción catalizada por una enzima pura consiste en mezclar las soluciones de sustrato y de la enzima pura apropiada, tiempo cero, en un recipiente bien agitado, en condiciones isotérmicas, con una solución amort¡guadora (buffer) para controlar el pH. 191

sustrato y de producto es registrada en diversos momentos mediante técnicas espectrofotométricas, manométricas, polarimétricas, electrodos y métodos de muestreo y análisis. La concentración de

La variación inicial de la concentración de sustrato, o de producto, con respecto

al t¡empo, puede calcularse a partir de la ecuación:

=l #L. = I'r=o

t4.1I

Donde, p, s, ei concentración de producto, sustrato, y enzima, respectivamente; r: tiempo de reacción; v: velocidad inicial de la reacción. Para t : 0: e : eo,

P: P.YS:

so'

Generalmente, la representación gráfica de los datos de un experimento típ¡co para medir la velocidad inicial de una reacción catalizada enzimáticamente indica, como en el caso del Problema 4."1, algo de producto en el tiempo registrado como cero y, por consiguiente, este t¡empo realmente no es el tiempo inicial de la reacción; Además, cuando una enzima se remueve de su ambiente biológico nativo y se cgloca en un ambiente acuoso "extraño", pierde gradual-

mente su actividad catalít;ca. Sin embargo, a pesar de estas dificultades, el método de determinación de las velocidades iniciales de la reacción, es razonablemente reproducible. Las unidades de actividad indican la cantidad de enzima que produce una determinada actividad catalltica bajo un conjunto definido de condiciones estandarizadas para esa enzima particular. Generalmente se encuentran diferentes definiciones de actividad para la misma enzima estud¡ada bajo diferentes conteitos.

Ejemplo

4.1 Determinación

de la actividad de la enzima B-

glucosidasa

Lee; 1992, describe el siguiente procedimiento experimental, con el propósito de medir la actividad de una enzima y la velocidad inicial de la reacción: Se agregan 5 ml de celobiosa (concentración: 1 0O pmol/mll a 44 ml de solución amortiguadora (buffer) en un recipiente agitado. Se agrega entonces, para iniciar la reacción, 1 mlde solución de la enzima (B-glucosidasa, concentración: 0,1 (mg

192

enzima)/ml y se toman muestras (Volumen: 0,1 ml) de la mezcla a los 1, 5, 10,

15 y 30 minutos. Los datbs del contenido de glucosa de cada muestra

se

presentan en la Tabla 4.4.

Calcular: (1) La velocidad inicial de la reacción; (21 La actividad de la Bglucosidasa expresada como la cantidad de enzima que produce 1 (pmol glucosa)/minuto.

Tabla

4.4

Determinación de la actividad de la enzima B-glucosidasa, Lee, 1992. Concentración de glucosa en /mol/ml

Tiempo en minutos

0, 05 0,23 0,38 0 ,52 t-, 03

1

5

10 15 30

Solución: - Los datos de la Tabla 4.4 son representados en la Figura 4.1. La velocidad inicial de la reacción se calcula a part¡r de la pendiente de la lfnea a trazos: vctocidad iniciut =

Affi

4.2.2

*3

= (o,o4sg).(so

= o,o45e

n[

##f

= 2,288

W,

Número de recambio

Elnúmero de recambio, N, de una enzima (Tabla 4.5) es el número de moléculas de sustrato transformadas por unidad de tiempo por una molécula de enzima, o por cada centro catalítico, cuando la enzima es el factor limitativo de la velocidad.

193'

: ,.

Figura 4.1 Determinación de la velocidad inicial de.la reacción entre ta B-glucosidasa y una solución de celobiosa. Ejemplo 4.1.

-

_ Glucoso producido,

enzima

micromol/ml.

^c-'

0.5 o.4 0.3 Q.2 0.1

o

o

5

10

15

Tiempo de reoccion, mÍnutos +

Ejemplo

4.2

Dotos experimentoles '--- - Tendencio inicÍol

Determinacién'del número de recámbio

Hallar el número de recarnbio de una enzima (peso molecular: M : 1 16OO0), si 12 Ug de enzima transforman 32 micromoles de sustrato por minuto.

Rcconbio

_

Moléculas d¿ sustrao transformadas

(ticmpol.(noUcub de ewimal

Por consiguiente el número de recambio es;

32.10-6 mol sustrato 11ñ0O e ¿nzima (niruao).(l2. 10-6Sr euinw) mol e¡uima Nún¿ro d¿ ¡econbio =

194

mal s+rao minuto.mol etuims

[email protected],3

v

Tabla 4.5 Número de recambio.de algunas reacciones catal¡zadas por enzimas y catal¡zadores sólidos. (Maatman, 1973); ly': número de moléculas por sitio activo por segundo. Enzima

Reacción

lntervalo de los valores de /V informados, entfe 0 y 370C

Ribonucleasa

Transferencia del fosfato de un polinucleótido

2

- 2.10-3

Tripsina

Hidrólisis de péptidos

3.10-3

- 1 .102

Papaina

Hidrólisis de péptidos

8.10'2

-

Bromél¡na

Hidrólisis de péptidos

4.10-3 - 0,5

Anhidrasa carbónica

Hidratación reversible de los compuestos de carbonilo

9.10'1 .6.105

Fumarato

L-malato Hro

hidratasa

:

fumarato +

1

1

.103 (hacia la

derecha)

3.103 (hacia la iz-

quierda)

Catalizador sóHo

Reacción

s¡o2 - Al2o3 (impregnado)

Destilación fraccionada del cumeno

3.10-8

2.104

420

Zeolita decationizada

Destilación fraccionada del cumeno

-

325

Deshidrogena-

7.10-11

ción del ciclohe-

102

vro,

N

10e 108

Temperatura,

oc.

25

25

25 350

xeno

Cu.Au tratado

ción de HCOrH

Alcl3-Al2o3

lsomerización de n-hexano

Deshidrogena-

(líquido)

2.107 3.1010

1.10'2 1,5.10-2

25 327 25 60

19s

4.2.3 lnfluencia

de los factores ambientales

En la célula se forman continuamente centenares de enzimas que funcionan coordinadamente para fomar productos en la proporción correcta y aprovechar,

sin desperdiciar, los nutrientes disponibles. La estructura de una

enzima depende de numerosos enlaces débiles no covalentes. Por esta razón la enzima tiende a perder su conformación o a desnaturalizarse, La actividad específica de una enzima es perturbada por factores ambientales como pH, temperatura, los esfuerzos cortantes, la intensidad iónica del medio y el estado de la enzima en el reactor (en solucíón, o inmovilizada sobre un soporte). Estos factores deben

tenerse en cuenta en el diseño de reactores para la conversión de sustrato en productos útiles. EI propósito de esta Sección es describir el efecto del pH y la temperatura sobre la actividad enzimát¡ca,

4.2.3.1

pH

En la Figura 4.2 se muestra la influencia del pH sobre la actividad de tres enzimas, Hay un valor óptimo de pH para el cual la actividad enzimática es máxima. La influencia del pH se debe a los grupos ionizables presentes en el sitio activo de la enzima, estos grupos pueden tener una carga positiva o negativa, de acuerdo con el pH del medio, pero el s¡tio act¡vo debe estar en la forma iónica adecuada para tener actividad catalítica, Ennis y Maddox, 1987t Bahlet al., 1982.

4.2.3.2 Temperatura

La temperatura, en el intervalo adecuado, favorece inicialmente la activación de

la enzima y luego cuando es demasiado alta la inactiva o desnaturaliza. A medida que la temperatura aumenta, aumentan la velocidad de reacción y la 196

frecuencia de las colisiones entre moléculas de enzima y de sustrato. Esta velocidad atcanza un máximo a la temperatura óptima para la actividad de cada enzima particular. Un incremento adicional de temperatura reduce gradualmente la velocidad de la reacción catalizada a causa de la ruptura de los enlaces covalentes dentro de la molécula de enzima. Un aspecto fundamental en el diseño de reactores enzimáticos es el logro de un microambiente apropiado para la enzrma.

Figura 4.2 Efecto del pH sobre la actividad enzimática de tres enzimas: pepsina, descarboxilasa y arginasa' (Fruton y Simmonds, 1953)'

too

Actividod relativo, %

ao 60 40

20 o

17

pH

Los recientes avances en biologla molecular están dirigidos hacia la modificación de la estructura de la enzima con el propósito de retener su activídad dentro de ün intervalo más amplio de temperatura y de pH, 'y aurnentar así su campo de

aplicación. Generalmente, la influencia de la temperatura sobre la activación o inactivación de un sistema enz¡mát¡co, puede describirse mediante la ecuación db Arrhenius:

ft

= .r{.exP-

(#,)

f4.21

197

Donde: Eo: energla de activación, J.mol-l; R: constante de los gases, R : 9,314 J.mol-l .K-l ;T: temperatura absoluta, K; A:factordefrecuencia, s-1; k: constante de velocidad, s-1.'

Ejemplo

4.3

Determinación de las energías de activación e inactivación de un s¡stema enz¡mát¡co

Sizer (1944), estudió la activación e inactivación del sistema catalasa-peroxido de hidrógeno. La catalasa utilizada fue extraida del hlgado de vaca y luego recristalizada. En este caso la actividad de la enzima se define mediante la velocidad de producción de O, (convertida a temperatura normal) del sistema catalasa-Hror. La velocidad de producción de gas se evalúa con un manómetro Warburg-Barcroft en el intervalo de temperatura entre 0 y 60oC.

La Figura 4.3 es una representación gráfica de los datos experimentales.

La

ordenada representa el logaritmo de la velocidad de producción de oxígeno, en (mm)3/(minuto), y la abcisa representa el recÍproco de la temperatura absoluta. Calcular las energlas requeridas para la act¡vac¡ón e inactivación del sistema. Solución:

- Los valores experimentales obtenidos aparecen repartidos en dos grupos en la Figura 4.3. El primer grupo está relacionado con la activación de la enzima en el intervalo de temperatura entre 0 y 53oC (correspondiente a valores de 1/T entre 3,66.10'y 3,O7.10-3 K-1), El segundo gruBo está relac¡onado con ]a inactívación de la enzima a mayores temperaturas, hasta 66oC {correspondiente a valores de 1/T : 2,95.103/K.

- La ecuación

de Arrhenius describe adecuadamente la dependencia de la temperatura de muchas reacciones catalizadas por enzimas, y la descomposición del HrO, const¡tuye un buen ejemplo. La pendiente de la curva ln k vs 1/T es

198

-

(EA/R), Ecuación t4.21:

::t

lnt, = ln,lr-{fi lntz=lná por tanto.' Ea

EA

"- nJ,

2,303 (og

&-log tt)

R.. IT1 + -

(1t

T2

Y

4.3 Representación gráfica de la influencia de la temperatura, en grados K, sobre la activación e inacfivación del sistema catalasa-peróxido de hidrógeno.

Figura

Velocidad de la reacción: velocidad de producción de 02, Bn, (mm)3/(minuto), Sizer, 1944.

^=-Loo, velocidod de reoccion 25 z.J

7.9

t7 1.5

2.9

3

3.

1

3.2

3.3

3.4

3.5

3.6

J.7

3.8

Parala rama derecha de la curva (Fig¡ra 4.3): log

k, : 2,4i

1lTl-

=

3,25.10-3

: 2,1'

1lT1

:

3,61.10-3

log k,

199

: ''

Si se reemplazan estosvaloresen la Ecuación (1), donde R

se obtiene la energla de activación: E^

= - 15.956

=

8,314J.mo|-l.K-1, *

J.mol-1.

Similarmente, paÍa la rama izquierda de la curva (Figura 4.3):

.

log

kz: 2,2i

1lT2

log

k,: 1,7'

llT

:

j:

2,985.103 2,94.103

Si se reemplazan estos valores en la Ecuación (1), se obtiene la energía

de

activación:

E¡=-212.746J.mo|'1 La energfa de inactivación

los valores anteriores de AHd

4.3

:

Al{., de la enzima es elvalor absoluto de la suma

de

Eo:

15.955,9 + 212.746

:

228.70"1,9 J.mol-l

MODELOS CINETICOS DE LAS REACCIONES CATALIZADAS POR ENZIMAS

4.3.1 Modelo de Michaelis-Menten

Un modelo es un conjunto de relaciones entre'las variables de interés del s¡stema estudiado. Estas relaciones pueden expresarse mediante ecuaciones, gráficas o tablas. En el caso de la cinética enz¡mát¡ca homogénea, las variables de interés tales como ternperatura, concentración, pH, oxígeno disuelto, velocidad de reacción, son generalmente uniformes en la región de control considerada,

200

Michaefis y Menten (Bailey y Ollis, 19861 hicieron importantes contribuciones a la deducción de las ecuaciones de velocidad de la reacción irreversible:

s--k-->

t4,31

P

para la cual se plantean los siguientes mecanismos:

S + E --- k,, --)

ES

S+E (--kr--

ES

t4.3.al

ES ---k.--) P+E

t4.3.bl

Donde: S, P, ES, E, indican el sustrato, el producto, el complejo enzimasustrato, y la enzima respect¡vamente. La ecuación anterior supone que cada molécula de enzima acomoda sólo una molécula de sustrato, aunque hay moiéculas de enzimas con varios sitios activos disponibles para ligarse con mriltiples moléculas de sustrato,

Sise supone que la ecuación t4.3.al está en equilibrio, o en otras palabras, que equilibrio se logra rápidamente si se-compara con la menor velocidad de'la reacción [4.3.b], la velocidad de la reacción [4.3], es:

'el

.

rs=

-#=rr=#

=kr(cs)=r

14.41

Donde: s, p, (es), representan la concentración molar de sustrato, de producto y de complejo enzima-sustrato respectívamente; rs: velocidad de consumo de sustrato; rr: velocidad de formación de producto. La ecuación de balance de materiales de la enzima es:

eo=e+(es)

t4.51

Donde: oo, o, os, representan la concentración molar de la enzima cargada al reactor, de enzima libre, y de enzima ligada al complejo respectivamente. Si la ecuación anter¡or se divide por eo, se obtiene:

1

=fs*fs

t4.61

201

Donde: f, : eleo, fEs : (es)/eo: representan la fracción de la enzirna total presente en forma libre y la fracción de enzima ligada al complejo, respectivamente. Después de reemplazar

fr. en la Ecuación

14.41, se obtiene:

r = h.e"-fo

f4.71

Además si en la reacción t4.3.al se supone que el complejo está en equilibrio con los componentes libres se obtiene;

e.s=k_kc,s

t4.81

K1

¿_ t,§-

t4.9t

fts*s

Donde k. es la constante de disociación del complejo enz¡ma-sustrato.

Si la velocidad de formación de producto está contolada por la velocidad k., entonces k3 < < k, Y k. = Kr,¡, donde K, es la constante de Michaelis-,Menten. Si la fracción fr. de la Ecuación 14.91 se reemplaza en la Ecuación t4.71 se obtiene: f=

Vx's

t4.101

Kr*s í

Donde la máxima velocidad de la reacción se define como:

vv = 4-e"

14.11'-L

En la Ecuación [4.10] conocida como ecuación de Michaelis-Menten, V, es la velocidad máxima o velocidad limitante y K* es la constarfte de Michaelis. Puede observarse que K, es la concentración del sustrato para la cual la velocidad de la reacción es la mitad del valor máximo. El valor de K, varla ampliamente de acuerdo con la fuente de la enzima. Cuando la concentración del sustrato es alta, s > > Kr, la velocidad de la reacción

202

enzimática es prácücamente iguala la máxima velocidad y es independiente de un incremento de s:

t-Vu

f4.12t

Si s < ( Kr, la velocidad de la reacción, r, es muy sensible a los cambios de concentración del sustrato:

¡=¿Vu's Ku

t4.131

Figura 4.4 tnfluencia de la concentración del sustrato sobre la velocidad de la reacción enzimát¡ca de hidrólisis del almidón con o-amilasa,.Dawes {1967)' La concentración, eo, de la enzima, Se mantiene constante. DatOs de !a Tabla 4.6. 140

velocidod relotivo de lo hidrolisis

20

oo ao 60 40 20

12 I 6 3 concentrocion de sustroto, mg/ml

En la Figura

4.4 se representa

15

la ecuación de Michaelis-Menten, la concentración

de la enzima se mantiene constante cuando se estudia el efecto de la concentra-

ción de sustrato sobre la velocidad de la reaciión catalizada'

203

- Representación gráfica de Lineweaver-Burk:

1 *Ku r - Vx Vus

1

1

Í4.141

- Representación gráfica de Langmuir:

!-Ku * 1" rVaVM

14.151

- Representación gráfica de Eadie-Hofstee:

r=Vu - KuL s

t4.161

En el método de Lineweaver-Burk, Ecuación f4.141 los valores de 1/r son representados gráficamente contra los correspondientes datos de 1/s, obteniendose una recta, de pendiente K¡¡/Vp¡, e intercepto 1/Vr. Los válores de r determinados con mayor exact¡tud, o sea, aquellOs correspon-dientes a elevadas concentraciones de sustrato, para las cuales el cambio de la concentración de sustrato s con respecto al tiempo es muy pegueño, son los puntos cgn los mejores datos, pero estos quedan agrupados cerca del intercepto, y la pendiente queda determinada, predominantemente, por los

valores menos exactos. Por esta razón no debe utilizarse, con estos datos, el ajuste de valores por mfñimos cuadrados

[4.15], por-elcontrario, tiende a esparcir los puntgs de datos,haCia mayores valores detr, y, por tanto, la pendiente 1/V* puede catcularse con mayor exactitud, páro el ¡ntercepto KM/VM, generalmente queda muy cerca del origen y la determinación de K, puede estar sometida a El método de Langmuir, Ecuación

errores.

205

En el método de Eadie-Hofstee, Ecuación t4. 1 61, los valores de r son representa-

dos gráficamente contra los correspondientes datos de r/s,la variable medida, r, aparece en ambas coordenadas y los grrores cometidos en la determinación de K, y V, pueden ser grandes. Una metodología apropiada consiste en evaluar Vr, por uno de los métodos anteriores y luego construir una gráfica de r vs s, similar a la Figura 4.4, con el propósito de hallar la concentración del sustrato para la cual la velocidad r esY*12. Como se mencionó anteriormente, este valor de la concentración de sutrato s es el correspondiente a Kr.

Ejemplo

4.4

Evaluación de Ios paiámetros de la ecuación de Michaelis-Menten para la hidrólisis del almidón

En las dos prímeras columnas de la Tabla 4.6 se presenta un resumen de los datos experimentales de la hidrólisis del almidón con o-amilasa, obtenidos por Dawes (1967). Determinar la constante de Michaelis, Kr, y la velocidad máxima, Vr.

Solución: - Los datos de la Tabla 4.6 son representados gráfieamente^en las Figuras 4.4,

4.6,.4.7 y 4.8.

- De

la, Figura 4.6, representación gráfica de !a ecuación de Lineweaver-Burk (Ecuación 4.141, se deduce: Kr,r : 3,57 mg/ml; Vu : X29,9

- De la Figura 4.7, representación gráfica de la ecuación de tangmu¡r (Ecuación t4.151), se deduce: Krv : 3,5 mg/ml; Vy = 129,4. - De la Figura 4.8, representación gráfica de la ecuación de Eadie-Hofstee tEcuación'4.16), se deduce: Ku : 3,43 mg/ml; Vu : ;128. : ,

206

i

/

/

Tabla 4.6 Datos de la hidrólisis del almidón con o-amilasa, Dawes, 1967¡ r: velocidad relativa de la hidrólisis; s: concentrac¡ón del sustrato, mg/ml. 1/s

1lt

s/r

r/s

10r_, 0

0, 080

0,124

,2 ,4 90, 0 82 ,7

0,089 0, 111 0 ,]-23 0, 158

,04 8,74 10,27

79,1-

0, 178

io,g

0,,234 0,28]. Q ,427 1,000

0,0099 0, 0L01 0,0108 0, 0111 0 ,072]. 0 ,0L26 0, 0141 0, 0154 0,0193

I

s

L2,56 L7- ,24 9, OO' 8,)-2 6,33 5 ,61 4 ,28 3, 55 2,34 1,00

98 92

55,0 51 ,7 28 ,8

0, 114 0, 097' 0,090 0.076 0, 071 0,050 0, 055 0, 045 0, 035

0..n0347 ,.#f

.

8

1r-, 08

13,05 7-4,)-O

].6,56 ]-8,26 22, Q9 28,80

ii

4.6

Representación gráfica de Linewaver-Burk de los datos experimentales obtenidos por Dawes (1967) en la hidrólisis del almidón con a-amilasa'

Figura

1,/, o.o3

o.o2

o.o I

o

-o.4

-o.2

l/Km

0.4 o.2 1/s, ml/mg

o.6

207

4.3.1.2 Modelo de Briggs-Haldane

1925, aplicable al complejo intermedio, ES, es válido para reacciones en un sidtema cerrado, siempre que so > > eo. La reacción 4.3.a, no alcanza elequilibrio sila velocidad de descomposición del compleio ES, hásta producto y enzima libre, es rápida, comparada con la veloeidad de disociación de ES, hasta E + S. El modelo propuesto por Briggs y Haldane,

En un sistema con una concentración inicial de sustrato mucho mayor que la concentración iniciaf de enzima, puede aplicarse la aproximación de estado cuasiestable, dbd/dt : 0. al complejo intermedio'

4.7

Representación gráfica de Langmuir de los datos experimentales obtenidos por Dawes (1967) en la hidrólisis del almidón con a-amilasa. Ftgwa

0.

l4

0.12 o.1 --i-...--¿

0.08 0.06 0.04

'm/Vrnax

o.o2 o

-2 -4 - Km

208

0

2

4 6 s, mg/ml

I

to

12

14

En la Figura 4.9 se muestran los resultados obtenidos con el prograrna C:\lSlM\MENTEN.SIM, resumido en la Tabla 4.7, o con el programa C:\GWBASIC\MENTEN.BAS, resumido en la Tabla 4.8, Los dos programas producen resultados similares.

Figura 4.9 Variación de las concentraciones de sustrato, enzima y complejo enz¡má-sustrato, de acuerdo con elmodelo de MicháeJ¡s-Menten. Representación gráfica de los resultados obtenidos con los programas C:\lSlM\MENTEN,SIM y C:\GWBASIC\ M ENTEN. BAS.

o,3

Si;ustrato,

Producto

Enzima, Enzima, Complejo Cometeio ES

o,o3

En la Figura 4.9 se observa que la suposición de estado cuasiestable, dbd/dt : O, constituye una buena aproximación después de un breve periodo inicial, cuando la relación entre los valores de las concentraciones iniciales de sustrato y enzima, so/eo, es muy grande En una célula viva las concentraciones de sustrato y de enzima son del mismo orden, y no se aplica la aproximación de estado cuasiestable. Si en la Ecuación t4.181 se reemplaza dbs)/dt : 0, y se eliminan e y s mediante la Ecuación [4.5], se obtiene (Bailey y Ollis, 1986]:

210

t4.19I

De acuerdo con la Ecuación constante dé Michaelis, es:

14.1 11,

Klt

V, : kr.eo. Por consiguiente Kr, la

kz*h =

k"

= ¡t. + --:

"t,

k1

14.201

Donde k. es la constante de disociación del complejo enzima-sustrato defin¡da en la Ecuación t4.81. En la deducción de Michalis-Menten, la constante de Michaelis,

K¡y¡,

es igual

la constante de disociación, K, - ks = krlk,, mientras que'en la deducción Briggs-Haldane, K, : (k2 + k3)/kr. Estos valores de K, coinciden sik2 > >

a

de ks;

lo cualsignifica que la etapa de liberación de producto es más lenta que la etapa de disociación del ccítnplejo enzima sustrato,

Si se reemplazan k,eo y K* en la Ecuación t4.191 se obtiene laecuación de Michaelis Menten (Ecuación 4.10): i-=--=-

"

dS

Vx.s

dt

Ka*s

cuando esta ecuación se integra entre obtiene:

*, ,.(|) .

t:

".

0, s

:

-s=Vil.t

so,

Yt : t, con s = 9, s€ f4.211

Donde t es el tiempo requerido para alcanzar una concentración dada de sustrato.

211

4.3.1.3 Simulación del modelo de Michaelis-Menten

fabla

4.7

Simulación del modelo de Michaelis-Menten. Programa C:\lSlM\MENTEN.SIM

:MENTEN,SIM

:Simulacion del modelo de túichaelis-Menten Ei-ir

'

CONSTANT VM:0.01: mg/(ml.minuto) | ;" CONSTANT KM :0.1 : mg/ml CONSTANT E0:O.01 : mg/ml CONSTANT S0= O.Q: mg/ml : ,. CONSTANT ESO:0 CONSTANT PO:O CONSTANT CINT:0.01: Paso de integracion CONSTANT TFIN: 100 : Valor final de la variable independiente SIM

lNlTlAL : Condiciones iniciales

S:

SO

ES

:

P:

PO

ESO

DYNAMIC E: EO-ES : Balance de materiales :Constantes

K3-VM/EO; K3:VM/EO:1

K2:10*K3: K2 >> K3;K2:10 Kl =K2IKM:

K1

:10/(0,1)=100

: Ecuaciones diferenciales K2*ES-Kl *E*S; Ecuacion 14.171 ES' : K1 *E"S-(K2 + K3l"ES: Ecuacion t4.181 P' : K3*ES: Ecuacion [4.4] S'=-1 *P'

S':

212

: Salida de resultados en forma de tabla OUTPUT T,S,P,ES,E

: Control de salida de datos (En este caso cada 1000.C|NT) NOCI : 1000.0

S VAL

Tabla

4.8

Simulación del modelo de Michaelis-Menten. Programa C

-

:\GWBASI C\M ENTEN. BAS

1O REM MENTEN.BAS

20 REM Simulacion del modelo de Michaelis-Menten 30 KEY OFF 40 CLS 50 NN:1 60 REM Escribir las constantes: 70 VM:.01 ' 80 Kl = 100 90 K2:10 100 K3=1 110 KM=.1 12O E0 =.01

)

130 REM Paso de integracion: T1 140 T1 =.01 150 REM Valor final de la variable independiente: T2

160T2:1OO 170 REM lntervalo de impresion de los resultados: T3

180T3=10 190 PRINT "MENTEN.BAS" 2OO PRINT

k

210 220 230 240 250 260 270 280

PRINT "Simulacion del modelo de Michaelis-Menten" PRINT

PRINT PRINT "T: variable independiente (tiemÉo, minutos)" PRINT "Valor final de ¡, ¡2="¡T2 PRINT "T1: paso de integracion, T1 =";T1 PRINT "T3; intervalo de impresion, T3-";T3 PRTNT

213

: .;

'

290 PRINT "PULSE ENTER !" 300 ANS$: INPUT§(1) 3IO CLS 320 PRINT "RESULTADOS" 330 PRINT 340 PRINT "T: tiempo, minutos" 350 PRINT "O(1): concentracion de sustrato, mg/ml" 360 PRINT "O(2): concentracion de complejo enzima-sustrato, mg/ml" 370 PRINT "O(3)i concentracion de producto, mg/ml" 380 PRINT "E: concentracion de enzima, m§/ml!: 390 PRINT 400 REM Numero de ecuaciones diferenciales: 410 N:3 420 REM condiciones iniciales: Ol :S;O(2):ES;O(3):P;O(4):E j 430 O(1)=.3 440 O(2)=0 450 0(3):0 460 REM Subrutina de Runge-Kutta de orden 4; , 47O Í :lNT(T2fr1 +.5):T1 :f2lT:l = INT(T3/T1 +.5):T3 :T"T1 :T :0:T4 480 T8:1 :GOTO 720 490 IF(T-T4 +T1 l'l0)< 0 THEN 530 500 T4:T4+T3:T5 :lNT(TiT1 +.5):T:T5*T1 : GOSUB 780 510 1F(T-T2 +T1l10l 0; válidaparas >>

t4.73)

KM

Donde, Ko: coeficiente de velocidad de orden cero.

Si K. se reémplaza eñ'la Ecuación t4.551'se obtiene: 'd?s

*2

d.R2,

ds

-Ko =O .R dR Ds

:

¡,q,1+l

:'i, i s > 0. Donde la concentración de sustrato s está limitada a medida queRtiendeaceroys: soen R: Ro; Ro: radiodelapartículaesférica. Por consiguiente: ,

Válida para

s

1 K".R:

14 s, 6 s,.D, l¡,2

254

=

_'.| ) )

-,

[4.75t

EI radio crft¡co R" por debajo del cual s vale cero se obtiene mediante el reemplazo de (s/s") : 0 en la ecuación anterior:

/

6.s-.4-

&=R.11-----s-i

t

r,''u

\12 I

f4.76t

)

La velocidad real de la reacción es:

* " (*: - nl ).r"

14.771

U

La velocidad de la reacción no frenada por difusión es:

14.78t

f,.".nl,.x,

Por consiguiente, el factor de efectividad, n, definido como !a relación entre las dos velocidades anteriores es:

q

=1-l-t rR r

f

t4'7el

/

Y después de sustituir la Ecuación f4.761en la ecuación anterior:

r¡=1_['H)-

t4.801

PROBLEMAS

4.1 La Figura 4.16 es una representación

gráfica de los datos obtenidos en un reactgr por lotes para la hidrólisis de almidón al3OYo con glucoa¡nilasa (6OoC, eo : 11600 unidades, volumen del reactor: 1 litro). Bailey y Ollis, 1986.

255

Calcular; (1) [a velocidad iniciá] de la reacción; l2l La unidad de actividad de glucoamilasa exprésada como la cAntidad de enzima que produce un mieromol de glucosa por minuto en una solución de almidón de Lintner al 4Yo a 60oC y pH 4,5, Figura 4.16 Representación gráfica de los datos obtenidos en un reactor por lotes en la hidrólisis de almidón al 30 % con glucoamilasa. Bailey y Ollis, 1986.

Glucoso producido, rng/rnl zvv

20

o

100 40 80 60 .Tiempo de reoccron, mrn.

120

140

,

4.2

El siguiente modelo c¡nét¡co describe la hidrólisis de la lactosa mediante lactasa obtenida a part¡r de Aspergíllus niger, Scott er a/., (1985):

---) ES ES --- k, ---) E + S E

+S

---k,,

ES ---kr---) E+P+O E+

EP '

i

-¡!

P---ko---) --- k,

---)

EP

E

+

P r

-

.

Donde, E, S, P, O: indican enzima libre, lactosa, galactosa y glucosa, respectivamente. ,

256

:

- Deducir la ecuación de velocidad para la producción de galactosa según el modelo de Briggs-Haldane, e indicar si la galactosa es un inhibidor competit¡vo o no compet¡tivo.

4.3

El siguiente modelo cinético describe la hidrólisis de la lactosa mediante lactasa obtenida a partir de Aspergillus niger, Yang y Okos, 1989:

E

+ S ---k,

---) ES

ES --- k, ---) E + S ES --- k. --) EP + O EP --- ko ---) E + P E + P --- k,

---)

EP

Donde, E, S, P, O: indican enzima libre, lactosa, galactosa y glucosa rbspectivamente. En este modelo primero se libera glucosa a part¡r del complejo enzimasustrato, y luego se libera galactosa a part¡r del complejo enzima-galactosa.

- Deducir la ecuación de velocidad para la producción de galactosa según el modelo de Briggs-Haldane.

4.4

En la Tabla 4.14 se presentan los resultados obtenidos por Eadie, 1942, en la hidrólisis de una solución de acetil col¡na (sustrato) con suero de sangre de perro (fuente de la enzima). La tercera columna de la Tabla presenta la velocidad inicial de la reacción en presencia de prost¡gm¡na como inhibidor, concentración: 1 , 5. 1 0-7 (moll/(litro) .

- Evaluar la constante de Michaelis y la máxima velocidad de la reacción de hidrólisís sin inhibidor mediante: (a) una gráfica de Langmuir, (b) una gráfica de Lineweaver-Burk, (c) una gráfica de Eadie-Hofstee. -

Evaluar la constante de Michaelis y la máxima velocidad de la reacción de hidrólisis en presencia de inhibidor mediante (a) una gráfica de Langmuir, (b) una gráfica de Lineweaver-Burk, (c) una gráfica de Eadie-Hofstee y determinar si la prost¡gm¡na es un inhibidor competitivo o no compet¡t¡vo.

257

Tabla 4.14 Datos experimentales de la velocidad inicial de la reacción de hidrólisis de acetil colina en presencia y en ausencia de un inhibidor, Eadie, 1942. Concentración de sustrato

mmol/litro

Velocidad inicial de reacción

mmol/{litro.minuto) Sin inhibidor

3,2 4,9 6,2 8,0 9,5

111 148

r43 766 200

Con inhibidor 59

7l 91

L11

r25

4.5

En la Tabla 4.15 se presenta información sobre la velocidad inicial de la reacción de hidrólisis del azúcar de caña por acción fle la en4ima invertasa a diferentes concentraciones de sustrato, obtenida por Bowski et al., 1971, con la enzima invertasa o B-fructofuranosidasa lE.C. 3,2,1 ,26) obtenida a partir de levadura. l-a cinética de la reacción a baias concentraciones de sustrato s¡gue el modelo de Michaelis-Menten. Sin embargo hay una concentración crítica de sustrato, entre 66 y 104 g/litro, según la cepa de levadura empleada como fuente de invertasa, por encima de la cual la velocidad de reacción es inhibida por el sustrato. Realizar un,análisis de regresión lineal con los 6 primeros datos de la tabla, y calcular la velocidad máxima V, de la reacción y la constante Kr, de Michaelis-

Menten: a) por el método de Lineweaver-Burk; bl por el método de EadieHofstee; c) por el método de Langmuir-Hanes; c) Dor elmétodo de Dickensheets et al., (Ecuación 4.43l.. Realizar un análisis de regresión con los últimos 5 datos de la tabla y calcular la constante de inhibición, K,, de la_ecuación de Dickensheets et al., 1977, (Ecua-

ción 4.43)

258

Bailey,

J.

E., and Ollis, D. F. (1986). "Biochemical Engineering Fundamentals,"

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CAPITULO 5

CINETICA DEL CRECIMIENTO DE BIOMASA, CONSUMO DE SUSTRATO Y FORMACION DE PRODUCTOS

El conocimiento de la cinética del cultivo permite predecir el desarrollo de la fermentación y evaluar rendimientos y productividades, datos importantes en el diseño de estrategias de producción y opt¡m¡zación de procesos. Las células consumen las sustancias nutritivas requeridas para crecimiento y las

convierten en nuevas células y productos metabólicos. La velocidad de estos procesos varfa con el desarrollo del cultivo.

A medida que las células crecen se acumulan en el medio los productos finales del metabolismo celular, Frecuentemente, estos componentes alteran el pH y la reologfa del medio, factores decisivos sobre la actividad celular y los mecanismos de transporte. Además, la población celular en crecimiento es heterogénea, y en cualquier momento, en cada punto del fermentador, coexisten células de

diferentes edades, con diversas funciones y act¡v¡dades metabólicas.

5.1

CRECIMIENTO DE BIOMASA EN UN CULTIVO POR LOTES

5.1.1 Densidad de la biomasa

La masa de una muestra se expresa como biomasa seca, esto es, la masa residual obtenida después de.someter la muestra a, un procedimiento estandarizado de secado, por la dificultad técn¡ca para remover el agua adherida a la superficie de un biomater¡al, sin retirarle tam.bién el agua interior.. La densidad de un biomaterial es la calltidad de biomasa seca presente, por unidad de volumen de biomaterial húmedo. Generalmente, el,agua constituye aproxinladamente el 8O% de la masa total y la densidad verdadera de un biomaterial, o sea, la masa total por unidad de volumen de biomaterial húmedo, es similar a la del agua. Por consiguiente, la densidad de un biomaterial es aproximadamente 200 kg.m-3 y su volumen específico es aproximadamente 0,005 m3.kg-l, (Fredrickson y Hu, 1989).

5.1.2

Etapas de! crecimiento

La evaluación del crecimiento microbial requiere la normalización de métodos experimentales para la obtención de datos confiables. En el cultivo por lotes, después de proveer las sustancias nutritivas al fermentador y suministrar los materiales y la energía requeridos para la síntesis de biomasa, se inocula el medio con una determinada cantidad de células viablés. El cultivo se desarrolla sin intercambío de materiales con los alrededores, excepto por la transferencia de gases tales como aire, CO, e Hr. El desarrollo de un cultivo por lotes bajo condiciones fisicoqulmicas adecuadas en un sustrato simple y homogéneo, libre de gradientes de concentración y de sustancias inhibitorias, donde las células se reproducen a intervalos regulares, puede representarse mediante una curva típica, similar a la Figura 5.1, en la cualse observan las diferentes etapas representativas de los qambios de la biomasa y de su ambiente.

264

5.1.3 Velocidad

específica

En los procesos de fermentación los microoorganismos desarrollan su a'ctividad vital en medios de elevada complejidad. El agente responsable de la transformación es una célula viva que asimila diversos materiales, se reproduce y produce otras sustancias, algunas de interés económico. uno de los aspectos más importantes del estudio de la cinética de estos procesos es la selección de métodos analíticos seguros para evaluar confiablemente las sustancias consumidas y producidas por el microorganismo y lá variación de su concentración con el tiempo.

La concentración de céfulas en el medio constituye una medida adecuada de la concentración del sistema enzimático responsable de la transformación. ,por esta razón las velocidades de consumo de sustrato y de formación de producto generalmente son expresadas como velocidades específicas referidas a la concentración de células:

l¡x

=

1dx xdtx^

1

t5.11

Donde, p^: velocidad específica de crecimiento del ffiicrg9¡96¡ismo, h-l; x: concentracién de células, (g células secas).litro-l; r¡: velocidad de crecimiento de las células, g.litro-t.h-1 . l¡s

=

1.& =1.r^ xúro

Í5.21

Donde, s: concentración del sustrato, (g sustrato).1¡tro-1; r": velocidad de consumo de sustrato, g.litro,l .h-'; /s: velocidad específicdde consumo de sustra.

to,

h-1;

1b 1 u,=;'á=;'',

i 4.

r

t5'3I

Donde, pr: velocidad específica de formación de producto, hora-l; p: concentración,del producto, (g producto).litro-1; rr: velocidad de formación de producto, g.litro-l.h-l.

266

Ejemplo

5.1

Determinación de las velocidades específicas de una fermentación

En las FigurEs 5.2, 5.3 y 5.4, se presentan los resultados obtenidos en una fermentación alcohólica, Borzani, 1975. Calcular las velocidades especfficas de crecimiento de levadura, consumo de azúcar y producción de etanol en el

tiempot:5horas. Figura 5.2 Representación gráfica de los resultados obtenidos en una fermentación alcohólica. Variación de la concentración de levadura, Borzani, 1975.

X, g/titro

4s6' Tiempo,

+

X vs t

:h

'--- dx/dt

t

:

3,45 g.litro-1. La concentracjón de células en el instante = 5 horas, es: x Figura la velocidad de crecimiento De acuerdo con la Ecuación t5.11y la [5.2], de levadura es:

.

dx _ (3,9

dt

- 2,6) g = 0.438 g.cé|. lino.h - 3)á

(1t

litro.(6

267

i1,

lrx

=

djf,33 3,45

=

0,126 ¡-r

Figura 5.3 Representac¡ón gráfica de los resultados obtenidos en una fermentaéíón alboh6lica.'variaciún de ta concentración de sustrato. Borzani, 197s,

34567 Tiempo, h

+

S ys t

---- ds/dt,

De acuerdo con la Ecuación t5.21 y la Figura [5.3], la velocidad de consumo de sustrato es:

_

ó = 100 - 70 =7j g. ulcar ú 7-9,2 "v ütro.h tzt

rt'=# |

( .

,

=2'ͧ ¡-t

,'1,-

De acuerdo con la Ecuación tb.31 y ta Figura [S.4], las velociiiades de produc_ ción de etanol sonl

4I-'= 20 - Ot = ¿75, g ctanot dt 8,2 - 3,5 "- lfuo.h

268

(3)

tx= dr = l¡r.x & Donde,

t5.4I

k¿.x

x: concentración de la masa celular, (g biomasa

seca).litro-r; r*:

velocidad de formación de biomasa, (g biomasa seca).litro-1.h-l; t: tiempo, horas; g^: velocidad específica de crecimiento de biomasa, h-1; ko: velocidad específica de muerte celular y metabolismo endógeno, h-1. Para un cultivo en la fase exponencial del crecimiento,

p* > >

kd, y: l¡t* - kol = El valor de px, constante durante el período de crecimiento exponencial, corresponde al valor de la pendiente de la curva de crecim¡ento en esta etapa:

!x,

añ la Ecuación

[5.4].

v-=+*=*u"o x=xo.en t=tue i t,=x,€n t=t Por tanto: ¡

= r,.€Xp

15.51

[pr. (r - tun))

Donde, tloo: duración de la fase de adaptación; xo: concentración de biomasa al final del periodo de latencia, (g biomasa seca).litro-1. Si la velocidad de crecimiento se caracter¡za por el número de células, en lugar de la masa celular, la ecuación anter¡or se convierte en: IV = /V,.exp [rrr.1r

- h")]

Donde, N: número de células o microorganismos viabres al tiempo número de células o de microorganismos viables al tiemBo t : tue.

15.61

t : t; No:

La ecuación [5.6] expresa el crecimiento exponencial de Ia biomasa cuando la concentración de sustancias y las condiciones fisicoquírnicas det medio de crecimiento permanecen constantes. En un cultivo por loteg los microorganismos modifican continuamente estas condiciones y afectan la concentración de biomasa.

270

dM

ú

= pu.4tc.R'?# = b.,.(S .n.p*)'o .uE'

Donde:

b. =

# i

bz =á1.(36.n

.pul'F t5.81

Portonto: M=(

"r^-?)t'

Donde, 9r y bz: constantes; Mo: masa de la pelotilla en el tiempo t : 0; t: intervalo de tiempo. La Ecuación [5.8] concuerda con observaciones experimentales según las cuales el crecimiento de los organismos filamentosos es proporcional al cubo deltiempo. La diversidad de la anatonomfa microbial y de las condiciones de crecimiento afecta la velocidad de crec.imiento. Generalmente, entre mas complejo es un rñicroorganismo, mayor es su tiempo de división celular. En la Tabla 5.1 se presentan datos delperiodo de reproducción de algunas especies de bacterias.

5.2

INFLUENC¡A DE LAS CONDICIONES AMBIENTALES SOBRE LA VETOCIDAD ESPECIFICA DE CRECIMIENTO

5..2.1 Temperatura

La'temperatura afecta la velocidad de Ias reacciones eelulares, la naturalezadel metabolismo, los requerimientos nutricionales y energéticos, y la composición de. la biomasa. Generalmente los microorganismos crecen en un intervalo de temperatura ambiente entre 25 y 3O'C. Sin embargo, existen microorganismos que se desarrollan a temperaturas inferiores a 0"C y otros a temperaturas superiores a 93"C.

272

É

El requisito fundamental es la presencia de agua lfquida. En la Antártida hay bacterias que se reproducen a 7"C, pero que se desarrollan a mayor rapidez a temperaturas entre 20 y 30"C, (Pelczar, 19771' En la Tabla 5'2 se presenta una clasificación de los microorganismos en términos de la dependencia de la velocidad de crecimiento con la temperatura.

Tabla

5.1 Periodo 1

de reproducción de varias especies de bacterias, Spector,

956.

Bacteria

Temperatura Periodq

Medio

oC

Caldo

37

B. thennophiTus Caldo

, 55'

BaciTTus mycoideis

de

reprodücción minutos 28

18,3

Escherichia coli

Cafdo Leche

37 37

t7

Lactobacíllus

Leche

37

65-

87

M. tubercuTosis

Sintético

37

192 -

932

Rhizobium Japonicum

Sales minerales + levadura

25

344 - 46].

12,5

acidophiTTus

Extracto

+

manitol

StaphyTococcus caldo:

37

2'7 -

¡0

aureus

Streptococcus lactis

Caldo + lactosa

leche

37 37

48 26

Trepoñema

Testículos de

37

1980

paTTidum

conej o

273

5.2.2 Energía

de activación

La temperatura, en el intervalo adecuado, inicialmente estimula el crecimiento de los microorganismos, y luego, cuando es demasiado alta, los destruye. La

ecuación de Arrhenius constituye una hipótesis apropiada para describir el efecto de la temperatura sobre el crecimiento:

v¡¡=A.exp

(*) -r,.r* e)

t5.9I

Donde, ¡rr.: velocidad efectiva del crecimiento, veloc¡dad de síntesis menos velocidad de muerte, h-'; A, AD: factores de frecuencia, s-1; Eo: energía de activación'para crecimiento, kJ.(mol)-1, es la energía requerida para llevar las moléculas a un estado de energía en el cual puedan reaccionar; Eo: energía de act¡vación para muerte térmica, kJ.(mol)-l; R: constante de los gases, R : 8,314 J.(mol.K)-1; T: temperatura absoluta, K. La aplicación de la ecuación de Arrhenius a un proóeso microbiológico es un procedimiento cinético formal. Sin embargo, la complejidad del crecimiento microbial, entendido como una secuencia de reacciones, permite prever desviaciones de este comportamiento, Moser, 1988.

5.2 Clasificación de los microorganismos'de acuerdo con la dependencia la velocidad de específica de crecimiento con la temperatura, stanier, et al., 1 975. Tabla

Temperatúra oC Gtupo

Mfnimo

Termófilos

40

45

Mesófilos

10

r5

Sicrófilos obligados

-5 -5

Facultativos

274

5

5

Optimo 55 75

Máximo

60

80

30 15 25

35 19 30

47

45 18

30

22 35

Finalmente es necesario recalcar, en la optimización de procesos, que la tempe-

ratura puede afectar de manera diferente las velocidades de crecimiento de biomasa y de formación de producto. Por tanto, estas dos funciones obletivo deben optim¡zarse independientemente.

5.2.3 Actividad del agua

El agua es el

compuesto más importante para los organismos vivos. Las fuerzas

de atracción, en forma de puentes de hidrógeno, entre moléculas de agua, explican los valores relativamente elevados del punto de fusión, punto de ebullición, calor específico, calor de vaporizacíón, y tensión superficial del agua. La polaridad del agua y su facilidad para establecer enlaces de hidrógeno, la convierten en un excelente disolvente de muchas moléculas iónicas y neutras. El agua también aglomera moléculas amfipáticas tales como jabones y llquidos polares, en forma de micélas, donde los grupos hidrófobos se sitúan hacia el interior del agregado, y los grupos hidrófilos hacia el exterior.

Algunas propiedades del agua tales como el punto de fusión, el punto de ebullición, la presión de vapor y la presión osmótica, conocidas como propiedades coligativas, son modificadas por la presenciade solutos disueltos. La disolución de un peso molecular gramo (1 mol) de un soluto ideal en 1000 gramos de agua (disolución 1 molal), a presión atmosférica normal, disminuye el punto de congelación del agua en 1,86 oC, eleva 0,543 oC el puntb de ebullición, y ejerce una presión osmótica de 22,4 atmósferas, Un soluto ideal no se disocia en dos o más componentes, ni se asocia para disminuir el número total de partÉ culas. Las leyes coligativas solo se cumplen con exactitud en soluciones muy diluidas, Los efectos de los solutos sobre las propiedades del agua tienen una importancia biológica considerable. Asf, por ejemplo, los peces pueden permanecer activos a temperaturas de congelación, y la presencia en la sangre de solutos incapaces de atravesar membranas como en el caso de las proteinas, confiere a la sangre una presión osmót¡ca mayor que la del fluido.extracelular rl el agua presente en este flu¡do tiende a difundirse hacia los capilares sangufneos.

275

Elagua constituye en promedio el 80 % de peso de la célula, interviéne en la reacciones de hidrólisis y en la reducción del oxígeno en la cadena de transporte de electrones. La actividad del agua se define como: i l

A,

=

I!p_

ts.10I

Donde, Pr: presión del vapor de agua de una solución a una temperatura dada;

Pr: presión de vapor del agua a la misma temperatura Según la ley de Raoult, la disminución relativa de la presión de vapor del solvente, en una solución de una sustancia.no electrolítica ideal, es igual a la fracción molar de soluto en la solución:

Pw-Ps Pv

n+N

[5.11]

Donde, n: número de moles de soluto; y'ú: núlñero de moles de agua en la solución. Cuando el soluto es un electrólito, se reemplaza z.rl e¡ lugar de n, donde z es el número de iones por molécula. Cuando el soluto no se comporta idealmente, se reeemplaza Q.z.n, en lugar de n, donde Q es el coeficiente osmótico.

5.2.4 Tonicidad,

osmola!¡dad y osmolar¡dad

El valor de la actividad del agua en los medios de cultivo

diluidos difiere muy pgco de la unidad, por esta razónla acción del agua se expresa en términos de la tonicidad del medio. Una solución de NaCl al9 o/o, en agua, es isóosmótica e isotónica. Aunque isotónico e isoosmótico son términos sinónimos, términos como toniciuad e isotonicidad son utilizados generalmente con los líquidos fisiológicos. Una solución hipotónica tiene una presión osmótica menor que la I de los llquidos'corporales, o la del NaCl al 9 o/o.

276

,Un osmol es la cantidad de soluto que provee un número de Avogadro, 6,02.1023 partlculas en solución, y que al disolverse en un kilogramo de agua, genera un ¡ncremento de 22,4 atmósferas en la presión osmótica. La solución J de un electrólito como el NaCl, representa un ion Na y un ¡on Cl, o sea, 2 osmoles. Por consiguiente, 1 osmol de NaCl corresponde a 29,1 g de NaCl, Una Lobción 1 osmolal contiene 1 osmol de soluto por kilogramo de agua, en tanto que una solución 1 osmolar contiene un osmol de soluto por litro de solución. Los valores de la actividad del agua o de la tonic¡dad del medio son útiles en los estudios de crecimiento de microorganismos en medios concentrados, en los estudios de contaminación microbial, y en el estudio del crecimiento de hibridomas, metabolismo y producción de anticuerpos, Ozturk, S.S., y B.O. Palsson, 1991. Las bacterias son mas sensibles a la actividad del agua que los mohos, Los métodos de prevención de la contaminación de los líquidos están basados en este comportamiento. Si se reduce la actividad del agua, A*, por debajo de

0,95 las bacterias no crecen y para valores de la actividad del agua, A*, por debajo de 0,7 no crecen los mohos. En la Tabla 5.3 se presentan datos del valor óptimo de la actividad del agua, y su Correspondiente tonicidad, para el crecimiento de algunos microorganismos.

Tabla

5.3

Actividad y ton¡cidad del agua. Pirt, 1975' Tonicidad

Actividad del agua (m"-l Organismo

optimo

Mlnimo

optimo

Pseudomonas f Tuoresc ene

0,999

0,960

0,05

2,30

KlebsieTTa aerogenes

o

,999

0,950

o,

05

2,9O

0

,994

0,950

0,,28

2

o

,994

0,860

o,28

A,4O

AspergiTTue niger

o

,975

0,860

l,2a

a

AepergiTTus a¡nsteTodilni

0,950

0,700

2,Ls

19,80

céluJa's f, de ratón

0, 99s

0, 993

0,30

0,40

SaTmoneTTa S

neryort

taphyT o coccus a.ureus

Máximo

,90

,40

* Osmolalidad real 277

l,-n¿

En la Figura 5.5 se presenta elefecto de la actrvidad delagua sobre la velocidad

de diversos procesos físicos,"químicos y enzimáticos. La actividad se determina experimentalmente con un higrómetro, o mediante la evaluación de la disminución del punto de congelación, (Bol et al., 1980). En términos generales la velocidad relativa de los procesos indicados en la Figura 5.5 es proporcional a la actividad del agua,

5.2.5

pH

El agua ioniza ligeramente, formando íones hidronio (HrO*), e hidróxilo (OH). La concentración de estos iones en una disolución acuosa diluida, se determina

mediante la expresión:

K*=ln-llon l= 1..10-14

t5.121

Donde, K*; producto ión¡co del agua, a 25 oC, es el fundamento de Ia escala de pH, definida como pH : - logro [H*]. La actividad metabólica de los.microorganismos es muy sensible a los cambios 'de pH. según Ia teoría de Brónsted-Lowry un ácido es un donante de protones,

(H*), y una base es un aceptante, (A-), de protones. Un pai ácido-base

conjugado (HA) se define como un donante de protones con su correspondiente aceptante. La constante de disociación, K'o, a una temperatura dada, indica la tendencia de un ácido, en solución acuosa, a donar protones: K¿, =

f¡rl tá-l

t5.131

IHA) En la Tabla 5.4 se presentan los valores de pH de algunos fluidos. Se observa que el jugo gástrico, los refrescos a base de cola y el jugo de limón tienen un pH bastante bajo. Los ácidos débíles como el ion amonio manifiestan una alta afinidad por sus pro-

tones y tienen una considerable importancia biológica, ya que actúan como amortiguadores para resistir los cambios de pH, y mantenerlo en un nivel adecuado, en el organismo.

278

Figura 5.5 lnfluencia de la actividad del agua, a temperatura constante, sobre Ias velocidades relativas de diversos procesos. Curva 1 : Destrucción de clorofila en espinaca a 37 oC; Curva 2: Degradación del ácido ascórbico; Curva 3: Oxidación de astillas de papa almacenadas a 37 oC; Curva 4: lnactivación de fosfatasa en leche desnatada; Curva 5: lnactivación del ClosÜidium botulinum; Curva 6: Secado de glucosa a 30 oC. (Thijssen, 1979).

Vet'ocldad relatlva

o,3 0,4 0,5 0,6

0,7

o,8

o,9

Actividad del agua

La ecuación de Henderson-Hasseltialch permite calcular el valor de pK,

log.,o

K') de cualquier ácido, a partir de la relación molar entre la

pH

=

pK'. bg

#

(pK':

-

especie

t5.14I

Los fluidos intra y extracelulares de los organismos vivos contienen pares con-

jugados ácido-base que actúan como athortiguadores. El principal sistema amortiguador intracelular es el par conjugado HrPOo- - HPO42', IBK' *'7,21'. también contiene amortiguadores muy act¡vos. Si sd añade mlde HCl, 0,1 N, a 1 litro de suero fisiológico (NaCl, 0,15 M)a pH 7,0, el pH desciende hasta pH 2, ya que la solución de NaCl no posee capacidad amortiguadora. Sin embargo; si se añade 1 ml'de HCI, 10 N, a 1 litro de plasnia sangulneo, a pH 7 ,4, el pH desciende hasta pH 7 ,2, El plasma sanguíneo

1

279

Tabla

5.4

pH de algunos fluidos. (Lehninger, 1973) pH

Fluido

Plasma sangulneo

7,O - 7,5 7,4

Fluido interstic¡al

7,4

Agua de mar

Fluidos intracelulares Músculo

6,1

Hlgado

6,9

Jugo gástrico Jugo pancreáüco

1,2 - 3,O 7,8 - 8,O

Saliva

6,35 - 6,85

Leche de vaca

6,6

O¡'ina

5

Zumo de tomate

4,3

Zumo de toronja

3,2

Refrescos a base de cola

2,8

Zumo de limón

2,3

-8

5.2.5.1 Efectos delpH delmedio sobre la velocidad de crecimiento de algunas bacter¡as

Elvalor óptimo de pH, entendido como el valor para el cual la velocidad de crecimiento es máxima, varía entre 6,5 y 7,5 para bacterias, entre 4 y 5 para fevaduras, y entre 5 y 7 paramohos. En la Tabla 5.5 se presentan los valores mínimo, óptimo y máximo, para el desarrollo de algunas especies de bacterias. El pH del medio de cultivo cambia como respuesta a la actividad microbial: se genera H* durante la demanda de NHo*; se consume H*, en el metabolismo de NO.-; se consume H* en la utilización de aminoácidos, como fuente de carbono.

280

-

cultivo, usualmente med¡ante la adición de ácido clorhídrico o sulfúrico, y una de las bases: hidróxido de sodio, de potasio o de amonio, al medio. Se prefiere el amonlaco gaseoso en lugar del hidróxido de amonio, por la posibilidad de contaminación, de este último compuesto con esporas bacteriales.

Tabla

5.5

Valores de pH para el desarrollo de varias especies de bacterias.

Límite inferior

Bacteria

Optimo

Límite superior

0, 5

2, o -

4,o - 4,5

5,4 - 6,3

7 -

4,2

7,O - 7'5

9,3

5,5

7'i O - 7 .5

8,

ChTorobium TimicoTa

6,0

5,8

7'O

Thermug aquatieue

6,0

'7,5 - 7,8

9,5

ThiobaciTTus thiooxidans Acetobacter

aceti

StaphyTococcus aureus Azotobacter

spp.

3

,5

5

8

5

Fuente: Datos tomados del Manual of Determinative Bacteriology de Bergey. 8a ed. Williams & Wilkins. Baltimore, 1974,

5.2.5.2 lnfluencia del pH del medio sobre la velocidad de un bioproceso

Generalmente hay un valor del pH del medio para el cual la veloqidad de un bioproceso es máx¡ma. Valores de pH menores que el máximo estimulan la velocidad y valores mayores la inhiben. Humphrey 11977 , 1 978) presenta la siguiente ecuación:

28'l

fi = f¡max

1r,.s¡(r.*.8)

t5.151

Donde: r,: velocidad de producción o de consumo de la especie i. El subíndice irepresenta uria concentración, en g,.litro'l . AsÍ e, X, o, pt s, h*:concentrac¡ón de enzima, de masa celular, de oxfgeno, de producto, de sustrato, y de ion hidrógeno, respectivaméflt€i [¡,.o: máxima velocidad de producción o de consumo de especie i; K.,: constante c¡nét¡ca, rbpresenta elefecto estimulante del pH sobre la velocidad de un bioproceso, en g.litro-l; Kr: constante cinética, representa el efecto inhibitorio del pH sobre la velocidad de u4 proceso, g.litro-].

Otros autores, (Andreyeva y Biryukov, 1973), presentan la influencia del pH sobre la velocidad de un bioproceso mediante una curva de ajuste:

r,=r,*[t Donde:

5.3

so + s.1 .@Hl x

"2.bfl\2.,)

t5.16I

q: coeficientes de un polinomio.

MODELOS CINETICOS NO ESTRUCR'RADOS PARA CRECIMIENTO DE BIOMASA, CONSUMO DE SUSTRATO Y FORMACION DE PRODUCTO

Fredrickson , et a|.,1 970, clasifican los modelos de crecimiento de una población microbial en estructurados y no estructurados. El modelo estructurado considera algunos aspectos básicos de la estructura celular e identifica una o dos especies químicas claves dentro de la célula, quizás aquellas que pueden extraerse a escala comercial, y agrupa los demás componentes de la célula, en una o dos clases generales tales como proteínas y lfpidos. Sin embar(¡o, para muchos propósitos tecnológicos es suficienté un modelo no estructurado, donde el microorganismo o la célula se considera como gn componente simple, generalmente con una composición química fija. Los modelos segregados óónsideran la población celular como una colección heterogénea de entidades discretas, en

282

tanto que en un rnodelo no segregado, el comportamiento de la población celular se aproxima al de una célula promedio.

En un fermentador real el crecimiento es estructurado

y segregado.

Sin

embargo, cuando la heterogeneidad celular no afecta los procesos cinéticos.de interés, son válidos los conceptos de célula promedio y modelo no segregado. En el estado de crecimiento,csnocido como balanceado todas las act¡vidades de sfntesis celular esiári csóiÉhÉdas de manera que la composición celular promedio no se afecta por la proliferación de la población. En este caso un modelo adecuado no requiere la con§ideración de la naturaleza multicomponente de la célula.

'] 5.3.1 lnfluencia

de la compos¡ción del med¡o sobre la velocidad específ¡ca de crecimiento

5.3.1

.1 Modelo de Monod

El efecto de la'composición de un medio de cultivo libre de sustancias inhibitorias sobre la velocidad específica de ,clecimiento fué estudiado por Monod (19581. Las ecuaciones básicas que describen la interacción entre el crecimiento de los microorganismos y el sustrato limitativo del crecimiento son:

!d, xdt I

o ^

=

lLx

'ds -

--

dt

= llu

s+Ks

1

dx

Yus dt

t5.1 7I

t5.181

Donde, s: concentración del sustrato limitante, (g).litro-l ; r": velocidad de consumo de sustrato, (g sustrato).(litro.hora)-'; Yxi":factor de rendimiento de sustrato en producto, (g células).(g sustrato)-1; x: concentración de biomasa, (g células secas).litro 1; p*: velocidad específica de crecimiento, h-'; /rr: velocidad específica máxima de crecimiento, h-l ; K": constante de saturación, g.litro-l; K.:

283

es la concentrac¡ón del sustrato para la cual la velocidad específica crecimiento es la mitad del valor máximo, pr'

de

En la Tabla 5.6 se presentan los valores de la constante de saturación, Kr, correspondientes al crecimiento de algunos microorganismos en diversos sustratos. Los valores relativamente altos de K" de la glucosa indican que este sustrato es una de las fuentes de carbono y energfa "preferidas" por muchos micrOorganismos. Sin embargo, para otros miCroorganismos existen mejores sustratos que la glucosa.

Tabla 5.6 Valores de la constante de saturación_, K., para el crecimiento de microorganismos sobre diversos sustratos (Cooney, 1982l .

organlsmo (genua)

Escherichia Escherichia Escherichia AspergiTlus Candida Escherichia Saccharomyces Pseudomonas Pseudomonas KTebeieLla Escheríchia KTebsieLLa Klebsiefla KfebsielTa Candida Candida AspergiTTus Escherichia 'Escherichia Cryptococcus 284

Sustrato glucosa manitol glucosa glucosa glicerol lactosa glucosa met,anol meLano Co, iones fosfato iones magnesio iones potasio iones sulfato gxÍgeno oxfgeno arginina tript,of ano tr:iptof ano Eiamina

Kr, mg,/Iítro 6,8 .10-'z 2,0 4,0 5,0 4,5 20,0 25,o 0,7 0,4 0,4 a,6 5,6 .10-l 3,9.10-1

2,:l 4,5.10 4,2.10

I 2

5, 0.10-l 1, 1 . 10-3

,9 .!0'4 L,4 .10-1

4

En el caso de medios con múltiples fuentes de carbono, una vez agotado un sustrato, la célula adapta sus "rutas metabólicas", catalizadas por enzimas, a la siguiente fuente de carbono y, después de un nuevo periodo de adaptación, se reinicia el crecimiento. Este fenómeno se conoce como crecimiento diauxico.

5.3.1.2 Modelo de Moser

Con el propósito de lograr la representación de los datos experimentales con un mayor grado de ajuste, diferentes investigadores han propuesto otros mÓdelos como alternativa a la ecuación de Monod. Las ecuaciones presentadas en esta Sección corresponden a modelos cinéticos no estructurados, considerados como una buena aproximación cuando la composición celular es independiente del

tiempO, cuando el crecimiento es balanóeado, o cuando la composición celular no es importante a escala industrial. El modelo propuesto por H. Moser (19581, se expresa mediante la ecuaciÓn:

Px =

l¡¡¿

§' Ks * sn

t5.19I

Donde, n: constante empírica. Las variables tienen el mismo significado que en lás Ecuaciones [5.17 y 5.181.

La expresión logarítmica de la Ecuación t5.191 es útil en la evaluación de los parámetros n y Ks del modelo:

bg

---IrPr-Px

= ,r.logs

- log¡,

t5.19.a]

La representación gráfica de log tpx/fun - ltx)l en las ordenadas versus log s en y [aS abcisas corresponde a una línea recta cuya pendiente es n cuyo intercepto

es L log

Kt.

285

.) 5.3.1.3 Modelo de Contois y Fuiimoto

El modelo propuesto por Contois, (1959)

.

y

Fujimoto, (19631, se aplica en

sistemas donde prevalecen altas concentraciones de biomasa cuyo crecimiento está acompañádo por la producción de metabolitos o inhil¡idores tóxicos: rrx =

pll.I,jls

ts.zol

Donde las variables t¡enen el mismo significado que en e! modelo de Monod, Ecuaciones Í5.17 y 5.181.

v

5.3.1.4 Modelo de Teissier

La ecuación que expresa el modelo propuesto por Teissier (1936), es:

Fr=Fv

['

-"'e(¿)

]

Donde las variábles tienen el mismo significado que en el modelo de Ecuaciones [5.17 y 5.18].

'u"' Monod,

5.3.1.5 Modelo de Konak El modelo propuesto por Konak 119741, se expresa mediante la ecuación:

*

286

= k'(vx - F, )o

15'221

r-

k :, l/fu*Kt; p: coftstante

empfrica.' Las variables tieneh el rnismo que Monod,.Ecuaciones t5.17 y 5.181,.,.Además, de modelo en el significado la ecuación de Monod, que en esta ecuación se convierte Konak demostró Ecuación 15.17l,para p : 2, Y en la ecuación de Teissier, Ecuación [5.2O], para Donde,

p:

1.

5.3.1.6 Modelo de Kargi Y Shuler

El modelo propuesto por Kargi modelos mencionados:

y Shuler (1979), es una generalización de

los

15.231

En la Tabla 5.7 se presentan los valores de las constantes K'

m y p, correspon'

dientes a cada modelo.

Tabla 5.7 Valores de tas constantes de la Ecuación [5.2O]. Moser, 1988' Modelo

K

m

p

Monod

t/rx

0

2

Moser

1-t/n

)- + L/n

Teissier

n/ (K")'/" l/K*

U

1

Contois

t/ (K,.x)

0

2

Konak

k. p,

p

p

247

S.g.zlnfluencia de la concentración de biomasa sobre la velocidad específica de crecim¡ento: Modelo de Meyrath

Meyrath (1973), considera la influencia de la concentración de biomasa sobre la velocidad específica de crecimiento como una consecuencia de la limitación por sustrato. Sien un medio de crecimiento se mantienen constantes las condiciones fisicoquímicas y la concentración de nutrientes, la velocidad especlfica de crecimiento es aproximadamente igual a su valor máximo, pr. Los microorganismos formados modifican continuamente las condiciones del medio y alteran la concentración de biomasa.

f5.24t

[x = ]la, Ks*

1; Las demás Donde, so: concentración inicial del sustrato limitante, (mg).litro variables t¡enen el mismo significado que en el modelo de Monod, Ecuaciones

f5.17 y 5.181.

5,3.3

PerÍodo de adaptación: Modelo de Hinshelwood

El período de adaptación de la célula a los cambios de su ambiente fisicoqufmi-

co, conocido también como perfodo de latencia o perfodo lag, puede calcularse por el método de Hinshelwood (1946), o de Lodge v Hinshelwood'(1943):

tt=t-

1x Fr --ln

-xo

Donde, t,_ : perfodo de adaptación; xo: concentración de biomasa en concentrac¡ón de biomasa en la fase exponencial en t : t.

288

t5.2sI

t:

tr; x:

:

5.3.4

Fase estacionaria: Modelo de La Motta

La Motta (1976), utilizó la ecuación loglstica de Kendall (1949) para cuantificar

el crecimiento de biomasa en los cultivos continuos después de un prolongado periodo de fermentación como en el caso de algunos procesos de tratarñiento

biológico de aguas residuales y de algunos procesos de producción de ant¡bióticos, donde la formación de producto ocurre después de cosar el crecimiento:

fx=

t5.261

ff=u*'*'['*t)

Donde, xM: concentración de'biomasa en la fase estacionar¡a, g.litro'l

5.3.5

Fase de muerte microbial

5.3.5.1 Modelo de Chiu

La importancia de la fase de muerte microbial es directamente proporcional al tiempq de residencia gnrlos.pro@sos con perfodos prolongados de retención como en el caso deltratamiento b¡ológico de aguos residuales. Las ecuaciones que describen este modelo, empleado exitosamente en el procesg de lodos act¡vados, según Chiu, et al., (1972), son:

r§

--

-ds - 1 -r-^ dt Yn,

- -dx = px.x ^ú

kD.X

15.27.a|

.Í5.27.bl

289

Donde, rr: velocidad de consumo de sustrato, g.litro'1.h'1; r^: velocidad de crecimiento de biomasa; Y*,.: rendimiento del sustrato en células,

19 céluias)/(O

sustrato); ¡,rr: velocidad especffica de crecimiento, h-1; x: concentración de biomasa, (g biomasa secal,litro-l; ko: velocidad especffica de muerte celular y metabolismo endógeno, h-l .

5.3.5.2 Modelo de Moser y Ste¡ner

La aplicación del modelo de Monod (Ecuaciones 5,17 V 5.18) puede conducir a valores falsos, e inclusive negativos de Kr, cuahdo se ignora el valor de la constante ko. Moser y Steiner (1975), presentan la siguiente ecuación para modelar la fase de muerte microbial:

1 = L* Vx * ko l¡¡r.s

.

t

f5.28t

Fa

5.3.6 Metabolismo endógeno

La disrninución de la masa global de células en los procesos con períodos prolongados de retención obedece a dos factores independientes: la muerte celular y el metabolismo end,ógeno:

Ko=Kl+K,

f5.291

Donde: Ko: velocidad específica de muerte celular y metabolismo endógeno; h-1; Koo: velocidad verdadera de muerte, h-1; Kr: velocidad especffica de metabolismo endógeno, h-l.

290

Las constantes de veloc¡dad, Ko, y K, generalmente son evaluadas por el método recomendado por S¡nclair y Topiwala, '1970, a part¡r de la representación gráfica de la Ecuación f2.371, (Figura 56): lL, =

1 il" * ("rJ.u,

IEcu.2.37l

Donde, p": vélocidad específica de consumo de sustrato, {mol sustrato). (g cél.h)'

de mantenimiento basado en el sustrato, (mol sustrato).(g cél.hora)-1; p^: velocidad especlfica de crecimiento de biomasa, h-'; (Yrs),: coeficiente de rendimiento verdadero de sustrato en biomasa, g biomasa (mol

'; m.: coeficiente

sustrato)-1.

Figura

5.6

Evaluación de las constantes de velocidad del metabolismo endógeno. Sinclair y Topiwala, 1970,

Volocldad especlflca de consumo de sustrato, l/hora

o

Velocidad especi flc"a de crecirrllento, l/h

La Figura 5.6, representación gráfica de la Ecuaci 6n 12.371, ¡lustra el método de

Sinclair y Tofiwala, 1970:

-

El coeficiente de rendimiento verdadero de sustrato en bisrñasa se evalua partir del valor de la pendiente,

a

291

-

El valor de la velocidad verdadera de muerte, ¡ntercepto con el eje de las x.

Ko, es el correspondiente al

-

El valor del coeficiente de mantenimiento es el correspondiente al ¡ntercepto con el eje y. El valor de la velocidad específica de metabolismo endógeno, Kr, se calcula a partir del intercepto con el eje de las y:

t5.301

5.4

MODELOS CINETICOS PABA LA ¡NHIBICION DEL CRECIMIENTO

5.4.1

lnhibición por sustrato

5.4.1,1 Efecto de la fuente de carbono

Los valores de la constante de saturación, K", para diversas fuentes de carbono, (Tabla 5.6), varían tfp¡camente entre 1 y 10 mg.litro'l. Estos valores significan

que las células crecen a su máxima velocidad cuando la concentración de la fuente de carbono excede 1 0,Ks, o sea, entre 1 0 y 1 00 mg.litro'1. Para todos Ios nutrientes hay un valor de la concentración que al ser sobrepasado origina una disminución de la velocidad de crecimiento. Este efecto, conocido como "inhibición por sustrato" puede presentarse en el caso de carbohidratos alrededor de 50 g.litro-1, aunque generalmente, solo se manifiesta entre 100 y 150 g.litro-1. Usualmente un incremento de la concentración de sUegglo ínfluye sobre la presión osmót¡ca y causa una deshidratación parcial de la célula.

292

Otros sustratos como el fenol, el tolueno o el butanol, extraen componentes de la célula y deterioran la membrana celular cuando su concentración es de unos pocos g,litro-1 I

.

En la inhibición competitiva la sustancia inhibitoria compite con el sustrato limitante del crecimiento. En la inhibición no compet¡tiva, la sustancia inhibitoria reacciona o se combina con la biomasa sin afectar su afinidad por el sustrato. Otros modelos de inhibición incluyen características tanto de la inhibición competitiva como de la no competitiva.

5.4.1.2

Efecto de la fuente de nitrógeno

Los microorganismos metabol¡zan prácticamente todas las formas orgánicas e inorgánicas de este elemento para proveer las protefnas intracelulares, los ácidos nucleicos, y las proteínas que conforman la pared celular, El nitrógeno const¡tuye hasta el 12o/o del peso, base seca, de las bacterias, y el 1Oo/o del peso de los hongos. Los valores de la constante de saturación, K", para los aminoácidos, varlan entre 0,003 y 0,2 mg.litro-'!, y para amonfaco entre 0,1 y

l

mg.litro-1.

Estos valores de K. demuestran la capacidad de los microorganismos para crecer a su máxima velocidad con muy bajas concentraciones de nitrógeno. Generalmente la concentración de los compuestos nitrogenados en el ambiente es baja

y aquellos microorganismos capaces de crecer a estas concentraciones tienen una apreciable ventaja competitiva. Frecuentemente, cuando se provee demasiado nitrógeno, se originan problemas de inhibición por sustrato. El amonfaco causa inhibición a concentraciones superiores a 3 - 5 g.litro-l. Al agotarse.la fuente de carbono en un medio de

cultivo, en presencia de aminoácidos, los microorgan§mos consumen el esqueleto carbonado de los aminoácidos y se acumula arhonfaco. Cuando se ut¡lizan nitratos como fuente de nitrógeno, estos compuestos son parcialmente reducidos hasta NOr, sustancia que puede ser tóxica para las células.

293

5.4.1.3

Modelo de Andrews

Andrews, '1971 , recomienda la siguiente ecuación para la inhibición pirr sustrato de un cultivo en'un reactor de mezcla completa:

'^ '-

[5'31]

'

r*K§*'§' § K¿s

Donde, !x, !¡¡i velocidad específica y velocidad específica máxima de crecimiento; Kr: constante de saturación, mg/litro; K,.: constante de inh¡b¡ción por sustra-

to, mg.litro-l ; s: concentración de sustrato,

mg,litro-1

.

Edwards. (1970). confronta la Ecuación t5.311 y las deducidas por otros aujores, (Noack, 1968, Aiba er at., 1968; Yano ét al., 1966; Webb, 1963, óon datos experirnentales y deduce que todas estas ecuaciones conducen a resultados similares. El valor de la concentraqión del sustrato, corespondiente a part¡r de la Ecuación t5.311:

lr,

se'obtiene

*=o=py.(,.+.*)'(_:.*) .

De dondc

:

s = (K"

. Xo)'o

*

-:,

a

.

15-.32'l ,

Y a! reemplaza¡ la concentración de sustr,ato s, en la Ecuación [5,31]:,

'

lu

Í5)'o

1 + 2,1-

(r"

/ \ )

294

t5.33r"

5.4.1.4

Modelo de Tseng y Waymann

En algunos casos el patrón de la inhibiciÓn por sustrato difiére del expresado por

Ecuación t5.311 y demuestra un decrecimiento lineal de la velocidad específica de crecimiento, /.rx. Tseng y Waymann, 1975, presentan una ecuación, válida para concentraciones de sustrato mayores que un valor crftico,

la

sci )L

= Fu-

Kt*s

Kr.(s - S.

)

t5.34I

5.4.2 lnhibición por produeto

Los modelos c¡néticos de inhibición por producto presentados por diferentes investigadores ajustan los datos experimentales de acuerdo con el patrón específico de comportamiento de cada proceso. El decrecimiento de la velocidad específica, /x, puede ser lineal, exponencial, por etapas, etc., y, generalmente el cambio de una cepa o la modificación de las condiciones experimentales alteran los resultados.

5.4.2.1 Modelo de Holzberg

Holzberg et al., (1967), presentan un'modelo cinético válido en aquellos casos donde la velocidad específica de crecimiefito, ltx, decrece linealmente;

Vx=Va-f,t.(p-Kz) Donde,

0;

ts.3sl

¡rr: velocidad específica máximg4e crecimiento, h-r, evaluada con p

p: concentración del producto, g.(ñtrol-'; K,,: constante cinética, litro.g-1 Kr: constante cinética, g.(litro)'l

:

.h-1;

.

295

5.4.2.2. Modelo de Ghose y Tyagi Ghose y Tyagi, 1979, presentan un modeto para evaluar la' inhibición del crecimielto de revadura

*'*;"1'-r.r, \

.

-.cx)l

Donde, c: concentración media del productoi producto a la cual las células son aun viables.

cr,¡r:

r5.s6,

máxima concentración de

5.4.2.3. Modelo de Jerusalimsky El modelo propuesto por Jerusalimsky, 1967, es uno de los modelos utilizados con mayor frecuencia en la evaluación de los resultados de la c¡nética de inhibición por producto en cultivos discontinuos:

=r"'t'[

#

Donde, K,, es la constante de inhibición por

t5'37]

ptoducto. \

5.4.2.4. Modelo de Bazua y Wilkie Bazua

y Wilkie, 1977,

ajustaron los datos experimentales obtenidos en la

c¡nét¡ca de inhibición delcrecimiento de levadura en cultivo continuo, por etanol,

mediante la siguiente ecuación:

t

-

\t/2

r¡r=r¡c.ll*'c cx)I

t

296

t5.381

Donde, pr: velocidad especlfica máxima de crecimiento, cc: concentración media del producto en cultivo continuo, g.litro-1; ¡r.: velocidad específica de crecimien-

to observada a la concentración c..

5.4.3.

Represión cataból¡ca

Un cultivo de microorganiSmos en un medio compuesto por diversas fuentes de

carbono utiliza selectivamente aquella que !e permite una mayor velocidad de crecimiento y reprime catabolicamente los nutrientes menos Útiles. La represión cataból¡ca es un fenómeno importante en algunas fermentaciones industrÍales como en la producción de levaduras y de algunos ant¡bióticos, y cuando hay crecimiento diauxico y formación de metabolitos secundarios. Moser, 1988, recomienda el siguiente modelo de represión catabólica: ft=ltv

(,*".[r.¿)

t5.391

Donde, r,: velocidad de formación, o de consumo, de componente i, g'litro-1.h-1; x: concentración de biomasa, (g células secas).litro-1; s; concentración de 1. sustrato, g.litro-l; KR: constante de represión, g.litro

5.5

MODELOS CINETICOS PARA LA FORMACION DE PRODUCTO

Normalmente los microorganismos convierten la fuente de carbono en biomasa y producen so.lo la mfnima cant¡dad de metabolitos esenciales y posiblemente pequeñísimas cant¡dades de metabolitos secundarios o no esenciales. La optimización de la productividad de un proceso para la obtención de metabolitos secundarios usualmente incluye la interferencia de los mecanismos de regulación 297

metabólica del microorganismo, para convertirlo en sobreproductor del compues-

to deseado, además de ensayos con microorganismos mutados en diferentes condiciones ambientales,

5.5.1.

Clasificac¡ón de los productos

Los microorganismos utilizan el sustrato en la síntesis de nuevo material celular

y de productos extracelulares,

para obtener la energfa requerida por las reacciones de síntesis y recirculación de materiales, y para mantener las sustancias dentro de la célula en un nivel de concentración generalmente diferente de la concentración de estas mismas sustancias en el ambiente. La energla que impulsa los procesos celulares es la energía qulmica del ATP, o

de sustancias similares, obtenida mediante la oxidación del sustrato por el oxígeno molecular hasta CO, y agua, proceso conocido como fosforilación oxidativa. Otro proceso de obtención de energla es la fosforilación a nivel de sustrato mediante la degradación del sustrato hasta productos mas simples como etanol, ácido láctico, ácido cftrico, CO, y agua. Estos productos excretados por la célula, mediante fosforilación a nivel de sustrato, son conocidos como productos del tipo 1. Los productos del tipo 2 son compuestos extracelulares tales como exoenzimas, polisacáridos y metabolitos especiales, Las exoenzímas degradan las moléculas

del sustrato demasiado grandes para atravesar la pared celular. Los polisacáridos como la celulosa y el almidón, cumplen funciones estructurales en la agregaoión de células, y como reserva de alimentos. Los metabolítos especíales como

los antibióticos, evitan la competencia de otros microorganismos,

'/

7

En algunos casos donde el medio contiene un exceso de fuente de carbono y cantidades limitadas de otros sustratos como nitrógeno o magnesio, pueden obtenerse productos del tipo 3. Los productos del tipo 3 como el glicógeno y las grasas, actúan como depósitos de energía y pueden ser o almacenados o excretados por la célula. Los productos del tipo 4 son los constituyentes celulares tales como el núcleo, los cromosomas, el citoplasma, el lisosoma y las membranas celulares.

298

Gaden, (1959), distingue cuatro tipos de formación de producto de acuerdo con

la relación cuantitat¡va entre la cantidad de producto y el crecimiento

biomasa.

de

.

- Tipo 0: Las células en reposo utilizan pequeñas cantidades de sustrato para su propio metabolismo y funcionan como transportadores de enzimas. Como ejemplos puéden mencionarse la transformación de esteroides y la slntesis de vitamina E por Saccharomyces cerevisiae.

-

1:

La formación de producto está directamente asociada con el crecimiento. Es el caso de los metabolitos primarios en los cuales la formación del producto está asociada con el metabolismo de energía. Como ejemplos

Tipo

pueden mencionarse la producción de alcohol y ácido glucónico, y el tratamiento biológico de aguas residuales.

2:

No hay una relación entre el crecimiento y la formación de producto. Como ejemplos pueden mencionarse la producción de penicilina y de estreptomicina. - Tipo

- Tipo 3: Hay una relación parcial entre el crecimiento y la formación de producto y por consiguiente una relación indirecta con el metabolismo de energía. Como ejemplos pueden mencionarse la producción de ácido cítrico y la de algunos aminoácidos.

5.5.2. Modelos c¡nét¡cos 5.5.2.1 Formación de producto asociada al crecimiento m¡crobial

Algunas de las ecuaciones que describen la formación de producto asociada al crecimiento microbíal son: dP rp=E

=

(Yn*).r*

=

(Yrt*).

dx.

&

t5.401

299

1dP

xú

=r¡¿=

rp

=

v,,il.! ff=vri.v*

(Yrts).""

= (Yry, ).

ds

ú

t5.411

t5.42)

Donde: rp, r¡, rsi velocidad de formación de producto, crecimiento de biomasa, y consumo de sustrato, respectivamente en g.litro-1.h-,; x, p, s: concentración de células, producto, y sustrato, respectivamente en g.(litro)-1 ; ¡rr: velocidad específica de crecimiento de biomasa, h'1 ; ltpi velocidad específica de formación de producto: (g producto).(g células)-1.h-1. La siguiente ecuación relaciona los factores de rendimiento de las tres ecuaciones anteriores: t5.431

Donde, Yor: rendimiento del sustrato en células, (g células)/(g sustrato); yr,.: rendimiento de sustrato en producto, (g producto)/(g sustrato); Y"rx: rendimiento de biomasa en producto, (g producto)/(g biomasa).

Moser, 1988, presenta la siguiente ecuación, Tipo Monod, para la formación de producto asociada al crecimiento: fP=fp,ti.

s.r Ks *s

15.441

ponde, rr: velocidad de formación de producto, g.litro-, .li1 ; pr*: velocidad especffica máxima de formación de producto, (g producto).(g células.h)-r.

5.5.2.2. Formación de producto no asociada al crec¡m¡ento microbial Generalmente, la cuantificación de la forma",on ,, producto no asociada al crecimiento es una tarea diflcil. En algunos casos el siguiente modelo ajusta los datos obtenidos experimentalmente, Moser, 1 g8B:

300

\

rt = x'Ky

t5.451

Donde, rp: velocidad de formación de producto, g.litro-1 .(hora) 1; ,t Jón""nrr"-

ción de biomasa, g.litro-l; Kr: constante de ve¡oc¡dad para formación

de

producto: (g producto).(g células.h)-l.

5.5.2.3

Formación de producto parcialmente asoc¡ada al crec¡m¡ento: modelo de Luedeking y Piret

El modelo propuesto por Luedeking y Piret, (1959), para la fermentación del ácido láctico, es una combinación de las ecuaciones t5.411 y [5.45], y por tanto, es un modelo para la formación de producto parcialmente asociado al crecimiento:

f¡¡ = f¡r.

(Y^) + K,

t5.461

Donde, !p, Kpi velocidad especifica de formación de produeto y constante de velocidad de formación de producto, (g producto).(g células.h)-1; p*: velocidad

específica de crecimiento de biomasa; h'l; Yrr*: rendimiento de biomasa en producto, (g producto).(g biomasa) 1.

5.6

EVALUACION DE PARAMETROS CINETICOS A PARTIR DE DATOS EXPERIMENTALES

El modelo de Monod (Ecuaciones t5.171 y t5.181) describe la interacción entre el crecimiento de microorganismos en un cultivo por lotes y la utilización del sustrato limitativo del crecimiento en aquellos sistemas donde prácticamente todo el sustrato es transformado en biomasa:

301

-

¿x

dt

_ Pu-b.r) Ks*s

dsldx dr Y*1, df

15.171

15.181

Donde, Y^,=: factor de rendimiento de sustrato en producto, (g células).(g sustrato)-1; s: concentración del sustrató limítante, g.litro-l; x: concentración de biomasa, (g células secas).litro-'; lt*: vetocidad específica m{xima de crecimiento, hora-l; Kr; constante de saturación, g.litro-l; K.: es la concentración del sustrato correspondiente a una velocidad especffica de crecimiento igual a la mitad del valor máximo, !u.

5.6.1 Método integral

de análisis

El método integral de análisis del modelo de Monod.(Ecuaciones ts.17l y [5.18]], propuesto por Ong, (1983), se fundamenta en.un algoritmo de búsqueda unidimensional y en un procedimiento de ajuste por mlnimog cuadrados. El punto de partida del método es la siguiente ecuación obtenicla mediante integración de la Ecuación [5.18]:

x=Ío+Y*lr Gr-")

Í5.47t

Donde,, xo, so: cóncentración inicial de biomasa y de sustrato limitativo'del crecimiento, respectivamente. Si la Ecuación'[5.47] se sustitu'ye én la Ecuación t5.171 se obtiene:

#

302

=

#*

l*o

* Yn,' t", -'l l

ts.481

ds __ dt

+ffi[r'

* Í*¡"'(s' -s)]

Kr+s

.ds=- P, la

I " [r, * Yrr-. (", - ")

]

Jo

1. s .1Lnfi., +a.dll '. -t ln- =D. . -so o..=

!s!.

rrr.

-c

.

t5.491

á

[5.50]

t5.511

xo

b=1

+ Yr¡r. s,] +=l=: [x, Yv*'Kr t "

t5.521

"=#["*r'r¡'"']

t5i53I

¿=(so-s)

t5.541

La Ecuacióo tS.SOL Ceducida,por @eory Marlar,, (1968); iedba, una,felaci6n lineal entre los términos {(1lt}iIn (s/so}}y {(1/t).ln (1 + a,d)}, Gate&y Mar'lar, (1968), sugieren un procedimiento basado en la representación gráfica de estos térm¡nos para diferentes va[ores supuestos del parámetro a. Los valores de ¿, b, y c, asociados con la tnejor,[aea rebta obteirida, son seleccionados como los mejores estimativos y- son los utilizados en la evaluacíón de pu,'K. y Y*,., a '' i .' j partir de las Ecuaciones [5.51], [5.52] y [5.531: |Ú-u=

c

b-1

ts.55I

303

_1 *sa Ks=

t5.561

a

b-1 t5.57I

Yr6=a.xo Los parámetros c¡néticos de la ecuación de Monod,

/¡¡ y

Ks, no pueden

estimarse con la misma facilidad que los de Michaelis-Menten en una reacc¡ón enz¡mática. En el caso de una reacción enzimática, la velocidad inícial de una reacción se mide en función de la concentrac¡ón de sustrato a part¡r de una serie de varios ensayos por lotes. En un cultivo de microorganismos la velocidad

inicial de una reacción siempre es cero por la necesidad de una fase de adaptación durante la cual no se aplica la ecuación de Monod. Además, estas ecuaciones, aunque similares, son diferentes:

- Michaelis-Menten dP

d,

fx's _-,r- - Kr*,

t5.581

- Monod

!d* =! 'fx= xdt x

l¡¡r. s

Ks*s

t5.591

De acuerdo con Ong, 1983, el coeficiente de correlación R, describe el grado de ajuste de una lfnea recta. Por consiguiente el coeficiente R correspondiente a la relación lineal expresada en Ia Ecuación [5.50] es:

R2=

(n.E;.r - E¡.Ey )2 I n.Ex2 - (E* f )l".Dy' -(EyÉ]

15.601

Donde:

-_ln(1

+a.d) t

Donde, n: número de datos analizados; y: ordenada; x: abcisa.

304

t5.61I

t5.62I

En las tres ecuaciones anteriores se conocen todos los términos, excepto el parámetro a. La función objetivo es minimizar (- R2l. Esta función objetivo es unimodal gara a > 0, esto es, solo tiene un valor óptimo local igual al óptimo globat, El algoritmo mencionado en esta Sección es una modificación de la técnica de búsqueda unidimensional de Powell desarrollada originalmente para la solucíón de un problema de programación no lineal no restringida descrito por Rskbitas

et al., 1983. El progiama C:\GWBASIC\MONOD.BAS, resumido en la Tabla

5.12, constituye un ejemplo de la aplicación del método integral de análisis de datos en la evaluación de los parámetros cinét¡cos de la Ecuación de Monod.

5.6.2 Método diferencial de análisis

Elobjetivo del método diferencial de análi§is es la evaluación de las velocidades de crecimiento de biomasa y de consumo de sustrato a partir de un conjunto de datos experimentales de las concentraciones de biomasa y de sustrato en función deltiempo en un cultivo por lotes. Aunque existen numerosas alternativas pára la evaluaclon de estas velocidades, los siguÍentes procedimientos han sido utilizados coil alguna frecuencia: - Et procedimiento geométr¡co de diferenciación de una función experimentalen un punto, propuesto por Leduy y Zaiic, 1973. En el programa C:\GWBAS|C\IEDUYZAJ.BAS,'resumido en la Tabla 5.13, se aplica la subrutina de Leduy y Za¡ic, en la evaluación de la velocidad de crecimiento de biomasa a partir de un conjunto de valores de la concentración de biomasa (variable dependiente) en función del tiempo.

305

- El procedimiento

propuesto por Tao, 1987, fundamentado en arreglos de

polinomios de la forma:

flxl = a(i) + b(i).¡ * c(i).x2 * d(i\.xi Donde, x: variable dependiente;

t5.63I

t: variable independiente.

El programa i:\GWBASIC\SPLINE.BAS, resumido en la Tabla 5.14, evatúa tos coeficientes de la curva de ajuste para cada intervalo de la variable independiente (tiempo). La variable dependiente en la ecuación t5.631 es la concentración de biomasa. En elprograma se obtienen las derivadas de los polinomios en

cada punto de la curva. Los valores de los parámetros Ir¡¡ y Ks son obtenidos a part¡r de las siguientes relaciones lineales, deducidas de la ecuación de Monod, una vez conocidos los

valores de la velocidad de crecimiento de biomasa consumo de sustrato r":

r, y de la velocidad

de

- Lineweaver-Burk:

1_ 1 *5r

lL Fx Vus

ts.64l

La representación gráfica de 1lp versus l /s, en el caso de microorganismos que

se comportan de acuerdo con el modelo de Monod, corresponde a una línea recta, cuyo intercepto es 1lp* y cr,rya pendiente es Kr/gr.

La evaluación de lrr,¡ y Ks por el método de Lineweaver-Burk depende

las

mediciones realizadas a bajas concentraciones de sustrato. Sí se considera que et valor de 1lU tiende a infinito a medida que la concentraciórÍ de sustrato disminuye, los puntos correspondientes a estos valores afectan ta pendiente y el intercepto.

- Langmuir:

sKsl l¡

306

Va

+-.s Fu

ts.651

La representación gráfica de slp versus s, en el caso de microorganismos que se comportan de acuerdo con el modelo de Monod, corresponde a una llnea recta, cuyo intercepto es K./¡r,, y cuya pendiente es 1lp*,

- Eadie-Hofstee:

l¡=prr- fs .tr"

t5.66I

La representación gráfica de p versus ltls, en el caso de microorganfsmos que se comportan de acuerdo con el modelo de Monod, corresponde a una línea recta, cuyo intercepto es /rvr y cuya pendiente es - Kr. La principal limitación del método diferencial de análisis en la determinación de parámetros c¡nét¡cos es la d¡ficultad para la realización de ensayos en un reactor continuo de mezcla completa (CSTRI donde existe la posibilidad de mantener un medio ambiente estable para los microorganismos. En los ensayos por lotes pueden utilizarse matraces para realizar simultáneamente múlt¡ples ensayos con diferentes condiciones ambientales. Los ensayos en reactores continuos requieren tanques de reserva de nutrientes y de producto cónectados asépticamente alfermentador. El control delcaudal efluente se dificulta en algunos casos por la formación de espuma y por el taponamiento del ducto de salida con aglomerados de células. La duración de un ensayo puede prolongarse durante varios dfas, e incluso semanas, y aumentar el riesgo de

contaminación y de mutación de la cepa por su adaptación a las nuevas condiciones ambientales. Las diferentes condiciones ambientales en un ensayo por lotes y en una fermentación continua afectan la validez del modelo cinético desarrollado en un reactor continuo para la predicción del comportamiento de una fermentación por lotes y vicéversa. Por consiguiente, estos parámetros requieren una verificación cuidadosa con el propósito de evaluar la confiabilidad del modelo establec¡do.' El Ejemplo 5.2 muestra la evaluación de los parámetros cinét¡cos de la Ecuación

de Monod a part¡r de un conjunto de datos experimentales. Los programas LEDUYZAJ,BAS y SPLINE.BAS obtienen las velocidades de crecimiento de biomasa y consumo de sustrato; los parámetros I/M, K. y Y¡¡s, son calculados mediante un análisis de regresión de las ecuaciones de Lineweaver-Burk, Langmuir y Eadie-Hofstee, con el programa C:\OUATTRO\MONOD.WO1. Los parámetros de la ecuación de Monod también son obtenidos por método integral de análisis con el programa GWBASIC\MONOD.BAS. 307

Ejemplo

5.2 Evaluación de los parámetros cinéticos

de ra Ecuación de Monod a partir de datos experimentales

En la Tabla 5.8 se presentan datos obtenidos experimentatmente en un cultivo porlotes de Aerobacter cloacae en un medio qulmicamente definido, compuesto por glícerol como sustrato limitativo del crecimiento. Evaluar los parámetros cinéticcis: /rrr, Ks y Yvs, de la ecuación de Monod mediante los métodos integral y diferencial de análisis de datos.

r

.5.8

Evaluación de las velocidades de crecñniento de biomasa y de consumo de sustrato a part¡r de datos experimentaleS. Análisis de regresión realizado con el programa C:\OUATTRO\MONOD.WOI Tabla

/ f

ABCDEF

.

.

Tiempo BiomaEa Sustrato horas mg,/Iltro mg/litro

dx/dt LD-Z

.o,52 q. 86 r;19' l;1r3 t.74 2,06 2,37 2,48

15,54 L9 ,25 22,og 23,07 L7 ,43 5,40 L,O2

7_

22,5 28 , q 35,3 4L,L 48 ,2 53,0 54,4 54,5

60,5 ,2 36,5' 25,5 11, 0 3,1 0,4 49

o

dx/dt

s.promedio

SPLINE

15,90 ,63 22,2s 23,92 20 ,,20, 9,a2 1_,66.

54,90

L9

42 ,85

31,00 1,A,Zs 7 , 05

7,,15

,

-

,2

OEIiTKL. d¡/dt P_Iom

LD-Z

'

14,500 L7 ,395 20 ,670 22,58O 20 ,250 l_1,415 3,270

dx/dt Prom.

(t/s)

t4,o70 L7,765 20 ,950 23,l.05 22,060 L4,660 5,390

0,0149 o, 0182 0 , 0233 o,0323' 0, 0548 0,1418 0,5?t4

x prom.

LL LD-Z

tL

SPIJINE

SPIJINE

19,00, 25" 55 31, 95 38,20 44,65 50, 50 53,10

o,75j.2 0,6808 0 ,5459 0:,5g,!1 o, 4535 o ,2256 o,os98

0,7405 o, ais: O

,

6560

0,6C48

,4s4t ,28s7 0,1004 0 0

Continúa 308

Tabl¡ 5.8 ConEinuación ü

o

N

(a/ p)

(t/

TrD-Z

SPI,INE

1,310

L,469 L ,546 L,692 2 ,205 4 ,433 L6,'129

0,0113

L,524

0, 0151 0, 0191 o

ot24

, 0249

0, 0320

,4s2 ,963

I p

o,

1, 653 2, O24 9

(tt/

(p/ a) frD-Z

tt)

1, 350 1, 438

3

P.

0

, 0342

(e/ p)' LD-Z

E)

SPIJINE

88;121 80,638 66 ,234 52,445 40,240 3L,251_ 29 ,276

0, 01:_0 o , oL27 0, 0153 0, 0195 o,

o27!

0, 0411 O

, O.S?4

Prom.

L/ ¡.t. prom. I¡DZ-SPfr

p

prom.

IJDZ -

S

PIJ

o,752

1, 330

0,

0, 688 0, 651

L,453 1,535 L,672

0,0152

0,598 o ,'47 4

o,258 o;o8o

2,Lt4 '3,942 ]-3,,346

y.)

eO, 814

78,958 55,318 5'1 ,

253

36,938 24,334 1,7 ,43s

v

T

LEZ-SPL

le/

.SPIJINE

0112 0, 0125

o, 0193 , 0260 0, 0355 0, 0458 o

/e

s/ pprom. LDZ-SPL 89 ,467

79,798 65,?75 5)-,849 38, 589 27,'192 23

,355

Observaciones:

A, B, C : datos experimentales. La concentrác¡ón inicial de biomasa: (mg 15,50 de biomasa seca)/l¡tro, corr'esponde a la concentrac¡ón de biomasa' después del pe¡fodo de adaptación, esto es, la concentrac¡ón al comienzo de la fase exponencial. - Columnas

- Cotumna D: Velocidad de crecim¡ento de biomasa obtenida con et proErama C:\GWBASIC\LEDUYZAJ.BAS, flabla 5.13), a part¡r de la información de las columnas A y B.

- Columna E: Velocidad de crecimiento de biomasa obten¡da con el prograrna C:\GWBASIC\SPLINE.B'AS, (Tabla 5.14), a part¡r de la informac¡ón de las columnas A y B.

- Columnas F, G, H: Valores promed¡o de las columnas C, D y E, respectivamente; Columna l: Recfproco de los valores de la columna

F.

309

- Columna J: Concentración de biomasa. Promedio de los,valores anotados en la columna B en cada intervalo de tiempo. Columnas K, L: Velocidad específica de crecimiento de biomasa, calculada'con los valores de la columna J, y las columnas D y E respect¡vamente, en (horas)-1. - Columna S: La velocidad especlfica promedio / prom es el promedio aritmético de los valorcsranotados en las columnas K y L qn cada ¡ntervalo de tiempo

Tabla

5.9 Resultados obtenidos mediante

análisis de regresión de los valores

anotados en la Tabla 5.8 aon el programa C:\OUATTRO\MONOD.WOl

Y

R2

¡ErY

m

ErrX

75,4252 27,73AA. 21-,5820

o, 0990

Lineweaver-Burk, Ecuación [5.64]:

sPL t,1699 LDZ O,8026 PROM O,9862.

,

O , 0492 0,1,769 O,0678

0, 9998

O,9992 0,9998

Langmuir, Ecuaeión [5.65] z

0,3559 0,L364

,

SPIJ 16,2L30 LDZ 24,9965 PROM 20,6048

0,8319 2,3695 1,,3236

Eadie-Hofstee,

Eeuación [5.66]

0,9992 0, 9916 0,9978

!,1_278 0, 9560 1, 0419

0,0138 O, 0394 0

, 0220

:

sPI+. 9,8723

-0.,014s 0,9,pqg -13r7?O.7 0,343s,..."i. IJDz.L,o.l25.o,o55oo,g624-zl,+i.gs2,427o pRoM 0,948': o,orez:: ois'ddl;,,,-,aa,;de?4,' o,sosz,', l't

'

Observaciones:

i

-

-

Y:lntetceptoconelejoY;Y:var.iab1edependiante',:.' 1-;

:

.,

'I

:

..

-,

Err Y: Error estándar de los valores estimados de Y.

$:,coeficiente de correlación linear; R2: coeficiente de delerminación, (steel y Torrie, 19"80). ,: I :

m: Valor de la pendiente o coeficiente de X; X: variable independiente. ,

Err

X: Error estándar de los valores estimados,de X.

310

:1

'v

Lin'eweaver-Burk, Ecuación t5.641: Variable independiente: datos de la columna I (Tabla 5.8); Variable dependiente: columna N: método Spline; columna M: método de Leduy y Zaiic; columna T: método de la velocidad'específica Promedio de crecimiento.

--

-- Langmuir, ,Ecuación t5.651: Variable independiente: datos de la columna F (Tabla 5.8); Variable dependiente: columna R: método Spline; columna O: método de Leduy y Zgiic; columna V: método de la velocidad especffica

,

l l l

:

promedio de crecimiento.

?

columnas velocidad dependiente:

- Eadie-Hofstee, Ecuación t5.661: Variable independiente: datos de las

P, O y U (Tabla 5.8) para los métodos de Sptine, Leduy y Za¡ic, y

específica promedio de crecimiento, respect¡vamente. Variable datos de las columnas L, K y S (Tabla 5.81 para los métodos de Spline, Leduy y Zajlc, y velocidad específica promedio de crecimiento, respect¡vamente.

Tabla 5.10 Parámetros de la Ecuación de Monod obtenidos a part¡r de los valores anotados en la Tabla 5.9, (Método diferencial de análisis); R: coeficiente de correlación.

Lineweaver-Burk, Ecuación [S.S¿]

..+,

spline Leduy y za)ic Promedio

r¡r = 0,8548

Fu = 1,2459 ru = 1,014

Langrmuir, EcuaciÓn [5 .55]

= 0,886'7

P¡r

Promedio

ltu=9,9598

F¡ = 1,0450

Eadie-Hofstee, Ecuación [5.56]

spline

Leduy y zalie

Promedio

= 0,8723 P¡r = 1 ,0725 llu = 0,9483

Fu

Ks = 13,185 IG = 34,560 IG = 21 ,884

R: 0'9999 R = 0,9996 R=0 '9999

G = L4'376 IG' = 26 't47 Ks =\9,776

R = 0'9996 R = 0 '9958

IG = 13,72t Ks = '27,439 Iq = L8,8a7

R - 0,9984 R = 0' 9810

:

spline

Leduy y zajic

:

R=0'9989

:

R:0'9982

311

l

)

l

Tabla 5.11 Parámetros de la Ecuación de Monod obtenidos con el programa C:\GWBASIC\MONOD.BAS. resumido -e¡ la Tabla 5.12, pata el conjunto de valores expefirnentales de la Tabla 5.8.

:, , ;

!u: 0,8528 (hora)-1 Ke .: 12,326 (mg gliceroll/(litro

,

gttos valores coinciden con loi informados por Herbert et al., 1956: Yx/s : 0,53 g/g;lrrrr : 0,85 (hora)-l; K, = 12,3 mg/litro.

de medio)

5.12 Programa C:\GWBASIC\MONOD.BAS. Gates, W.E', y Marlar, 1968; Moser, 1988; Rekla¡t¡s, G.V., Ravindran, A., and Ragsdell, 1983; Ong,S.L.

Tabla

1983) Rolz Carlgs, 1989. 1O CLS

20 PRINT "MONOD.BAS: METODO INTEGRAL DE ANALISIS" 30 PRINT "EVALUACION DE LOS PARAMETROS DE LA ECUACION MONOD"

, r i

; i I

i ' ; i ;

4o,PRINT

:

50 PRINT "REFERENCIAS:" 60 PRINT 70 PRINT "Gates, W.E., y Marlar, J.T., Water Poll." 80 PRINT "Contro! Fed. 40: R 469, 1968" 90 PRINT 100 PRINT'Moser, A., Bioprocess Technology, Kinetics" 110 PRINT "and Reactors, Springer Verlag, 1988" 120 PRINT 130 PRINT "Ong, S.L., Biotechnol. Bioeng. 25: 2347, 1983" 140 PRINT '150 PRINT "Reklaitis, G.V., Ravindran, A. and Ragsdell," t60 PRINT "K.M., Engineering Optimization, Methods and" 170 PRINT "Applications, John Wiley & Sons. 1983" 180 PRINT t 90 PRINT "Rolz Carlos, Curso: lngenieria de'RQacciones" 2O0 PRINT "y Procesos Biologicos. lnst¡tuto Centroamericano" 210 PRINT "de lnvestigacion y Tecnologia lndustrial,'lcaiti," 220 PRINT "Programa: MOINTXS.BAS, 1989"

312

DE

v

4

;¿

230 PRINT 240 PRINT "PULSE ENTER !" 250 ANS§ : INPUTS(1) 260 CLS 270FOR X:1 TO 10000 280 NEXT X 290 CLS:KEY OFF 3oo GosuB 1o5o 310 CLS 320 WHILE CMD < >3 330 0N CMD GOTO 360,640 340 WEND 350 GOTO 1030 360 PAGINAo/o =1 370 GOSUB 1200 380 REM SUMINISTRAR DATOS Y CONSTANTES 390 PR!NT 400 INPUT "Conc.inicial de biomasa y sustrato ";CXo,CSo 410 PRINT 42O INPUT "Numero de pares de datos, incluir datos para t=0 ";N 430 PRINT 440 l=N 450 Dt M CS(t),T(t), CX(t l,X(t),y(t),A (t), E1 (tl,XX(D,TTill 460 FOR l:1 TO N 470 INPUT "Conc. bio.masa, sustrato, tiempo ";CX(l),CS(l),T(l) 48O NEXT

I

490 PRINT., 500 cLS 510 REM ESCRIBIR LOS DATOS EXPERIMENTALES LEIDOS 520 PRINT SPC(1 0);"DATOS EXPERIMENTALES" 530 PRINT 540 PRINT SPC(5);"Conc.biomasa";SPC(5);"Conc.sustrato";SPC(5);"Tiempo" 550 PRINT

560F1$:" ,

##"+" ###.##'+SPACES(S)+" ###.## "+ SPACES(SI+

###.##" 570 FOR l=1 TO

580 v

N

PRINT USING Fl $;l,CX(l),CS(ll,T(l)

590 NEXT I 600 PRINT 610 PRINT "PULSE ENTER t" 313

620 ANS$ : INPUTS(1} 630 CLS 640 lF PAGINATo>1 THEN PRINT CHR$(12); 650 GOSUB 1200 660 REM CALCULO DEL RENDIMIENTO CELULAR 670 YE : (CX(N)-Cx0)/(CS0-CS(N)) 680 REM CALCULO DE AP 690 AP:YE/CXO 7OO REM CALCULO DE X'S E Y'S SEGUN ONG

:. "

710FORt:1TON

72O 730

X(t):LOG(1 +Ap*(CSo-CS(|)l)/Tfl)

Yfl) : LOc(CSfl)/CSo)/Tfl) 740 NEXT I 750 REM SUBRUTINA DE AJUSTE POR MINIMOS

760 770 780 790 800 810

L:2

INPUT "Criterio de convergencia, (se sugiere 1E-3): ";E E1

:.5

GOSUB 1740

GosuB 1230 REM CALCULO DE MUMAX Y KS

82O MUMAX :A(2)/(A(1

830 840 850 860 870

.

CUADRADOS

)-1

)

KS = ((1 /AP) + CS0)/(A(1 )-1

)

PRINT

PRINT "Criterio de convergencia usado: ";E PRINT

PRINT "El valor calculado del rendimiento

y es: ";yE

88O PRINT

890 PRINT "Velocidad maxima de crecimiento, MUMAX ,';MUMAX 9OO PRINT

,

'

910 PRINT "El valor estimado constante Ks. es: ";KS 920 PRINT 930 PRINT "Desviacion estandar del ajuste ", 940 pRtNT tNT(1 0000000#*D)/1 0000000# 950 PRINT 960 PRINT "Numero de iteraciones requeridas: ";M 970 PRINT 980 PRINT "PULSE ENTER !" 990 ANS§ : INPUTS(1) l OOO WHILE CMD < > 3 1010 0N cMD GOTO 290,290 314

.

,,

1O2O 1O3O 1O4O 1O5O

WEND

1060 1070 1080 1090

PRINT

END

REM VENTANA DE MENU PRINCIPAL PRINT "MENU PRINCIPAL"

"1. lngreso datos experimentales" PRINI "2, Reiniciar calculo con nuevos valoresn PRINT "3. Terminar el calculo" PRINT

11OO PRINT

1110 INPUT "Favor seleccione numero y luego pulse ENTER !:",CMD' 1 120 PRINT 1130 PRINT "PULSE ENTER !" 1 140 WHILE CMD < > FIX(CMD) OR CMD < 1 OR CMD > 3 11

50

160 1 170 1 180 1 190 1

BEEP

PRINT

SPC(40);

';

INPUT "Favor entre 1 ,2 o 3 : ",CMD WEND RETURN

12OO PR]NT'CALCULO DE PARAMETROS DE MONOD' 1210 RETURN 1220 REM SUBRUTINA DE AJUSTE DE LA CURVA POR MINIMOS CUADRADOS

1230 FOR r:1 TO L 1240 E1(r) : E1 1250 NEXT I 1 260 M:O 1270 REM FIJAR RESIDUAL PARA EL ENSAYO 1280 Ll =1000000! 1290 REM RECORRER TODOS LOS PARAMETROS 1300 FOR r:1 TO L 1310 A0:A(r) 1320 REM OBTENER EL VALOR DEL RESIDUAL 1330 A(r):A0 1340 GOSUB 1s90 1350 REM ALMACENAR EL RESULTADO EN MO 1 360 MO :12 1370 REM REPETIR PARA M1 1 380 A(r) :A0*(1-E1 (t)) 1390 GOSUB 1590 1400 M1 =L2 315

-?

1410 REM CAMBIAR EL INTERVALO SI ES NECESARIO

1420 REM St LA VARTANZA AUMENTA, DtVtDA E1(l) EN DOS

PARTES

IGUALES 1430 tF M1 >M0 THEN E1(t):-El(t)/2 1440 REM SI LA VARIANZA DISMINUYE, AUMENTE E1(I)

1450 lF M1MO THEN A(II:AO 1 480 tF M 1 > M0 THEN GOTO 1 340 1490 NEXT I 15OO REM FIN DE UN PASO COMPLETO 1 510 REM ENSAYO DE CONVERGENCIA

1520M:M+1 1530 IF L2:O THEN RETURN 1 540 IF ABS((11 -LzIILZI < E THEN RETURN 1550 REM SI ALCANZA ESTE PUNTO, SE REOUIERE OTRO PASO 1 560 L1 :12 1570 GOTO 1300 15BO REM SUBRUTINA DE GENERACION DE RESIDUAL

590 L2:0 600 FOR J:1 TO N 1610 X:X(J) 1620 REM OBTENCION DE LA FUNCION 1630 GOSUB 1690 * 1 640 L2 : L2 + (Y(J)-Y) (Y(J )-Y) 1650 NEXT J 1660 D=SOR(L2|(N-L)) 1670 RETURN 1680 REM SUBRUTINA DE FUNCIONES 1690 Y:A(11"X-A(2) 1 1

17OO RETURN

1710 REM LECTURA ESTIMADOS DE PARAMETROS INICIALES 1720 ANSS : INPUTS(1) 1730 CLS 1740 INPUT "Estimado inicial de Ks para iniciar calculo:";KS 1750 PRINT 1760 PRINT "Estimado inicial de Ks: ";KS 1770 Al1) : (1 + (CXo + YE*CSoI/(YE"KS)) 1780 PRINT 1.790 INPUT "Estímado inicial de MUMAX para iniciar calculo:";MUMAX 316

-

- ) -.

1800 PRINT "Estimado inicial MUMAX: ";MUMAX 1 81 0 A(21 : MUMAX* (CXO + YE*CSO)/(YE*KS) 1820 RETURN

Tabla 5. 1 3 Programa C:\DOS\GWBASIC\LEDUYZAJ.BAS. Leduy, A.L.,y Zatic, J.E., 1973; Oner, M.D., et al., 1986; Rolz, Carlos, 1989.

fO CLS 20 PRINT "LEDUYZAJ.BAS: METODO DIFERENCIAL DE ANALISIS" 30 PRINT 40 PRINT "PROCEDIMIENTO GEOMETRICO DE DIFERENCIACION DE UNA" FUNCION EXPERIMENTAL EN UN PUNTO 50 PRINT " 60 PRINT 70 PRINT tr 80 PRINT "REFERENCIAS: 90 PRINT 100 PRINT'Leduy, A.L.,y Zajic, J.E., Biotechnol, Bioeng. 1 1O PRINT " 1 5: 805, 1 973 120 PRINT 130 PR|NT "Oner, M.D., et al., Biotechnol. Bioeng. " 140 PRINT "28:902, 1986 150 PRINT rr 160 PRINT "Rolz Carlos, lnstituto Centroamericano de 170 PRINT "lnvestigacion y;fecnologia lndustrial. lCAlTl " 180 PRINT "Curso de lngenieria de Reacciones y Procesos rr 190 PRINT "Biologicos, Guatemala, 1989. Programa: DIFLEZ.BAS" 'ir

2OO PRINT

210 PRINT "EVALUACION DE LAS VELOCIDADES DE CRECIMIENTO

DE

BIOMASA "

220 PRINT "Y DE CONSUMO DE SUSTRATO A PARTIR DE DATOS MENTALES" 230 PRINT 240 PRINT "PULSE ENTER

250 ANS§ : INPUT§(I} 260 CLS 270 FOR X:1 TO 10000 280 NEXT X 290 CLS:KEY OFF

EXPERI-

!'

317

300 GosuB 790 310 CLS 320 WHILE CMD < >3 330 0N CMD GOTO 360,440 340 WEND 350 GOTO 770 360 PAGINAYo:1 370 REM SUMINISTRAR DATOS

: ,

{'i

38O PR]NT 39O INPUT "Numero de valores de la variable dependiente ";V 4OO PRINT

41O

W:V+3

42O DIM TETA(W),CX(WI,ZMAB(W),ZMBC(W},DCX(W),CXCR(W),ZMNO(W ,ZNNO(W}

430 DIM ZMMO(W),ZNMO(W},TETAC(W) 440 FOR l=1 TO V 450 INPUT"IND,DEP';TETA(ll,CX(l) 460 NEXT I

.

47O REM ESCRIBIR DATOS EXPERIMENTALES

480 CLS 490 PRINT SPC(1 6l;'DATOS EXPERIMENTALES" 5OO PRINT

0 PRINT SPC(5); "Variable independiente" ;SPC( 51;"Variable dependiente" 520 PRINT 530 Fl$=1 ## "+" ####.#### "+SPACE§(10)+" ####,#### I 540 FOR l:1 TO V 51

550

.

PRINT USING

Fl9;l,TETA(l),CX{l)

560 NEXT I 570 PRINT 58O PRINT "PULSE ENTER !"

590 ANSS : INPUTS(1} 600 IF PAGINA% > 1 THEN PRINT CHR${1 2}; 610 CLS 620 PRINT SPC(1 0);"DATOS CALCULADOS" 630 PRINT 640 PRINT SPC(S);"lND";SPC(1 7);"DERIVADA" 650 PRINT 660 GOSUB 930 670 F1$:" ##.## "+SPACE$(8)+" ####.## 080 FoR l:1 TO v 318

,

r

690

PRINT USING F1§; TETA(|),DCX(I)

7oo NEXT I 71O PRINT

720 PRINT "PULSE ENTER !" 730 ANS$ : INPUTS(1} 740 WHILE CMD < > 3 750 oN.CMD GOTO 290,290 760 WEND 770 CLS 780 END 790 PRINT "MENU PRINCIPAL" 8OO PRINT

2r

81O PRINT

820 830 840 850

PRINT PRINT

"1. lngreso datos experimentales" "2. Reiniciar calculo" "3. Terminar calculo"

PRINT

INPUT "Favor seleccione numero : ",CMD WHILE cMD < > FIX{CMD) OR CMD< 1 OR CMD> 3

j60 870

BEEP

880 INPUT "Favor entre 1 ,2 o 3: ",CMD 890 WEND 9OO RETURN

r

910 PAGINAo/o: PAGINAo/o + 1 920 REM SUBRUTINA LEDUY Y ZAJIC 930 l:1 940 DCX(l) : (CX(l + 1)-CX(l))/(TETA(l + 1 )-TETA(ll) 9S0 ZMAB(t+ 1):(CX(t+ t )-CX(D)/(TETA(I+ 1]-TETA(|)) 960 zMBC(l + 1 ) = (CX(l + 2)-CX(l + 1 ))/(TETA(| + 2)-TETA(| + 1 )) 970 lF ABS(ZMAB(I + 1)-ZMBC(l + 1 ))< : .001 THEN 980 ELSE 1030 980 DCX(t+ 1):.5"(ZMAB(|+ 1)+ZMBC(l+ t )) 990 l:l+1 1000 lF {l + 2} < : V THEN 1010 ELSE 1O20 1010 GOTO 950 1O2O IF I B. La concentración de células en el reactor se calcula a partir del coeficiente de rendimiento Y*,.:

340

vtrls -

E

s¡

-s

F

| . = +.(s¡

- ")

t5.791

Figura 5.16 Simulación del crecimiento de Aerobacter cloacae en un reactor cont¡nuo de mezcla completa (CSTR) con recirculación (F : 160 litros/hora, so = 3 gramos/litro), Efecto de la relación de recirculación B sobre la concentración de células y la productividad.

3,5

i,

(e=o,o); concdntraolon de celütas, gllltro

2,5 l::i

tili

1,5

tlvldad, g/(litroihora) .-.:::__--___]] vidad, g/(litr

o

o

46

a

Tlempo de retencion, horas

En la Figura 5.16.se presenta el efecto de la relación de recirculación sobre la concentración de células y la productividad en la símulación del crecimiento de Aerobpcter cloacae en u.n reactor cont¡nuo de mezcla completa (CSTR) con recirculación (F : 160litros/hora, sc : 3 g/litro). En elcaso especial de B : 1, no hay recirculación de células yi ! = D = 1lr. La concentración de células y

la productividad se duplican en el caso de B

:

O,5, lp

:

B.D

: Bltl.

341

5.7.7

Fermentadores en serie

Las siguientes conclusiones generales pueden deducirse de la confrontación de las Figuras 5.8, 5.10 y 5.1 1, para un sólo fermentador:

- El reactor continuo de mezcla completa (CSTR) operado a una concentración de producto correspondiente a (1/r¡1.¡^¡.o. es el sistema más productivo ya que requiere el menor tiempo de residencia (Figura 5.1 1).

- Cuando hay necesidad de alcanzar una concentración de producto

(células), X¡, €n el perfodo de crecimiento estac¡onario, se logra mayor productividad en

el fermentador por lotes (Figura 5.8) que en el sistema de reactor continuo de mezcla completa (Figura 5.10).

- La selección del sistema óptimo de fermentación depende de la forma de la curva 1/r^ versus x y de los requerimientos del proceso, tales como el grado de conversión deseado o la concentración final del producto. Si la concentración final de producto es menor que la correspondiente a (1/rxl.in¡^o, es más eficiente un sólo fermentador que dos conectados en sene.

- sin embargo, si la concentración final de producto (xr) es mucho mayor que la correspondiente a (1/rr),,n,-o, la mejor combinación para rograr er mínimo tiempo de retención es un reactor cont¡nuo de rirezcla completa (CSTR) operado

a una concentración de producto, xópti.o, valor correspondiente a

(1/rx).rn¡.o,

seguido de un reactor de flujo tapón (PFR), (Figuras 5.17 y S.181. - Aunque la Figura 5,18 ilustra el procedimiento de evaluación delt¡empo total de retención del sistema de reactores csrR y pFR en serie, debe tenerse presente que en el caso particular de la simulación del crecimiento de Aerobacter cloacae, xF = xópti-o, y, por consiguiente, sólo es necesario un reactor.

- De las Figuras 5.10 y 5.19 se deduce que un reactor continuo de mezcla completa (CSTR) operado a una concentración de producto correspondiente a (1/r*).,^,.o seguido de otro reactor csrR conectado en serie (Figura s.1g) es un sistema más eficiente que un sólo reactor CSTR {Figura S.10).

342

Figura

5.17 Representación esquemática

de dos fermentadores conectados en

serie: Reactor continuo de mezcla completa (CSTR) y reactor de fluio tapón (PFR).

o

Xe Se

Pe

CSTR

5.7.8

Reáctor de FtuJo topon

Columnas de burbujeo y reactores con c¡rculación líquida inducida

En términos generales los costos de obtención de un producto y todos los costos fijos y variables disminuyen al aurnentar la capacidad del reactor. Esta tendencia requiere grandes biorreactores, diffciles de construir y manejar. .Se presentan considerables problemas de construcción con los reactores agitados mecánicamente de capacidad superior a 1000 m3, además los requerimientos de potencia resuhan muy elevados cuando el criterio de cambio de escala es mantener la potencia por unidad de volumen constante. Este aspecto significa elevados costos de energía y de agua de refrigeración y problemas de remoción

de óalor. Por otra parte se dificulta la distribución uniforme de oxígeno, de sustrato y otros nutrientes y el control de pH y de agentes antiespumantes.

343

Figura 5.18 Simulación del crecimiento de Aerobacter cloacae, programal C:\GWBASIC\HERBERTI.BAS. Tiempo total de retención requerido por un fermentador cont¡nuo de mezcla completa (CSTR) y un reactor de flulo tapón (PFR) conectados en serie.

to

1/Rx

0,6 Concentracion

1 de biomasa,

1,5 g,z/i

tro

Figura 5.19 Simulación del crecimiento de Aerobacter cloacae, programa: C:\GWBASIC\HERBERTI.BAS. Tiempo total de retenc¡ón requerido por dos ferrhentadores continuos de mezcla completa (CSTR) conectados en serie. 7,/RX

1 t,6 0,6 Concentracion de blomhsa, 9,4/tro

344

5.20 Representación esquemática de algunos reactores de columna: Acolumna de burbujeo; B- columna de platos perforados; C- columna con Figura

rec¡rculación; D- lecho empacado. Co(unnq de Jeo

ptotos

A¡re

rforodos

Colu¡rno con

rec¡nculqclon

Alre

Por consiguiente se han desarrollado nuevos tipos de reactores que ofrecen ventajas técnicas, económ¡caS y, en algunos casos, biológicas sobre el fefmentador estándard de tanque agitado, Schügerl (19821. Elfermentador más sencillo es el fermentador de columna o de torre de burbujeO, formado por un recipiente cilfdrico provisto de un sistema de aspersión de gas en el fondo (Figura 5.201. Las burbujas de aire o de oxígeno a medida que ascienden mezclan el contenido del reactor y sat¡sfacen la demanda de oxígeno de las células. Este tipo de ferrnentador sólo tiene aplicación en fermentación aeróbica. La elevada demanda de aire de las células cuya velocidad de sed¡mentación es

mayor que la velocidad de ascenso de las burbujas, concentradas en el fondo de la columna, favorece la formación de e§puma y la retención de burbujas, fenómeno que disminuye la productiv¡dad del reactor. Las condiciones de diseño de los fermentadores de columna limitan su aplicación a un estrecho intervalo de,condiciones de operación.

345

Figura 5.21 Representación esquemática de algunos reactores de columna: AReactor con circulación lfquida inducida por aire; B- Columna de burbujeo de sección transversal variable; C- Reactor con circulación lfquida inducida por

agitación mecánica.

Reqcton 'o¡r-ltFt' Cotu¡rnq de burbuJeo Clrculoclon lnducldq de seccton tronsversql

Atre

Chculoc¡on ¡nduc¡do

Atre

La columna de burbujeo de área transversalvariable (Figura 5.21.bl.satisface la necesidad de una mayor velocidad del aire en la porción inferior de la columna donde la concentracíón de células es mayor. Las columnas de burbujeo con placas perforadas (Figuras 5.20.b y 5.20.c) favorecen eí gas:llquido.

"ont""to una bomba Además, el contenido del reactor puede recircularse mediante (Figuras 5.20,c y 5.20.d).

En la Figura 5.20.d se representa esquemáticamente un reactor de lecho empacado provisto de un circuito externo de bombeo. Las partlculas del lecho sirven como soporte para inmovilizar las células. Además, el fermentador puede operar como reactor de lecho fluidizado si la velocidad ascendente del fluido supera el valor de la velocidad mlnima de fluidización. En el fermentador de circulación llquida inducida por aire "airlift" el aire gue sale del aspersor'y asciende por el tubo central origina una diferencia de densidad entre la porción de caldo saturado de burbujas dentro del tubo y la porción de

346

5.2

Monod, 1958, presenta los datos anotados en la Tabla 5.18 sobre el crecimiento de Escherichia Colien un cultivo por lotes con un medio qulmicamente definido, con lactosa como sustrato limitativo del crecimiento. La concentración inicial de biomasa: 15,5 (mg de biomasa seca)ilitro, corresponde a la concentración de biomasa después del período de adaptación o a la concentración al comienzo de la fase exponencial. Evaluar los parámetros cinéticos: y diferencial de análisis de datos.

pr,

Ks

y

Yxvs, mediante

los métodos integral

5.18 Datos delcrecimiento de Escherichía Colien un cultivo por lotes, en un medio compuesto por lactosa como sustrato l¡m¡tat¡vo del crecimiento, Tabla

Monod, 1958. Tiempo, horas

U

15,

,54 0, 90

23 ,0

o

I,23 l-,58

l_, 95 2 ,33

2,70

#-5.3

Concentración de células, mg/litro 5

30,0 38,8 48 ,5 58,3 6t ,3 62 ,5

Concentración de lactosa, mg/litro

151,0 L23 ,0 105,0 75 ,0 43,s 74 ,5 3,5

0,s

Simular el crecimientode Escherichia Coli en un reactor por lotes, Utilizar

los parámetros c¡néticos l,r¡y¡, K. y Yru., obtenidos en el problema anterior. Representar gráficamente el tiempo de retención. Simular el crecimiento de Escherichia Coli en un reactor de flujo tapón. Utilizar los parámetros cinéticos /u, Ks y Yxr., obtenidos en el problema 5.2. Representar gráficamente el tiempo de retención.

&5.4 5.5

Simular él crecimiento de Escherichia Coli en un reactcr por lotes operado con un caudal constante de alimentación continua. Utilizar los parámetros cinét¡cos /rvr, Ks y Yxrs, obtenidos en el problema 5.2.

348

5.11 Simular el crecimiento de un microorganismo en un reactor por lotes. utilizar los datos del problema 5.1 0 y suponer un perfodo de adaptación de 1 ,2 horas. Evaluar la variación de la concentración de células, sustrato y producto en función del t¡empo. IEcu. 5.25]

Donde, tL: perfodo de adaptación.

5.12

simular el crecimiento de un microorganismo en un reactor por lotes. utilizar los datos del problema 5.10 e incluir en el modelo el efecto de la velocidad de muerte de los rhicroorganismos (ke = 9,921 (hora)-1). Evaluar la variación de la concentración de células, sustrato y producto en función del tiempo.

rx = (p

- kr).*

[Ecu. 5.27.b]

5.13 simular el crecimiento de un microorganismo en un reactor por lotes. utilizar los datos del problema 5.10 e incluir en el modelo et efecto del

metabolismo endógeno de los microorganismos [m, = O,O3g (g sustrato).(g células.hora)11. Evaluar la variación de la concentrac¡ón de células, sustrato y producto en función del tiempo.

rs=ms.x.(r*)

tEcu. 2.37I

5.14 simular

el crecimiento de un microorganismo en un reactor por lotes. Utilizar los datos del problema 5.10 e incluir en el modelo el efecto de inhibición por sustrato [k," : 0,8 (g sustrato).(litro]-11. Evaluar la variación de concentrac¡ón de células, sustrato y producto en función del tiempo. [r

Fa

t*&*1 §

k¡s

3s0

tEcu. 5.31I

la la

5.15

Simular el crecimiento de un rnicroorganismo en un reactor pOr lotes. Util¡zar los datos lel problema.5.10 e incluir en el modelo el efecto de la inhibición por producto [k¡p : O,12lg productol/(litro)]. Evaluar la variación de la concentración de células, sustrato función del tiempo, Px = l¡¡r.

s K,

_

Kn,

"-

K_

_l

y producto en [Ecu. 5.37]

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u

.'Jr

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Jap.,30,42.

r:

r ,d

.t§

'

355

1\

CAPITULO 6

ESTERILIZACION

6.1 INTRODUGCION

La mayorfa de Ias fermentaciones industriales ocurren como cultivos puros con

cepas cuidadosamente seleccionadas. La presencia de microorganismos extraños en el medio, o en cualquier parte del equipo, afecta el consumo de nutrientes y disminuye el rendimiento y la productividad del proceso' Además, los productos de estos microorganismos pueden ser nocivos para la cepa seleccionada y limitar su crecimiento, La esterilización destruye, inactiva o remueve toda forma de vida microbiana, y produce en los microorganismos una

pérdida irreversible de su capacidad de reproducción en el ambiente considerado, pero no significa la inactivación de las enzimas celulares y de las tox¡nas.

La esterilización se realiza mediante calentamiento {calor seco o hÚmedo), o mediante filtración en filtros de porcelana no vitrificada (filtro Chamberland), de tierra de diatomáceas (filtro Berkefeld o filtro Mandler), filtros de placas de amianto utilizables una sola vez (filtro Seitz), filtros de ésteres de celulosa (Millipore), filtros de placas de vidrio sinterizado, etc. Los microorganismos presentes en un medio también pueden removerse mediante centrifugación, agentes químicos, radiación (ultravioleta y rayos X), y medios mecánicos (vibraciones sónicas y ultrasónicasl. 356

El vapor saturado seco es el medio ideal para esterilización por su elevado contenido de calor por unidad de masa o de volumen, por ceder este calor a una temperatura constante y controlable, y por ser de fácil producción y distribución. El vapor saturado húmedo cede menos calor que el vapor saturado seco a la misma temperatura y contiene gotas de agua en suspensión que pueden originar problemas de contaminación.

A nivel industrial el método preferido de esterilización es el calentamiento mediante vapor de agua en el mismo recipiente de fermentación, o en un equipo separado. En este caso el aire presente en el equipo debe ser cuidadosamente purgado, La temperatura de una mezcla aire-vapor saturado no solo es menor que la del vapor sino que disminuye con el conten¡do de aire en la mezcla. Por consiguiente, si la esterilización se controla mediante la observación de la presión, la temperatura alcanzada puede ser inferior a la requerida por el proceso. Otro aspecto importante originado por la presencia de aire en la esterilización de equipo con vapor de agua es la diferencia de densidad. El aire más denso que el vapor fluye hacia el fondo del equipo originando gradientes de temperatura. La aplicación de calor seco mediante una llama o aire caliente, utilizada en la esterilización de equipo y de material de vidrio, es menos efectiva que el vapor de agua debido a la mayor resistencia de los microorganismos al calor seco. El endurecimiento de la capa externa de las células, ocasionado por la coagulación de'las proteínas que la conforman dificulta la tranferencia de calor.

6.2 CINETICA DE LA DESTRUCCION

DE MICROORGANISMOS

MEDIANTE CALOR HUMEDO

Generalmente la activación del crecimiento y de la reproducción de esporas puede representarse mediante una curva similar a la curva A de la Figura 6.1, donde el número inicial aumenta rápidamente hasta llegar a un máximo y luego disminuir aceleradamente. Ocas¡onalmente la velocidad de activación por calor al comienzo del tratamiento puede ser igual (curva B, Figura 6.11o inferior (curva C, Figura 6.1) a la velocidad de muerte.

357

!

Figura

'

6.1 Representación esquemática de la variación

- por la ácción del calo r. Richards,

- I - -r esporas

10

de la población inicialde ji 1

968..

N,lNoti,.,..:

1

o,

1

o,ol l,OOOE-03

t,oooE-04

|,oooE-05 t,oooE-06 t,oooE-o7

20

'

30

40 50 Tlempo

60. i

'

70

80

:

La Figura 6.2 muestra la curva de supervivencia de una pobpci ón de Escherichia coliala acción del calor. En la Figura 6.3 se represeñtan las curvas desupervivencia o de velocidad destrucción térmica de esporas de B. stearothermophitus.

El número ly' de microorganismos aún viables después de un tiempo rilización a ternperatura f constante, es: 1*. .,.

#=-*"'* .rv tn_= No

Válida para

T=

- Ko't

'

f de qstet6.11

t6.21

constante.

Donde, Kr: constante de velocidad de muerte térmica en s-1, o en (minuto) 1, valor de la pendiente de la curva de supervivencia; No: número de microorganismos viables en el tiempo t : 0.

358

Figura

6.2

Velocidad de muerte delEsc/rerichia calia diferentes temperaturas,

Aiba et al.¡ 1973. N/NO 1

o,

1.

o,o

1

l,OOOE-03

t,oooE-04 l,OOOE-06

6.2.1

Energía de activación y coef¡c¡ente de Arhen¡us

La ecuación de Arrhenius generalmente describe el efecto de la temperatura T

sobre la constante de velocidad de muerte térmica

Ku:

16.31

t6.41

Donde: Ko: Constante de vetocidad de muerte térmica, s-l; Koo:'Coeficiente de Arrhenius, s-l; Er: Energla de activación requerida para llevar las moléculas a un estado de energía en el cual pueden reaccionar, J/(mol); T: Temperatura absoluta, oK; R: Constante de los gases, R : 8,314 J.(mol.K)-1. 359

El valor de la constante de velocidad de muerte térm¡ca, Kr, a una temperatura dada es el varor de ra pendiente de ra curva de supervivenciJ

{r;guras 6.2 y 6.3}. Asf, por ejempro, si los varores de Ko der g. stearothermophirus, obtenídos a partir de ra Figura 6.3, son representados en ra Figura 6.4 como rn Ko versus 1ff , se obtiene ra energía de activación Eo del B. stearothermophirusa part¡r de

la pendiente,

-

EDIR, de esta tfnea:

pcttdictttc

u( =

ED =

2 = 3445¡6,6'tr'

--Eo

n

(A4fi,6).(8,314) = 2EO4t2 J

gÍtol

Figura 6'3 Velocidad de muerte de esporas de B. stearothermophitus FS 7gs4 en agua destilada a diferentes temperaturas, Aiba et al., 1g73.

N/No

360

Si se reemplazan en la Ecuación 6.3 los valores de Eo/R, Ko y su correspondiente ternperatura T, se obtiene el coeficiente de Arrhenius Koo del Bacillus stearothermophilus. La ester¡l¡zación por lotes tiene la ventaja de ser un proceso sencillo

con algunos inconvenientes tales como la destrucción de muchas vitaminas y la desnaturalización de protelnas por el calentamiento a altas temperaturas' La destrucción de estds componentes sigue frecuentemente la misma cinética

de muerte de los microorganismos. Además, de acuerdo con la Tabla 1, las energlas de activación de estas reacciones laterales indeseables son típicamente menores que las requeridas para esterilizaciÓn. Con el propósito de prevenir las reacciones indeseables el proceso de,esterilización debe operar a la máxima temperatura factible durante el mínimo tiempo

requerido para destruir los microorganismos. Los prolongados perlodos de calentamiento y enfriamiento de la esterilización por lotes impiden el logro de estos obietivos, Jacobs et al,, 1973.

6.4

Determ¡nación de la energía de'activación Eo Y del coeficiente de Arrhenius Koo de las esporas de Bacíllus stearothermophilus FS 7954, Aiba e¡

Figura

al., 1973. 10

Velocldad de muerte, Kd, l/(m¡nuto) l--:.*........-.... ¿ ____\!

-.

-.

-............

- -

-.. -. - : i

i

---

-'.

-

-.. -.. ---.-...-........-'-'+.-........-1'..-

- -

-

---

-

1- - -

t.

i.+..,-..

i-

.-.+....-.-'---.....-.."....

-. -... ----... -'-..-

o1

o,o

I

1

2,54

2,56

2,58

2,6

2,62

2,64

2,66

(7OOO/T) = (|OOO)/(T, grados Kelvin)

361

Tabla

6.1

Valores aproximados de la energÍa de activación de algunas ,reacciones, Bailey y Ollis, 1986. Energla de activación

cal/gmol Acido fólico Alcohol d-pgntot.enil

Destrucción de vit.amina

Hidrocforuro de t.iamina Cianécobalamina

B,

Destrucción de ribofl-avina Desnat.uralización de peroxidasa - Pardeado o reacción de Maillard entrerproteÍrias y carbohidratos : Bacilfus stearothermophi)us Anaerobio putr,efactivo NCE 3679 eabi-Z-Lus

subtiTis

CTostridium botulinum

J/gmol

16800 21000 21000

7

22000 23100

92092 96697

23600 23500

987 90 987 90

31200

130603 283392 303066

677 00

72400 76000 82000

0325

87 906 87 906

3

1813 6

343252

En la Tabla 6.2 se presenta el efecto de la temperatura y del tiempo de esterilización sobre la destrucción de t¡am¡na por la esterilización de un caldo hasta un nivel constante de la relación entre esporas de B. stearothermophilus, viables al final del proceso e inicialmente viables, N/No : 10-16, Humphrey, 1989, Mulley et al., 1975, estudiaron la cinética de degradación de tiamina por acción del calor.

6.2.2 Reducción fracciona! de la población de microorgan¡smos

Eltiempo requerido para la reducción fraccional de la población de microorganismos a cualquier temperatura deseada se calcula a partir de las ecuaciones [6.2]

y t6.31:

Y=ln

362

No

lV

= Ko.t = Ko,.r.exP

t6.5I

v La eneigía de activación, Ep, y el coeficiente de Arrhenius, Kpo, caracterizan la destrucción de un microorganismo dado bajo las condiciones del ensayo.

Hasta ahora se ha considerado la muerte térmica de una sola especie de microorganismos. En la práctica la población está mezclada, aunque una o dos especies generalmente predominan. En la Figura 6.5 se representa el tratamiento con calor de'un cultivo mezclado en el cual la especie menos resistente A, de menor energía de activación, es la más abundante inicialmente, No : 1000 microorganismos. La especie B más resistente al calor es la menos abundante inicialmente, No : 100 microorganismos. La curva C de la Figura 6,5, que representa la disminución total de microorganismos de ambas especies, es la suma de microorganismos aún viables de cada especie en un momento f dado. En la práctica curvas similares a C indican una población mezclada.

Tabla 6.2 Efecto de la temperatura sobre la destrucción de tiamina por la esterilización hasta un nivel constante de la relación entre esporas de Bacillus stearothermophilus viables después de un tiempo t e inicialmente viables, N/No : 10-16, Humphrey, 1989. Temperatura de esterilización

oc

Tiempo en minutos requerido para alcanzar una relación N/No

:

100 110

t20 130 140 150

Pérdida de tiamina o/o

10-16,

843 75

7,6 0,8s1 0,107 0, 015

99 89

,99

27 10 3 1

La Figura 6.6 enfatiza elhecho de que una llnea recta no siempre indica una sola especie de microorganismos. En este caso la especie B, más resistente al calor,

es la más abundante inicialmente, No : 900 microorganismos. La línea C obtenida al sumar sobrevivientes de A y B en cada t¡empo r es prácticamente recta y no indica una población mezclada.

36s

Figura6.5 .Representación esquemática delefecto de la esterilización por calor sobre un cultivo." rnezclado. l-a población inicial menos resistente es la más abundante. Richards, 1968.

Numero de éobrevi vien

16

Figura

,

6.6

tooo

te;s

20 26. 30 fiemBo, minutos

40

35

45

Representac¡ón esquemática del efecto de la esterilización por calor de r.m cultivo mezclado: Richards, 1968

Numero de sobrevi vientes

100

10

o510

364

50

20 25 Tlempo, minutos

15

30

35

El factor Del, definido en la Ecuación [6.5], constituye una metodología apropiada para casi todos los propósitos de la esterilización por calor con temperatura variable. Si, por ejemplo, se desea esterilizar 10000 litros de un caldo de fermentador con una población inicial de 10O0 esporas/ml, el número inicial de esporas es No : (104 litros),(103 esporas/mll.(103 ml/(litro) : 1010 esporas, y si se acepta que el número final de esporas viables es N : 0,00O1 , entonces:

v = tn

\ = ¿, 10'o' = ln 101a = 32,236 N 10-4

t6.61

Este valor corresponde a la reducción fraccional de microorganismos en el proceso de esterilización:

Y total =Y calent- + V sosf¿¿. + Y et{riam.

t6.71

EI valor de la reducción fraccional de microorganismos durante el período de sosten¡miento a temperatura constante se calcula a partir de la ecuación:

Y sos@nimiento = Ko.ts

16.81

Donde, t.: Período de sostenimiento en minutos; Ko: constante de veloc¡dad de muerte térmica evaluada a Ts, s-1, o en (minuto§)-1; Ts: temperatura de soste-

nimiento, oC. El diseño de los ciclos de esterilización se fundamenta en los valores de la energla de activación, Ep, y del coeficiente de Arrhenius, Koo, del microorganismo formador de esporas más resistentes probablemente presente en el medio. En la piáctica este método es muy adecuado para eliminar microorganismos muy res¡stentes tales como el B. stearothermophitus s el Clostridiurn botulinum. La inaitivación dg esporas depende de la naturaleza del medio en el cual se calientan. En general, no solo hay que esterilizar un líquido sino preservar s¡multáneamente su valor nutritivo como ocurre con los caldos de fermentación, Chopra et al., 1981. 365

La Figura 6.7 representa una curva tfp¡ca de variación de Ia temperatura T con

t para el caldo de un fermentador. La reducción fraccional de microorganismos durante los perlodos de calentamiento y enfriamiénto son obtenidos mediante integración de la Ecuación [6.5]: el tiempo

Y=Koni*(

?).

t6.9t

Generalmente los sistemas de esterilización por lotes incluyen por lo menos una de las siguientes fuentes de calor: burbujeo de vapor vivo a través del medio, calefacción eléctrica y calentamiento o enfriamiento con un intercambiador.

Figura 6.7 Curva típica'de variación de la temperatura T con el tiempo el caldo de un fermentador.

t40

Temperatura,

t

para

C,

120

too

Calentamlen

i,riaml'ento

i

ao 60 40

20 o

40

80

100 120 140 Tiempo, m¡nutos

160

200 220 240

Deindoerfer y Humphrey, (1959), asociaron para cada sistema de transferencia de calor un perfil particular temperatura-tiempo. Estas funciones se presentan en la Tabla 6.4. La,integralde la ecuación t6.91se evalúá'mediante segmentación en tres intervalos: calentamiento, sostenimiento y enfriamiento. En la Tabla 6.3 se presentan cuatro soluciones de la integral, una para condiciones estable§ (temperatura constante) y tres para condiciones inestables (distribución hiperbólica, lineal y exponencial).

366

Dotde: , =

,

R.T, " Continúa

367

T¿blar

6.3 Continuacién

Lineal creciente:

Dottdc:_____ c=

Donde

En

es la integral

ED

R'To

exponencial:

a

,.,0=|(+)

tG

l4l

Donde: n = número de microorganismos. Los sublndices "o" y "F" indican condiciones iniciales y finales respect¡vamente; ED: energla de activación; Koo: coeficiente de Arrhenius.

Tabla

6.4

Variación de la temperatura con el tiempo de esterilización por lotes, Deindoerfer y Humphrey, 1959.

- Burbujeo de vapor,

(hiperbólical: , T=Tol1 *; o.t\ 1 I *b.t)

t6.151

o=Jé!-; á=* M.CP.T,' M' - Calefacción eléctrica, (lineal):

T=7.11 o \ +a.d

a=

Q

M.cp-To

16.16I

Continria

368

Tabla 6.4 Continuación - lntercambiador de calor con vapor de agua como fluido caliente, (exponencial); T = Tc .(1

* b.e-o")

U.A

To-7"

M.C,

Tc

a=-'.o=

16.171

- lntercambiador de calor con un refrigerante como fluido frio, (exponenciall: T=

,

Tr

(1 + b.e-"'); b

To =

-

Tr^

t6.18I

TF'

Do,t&;a=#[, "*( #*r)

Donüá, h: Diferencia de entalpla entre la correspondiente al vapor de agua a la temperatura del d¡stribuidor y la temperatura del medío, J/kg; S: Velocidad de flujo másico del vapor, kg/s; M: Masa inicial del medio, kg; To: Temperatura inicial del medio, oC; Q: Velocidad de transferencia de calor, J/s;' U: Coeficiente global de transferencia de calor; J/(m2.s.oC); A: Area de transferencia de calor, m2; Tr: Temperatura de la fuente de calor; w: Velocidad de fluio másico del oC; Cr: Calor refrigerante, kg/s; Tro: Temperatura de entrada del refrigerante, oC). especlfico del refrigerante, J/(kg. oC); C": Calor especffico del medio, J/(kg.

6.3

ESTERILIZACION FOR LOTES

La concentración de microorganismos sobrevivientes a una esterilización por lotes se calcula mediante la Ecuación t6.91 y las Tabtas 6.3 y 6.4' Otro enfoque del problema es la integración gráfica.

369

6.3.1

Selección del microorganismo de diseño

Es improbable que en un fermentador la naturaleza del medio y el número y clase de microorganismos presentes puedan permanecer constantes de un lote

a otro. La época del año, la naturaleza y la fuente de las materias

primas

empleadas cambian la población y los requerimientos de la esterilización. Lo apropiado, entonces, es seleccionar un microorganismo formador de esporas resistentes al calor y diseñar el ciclo de esterilización sobre esta base. Deindoer-

fer y Humphrey, (1959), sugieren la utilización del Bacillus stearothermophilus como el organismo de diseño, La experiencia indica que este mecanismo es apropiado para el diseño de la esterilización de caldos de fermentación. La concentración total de microorganismos presentes en el medio se determina

a part¡r de la incubación de muestras del caldo del fermentador, sin distinguir entre las diferentes especies, Esta cifra de la población bacterial total se utiliza en el diseño del ciclo de esterilización como si todos los organismos fueran 8. stearothermophilus. Aunque este fenómeno conduce a un sobrediseño, el problema no es serio a menos que el medio sea part¡cu¡armente sensible al calor.

6.3.2

Diseño de ciclos de esterilizacaún

Generalmente el período de incremento rápido en el valor de la reducción fraccional de microorganismos está lim¡tado al punto de esterilización que ocurre alrededor de 100 oC y se comete un error muy pequeño al considerar lineales las curvas de calentamiento y enfriamiento alrededor de 100 oC. Además, se pueden despreciar las secciones de estas curvas por debajo de 1 00 oC, ya que la esterilización por debaio de esta temperatura no es apreciable. Si se tienen en cuenta estas aproximaciones y se supone una velocidad de calentamiento de

l oCl(minuto), pueden calcularse los valores de la reducción fraccional de

microorganismos obtenidos después de alcanzar cada temperatura a esta veloci-

dad. Además, se supone que el valor obtenido para la reducción fraccional microorganismos cuando se alcanza una temperatura de 100 oC es cero. 370

de

6.5 presenta los valores, calculados a part¡r de las ecuaciones t6.31 v [6.5], de la velocidad de destrucción y de la reducción fraccional de B. stea-

La Tabla

rothermophrTus, durante el calentamiento o enfriamiento a razón de

Ko

= Kna.exe(

#)

Y=tn*=",,

1

oC/minuto:

lEcu. 6.31

IEcu. 6.5I

Donde, Kpo : (9,509).(1O3i' (minutos)'r :; E : 283392 J/gmo!, (Tabla 6.1!.: B. stearothermophilus; R = 8,314 J.(gmol.K)'1: constante de los gases.

Ejemplo

6.1

Determinación del período de sostenimiento en una fermentación por lotes

Los perfodos de calentamiento y enfriamiento en un fermentador por lotes de 60.000 litros de capacidad son:

- Calentamiento de 100 hasta 121 oC en 26 m¡nutos. - Enfriamiento desde 121 hasta 10O oC en 18 minutos. - Tres muestras sin esterilizar, tomadas de diferentes lotes de materia prima, dieron los siguientes recuentos bacteriales: 6.106; 1 ,1 .107 y 3.106/ml. Calcular el valor del perfodo de sostenim¡ento a 121 oC, si el calentamiento y el enfriamiento son realizados a razón de 1oC/minuto. Solución:

- En este caso se utilizan 1,1.107 (microorganismos)/ml como base del diseño del ciclo de esterilización. Continúa 371

Velocidad de destrucción y reduceióil'fraccional de Bacillus,,stearothetrnophrfus durante'el,calentamiento o enfriamionto a razón de 1-oC/minuto.

'fabh.6.5. :r;

Toc

kr.t:

Ko minuto-l

acumulado r_

101 1-02

103

L04

109 1r,0 11

tt2 113 +L4

0

,

9.r

18

L,3'?3

tL9

L,715

1,20 ].2.L,

722 L23

t24 L25 L26

t27 L28 129 130

i3i2

.

1"25áii-l-'

:I.ti 1,611

3,313 4, -

2 ,1,40

.

, 3,,319,

,126

5,359' ' 7, gg0

9,755 L2 ,054 L4 ,903 18,391

u

6 8

: 2,666,. 4

""

2,055 2 ,613

!s8

1-L7 r_

'

,444

0,700 0,877 1,099

1L5 116

0

0, 0€7 0, 110 0,139 Q,L75 ' 0,222 o ,'i8 o 0, 353

108

,079 ,12L 0,175 0,244 0,331 0,44L 0,580 0,756 0 ,979. 0

0, 059

105 106 107

t-

-----0 ,046

0,o20, 0 ,026 0, 033 0 ,042 0, 054

00

I

'

l_90

',2,-1,8

,66a ,376

10, 516 13,182 .16,501 20 ,627

25,752 32,lLL ,99]49,746 61, 810 76,71,3 95, 1'04'

.

,

39

" 'i

:i

Continuación (Ejemplo 6.1):

- Número iniciar de microorganismos viabres por lote: iv" = 60oo0 tinos.tú

=

6,6.t01{

ffi.fi,t.,,0r¡

orgaaisnos

- se supone

que el número aceptable de organismos sobrevivientes al tratam¡ento calorífico es 0,O0Ol organismos/lote.

v totat=rn

*=ln

ffi

=4Ít,st

- El valor de reducción fraccionar de microorganismos en ra etapa de carenta_ miento según la Tabla 6.S, es: Y calenamicno = 1g,tg2 Este varor de ra reducción fraccionar de microorganismos corresponde a catenta_ mrento a¡azón de 1 oCl(minuto), o sea, en 2l m¡nutor. Slg,jn las condiciones del problema el calentamiento ocurre et 26 m¡nutos:

v

cohttarnicrúo = (lg,1gzr.# = 16,32

- Análogamente para la etapa de enfriamiento: Y enfrianbno = (tg,tSa.# 11,00 =

-

El varor de ra reducción fraccionar de microorganismos en ra etapa de sostenimiento es:

y sosunimicno =v total _y catcn. _y crfriam. Vsosr. = /rc,33 _ 16,92 _ 11,90 ko.t = Donde er varor de Ko se evarúa a ra temperatura de sostenimiento de 121 0c.

373

Según la Tabla 6.5, KD sostenimiento es:

:

2,666 (minuto)-1, por tanto

vl*'=91

,=

Ejemplo

6.2

KD

2'666

=5,89

ef

valor del período de

minutos

Determipa,ción de la influencia del período de calentamie.nto sohre el período, de sostenimiento

Suponer que durante la etapa de calentamiento se presenta una falla en el control de témperatura dél ferrñentador del ejemplo anterior. La températura aumenta normalmente desde 100 hasta 112 oC,"permanece constante durante 14 minutos y luego sube hasta 121 oC. el valor del período de sosteni-

agl+tgl

miento. Solución

-

Ko

a 112 oC (Tabla 6.5): 0,353 (minuto)-1

-

Ko

a 121 oC (Tabla 6,5): 2,666 (minúto)-1

v = rl

.\

= Kz.tz = (0,353).(1a) = (2,666).r,

'z

':

= 1,85 mitutos l

Portanto 14 minutos a112 oC equivalen a 1,85 minutos a121 oC yelperíodo de sostenimiento se puede disminuir hasta: Período de sostenimiento

374

:

5,89 - 1,85

:

4,04 minutos.

Ejemplo

6.3

Determinación de la influencia del volumen del caldo sobre el período de sostenimiento

Suponer ahora que por ampliación de la planta se desea construir un fermentador similar al del Ejemplo 6.1 pero de 180.00O litros de capacidad. Los ciclos de calentámiénto y enfriamiento serán realizados en 30 minutos y 24 minutos respectivamente. Calcular el valor del período de sostenimiento a 121 oC.

-

El nuevo fermentador cón una capacidad tres veces mayor tendrá una 6.1: No : 6,6.1014.3 : 1,98.1015

población igual a tres veces la del ejemplo organrsmos. Y tout=

r,

1'99'1^o-.tt 0,0001

= 44,43

Por consiguiente:

Y calent. =13,182.

Y nfr. = (13,182)

V sosf. = 44,43

l=

6.4

-

18,83

-

30 21

= 18,83

.ff = t,oo 15,06 = 10,54

=

K».t

10,54 = 3,95 minutos 2,666

ESTERILIZACION CONTINUA

Los prolongados períodos de calentamiento y enfriamiento característicos de la esterilización por lotes producen la destrucción de vitaminas y la desnaturalización de las proteínas y otros componentes del medio. Las energías de acti375

vación de estas reacc.iones laterales indeseables (Tabta 6,'l ) son menores que las requeridas por la reacción de esterilización. Con el propósito de prevenir la alteración de los componentes susceptibles del medio, el proceso de esterilización debe realizarse a la mayor temperatura posible durante el menor tiempo, ffeifer y Vojnovich, (1952); Jacobs et al., 1923.

-La esterilización continua satisface estos requisitos además de proveer condiciones l:eproducibles y facilitar la recuperación del calor del medio esterilizado, Lin, 1975. El sistema de esterilización continua a alta temperatura y tiempos muy cortos es fundamental en la industria de alimentos donde el sabor y otras características del producto pueden ser afectados por pequeños cambios de temperatura durante el proceso. La esterilización continua por calentamiento indirecto se realiza usualmente en un intercambiador de placas o en uno de coraza y tubos, pero debe tenerse presente que los sólidos suspendidos en el caldo de fermentación pueden producir ¡ncrustac¡ones sobre la superficie de transferencia de calor. Las

condiciones de un proceso de esterilización continua de alimentos con partículas sólidas en suspensión fueron analizadas por de Ruyter y Brunet, 1973.

6.4.1 Esterilización mediante calentam¡ento directo por ¡nyecc¡ón de vapor

En la Figura 6.8 se muestra esquemáticamente uno de los sistemas

de

esterilización continua por calentamiento directo, mediante inyección de vapor

de agua al medio, seguida del paso del fluido caliente por la sección de sostenimiento y su posterior enfriamiento instantáneo con la ayuda de una válvula de expansión. El sistema de esterilización por inyección de vapor puede agregar exceso de agua al medio y favorecer la formación de espuma. En el sistema de esterilización continua, mediante inyección de vapor de agua (Figura 6,8), el medio caliente fluye en condiciones adiabáticas por la sección de sostenimiento diseñada como un tubo largo, Pick, 1982. El tiempo promedio

de residencia en ésta sección es;

376

tr=

L

t5.191

uM

Donde, ts: t¡empo de sostenimiento, s; L: longitud del tubo, media del caldo, m/s.

fili

urvr:

velocidad

Si la pérdida de calor en la seccíón de sostenimiento es despreciable puede suponerse temperatufa constante y la reducción fraccional de microorganismos se calcula a pan¡r de la ecuación:

Vs=ln&

=Ko.t" 16.20¡

vs

= K¡,o.eXp

( ,%) -

Donde, No: número de microorganismos viables a la entrada de la sección de sostenimiento; N: microorganismos viables a la salida; Kr: velocidad especffica de muerte, s-1; Koo: coeficiente de la ecuación de Arrhenius, s'l; Eo: energía de activac¡ón para la destrucción de células por acción del calor, J/gmol; T.: temperatura en la sección de sostenimiento, K.

si e! medio en la sección de sostenimiento se comporta como flujo tapón ideal, el tiempo de residencia es el mismo para todo el medio y la esterilización es uniforme, En el caso de flujo de fluidos newtonianos dentro de tuberías lisas de sección transversal constante, la relación entre la velocidad medía y la velocidad máxima del fluído es 0,5 cuando el fluido es laminar. Esta relación aumenta hasta 0,75 cuando elflujo se vuelve turbulento, y alcanza el valor de 0,87 para flujo con número de Reynolds mayor que'106 (McCabe, et al. 19g1), por

consiguiente, s¡ se utiliza la velocidad media del flúido en Ia Ecuación [6.19] para calcular el tiempo de sostenimiento, una porción del fluido puede quedar sin esterilizar y originar serios problemas de contaminación. Levenspiel, 1972, utiliza un modelo de dispersión para explicar las desviaciones delflujo tapón ideal ocasionadas por la mezcla axial. El balance de microorganismos suspendidos en el caldo de fermentación, en la sección de sostenimiento, en condiciones estables, es:

377

.

organismos = eliminados

organismos que entfan

or9anrsmos que salen

t6.211

La diferencia entre el número de microorganismos que entran y los que salen por

flujo volumétrico es: t6.221

Donde, ur: velocidad media del caldo de fermentación en la sección de sostenimiento, m/s; n: concentrac-ión de microorganismos en el caldo, (número de microorganismos)/m3; S: área'transversal deltubo, m2; x: dirección del flujo de microorganismos, m.

Figura

6.8

Representación esquemática de un sistema de esterilización continua mediante calentamiento directo por inyección de vapor de agua al medio.'

Voc¡o

Volvulo de

exponsioi Secc¡on

de sosten¡n¡ento Enfr¡odor Instonto Ited¡o

€ster¡l

378

La diferencia entre el número de microorganismos que entran y los que salen por dispersión axial es: - D. s.

!(

4

-[ - o.s.4. dxL b dr\- r. s.4\¿,] dx)

t6.23I

J

Donde, D: goeficiente de dispersión axial, m2ls. D : 0 significa que la distribución de vélocidades se aproxima a la de flu'jo tapón ideal. D --) o significa que el fluido dentro de la tuberla está perfectamente mezclado. En la Figura 6.9 se presenta !a correlación entre el grupo adimensional D/(u.d)

y el número de Reynolds en la tubería de sostenimiento, Si el número

de

microorganismos eliminados por esterilización es Ko.n, la ecuación final de balance de microorganismos se obtiene a partir de las Ecuaciones t6.201 y t6.23t:

4b.*)-+") e\ tu) &

-Ko.n=o

16.241

Donde, Kr: velocidad especifica de muerte, s-1; n: concentración de microorganismos, (número de microorganismos)/m3. Wehner y Wilhelm, 1956, presentan la siguiente ecuación como solución a la Ecuación f6.241:

"=(,

DAM =

K^.L _zuM

[6.25]

= Número dc Dmú,ñhl¿r

379

Pr=

ryl

= Núnrero de Pecl¿t

Figura 6.9 Relación entre el coeficiente de d¡spersión, expresado en el grupo adimensional (D/u".d), v pl número de Reynolds, Levenspiel, 1958.

D/(u,d) 1Q

\I:

\! i\

i

\.i )'-"'

o,

1

100000

10000

1000

100000

Reynolds

En la Figura 6.10, representación gráfica de la Ecuación [6:25], se expresa la fracción de microorganismos viables después del período de sostenimiento en función del número de Damkóhler para diferentes valores del número de Peclet.

Ejemplo

6.4

Esterilización continua med¡ante inyección de vapor

Se utiliza un sistema de esterilización mediante calentamiento directo por inyección de vapor de agua, seguido de un enfriamiento instantáneo (Figura 6.8), para esterilizar 0,41 kg/s de caldo de un fermentador. Los recuentos 380

bacteriales de tres muestras de caldo sin esterilizar dieron los siguientes resultados: 6,8.108; 1,7 1Oe y 3,4.108/ml.

Se requiere reducir la posibilidad de contaminación de manera que un solo microorganismo pueda sobrevivir después de cuatro meses de operación continua. Diseñar la esterilización sobre la base de que todas las esporas bacteriales resistentes a la acción del calor corresponden al B. stearothermophi /us (Ke" = 1,585.1036.s-1; Eo : 283,46 kJ/{gmol). La sección de sostenim¡ento del esterilizador es una tubería de acero de

3,068

pulgadas de diámetro interior, En la planta se dispone de suficiente vapor de agua saturado a una presión de 6 atmósferas con el propósito de calentar el caldo hasta una temperatura de sostenim¡ento de 128 oC. Las propiedades del caldo a esta temperatura son: densidadz p: 1000 kg/m3; viscosidad: 1,23.1O'3 kg.(m.s)-l; calor especlfico:4,187 J.(g.oC)-1. Calcular la longitud de la tubería de sostenimiento.

Figura 6.10 Fracción de microorganismos viables después del perlodo de. sostenimiento en función del número de Damkóhler para diferentes valores del número de Peclet, Aiba et al, 1973, 1,OOOE- 1 1

N/No

l,OOOE- t 2

t,oooE- t 3 t,oooE-

14

l,OOOE- 15 l,OOOE- 16 l,OOOE- 1 7 l,OOOE- 1A l,OOOE- 19

20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 100

140

(Kd,L)/u

381

Solución

,,

"

,¿

¡-

|

1. Longitud de la tubería si el medio fluye en f¡ujo tapón ideal ,

0,41

'

!'

'

&=rCrOO4.O § -,i

mo

Q =O,4L 1O-3 !t3 = 1,410 ,43

s

lpra

- Microorganism s viables no=1,7.toezr-3.

no=1,226.1012 _,i

"

t.+tefi.z+

ffln

t= ?,,,h*=

1,384.10-rg

- Criterio de diseño

'nl, = tn

lt

- tn7'2N'10t'

= 29.61

- Velocidad especffica de muerte, (Ecuación 16.31):

Kr= 1,51,.10s's----1.

- Perfodo de sostenimiento

382

au

- Diámetro de la tuberfa (3,068).

(0,02il)

= 0,oT79 m

- Velocidad del medio

,

o,41

& ='*o

#

m?:u*

i(0,07le)2

ua =0,@6 mls - Longitud de la sección de sostenimiento:

L

=

u*.t"= 0,096 4.1tS7rS¡s = IO,SS m §

2. Longitud de tuberfa si se considera el efecto de la dispersión axiali (0'0779)'(0'086)-'(f000) - Rcvnlds: R,= ='ffi '

¡'

1,23. 10-3

- De la Figura 6.9: D

;n"

1

Pra

RE = 5i446

- Por consiguiente elcoeficiente de dispersbn, D

'

es:

'

1.(0,086).(0,0779) = 6,7.10-3 m2ls

- Número de Peclet Para el primer est¡mativo se supone una longiilO de la sección ¿"

to:L:14m.

'

*","nimien-

PÉ=+=W=.os.l

383

- Número de Damkóhler 0,188s-1-14rn D,,,=Ko'L =30.6 M uM - 0,086 m/s

- Fracción de microorganismos viables El

valorde n/n. correspondiente a P,

:

179,7 V Drrur

:

30,6, en la Figura 6.10,

es:

L . 3.10-12 > 1,384.10-13 no

Como la fracción de microorganismos viables es mayor que la fracción

r"Or"r,d.

por el proceso de esterilización, se supone para un segundo estimat¡vo una

longitudL:16m: Pz=2o5,4 i.

Dut=§

y de la Figura 6.3:

n no

=8.10-14 < I,gB4.lo-rg

Por consiguiente, Ia tubería de sostenimiento debe tener una longitud de 16 m.

Este valor es 2,5 m mayor que el calculado en el punto anterior, donde se desprecia el efecto de la dispersión axial y se supone flujo tapón ideal.

6.5

ESTERILIZACION DE AIRE

En el aire existen microorganismos üiables generalmente asociados con partlculas más grandes como polvo o polen. Las diminutas gotas que salen deltracto respiratorio al toser, o aún al conversar, son transportadores muy efectivos de microorganismos patógenos.

384

v

Según Aiba et al., 1973, las bacterias y esporas detectadas con mayor frecuencia en elaire son:. Aerobacter aerogenes, Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacittus megaterium, Bacitlus mycoides, Bacillus subtilis, Micrócoccus aureus, Proteus vulgaris, y las esporas de: 8. megaterium, B. mycoides y B.subtilis. El tamaño de estos microorganismos varía desde O,5 - 2,1 pm de anchura, hasta

0,5 - 26 pm de longitud.

6.5.1

Condiciones del a¡re requer¡do por la industria bioquímica

El número de colonias detectadas por unidad de volumen de aire muestreado varía de acuerdo con el s¡tio y la actividad, desde aproximadamente 70 colonias/m3 a nivel del piso, hasta 12000 colonias/m3 en una fabrica. A falta de

información precisa un número confiable a suponer es del orden de 2000 colonias/m3, si el aire es tomado de un espacio abierto y limpio. La industria bioqulmica requiere aire y otros gases en condiciones estériles en diferentes etapas del proceso y con diferentes propósitos: - Salas estéríles: Se utilizan para realizar operaciones en las cuales debe evitarse la contaminación de los materiales manipulados con microorganismos potencialmente infecciosos. Una sala estéril no está completamente libre de microorganis-

mos, pero debe mantenerse escrupulosamente limpia y proveerse de aire estéril a una presión ligeramente mayor que la de las áreas adyacentes. Usualmente en las salas estériles donde se fabrican vacunas, materiales parenterales y se seleccionan y propagan cult¡vos, se requieren grandes volúmenes de aire estér¡l a baja presión (13,8 kPa, o 2 psig). Transferencia de llquidos: Los lfquidos son transferidos de un recipiente a otro por gravedad, por bombeo, o por transforte con aire u otros gases. Cuando la oxidación es un problema generalmente se emplea nitrógeno. En cualquier caso -

el gas 7

debe filtrarse cuidadosamente para remover partlculas inertes y mícroorganismos viables. Se requieren relativamente bajos voltÍmenes de gas estéril a presiones hasta 206,8 kPa (30 psig).

385

- Aeración de feimentadores: La mayoría de las fermentaciones aeróbicas a escala industrial requieren grahdes volúmenes de aire estéril para aerar y en algunos casos proveer agitacíón. Generalmente la fermentación requiere aeración aséptica durante períodos que oscilan entre tres y diez días a razón de o,5 - 2 vvm, lvolumenes de aire por volumen de licor cada minuto), si, por ejemplo, el fermentador tiene un diámetro de 3 m y la profundidad del licor en el fermentador.,es 3 m, los requerimientos de aire, a razón de 1 vvm, son:

o ,ú n=i.(3r)' 21,2

rlq = prz 4,.6s mln hr

=21,2m3

mo de aire cstéril

ho¡a

Teóricamente la entrada de un solo microorganismo puede infectar todo el lote. En consecuencia una planta de fermentación aeróbica requiere enormes cantidades de aire estér¡l a una presÍón que usualmente varía entre 137,g kFa.y 413,6 kPa (20 - 60 psi), según la naturáleza de la ¡nstalac¡ón, la resistenc¡a de los filtros y la profundidad del líquido en el fermentador, Stark y pohler, (1gso).

6.5.2 Esterilización

de a¡re por cator

6.5.2.1 Compresión politrópica

En muchos casos el.calor generado por la compresión es suficiente para esteriliqar el aire, de manera que no se requierpn otros medios de eliminación de microorganismos, Bruckshaw, 1973. El aire requerido para la aeración de fermentadores se comprime hasta 344,6 - 413,6 kpa (b0 - 60 psig), presión reque-

rida para vencer la cabeza hidrostática en el fermentador tuberías, accésorios, válvulas, etc.

386

y las pérdidas en

En condiciones normales, a escala industrial, la compresión del aire es politrópica, o sea, intermedia entre adiabática e ¡sotérmíca. En este caso;

rz=r,(f

t6.26I

)+

Donde: r: relac¡ón entre los calores específicos del aire a presión constante y volumen constante; r: 1,3 para compresión politrópica. Así, por ejemplo, la temperatura alcanzada mediante compresión politróp¡ca del aire en las condiciones de Bogotá (presión localatmosiérica:10,83 psi; temperatura 1 5 oC) hasta 1 50 psig, es:

z2=(zra.

ls).(%#Éq Tz =

)'*

= sos,7

r(

2€i2'7'c

Se ha demostrado que las temperatura§ del aire inferiores a 2OO oC son de poco

valor en esterílización, a menos que el aire se mantenga durante un período considerable, casi un minuto, a 150 oC. La esterilización de grandes volúmenes de aire debe satisfacer al menos dos condiciones:

- El aire normalmente debe comprimirse hasta una presión tres o cuatro veces mayor que la requerida por el proceso. - Un sistema de almacenamiento de aire, tipo serpentín, debe mantener el aire a elevada temperatura durante un tiempo adecuado. Así por ejemplo, la longitud de tubería aislada, de 15 cm de diámetro interior, requerida para almacenar 21,2 lm3 de aire)/(minuto) durante 30 segundos, es:

21,24

H.30s

=

f,.{o,rs ^)r.t

L = 599,84 m

387

6.5.2.2 Calentam¡ento directo

En este caso el aire se hace fluir por el espacio anular entre dos cilindros concéntricos de hierro. El cilindro interior se calienta con un quemador de gas. Estos hornos, que también pueden ser eléctricos, sólo son útiles para pequeños flujos de gas hasta 30 litros/minuto. Se han diseñado hornos eléctricos donde elaire se calienta hasta 700 oC en un tlempo de 0,4 segundos, con un consumo de potencia de 1,8 kW/(100 litros/minutol.

6.5.2,3 Calentam¡ento indirecto con gases combust¡bles

En este caso el aire fluye, separado del gas caliente, por serpentines o tubos, para prevenir la contaminación de los productos de la combustión o el agotarniento del oxfgeno. Las dificultades para diseñar y mantener una unidad de esta

clase son considerables y los costos de capital y operación son elevados. Por

esta razón el método no es compet¡t¡vo con el método de filtración. Con el propósito de prevenir excesivos períodos de sostenimiento el aire se calienta hasta 350 "C y se utiliza un serpentln como factor de,seguridad para evitar la supervivencia de aquellas bacterias enclaustradas o protegidas por sólidos.

6.5.3

Filtración

Los filtros cuyo propósito es remover microorganismos del aire pueden clasificarse en dos categorlas: aquellos cuyos intersticios son mas pequeños que las partículas a ser removidas y aquellos donde estos son más grandes. El primer grupo comprende los llamados filtros absolutos de cerámica, vidrio sinterizado, o metálicos, su eficiencia es prácticamente 1007o, pero cuando hay necesidad de esterilizar elevados volúmenes de aire, tienen la desventaja de ser costosos, además de originar altas pérdidas de presión.

388

Los filtros fibrosos de papel, algodón, lana de vidrio y lana mineral, no presentan esta barrera impenetrable a los microorganismos, los espacios entre fibras son

mayores que el tamaño de los microorganismos, pero son eficientes y originan

bajas pérdidas de presión, Chen, 1955; Davies, 1973; Decker et al., 1962; Decker et al., 1957, Conway, 1984; Esta eficiencia se explica por el hecho de que los microorganismos generalmente están asociados con partfculas de mayor tamaño.

6.5.3.1 Filtros empacados

filtro empacado. El lecho se para prevenir mantiene entre rejillas metálicas ajustables el movimiento de las fibras y el acanalamiento del aire a través del lecho. En algunos casos los materiales del lecho filtrante se pegan con resinas o se comprimen en bloques o láminas. En la Tabla 6.6 se presentan las caracterlsticas de uno de estos medios. En la Figura 6.1 1 se muestra esquemáticamente un

Figura

6.11

Representación esquemátaca de un filtro empacado

389

Tabla

6.6 Características de la lana mineral,'(Stilmed AST 1 3)-, Richards, .l 968.

Diámetro de fibra,

pm

50 D-

5.

Parámetro de Kuwabara:

'-

6.

Ev=-

tn, - I.

" - Í=o,941

Relación entre los diámetros de partlcula y de fibra:

.', 7.

i ú =0,(Bo

j'

Eéuación [6,361: g¿

,,ir¡

* Fr * Fa=12,S¡.iO,SA)-I4.(113.065,g8¡-zs *(o,923)-f .rO,oqer.t0,962|=2,$14.10-e

,

*

'

397

8.

Eficiencia de recolección por impacto: p

L

rM =

ug7s.tffi

Eficiencia de recolección

)'o

=

o,orro

por gravitación:

pn= (1@

- f ,2171.9,9.(0,6r.10-92 =2,364.10-5 18.(1,8.10-t).(0,¿O)

10.

Eficiencia total de.recolección:

0r

= 0,0197

1'1. Espesor del lecho: ln 1800.20.60.1@ _ 4.0,038.0,0197.¿

r.(rs.t0-6

0,001

I; = 0,52

6.6.2 Pérdida de presión

)

m

en los filtros de fibra de vidrio

Los filtros de fibra de vidrio son los más ulilizados en esterilización de aire para

las plantas de fermentación. Las fibras deben reemplazarse después de un período de operación que usualmente varía entre 1 y 2 años. El reemplazo es costoso y el empaquetamiento del lecho es relativamente difíc¡I. Además, los costos de producción de vapor y de aire caliente para la esterilización del lecho y subsiguiente secado.del mismo son considerables. La pérdida de presión del aire que atraviesa un lecho de fibras se calcula usualmente según el procedimiento de Kimura e linoya, 1959, estos autores recomiendan la Figura 6.1 3, construida a partir de valores experimentales, para gvaluar el coeficiente de arrastre Co, en función del número de Reynolds:

398

co*

rc

=

.9.-dr.

A

P

2-p.L.rÍ.0 - d^

t6.39I

Donde, dr: diámetro de fibra, m! gc: factor de conversión de unidades, 1 kg.m.s' 2.N-l;p¡: denSidad detfluido, kgim3; Uo: Velocidad superficial, o de torre vacla, del fluido, m/s; L: espesor del lecho, m; a: fracción volumétrica de fibras en el lecho: o : 11 - el; e: fracción volumétrica de vacios en el lecho. m = 1,35: fibras de vidrio; m : 1,45: fibras de algodón.

Ejemplo

6.6

Pérdida de presión del aire en un filtro de fibras de vidrio

Calcular la pérdida de presión del aire en el caso del ejemplo anterior.

- Número de Reynolds = 0,592 - Corur : 83:Figura 6.13, Para Re = 0,592 - m : 1,35: fibras de vidrio, dr : 19 /m - Pérdida de presión:

A P =#05,3

^p

=

(§É,-g-!ALf,A7

Pa

estl = 0,6s4 ps¡

399

Figura 6.13 Determinación de la pérdida de presión del aire que atraviesa un lecho de fibras según el procedimiento de Kimura e linoya, 1959. La ordenada es el coeficiente de arrastre Co, definido en la Ecuación t6.391 y !a abcisa es el número de Reynolds.

Coeticiente de friccion

Reynolds

PROBLEMAS

6.1 Los períodos de calentamiento y enfriamiento en un fermentador por lotes de 40 m3 de capacidad son: Calentamiento de 100 hasta 121 oC en 16 minutos; Enfriamiento desde 121 hasta 100 oC en24 minutos.

- Tres muestras sin esterilizar, tomadas de diferentes lotes de materia prima, dieron los siguientes recuentos bacteiiales: 8.1 06; i',6.10' y 3.1 06/ml. Calcular el valor del período de sostenimiento a 121 oC.

400

Durante la etapa de calentamiento se presenta una falla en el control de températura del fermentador del problema anterior' La temperatura aumenta a oC, permanece constante durante raz6n de 0,8 oC/minuto desde 1 00 hasta 108 oClminuto desde 108 hasta 121 oC. 8 minutos y luego aumenta a razÓn de 0,8 Calcular el valor del período de sostenimiento.

6.2

Suponer ahora que por ampliación de la planta se desea construir un fermentador similar al del problema 1 pero de 120 m" de capacidad. Los ciclos de calentamiento y enfriamiento serán realizados en 22 m¡nutos y 28 minutos oC. respectivamente. Calcular el valor del perlodo de sostenimiento a 121

6.3

6.4

Se utiliza un sistema de esterilización mediante calentamiento directo por

inyección de vapor de agua, seguido de un enfriamiento instantáneo (Figura 6.81, para esterilizar el caldo de un fermentador. Los recuentos bacteriales de dos muestras de caldo sin esterilizar dieron los siguientes resultados:8.1011; que 1 ,7.1O121m3. Se requiere reducir la posibilidad de contaminación de manera sólo 0,001 microorganismo pueda sobrevivir después de Un mes de operación continua. Diseñar la esteril¡zación sobre la base de que todas las esporas bacteriales resistentes a la acción del calor corresponden al B. stearothetmophi' /us (Keo = 1,585,1036.s-1; Eo: 283,46 kJ/(gmol). La sección delsostenimiento del esterilizador es una tubería de acero de 24 m de longitud Y 7,79 cm de diámetro interior. En la planta se dispone de suficiente vapor de agua saturado, a una presión de 6 atmósferas, suficiente para calentar el caldo hasta una temperatura de sostenimiento de 130 oC. Los periodos de calentamiento y enfriamiento son despreciables en este tipo de esterilizador. Las propiedades del caldo a esta temperatura son: densidad: 10OO kg/m3; viscosidad: 1,12.10'3 kg.(m.s)''; calor específico: 4,187 J'(g.oQ)'1' Calcular la cantidad de medio, kg/s, que puede esterilizarse: 1 - si se supone flujo tapón ideal; 2 - si se considera el efecto de dispersión axial. para esterilizar mediante filtración el aire necesario para aerar durante 960 horas un fermentador con 80 m3 de caldo a razón de 1,5 yym (volunren de aire por volumen de licor cada minutol. Se dispone de aire a 18 oC y 6 psig (presión bárométrica : 12 psi; viscosidad:p" : 1,85. 1 0{ kg. (m,s)-1). El aire contien e 24OO microorganismos/m3, (pp : t O00 kg/m3, dp : 0,6/m), y se acepta una probabilidad de hallar0,0o1 microorganis-

6.5 Hallar el espesor del lecho requerido

mos en el afluente al fermentador durante las 960 horas. El lecho está compuesto de fibras de vidrio (d, : 1 5 Ym, o = 0,03)' La velocidad superficial del aire es 0,46 m/s.

401

: .i

6.6 Calcular la pérdida de presión del aire en el lecho f¡ltrante descrito en problema

anterior.

el

!

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405

CAPITULO 7

FENOMENOS DE TRANSPORTE EN BIOPROCESOS

7.1

REOLOGIA DEL CALDO

Los caldos de fermentación están con§lituidos por agua, electrólitos, sólidos suspendidos (partículas, flóculos y máleriales filamentosos) y materiales disueltos. Estas sustancias determinan el comportamiento reológico y la tensión superficial del caldo e influyen sobre la transferencia de momentum, calor y masa en el biorreactor. r

Desafortunadamente la mayor parte de la i¡formación disponible sobre consumo de potencia por agitación, transferenclT de calor, cambio de escala y transferencia de masa, se fundamenta eR datos obtenidos con agua. El agua y las soluciones de electrólitos manifiestan un comportamiento reológico sencillo descrito por la ley de Newton, Bird et al., (1960). La mayorla de los medios de fermentación con bacterias y levaduras también manifiestan un comportamiento Newtoniano..Los medios donde partic¡pan células miceliales o donde se forman compuestos poliméricos se comportan generalmente como fluidos no Newtonianos.

406

7.1.1

Fluidos Newtonihnos

La viscosidad de un caldo Newtoniano no es afectada por la velocidad de agita-

ción: tz -

17.11

Donde, rxz: componente del tensor esfuerzo cor.tante en el plano XZ, N/m2; {dv./dx}: gradiente de velocidad del caldo, (m/s}/m; p: viscosidad del caldo, kg.(m.s) '. La ecuación antei¡or puede ser generalizada para incluir ftuidos con material suspendido o con macromoléculas disueltas: üE--

17.2t

La viscosidad aparente, por, kg.(m.s)-1, depende del gradiente de velocidad del fluido y de la temperatura y presión del caldo Y, Por consiguiente; no es una

propiedad del fluido.

La determinación del comportamiento r.eológico de un fluido reqtriere la construcción de un reograma a partir del ajuste de los datos obtenidos experimentalmente con un viscosimetro exacto dentro de un amplio intervalo de viscosidades. Metz, et al., (1979), describen algunos métodos de obtención de

las propiedades reológicas de los cultivos miceliales. Charles, M., (1978), clasifica los caldos de fermentación en tres'categorfas: cultivos miceliales, cultivos con polisacáridos extracelulares, y cultivos de bacterias y levaduras.

La Figura 7.1 es una representación esquemática de los reogramas típicos de algunos caldos de fermentación. Los resultados experimentales informados por

diferentes investigadores corresponden generalmente a datos obtenidos en diversos tipos de v¡scoslmetros, factor que influye ,sobre los resultados y dificulta la confrontación de estos valores, aun en el caso del mismo caldo.

407

¡

Figura

7.1 Reogramas

t

de fluidos con diferentes propiedades reológicas

Cue

Plqstlco Blnghorn

de

Cass

luldo Newtonlono

I

Esfuerzo

cortqnte

Futdo

drtot

Flu¡do

pseudoplos tlco

Grodlente de ve[ocldod Roels

et al., 119741presentan una lista de los modelos matemáticos empíricos

empleados por diferentes autores para describir la relación entre la viscosidad apafente, !¡p, y el gradiente de velocidad. La magnitud de los parámetros de los diferentes modelos depende de la concentración, de la morfología celulat, y de las condiciones del crecimiento, si es filamentoso o si es del tipo pelotilla. Los sustratos de alto O"ro *o,""ular como almidÓn de maíz disuelto en agua, o una elevada concentración de sólidos no disueltos, afectan la reología del caldo aun a bajas concentraciones celulares, La viscosidad es probablemente el factOr gue afecta en mayor grado el coeficiente de transferencia de calor, La disminución de este coeficiente es drástica a partir de viscosidades del orden de 0,5 kg,(m.sl-1, cuando la velocidad de aeración es alta.

Xueming et al., 1991, estudiaron el efecto de la víscosidad en caldos de fermentación de polisacáridos (goma xantana) sobre el coeficiente de tranferencia de calor. En el caso de caldos con una concentraclfln de 27 (g de goma)/li,tÍo, aEitados con turbinas Rushton, el valor de este coeficiente puede ser tan bajo como 6 % del valor en agua.

408

u*=*"(*)" ' -,.(*)'

17.51

El comportamiento pseudoplástico ha sido observado por Tuffile y pinho, (1'970), en caldos de s. aureofaciens; por Deindoerfer y weót, (1 960l, en caldos de c. helleboií y en caldos de Penicillium chrysogenum, y por Taguchi et al., (1968), en caldos de Endomyces.

7.1.4.

Cuerpo de Casson '1

,

La viscosidad aparente de un líquido que se comporta como cuerpo de Casson es inversamente proporcional al gradiente de velocidad y depende, además, de un esfuerzo constante inicial. Este comportamiento ha sido observado por Roels et al., 11974!., en caldos de P. .Chrysogenum:

("=)'P

l*=1

7.2

"(*)'

=

("")'o . *"

+

(*)"

K"'("t1P'(*)' -K:

t7.61

17.71

AGITACION, AERACION Y DISPERS¡ON

El calor añadido al sistema cuando el caldo es agitado para piomover la mezcla y la tranferenciá de calor y de masa, qoe, puede determinaÍse experimentalmente para diferentes valores de la velocidad de agitación y del flujo de aire, o evaluarse mediante correlaciones entre los números de potencia y de Reynolds,

410

(Perry y Chilton, 1973). Generalmente la agitación se realiza mecánicamente pero también se puede lograr mediante dispersión de aire. En la práctica la potencia suministrada por agitación a un reactor varía entre 1 y 5 W.(litro)-l, donde aproximadamente 85 - 95 % de este valor corresponde a agitación mecánica y el resto a la energfa cinética y expansión isotérmíca del

gas dispersado.

términos cualitStivos aproximados se considera que un sumistro de potencia al líquido menor que 0,2 W.(litro)1 proporciona una agitación moderada, entre 0,6 y 0,8 W.(litro)-l la agitación es vigorosa, y para 1 W.(litro)-1 o más, la agitación es intensa. Estas cifras están relac¡onadas con la potencia realmente entregada al lÍquido y no incluyen las pérdidas en sellos, cojinetes y otras ¡neficiencias eléctricas y mecánicas, (McCabe, Smith, y Harriot, 1991). En

Las pérdidas por fricción en sellos, cojinetes, bandas y poleas, generan calor y

contribuyen a la disminución de la eficiencia de transmisión de potencia, eo, entre el motor y los impulsores. Harmes 119721encontró una pérdida de 3O% de potencia, entre el motor y el impulsor, en un reactor de 270 litros. La energía mecánica suministrada puede alcanzar hasta un 25o/o de la carga calorífica total que debe ser removida de un biorreactor para mantener la temperatura óptima, (Charles, M., 1985). Las pérdidas por fricción en un fermentador de laboratorio pueden alcanzar hasta el 75 o/o del total consumido por el motor. A nivel piloto estas pérdidas pueden llegar a ser del 30 % con respecto al consumo total. A nivel industrial la fricción representa sólo el 5 % de la potencia consumida por el motor,

7.2.1 Evaluación

de la potenc¡a entregada al fluido

La velocidad de un agitador se mide directamente con un tacómetro conectado

al eje, La señal eléctrica se utiliza para controlar la velocidad de agitación y asegufar una adecuada transferencia de masa. La medición de la potencia entregada a un impulsor depende de la escala de operación. La lectura de un

411

vatímetro acoplado al motor del agitador proporciona datos exactos a escala industrial y de planta piloto:

P = I.Vu.er.oos$

17.81

Donde, P potencia, W; /: corriente, Amperios; Vor: potencial eléctrico aplicado, V; er: eficiencia del motor; cos tD: factor de potencia. La potenc¡a entregada al fluido a escala de planta piloto se determina directamente mediante dinámómetros de torsión y detectores de esfuerzo, (Aiba et al., 1973; Nienow y Miles, 19691:

t7.9t

P=(r),f Donde, r: momento de torsión. N.m;

u¿:

velocidad angular del agitador, radian/s.

La potencia entregada al fluido en un fermentador pequéño se evalúa preferen-

cialmente por el método de detectores de esfueeo Gtrain gaugesl y no por el método del momento de torsión, por la desproporcionada cantidad de energía disipada en los sellos del agitador. Similarment€,; no se recomiendan técnicas eléctricas de evaluación de potencia a escala de laboratorio (P < 1 kW o V < 50 lítros),'porque las pérdidas en et cílcuito pueden ser mayores que la potencia I¡ transmitida al fluido. ,

7.2.1.1 Dispersión de gases

La potencia entregada a un fluido por la dispersión de un gas se calcula mediante la ecuación:

(o'), - (r'), R.r . ¡_ln

_f

[

412

2.s.

Ms

P¡ P¿

t7.10I

Donde el primer térm¡no de esta ecuación representa el cambio de la energfa cinética del gas: v,: velocidad del gas en la tuberfa, rr.s-1i v,: velocidad del gas en el reactor; g": factor de conversión de la ley de Newton (1 kg.m.s-2.N-l). El segundo térm¡no de la Ecuación Í7 .101 representa la expansión isotérmica del gas, desde el punto de salida de gas por la tobera hacia el líquido, donde ia presión es'p,, hasta el punto de salida de gases del reactor donde la presión es p";

R: constante de los gases,8,314 kJ.kmol-1.K-1; M.: peso molecular del gas (I\lo,.r: 29 kg.kmol-tl I T: temperatura absoluta delgas, K; F.: velocidad de flujo de masa de gas, kg.s-l

:

F.=pe-F I pr= Ptx'M, R.T

17

.111

Donde, F: caudal de gas, m3 s-'; pg: densidad del gas, kg/m3; Por.: presión absoluta, Pa, (Pa : N.m-2):

Puror*^ = Pu.mwlttrc1 * Pul¡pustruct

7.2.1.2 Agitación

Los tipos de fermentadores utilizados con mayor frecuencia en la práctica de la

lngeniería Bioqulmica son los fermentadores de laboratorio, el tanque agitado, la columna de burbujeo y elfermentador de recirculación, (Figuras 5.20 y 5.21).

Los fermentadores de laboratorio generalmente son recipientes con un volumen de operación entre 0,5 y S litros, usualrnente son de vidrio y están provistos

de un sistema de agitación mecánica. Los fermentadores denominados "de banco" son similares a los de laboratorio, sólo que tienen volumenes de trabajo entre 5 y 15litros. Sykita, 1983, dor pequeño:

,r"."nr"

las siguientes caracterfsticas deseables de un fermenta-

413

- Relaciones geométricas (factores de formal similares a las de un ferrnentador industrial.

- Construcción hermética para prevenir la contaminación del medio. - Sistemas confiables de registro y control de temperatura, sistemas de control de pH y ruptura de espuma con el propósito de garantizar condiciones estandarizadas en los diferentes ensayos.

-

Volumen de operación suficientemente grande para permitir la toma de muestras sin alterar apreciablemente el volumen del cultivo o perturbar las condiciones de aeración y mezcla. La columna de burbujeo (Figuras 5.2O v 5.21) es un tanque cilíndrico diseñado generalmente con una relación entre altura y diámetro mayor que 3 y equipado con un distribuidor de aire. Este fermentador de reducido costo y fácít construcción y mantenimiento requiere una distribución homogénea del aire pero t¡ene la desventaja de generar demasiada espuma. Entre las industrias que

utilizan este t¡po de reactor están la de ácido cítrico, ácido láctico, enzimas, esteroides y levadura para panificación. Los fermentadores de recirculación más utilizados son el reactor de circulación

líquida impulsada por aire "airlift" y el fermentador de chorro (Figura 5.21lr. El fermentador airlift es una columna de burbujeo equipada con un tubo concéntri-

co de arrastre "draft tube" con el objeto de distribuir el aire. Este tipo

de

fermentador se utiliza principalmente en los sistemas de tratamiento de agua y para la producción de proteína unicelular. El fermentador de chorro, similar al airlift, está equipado con una bomba para recircular el lfquido.

A nivel industr¡al el fermentador más usado es el tanque agitado. En la Fígura 7.2 se representa esquemáticamente un reactor de mezcla completa agitado por dos impulsores de turbina acoplados al eje de rotación. Generalmenté se instalan entre 2 y 5 impulsores. Eltanque agitado es muy flexible ya que puede manejar fluidos con viscosidades muy diferentes y satisfacer,un.amplio intervalo de requerimientos de tranferencia de calor. Cuando el sistema de camisa no es suficiente para proveer el área requerida de transferencia de calor siempre existe la posibilidad de instalar serpentines, internos o externos, o utilizar un intercambiador externo. Los impulsores son preferencialmente de turbina, tipo Rushton. Estas turbinas fáciles de construir suministran una elevada potencia y se caracterizan por su alta eficiencia para dispersar el gas. Los impulsores del

414

tipo hélice marina son ut¡l¡zados cuando se requiere bajo corte y bajas transferencias de oxígeno. La relación (H/Dr) entre la profundidad del llquido en elreactor y el diámetro del mismo varía entre 2:1 y 3:1 . En la práctica Europea se prefiere una relación 3:1 ,

y en los EE. UU.,2:1.

Algunos fermentadores a escala industrial están construidos según la relación (H/D¡) : 1. En el sistema de eje con 2 impulsores, elimpulsbr inferior se inst¿ila a una altura

sobre el fondo del tanque igual a 1,5 diámetros de impulsor (E : 1,5 Dol y el segundo impulsor se instala a 1,5 Do sobre el primero. Cuando se'instalan'3 impulsores, la distancia (E) a partir del fondo del tanque, y entre impulsores se reduce generalmente a 1 diámetro de impulsor.

Representación esquemática de un reactor agitado por dos impulsores de turbina: Dr: diámetro del tanque; Do: diámetro del impulsor; E: altura del impulsor sobre elfondo del tanque y separación entre impulsores; W: anchura de las aspas; L: longitud de las aspas; J: anchura de las pantallas deflectoras; H: profundidad del líquido.

Figwa

7.2

II k- Do+t ¡-Dt+l

fr

EI

II 415

Fukuda (1968), encontró una proporcionalidad directa entre el número de potencia y el número de impulsores. Así, por ejemplo, se puede suponer gue la

potencia total es la suma de la potencia suministrada por cada ímpulsor. En condiciones aeradas el impulsor inferior consume menos potenc¡a que el resto. El diámetro de un impulsor varía generalmente entre

0,3 y 0,4 veces el diámetro (0,3 Dr < DA < 0,4 Drl. Usualmente elimpulsor se construye según del reactor la relación: 20:5:4 : D¡: W: L, donde W es la anchura y L es la longitud de las aspas del imBulsor. Generalmente se instalan 4 pantallas deflectoras uniformemente espacialas de anchura igual a 1/10 del diámetro del tanque (J : Dr/10) con el propósito de crear turbulencia y evitar la formación de vórtice.

7.2.2 Agitación

de fluidos Newtonianos no gaseados

Según McCabe y Smith (1976), la potencia requerida para agitar un fluido Newtoniano se calcula a partir de: P.g, p.n3.DAs

=

rl\ür,+,

r, ,...,r"]

P=8" p^= iFr=ol'D^ - p.no -Dt" =iRe=n'D^2'P F I

17.121

s,=N,',=l:s,=l

s,=l,tr=*,t"=l Donde, Po : número de potencia; Re: número de Reynolds; Fr: número de Froude; S,, Sr, S., So, S., S.: factores de forma; P: potencia requerida para rotar un impulsor dado a una determinada velocidad, W; g": factor de conversión de la Ley de Newton (1 kg.m.s'2.N-'); p = densidad del fluido, kg,m-3; n 416

velocidad del impulsor, revoluciones s-l; l.r = viscosidad del fluido, kg.m-1.s'1; Do: diámetro del impulsor, m; Dr: diámetro del tanque, m; g : 9,8 m.s-2: aceleración de la gravedad; E: altura del impulsor sobre el fondo del tanque, m; L: longitud de las aspas del impulsor, m; W: anchura de las aspas, m; J: anchura de las pantallas deflectoras, m. La Ecuación f7 .121, válida para agitación de fluídos Newtonianos no gaseados, generalmente se representa en forma gráfica (Figuras 7.3 V 7 .41 para diversos

tipos de impulsores, diferentes configuraciones (factores de forma) y condiciones de operación (McCabe y Smith, 1976; Wang, 1979; Perry y Chilton, 1973t.

Figura

7.3 Función de potencia versus

Reynolds para un impulsor de turbina de

6 paletas planas. McCabe y Smith, 1976.

t00

Funcion de potencio

-l'-i. t'-t

o {--1.1.+

t0

,.\

e1 \l

Éi

-¿l

+i *i 'i rfi

t4

iil \ l-{

?.!.v. t.9:

i l¡

to

1000

700

too00

ts<

+ 1

00000

Reynolds

La representación gráfica de la Figura 7.3 se aplica en'el caso de tanques equipados con un eje verticalcentral y una turbina de 6 paletas planas. Las dos curvas de la Figura 7.3 son válidas para los factores de forma: Sr = Dr/D¡ : 3;Sz = E/DA :1;S. = L/DA = 0,25; Ss = H/Dr = 1. LacurvaAseaplicaen el caso de tanques equipados con 4 deflectores, cada uno de anchura igual a la 417

: .i

décima parte del diámetro del tanque (Su : 6,1), y Q aplica en el caso de tanques sin deflectores.

: P". La curva B se

La fqnción de potencia, {p, representada en las ordenadas de las Figuras 7.4, depende de los números de potencia P" y de Froude, F^:

P'8' : F^=n"'D^ g p.ns.D|¡ 'R

Po='

'Q=Pr.Fi^i

7.3 y

t7:131

Figura 7.4 Functón de potencia, (D, versus Reynolds para hélices de 3 aspas. McCabe y Smith, 1976, .i

to0

a

_a\a_

'.4:::.¿t

.le,tti dr.o16.sri.slFfr

-3i:P-qf¿g,i?:ili

.EL:..il.

dérk

s¡.P.á.§a:12¡I

e

_'

\\ ...t\.

dé;i,t ¡a-te7"'; §i;'i 5,: Pá§óilil: ---!--j---.- l---¡--i,-i-i+i D:iG ddíl tctdresi §Jl r;Pespitil¡

t\\

10

'ai

(Uts9i9

I

i§ §i

\^i.. 'ii

\

\-.--¿.

-*-: iX

A

==+:M

§ it =

0.1

t

t0

100

1000

j::iri:i:i1

+

I

*+ 10000

100000

Reynolds

El efecto del número de Froude aparece cuando hay formación de vórt¡ce, y entonces sólo si el número de Reynolds es mayor que 300. En Ios tanques equipádos con pantallas deflectoras, o p'árá impulsores que entran lateralmente al tanque, o cuando el número'de Reynolds es menor que 300, no se forma vórtice, y el número de Froude no afdCta la Ecuación 17.121 y m : O.

418

El exponente m depende del número de Reynolds:

m= a-looRe '

t7.141

b

Donde:

ab 1 1,7 0 2,3

Curva 40 1g

Figura 7.3 7.4 7.4 7.4

B B

18

C

1g

D

La representac¡ón gráfica de la Figura 7.4 se aplica en el caso de tanques equipados con un eje vertical central y una hélice de tres aspas, Para todas tas curvas 52 = E/Do : 1, y Su : g¡¡, : 1. La curva A se aplica en el caso de tanques equipados con 4 deflectores y Ss : J/D, : 6,1 .

7.2.3 Agitación de fluidos Newtonianos

gaseados

La potencia consumida por un sistema gaseado es considerablemente rnenor que

en un sistema no gaseado. A bajos caudales el gas pasa por el impulsor sin dispersarse y el líquido fluye sin ser prácticamente perturbado por el gas. A medida que aumenta ef caudal, una mayor cantidad de gas es capturada por los vortices formados detrás de las paletas del impulsor, y luego es dispersada. En este momento el consumo de potencia del sistema §aseado comienza a disminuir con respecto al consumo del sistema sin gasear. El sistema de agitación se diseña generalmente para el procedimiento de esterilización donde el medio de fermentación e§tá usualmente en una condición no gaseada. El número de aeración,

Ar, relación entre la velocidad superficial del gas y

la

velocidad en la punta del impulsor define la intensidad de la aeración:

17.15t

419

Donde, Fo: caudal de gas, m3.s-',; Do: diámetro del impulsor, m; n: velocidad del impulsor, revoluciones.s-1; n,Do: velocidad en la punta del impulsor, m.s'1. En los cultivos de microorganismos miceliales se encuentra generalmente que

las células sufren daño cuando la velocidad en la punta del impulsor es mayor que 5 m.s-t, (Lynd, 1989). La relación entre los consumos de potencia en un sistema gaseado y en el mismo sistema sin gasear, Pn/P, varla entre 1,0 y 0,3' wang et al., (1979), presentan la relaciÓn, Po/P, en función del número de deración, A., para el impulsor de turbina de hojas planas: PG

P

0,65

= 0,35 *

t7.16I

1 + (f 6,67)-á,

Nagata, 1975, presenta la siguiente ecuación para evaluar la relación Po/P, en un reactor equipado con una turb¡na de hojas planas:

bsio+ =

Donde:

*,

=

,*(3f'*'*3'"' ';'* ?' 'n"

+

;

&

+,

=

n,

=

17.171

?,j,

Donde, Pu: consumo de potencia en el sistema gaseado, W; P: consumo de potencia en el sistema sin gasear, W; Fo: caudal de airé, m3.s-'; n: velocidad del impulsor, revoluciones.s-'; Do: diámetro del impulsoÍ, mi pi densidad del caldo, kg/m3; p: viscosidad del caldo, kg/(m.s). Michel y Miller (1962) desarrollaron la siguiente P

c

= K.ÍP2

.

n. D

.

^3

ecuación:

,

t7.18t

F

^-o'$]o'§

Donde, K: constante que depende de la geometrfa del sistema y de las Unidades utilizadas. Los intervalos de las variables físicas en los ensayos de Michel y Millerfueron: viscosidad: p - 9.10-4 - 0,:l kg,m-l's'1; densidad del caldo: p :

-

1650 kg.m-3 ; tensiÓn superficial: O,O27 'O,O72 N.m-'; Potencia consumida por el sistema gaseado: Po: 3,73 -74,6 W; Volumen del líquido en el reactor: 3,5 - 10,5 litros, BOO

420

Ejemplo

7.1

Consumo de potencia por agitación

un tanque cillndrico de 0,99 m de diámetro, prov¡sto de cuatro

placas

deflectoras, unifOrmemente espaciadaS. de anChura J = 0,1 .Dr, se agita con un impulsor de turbina de seis hojas planas (DA : Dr/3) que gira a 3 rps. Agua a 25 oC (densidad: p : 997,08 kg/m3, (Perrf,y Chilton, 1973); viscosidad p : 8,9O4.tOo fg/m.s) ltena el tanque hasta un nivel de operación H : Dr' El oC y 5,2 psig a ¡azÓn de 0,4 vvm tanque se alimenta con aire estér¡l a 25 (volumen de aire por volumen de licor cada minuto) por un orificio situado debajo del impulsor. La presión local es 10,8 psi. Calcular la potencia disipada por el impulsor en el líquido sin gasear y en el lfquido gaseado. Solución:

- Volumen de licor: V = !;(O,gq2.(O,gg) = 0,762

mg

- Caudal de aire:

- O,4.LO:762) = S,0g.l0-o ^60

F,

msls

- Nrimero de Reynolds: Rr

3.(0,$)2.(997,0q 8,904.10-4

=

\¿

t

Por consiguiente, Q - Po : 6, (Figura 7.3), y la potencia disipada por el impulsor en el llquido sin gasear, Ecuación [7.13], es:

P = 6.(997,08).(3)0.(0,33): = 6s2,1

W

- Número de Froude: FR =

n2.D,

I ---a

=

9,8

= 0,303

421

- Número de aeración:

A-= F^ ' n.o|

(5,08.10-1 =O.M7 3.(0,$)3

La potencia disipada en el líquido gaSeado, (Ecuación 7.'l-1l., es: ros

."+ = - .'rr.(:#f'o.",n"' .&I'*

.As =

- 0,1471

Pc = (0,7126).(632,1) = 450,4 W La potencia disipada en el llquido gaseado, {Ecuación 7.16}, es:

&=o.gs* P

0,65

1+(16,67)-(O,U7)

=o.T1u

Pc = 6O,V144¡}.(632,f) =.451,6

[

7.2.4 Agitación de fluidos no Newtonianos no gaseados

fluido no Newtoniano no gaseado (o velocidad del impulsorl. Metzner y Otto la velocidad de corte de depende {1 957} definen un número modificado de Reynolds para fluidos pseudoplásticosi El consumo de potencia en ta agitación de un

, )' R¿*=D^".o"-.^.pl rt (0,1).X" \6.n + 2)

t7.1gl

Donde, K": lndice de consistencia de flujo, igual al esfuerzo cortante

7

correspondiente a una velocidad de óorte de 1 s-t; m: fndice de comportamiento

de flujo lm -- 1: fluido Newtoniano; fluido dilatante).

422

r

m < 1: fluido pseudoplásticoi m > 'l:

Taguchi y Miyamoto (19661 relacionaron los números de potencia, po, y de Reynolds, Rerr, para caldos no Newtonianos no aerados en la fermentación de glucoamilas a con Endomyces:

Po=k.(fu¡t)"

(+)'(#)'

17.201

Donde, Dr: diámetro del tanque; Do: diámetro del impulsorr

w:

impulsor.

anchura del

En la Tabla 7.1 se presentan los vatores de k, a, b y c, correspondientes a la Ecuación f7.2ol. Los caldos de fermentación con organismos miceliales (como en el caso de la producción de antib¡ót¡cos con Penicillium o Streptomyces) o

con materiales poliméricos (fermentación de polisacáridos) manifiestan

un

comportamiento pseudoplástico.

Tabla

7

.1

Valores del coeficiente y exponentes de la Ecuación y Miyamoto, 1966).

Rer.:

50 9

-0,0s -1,2 o, 9'

gaseados no Newtonianos

Taguchi y Miyamoto, (1966), investigaron el efecto de ta aeración sobre el consumo de potencia en la agitación de un caldo no Newtoniano y encontraron que una forma modificada de la ecuación de Michel y Miller (Ecuación 7.19l, con Kl en lugar de K, fija adecuadamente los datos experimentates de la fermentación de glucoamilasa en régímen turbulento, Re", ) S0:

423

P

e = Kt -lr2.n.

o^3 -F,{-o's'

]o'45

t7.211

OonO", K,,: constante que depende de la geometría del s¡stema y de las unidades utilizadas. Los mismos autores recomiendan la siguiente ecuación para la zonas laminar y de transición: P

c=

K2.lP2.n. D^s . F;o'ú fo'n

t7.221

Donde, Kr: constante que depende de la geometría del sistema.

7.3

TRANSFERENCIA DE CALOR EN FERMENTACION

En los reactores biológicos hay necesidád de transferir calor en diferentes etapas y circunstancias del proceso de fermentación:

- En el procedimiento de esterilización se suministra calor para calentar el caldo hasta la temperatura requerida para la elimininación de todos los microorgariismos. El caldo se mantiene a esa temperatura durante un tiempo denominado período de sostenimiento. Entonces hay que retirar calor y enfriar el caldo hasta la temperatura de fermentación. - En el tratamiento anaerobio de los lodos de aguas residuales, el calor generado

por la conversión del sustrato es insuficiente para alcanzar lq temperatura requerida por el proceso (55 - 60oC) y, por consiguiente, hay necesidad de suministrar calor al digestor,

- La conversión del sustrato genera un exceso de calor con respecto a las condiciones óptimas del reactor en la mayoría de las fermentaciones microbiales y, por tanto, hay necesidad de retirar este calor, Los procesos de fermentación exotérmicos pueden llegar a generar entre 7,32

y

14,6 Wilitro. La disipación de energía (por agitación y aeración) puede alcanzar un valor entre 0,73 y 4,4 Wlitro. Los coeficientes globales de transferencia de calor para un fermentador industrial estándar alcanzan valores 424

entfe 280 W.m-2.oC-1 con medios de baja viscoSidad y 850 W.m-2.oC-ren el caso de fluidos viscosos y no Newtonianos. La magnitud de la transferencia de calor depende de los llmites del sistema y de las condiciones ambientales. Las variables más importantes en la determinación de la magnitud del calor transferido, qiñr, son: la diferencia de temperatura entre el fermentador y el aire ambiente, la temperatura del agua de refrigeración y el área disponible para transferencia de calor.

7 -3.1 Area de transferenc¡a de calor

La transferencia de calor se ¡ealtza entre el fluido procesado, caldo

de

fermentación, y el fluido refrigerante, generalmente agua, mediante sistemas de Camisas externas, Serpentines internos o externos, flujo a través de un intercambiador, o mediante la condensación o la evaporación del agua y otros compoñentes volátiles delfluido que contiene las células y demás productos de la ferirrentación. El área efectiva de transferencia de calor de un sistema de camisa externa (Figura 7.5.a), según Humphrey (1989), es eJ área láteral del tanque:

A" = n'DrH

f7.23t

Donde, A¿: área de,transferencia de calor de la camisa, m2; D.: diámetro del reactor, m; H: altura alcanzada por el caldo de fermentación dentro del reactor, m. Con el propósito de controlar la temperatura del caldo durante la fermentación, usualmenterentre 25 oC y 35 oC. es necesario remo\rer el calor generado' Con este propósito se requieren áreas de transferencia que generalmente no son

posibles de satisfacer con el área disponible de la camisa. Por e.sta razÓn prácticamente todos los fermentadores de capacidad superior a 1000 litros requieren un serpentín interno, Los serpentines helicoidales tienen la ventaja de proveer una gran cant¡dad de área de transferencia en un volumen dado de fluido pero son relativamente

425

costosos y difíciles de mantener. El área de transferencia de calor de un sistema de serpentfn interno (Figura 7.5.b1, es:

Ar=n.d.Ls=t2.d.Dr.n,

17.241

.Donde, A": área de transferencia de calor del serpentín interno, mr; d: diámetro externo del tubo del serpentín, m; Ls: longitud del serpentfn, mi Ls : n. D..n.; D.: diámetro del serpentín, m. Generalmente: Ds : 0,9.Dr, para serpentines sencillos de una sola hilera; Dr: diámetro del reactor; n. : (H./e) + 1 : número de espiras del serpentín; H": altura del serpentín, m. Usualmente: Hs =- 0,8.H; H: attura ocupada por el caldo de fermentación dentro del reactor; e: separación entre espiras adyacentes, m. Frecuentemente e varía entre 2d y 4d. En la Figura.7.5.c, se muestra esquemát¡camente-el intercambiador fle doble tubo, el flujo puede ser en paralelo o en contracorriente y cualquiera de los dos fluidos puede ocuparelespacio anularo el tubo interior. El equipo mostraflo;en la Figura 7 .5.d, es un intercambiador de un paso por Ia coraza y dos, puatro, o cualquier múlt¡plo de pasos por los tubos. Elequipo mostrado en la Figura.7,5"e, es un intercambiador con dos pasos por la coraza y cuatro, ocho, o cualquier múltiplo de pasos por los tubos. En la Figura 7.6 sq,representa esquemátieámente la variación de la temperatura de los fluidos cal¡ente y frío con Ia distancia, medida a partir de la entrada de fluido frío, en un intercambiador de doble tubo. En figura 7.6.b, se observa que la temperatura de salida del fluido frío es necesariamente menor que la temperatura de'salida del fluido caliente. El calor transferido es menor que el posible con flujo en contracorriente en el mismo equipo, y por esta razón el flujo en paralelo se utiliza raramente en un intercambiador de un sólo paso.

El fluio en paralelo se emplea en situaciones especiales donde es necesario limitar la máxima temperatura delfluido más frlo o donde es importante camb¡ar rápidamente la temperatura de uno de los fluidos. Otros intercambiadores ampliamente utilizados en la industria son los de co(aza y tubos. Un fluido fluye dentro de los tubos, mientras el otro fluido es forzado por la coraza a través de los tubos, mediante placas deflectoras.

426

Figura

7.5

Representación esquemática de algunos equipos de transferencia de ñ' calor.

H

:l-Dt A

x-Dt +

-¡

c

B

Reocton con conlso extenno

Reoctor

con

senpentln hterno

Intencqhb¡odon de tub€r¡o doble

fco Tfe

TFe

.Tfo

D

lntercqrrblodor de corozo y ttdoos un pqso por lo corqzo y ?, 4.,.. posos por los tubos

Tce,

fntereonk¡lodar Ce corqzo y tubgs dos pqsos por lo corozq y 4, 8-'-.poso:s por los tubos

427

Figura 7.6 Variación de la temperatura de los fluidos caliente frío en un intercambiador de doble tubo. T"o, T.r: Temperaturas afluente y efluente, respectivamente del fluido caliente, oC; Tro, Trr: Temperaturas afluente y efluente del fluido frío.

Tco

ftu¡do coltente T

Fluido col¡ente

AT2

ftu¡do Pro Tce

T

I

A:

Tf

Tf

ATI

t

fq

Tfo

D¡stoncio

D¡stonc¡o

b- flujo en paralelo

a-flujo en contracorriente

7.3.2

[are

ftu¡do

Balance de energía

En los intercambiadores de calor no'hay traba¡o de eje, y las energías cinética y potencial son pequeñas comparadas con los otros términos de la ecuación de balancg de energfa. Además, los intercambiadores de calor operan generalmente en,condiciones estables, excepto durante los cortos perlodos de arranque y finalización. Por consiguiente, la ecuación de balance de energfa aplicada a cada una de las corrientes que fluyen por el intercambiador se convierte enl

ewr = Fxr-(Hr"

428

-

Ho) = Fn.(Ho

-

Hu)

t7.251

Donde, q,,ur: velocidad de transferencia de caior, kW; Frr, Fr.: velocidad de flujo

de masa de fluido frío y de fluido caliente, respectivamente, kg.s-'; H.r, Hro: 1; entalplas del fluido frlo, efluente y afluente, respectivamente, kJ. (kg) H"o, H..: entalpías del fluido caliente afluente y efluente, respectivamente. La Ecuación 17 .251expresa un balance global de entalpía, el calor perdido por el fluido caliente es ganado por el fluido frío. Si se suponen constantes los calores específicos de ambos fluidos, el balance global de entalpía del intercambiador se convierte en:

Q¡iy=F¡ap-crr.(fo

-

Tr )=Fo"'c"r'(To

- Tu\

17

'261

Donde, T6¡, T6E: Temperaturas del fluido caliente, afluente y efluente, respectioC, En vamente, oC; Tr¡, Tr.: Temperaturas afluente y efluente del fluido frío, la Ecuación t7.2d los calores específicos se evalúan a la temperatura media aritmét¡ca entre las temperaturas de entrada y de salida def fluido: crr: calor espectfico del fluido frío, kJ (kg.oC)-1; Cr": calor específico del fluido calÍente. La velocidad de transferencia de calor por unidad de área se denomina fluio de calor y se expresa en unidades de potencia por unidad de área (W.m-'z) de la

superficie por la cual fluye el calor. La mayoría de los equipos de transferencia de calor están construídos con tubos. El flujo de calor puede expresarse con respecto al área exter¡or, o con respecto al área interior, y aunque la selecciÓn del área es arbitraria, ésta debe quedar clarameñte establecida.

7.3.3 Coeficiente de transferencia de calor

La ecuación general utilizada en el diseño de equipo de transferencia de calor es:

ftnn

= U'A'LTu = Uo'Ao'LTu = Ui'Ai'LTM

17.271

Donde, q,^r: velocidad de transferencia de calor (Ecuaciones 7.25 y 1.26l., kW; U: coeficiente global de transferencia de calor, kW.m-2.oC-l' Uo: coeficiente global referido al área exterior; U,: coeficiente global referido al área interior; A: área de la superficie de transferencia de calor, m2; ATr: diferencia media de temperatura en el intercambiador, oC.

429

7

El coeficiente global de transferencia de calor de un intercambiador de doble tubo (Figura 7.5.c} se expresa rnediante las siguientes ecuaciones: U¿= 1

hi

*

A,.ln (r.lr,)

Z.r.L.k

*

L

Ao

t

v.2at

ho

Donde, U,: coeficiente global referido al coeficiente global referido al área exterior. uo

Aol Ai

-t_

Donde, Ao

hi

+

,l".ln (r" lr,l 2.¡.L.k

1

Í7.291

ho

:

2.n.ro.L: área exter¡or del tubo interior, m2; ro: radio exterior del tubo interior; L: longitud total de la tubería doble, m; A, : 2.n.r,.L: área interior del tubo interior; r,: radio interior del tubo interior; k; conductividad térmica de la pared deltubo interior, kw.(m.oC) 1 ; ho: coeficiente de transferencia de calor por convecciÓn, o coeficiente de película, por el lado exterior del tubo interior, kW,(m2 oC)-1; hi: coeficiente de película por el lado interior del tubo interior, Las ecuaciones disponibles en la literatura para la evaluación de coeficientes de transferencia de calor dependen de las condiciones del flujo, de la geometría y

configuración del sistema, de las propiedades reológicas del fluido

y

del

mecanismo de transferencia,

Eltema de transferencia de calor es un área especializada de lngeníería Ouímica e lngenierfa Mecánica. En la literatura se encuentran numerosas ecuaciones de transferencia de calor, aplicables bajo diversas condiciones experimentales: Welty (1976), Foust (1980), McCabe y Smith (1976), Perry y Chitton (19731, Holman (1976). En la Figura 7,6 se muestra esquemát¡camente la variación de la temperatura de los fluidos caliente frío en un intercambiador de doble tubo (F¡gura 7.5.c). una inspección de la Figura 7.6 muestra que la diferencia de temperatura, entre los fluidós caliente y frk., varía entre la entrada y la salída del ¡ntercambiador. S¡ se suponen constantes los calores específicos y los coeficientes de pelfcula, el valor promedio de la diferencia de temperatura es:

\

430

LTM

-

LT2 LT. ln' LTz

LT1 =

17.301

Donde, ATr: diferencia media logarltmica de temperatura, oC. Enunciada en palabras, AT, es la diferencia de temperatura en un extremo del intercambiador menos la diferencia de temperatura en el otro extremo, dividida por el logaritmo natural de la relación entre estas diferencias de temperatura. En el caso de los intercambiadores de. tubo y coraza (Figura 7.5.d y 7.5.e), sg aplica un factor de corrección a la diferencia media logarltmica, ATr, calculada para un intercambiador de doble tubo con las mismas diferencias de temperatura en los extremos frío y caliente. La ecuación global de transferencia de calor,

Ecuación f7.271, se convjerte en:

enn J (I.A.Ft.^Ty

17.311

Donde, F': factor de corrección de la diferencia media logarítmica de temperatura, Holman (1976), Kern (195O). Los fluidos microbiales forman ocasionalmente

incrustaciones sobre la superficie de transferencia de calor que reducen gradualmente el valor del coeficiente de película por el lado del fluido.

7.3.4

Reactores equ¡pados con cam¡sa

El sistema de camisa tiene algunas ventajas de costo y economía de operación con respecto a los sistemas de serpentfn, pero el área de transferencia de calor

es prácticamente inmodificable una vez construido el tanque.

Brooks y Su, (1959), recomiendan la siguiente ecuación para calcular el coeficiente de película entre el líquido en el reactor y la superficie interior del recip¡ente encamisado) válida para un amplio intervalo de viscosidadeS y aplicable en un tanque agitado, equipado con pantallas deflectoras y una turbina de aspas planas, y documentada por otros investigadores en sistemas equipados con paletas y turb¡nas de flujo axial, (Strek, 1963): 431

ho'D,

= 0.74.(R,l)*.

trrl'r. ( -r

)''''

t7.32)

pr=n'Dtz'P i pr=F"-cp pk Donde, h": coeficiente de película entre el lfquido en et reactor y la superficie ínterior del iecipiente encamisado, W.m-2. oCi ; Re número de Reynolds; pr: número de Prandtl; Do: diámetro del impulsor, m; D.: diámetro del tanque; p: viscosidad del lfquido a la temperatura media aritmética, kg.m-'.s-'; lpi viscosidad del líquido a la temperatura de la pared; k: conductividad térmica del líquido, W.m-''.oC-t; cr: calor específico del líquido, J.kg''.oC''i p: densidad del líquido, kg.m-3;

La siguiente ecuación se aplica a la transferencia de calor hacia o desde

la

camisa de un tanque provisto de pantallas deflectoras y agitado por una turbina

de aspas inclinadas, Cummings y West, (1950):

ho'Dr

=

0,44.;y

rJ, (ü)"'

t7.33I

Donde, h": coeficiente de película entre el líquido en el reactor y la superficie interior del recipiente encamisado, W.m-2.oC-1. El coeficiente de la ecuación anterior es 0,76 para turbinas de aspas planas.

Ackley, 1960, analiza los resultados obtenidos por diferentes investigadores y recomienda la siguiente ecuación para evaluar los coeficientes de pellcula correspondientes a la superficie interior del reactor y a la superficie exterior de las superficies contenidas dentro del tanque:

ho'D,

= a.R"N.P,1F.

17.341

Donde, h.: coeficiente de película entre el llquido en el reactor y la superficie interior del reactor encamisado o entre el líquido en el reactor y la superficie exterior del serpentín, W.rn-2.oC-1; Dr: diámetro interior del tanque.

432

Los valores promedio del coeficiente'a"dependen del tipo de agitador y de la superficie de transferencia de calor:

tgiüador

Superflcle

Turbina Turbina

Camisa

PaIeLa P.aleta AncJa

Camisa' Serpent,f n Camisa Camisa Serpent ín

Hé1 Hé1

Coeficiente ,62 1,50 0, 35 0 ,87 0 ,46 0 ,54 0,83 0

Serpentfn

ice ice

a

Cuando los llquidos son muy viscosos se utiliza un agitador de tipo ancla, Uhl y Gray (1966):

ho'Dr

= K.R,o.P,o*

(ü)''"

t7.3sI

K : 1, o = 1l2para1.0 < Pe < 300; K = 0,36, a = 0,67 para 3O0< r9e