Intercambio ionico

Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Ingeniería Bioquímica

Profesora: Violeta Larios Serrato

Autor: Tinajero Vargas Sergio Aarón Coautoría: García Álvarez Víctor Fernando

Laboratorio de Métodos de Análisis

Práctica: Separación de una mezcla de aminoácidos por cromatografía de intercambio iónico.

Grupo: 4IV1

Sección 1

Fecha: 24/06/15

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INTRODUCCIÓN

La cromatografía de intercambio iónico es un método que permite la separación de moléculas basada en sus propiedades de carga eléctrica. Se compone de dos fases: la fase estacionaria o intercambiador iónico, y la fase móvil. La fase estacionaria insoluble lleva en la superficie cargas electrostáticas fijas, que retienen contra iones móviles que pueden intercambiarse por iones de la fase móvil, la cual suele ser una disolución acuosa con cantidades moderadas de metanol u otro disolvente orgánico miscible con agua que contiene especies iónicas generalmente en forma de buffer. Los iones de ésta compiten con los analitos por los sitios activos de la fase estacionaria. El principio básico de la cromatografía de intercambio iónico es que las moléculas cargadas se adhieren a los intercambiadores de forma reversible de modo que dichas moléculas pueden ser asociadas o disociadas cambiando el ambiente iónico. La separación mediante intercambiadores iónicos se realiza por lo general, en dos fases: en la primera las sustancias a separar se unen al intercambiador utilizando condiciones que originan una unión fuerte y estable; a continuación, se eluye de la columna con buffers de diferentes pH o diferente fuerza iónica, compitiendo los componentes del buffer con el material por los sitios de unión. Un intercambiador iónico es, por lo general, un polímero que tiene grupos cargados unidos. La mayoría de las proteínas son estables dentro de un margen de pH determinado (es decir, hay un margen en el que no se desnaturalizan), en el que están cargadas positiva o negativamente. Por lo tanto si una proteína es estable a valores de pH por encima del punto isoeléctrico, se debe utilizar un intercambiador anicónico. Si es estable a valores de pH situados por debajo del punto isoeléctrico, debe utilizarse un intercambiador catiónico. INTERCAMBIADOR CATIÓNICO: Los intercambiadores catiónicos son portadores de grupos con carga negativa que unen cationes de modo reversible. Un grupo típico que se utiliza en los intercambiadores de cationes es el grupo sulfónico, SO-3. Si se une un H+ al grupo, se dice que el intercambiador se encuentra en forma ácida y puede, por ejemplo, intercambiar un H+ por un Na+ o dos H+ por un Ca+2. El grupo ácido sulfónico es un intercambiador de cationes fuertemente ácido. Los poli aniones y poli cationes se unen a los intercambiadores de aniones y de cationes. Sin embargo, las proteínas y los poli electrolitos (polímeros poli iónicos) que son portadores de cargas positivas y negativas pueden unirse tanto a los cambiadores de cationes como a los de aniones, dependiendo de su carga neta. La afinidad con la que un poli electrolito concreto se une a un cambiador iónico determinado depende de las identidades y de las concentraciones de los demás iones presentes en la disolución, debido a la competencia entre los diversos iones por los sitios de unión sobre el intercambiador iónico. Las afinidades de unión de los poli electrolitos portadores de grupos ácidos-base dependen también, en gran medida, del PH ya que sus cargas netas varían con dicho valor.

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OBJETIVOS  Lograr la correcta separación de una mezcla de histidina y prolina mediante la técnica de cromatografía por intercambio iónico.  Realizar el perfil de elución para cada aminoácido tras su revelación con ninhidrina. RESULTADOS 1) ELABORACION DEL PERFIL DE ELUCIÓN

Los datos que a continuación se muestran fueron recopilados a partir de las lecturas de los eluatos recolectados del sistema cromatográfico y revelados con ninhidrina, el cual consto de los siguientes componentes: o o o o o o o

Soporte: columna de vidrio. Fase estacionaria: Amberlita Primer fase móvil: Regulador de citratos pH 5.25. Segunda fase móvil: Regulador de citratos pH 2.00. Mezcla: Histidina y Prolina Altura de empaquetamiento de la Amberlita: 38 cm Velocidad de elución: 40 gotas por minuto, altura constante de 45 cm. Tabla 1. Separación de prolina e histidina Volumen de Volumen de 𝑨𝟒𝟎𝟎 𝑨𝟓𝟕𝟎 𝑨𝟒𝟎𝟎 elución (mL) elución (mL) 3 0.137 63 0.241 6 0.059 66 0.392 9 0.029 69 0.493 12 0.025 72 15 0.289 75 18 1.931 78 21 1.981 81 24 1.982 84 27 1.990 87 30 1.968 90 33 1.969 93 36 1.912 96 39 1.688 99 42 1.455 102 45 1.135 105 48 0.869 108 51 0.711 111 54 0.429 114 57 0.482 117 60 0.516 120 -

𝑨𝟓𝟕𝟎 0.062 0.214 0.328 0.371 0.517 0.357 0.550 0.228 0.746 0.934 0.996 1.056 1.176 1.396 1.418 1.572 1.221 1.949 0.825 1.234

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Perfil de elución de prolina e histidina 2.5

Absorbancia

2 1.5 1 0.5 0

0

20

40

60

80

100

120

140

Vol. de elucion (mL) Prolina

Histidina

a) ¿Cuál de los aminoácidos eluye primero? Explique por qué. La Prolina, ya que al poseer una carga neutra no puede interaccionar con los iones fijos de la matriz del intercambiador a diferencia de la histidina que al ionizarse con cargas positivas al utilizar el regulador de citratos a pH de 5.2 genera interacciones con el ion COO− y queda adherido provisionalmente. Provocando que la prolina quede libre y pueda eluir por el sistema. b) ¿Cuál es la importancia de regular la velocidad de elución, qué pasa a altas y a bajas velocidades? La importancia de regular la velocidad de elución es con el fin de que exista una interacción efectiva para que se lleve a cabo la separación de los dos aminoácidos, no debe ser tan rápida debido a que no se daría tiempo suficiente para que las moléculas interaccionen con la resina. c) Empleando las fórmulas de los aminoácidos y del grupo funcional del intercambiador, haga un esquema de cómo se produjo la separación, considere el cambio de pH en el medio.

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DISCUSION DE RESULTADOS

El principio por el cual se separan los aminoácidos está completamente ligado con la carga que cada aminoácido tiene, el cual es conferido por sus grupos aminos, carboxilo y R, propios de cada uno. La interacción de cualquier componente que quiera separase con este tipo de resina deberá ser de forma catiónica, es decir, debe generar interacciones electrostáticas con el grupo COO− que esta fijo a la resina para poder desplazar al ion que se encuentre ligado en ese momento con la resina. La resina al encontrarse en su forma acida el ion que está ligado a esta es el ion hidrogeno. El primer paso para llevar a cabo esta cromatografía fue empacar la columna con regulador de citratos pH 5.25, el cual también contiene un ion sodio Na+ que es capaz de desplazar a él ion móvil H + por tanto en un momento antes de agregar la mezcla de aminoácidos el ion móvil queda remplazado estequiometricamente por iones Na+ . Al momento de agregar la solución problema constituida de una mezcla de Histidina y Prolina se hace eluir primeramente con el regulador de pH 5.25 lo que origina una ionización de los grupos amino y R del aminoácido Histidina proveyéndolo de una carga neta de +2, esta carga generada es la que posibilita la interacción con el ion fijo de la resina que se lleva a cabo de forma estequiometria, lo que quiere decir que se sustituyen dos iones sodio por uno molécula de histidina. Esta unión provisional posibilita por tanto la elusión con muy poca interferencia del aminoácido Prolina y por tanto es de esperarse de forma correcta y como se observó en el experimento que este aminoácido saliera primero del sistema cromatográfico, lo cual se muestra perfectamente en el perfil de elusión. El perfil de elusión muestra que en los volúmenes de elución de 18 – 33 mL leídos a una longitud de onda de 400nm, se obtuvo la mayor cantidad de Prolina. El siguiente paso para la separación de los aminoácidos fue liberar de su adherencia provisional a la Histidina, la cual fue realizada mediante el cambio del eluyente a un regulador de citratos de pH 2. El aumento en el pH provoca un aumento en la concentración de iones H + los cuales compiten intensamente con los grupos cargados de la histidina y debido a que estos están presenten en mucha mayor proporción logran desplazar a la histidina originando su total remoción del sistema cromatográfico. Es por tanto de esperarse que al realizarse las lecturas de absorbancia a una longitud de onda de 570nm se observase la recolección del segundo aminoácido; lo cual se observa perfectamente en el perfil de elusión construido en base a los eluatos recolectados. La mayor cantidad de Histidina obtenida se identificó en el volumen de elución de 114mL con un valor de absorbancia 1.949. Ha de mencionarse que posteriormente a la recolección total de las 40 muestras de elución se realizó una reacción con ninhidrina para lograr la coloración de los aminoácidos y poder ser leídos en la región visible. También gracias a esta coloración de los aminoácidos por la reacción del grupo amino libre con la ninhidrina pudo revelarse que efectivamente el primer aminoácido

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que salió de la columna fue la prolina, ya que este es el único aminoácido que al no contener un grupo amino libre en su estructura presenta una coloración amarilla-café con la ninhidrina, mientras que la histidina presento la coloración azul característica de la reacción antes mencionada. También es de gran importancia mencionar que las tendencias irregulares mostradas por los perfiles de elución de cada aminoácido son debidas principalmente a la evaporación de agua y etanol de los tubos al ser puestos en el baño maría para lograr la reacción con la ninhidrina. La evaporación en medidas no proporcionadas e incapaces de controlarse; ocasionan una diferencia en las concentraciones de aminoácidos contenidas en cada tubo y por tanto las diferentes tonalidades mostradas originando las irregularidades mostradas en las lecturas de absorbancia.

CONLUSIONES

SE logro la separación de los aminoácidos, donde el primer aminoácido en eluir como se esperaba fue la Prolina utilizando un regulador de citrato de sodio a pH 5.25 y el segundo aminoácido en eluir fue la Histidina en el regulador de pH 2. La coloración que presenta la prolina depende del grupo amino que al no estar libre no reacciona de forma estándar como los otros aminoácidos con la ninhidrina. La cromatografía por intercambio iónico es una técnica de separación eficaz para la separación de moléculas con capacidad de ionizarse por uso de reguladores a diferentes pH’s como fase móvil, esto basado en las interacciones que se generan con las cargas que presentan las moléculas y el ion fijo del intercambiador. El pH, la velocidad de elución y la altura de la fase estacionaria son algunos factores que influyen en la separación por cromatografía de intercambio iónico.

BIBLIOGRAFIA http://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografia Harris, Daniel C. “Análisis Químico Cuantitativo”, Lehninger, “Principios de bioquímica”, quinta edición.

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