Inmunologa 111016200450 Phpapp02

 

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Inmunología…cap6 PabLo Hernández Castillo Grupo 3-2

pate2

 

Radioinmunoensayo

3 1

S.A. Berson 1960 S.A. Berson y Rosalyn Rosalyn Yalow Yalow

2

1977 Premio Nobel

3

Unión Competitiva

4

Isotopo emisor de partículas gamma y beta

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La primera etapa para llevar a cabo un RIA es: 

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Determinar la cantidad de antígeno necesaria para unir de un 50 a 70 % la cantidad fija de un Ag*. Para determinar la cantidad de Ag marcado unida, el complejo Ag-Ab se precipita para separarlo del Ag libre…se mide la radiactividad y puede generarse una curva estándar. LOGO

 

Antisuero Antiisotipo secundario

Métodos Para Separar Ag

Proteína Proteí na A Staphylo Staphylococus cocus Areus RIA de fase solida Ab a cuentas de Sepharose Inmovilización de Ab (fosos)

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Ensayo de Inmunosorbente ligado a enzima

ELISA Indirecto

ELISA en Sándwich

ELISA (EIA)

ELISA Competitivo

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Quimioluminiscencia

Medicion ELISA

Sustrato Luxógeno

Limite de Detección aumenta

Luminol + H2O2

Ab-HRP + Ag

Ab-HRP-Ag

Luz

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Prueba ELISPOT Modificación de la prueba ELISA,

Placas se recubren con  Ag-captura AB-captura. El revelado Ulterior del ensayo por la adición de un sustrato Cromógeno o Luxógeno

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Prueba ELISPOT

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Western Blotting También se utiliza para detectar   Ab…prueba de confirmación VIH

Ab-Radiomarcado/Rayos X  Ab-ligado a enzima /sustratos

Identificación de una proteína en Una mezcla compleja.

Western Blotting

La mezcla se separa por  Medios Electroforéticos

Gel de SDS-policrilamida

Complejos pueden Visualizarse por varios Métodos. Membrana nitrocelulosa Bandas sumergidas en

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 Ab-mono,  Abmono, policlonales…  

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Inmunoprecipitación Permite el aislamiento Del Ag para análisis Mas amplios Extracto obtenido por rotura De células o de un tejido Se mezcla con Ab para Formar complejo  Ag-Ab Si la concentración de  Ag es baja el ensamblaje Puede requerir horas o días

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Evitar

limitaciones: Apoyo solido: cuenta sintética Anticuerpo especifico secundario 

Acoplamiento de cuentas magnéticas

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En conjunto con marcador biosintético con radioisótopo , permite detectar si una célula o tejido esta sintetizando un Ag particular. Radiomarcado radiomarcados de proteínas…a. a

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Complejo se limpia

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Contador de centelleo

  Análisis 

adicional con SDS, SDS, CALOR

Confirmar identidad de Ag marcado…

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Inmunofluorescencia

En 1944 Albert Coons Las moléculas absorben luz y emiten a dif. Long de onda Fluorocromo Fluoresceina,rodamina Fluorescei na,rodamina y Ficoeritrina

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Citometría de flujo y fluorescencia 

Las técnicas de Ab fluorescentes son instrumentos cualitativos extremadamente valiosos…

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Citóme Citó metro tro de Fl Fluj ujo o   Automatizar el análisis y separación separación de células  

Rayo laser y detector de luz Forma sencilla y mas complicadas

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Uso Clínico 

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¿Cuántas células expresan el antígeno blanco como un numero absoluto y también como porcentaje de células que pasan por el haz? Distribución de las células en la población de una muestra conforme a las densidades por la la intensidad de la fluorescencia Tamaño de las células

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Citometría puede analizar poblaciones celulares con dos o incluso tres anticuerpos fluorescentes

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Ocupa una posición fundamental en la inmunología, biología celular, y un recurso clínico indispensable…

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Alternativas de las reacciones de antígeno-anticuerpo Como defensa contra los anticuerpos de un hospedador las bacterias desarrollan la capacidad de elaborar proteínas que se unen a la región Fc de las moL. IgG: •Proteína A, de Staphylococcus aureus •Prote Proteína ína G estreptococ estreptococos os de los grupos grupos C y G La dede losun genes para las proteínas G y Cclonación generación hibrido, proteína recombinante, prot. A/G

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Microscopia Inmunoelectrónica 

Observar componentes tisulares intracelulares específicos.

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Un marcador electrodenso se conjuga con la porción Fc de un Ab, para tinción directa o con un reactivo antiinmunoglobulina antiinmunoglobulina..

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Marcadores como Ferritina y oro coloidal .

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Bibliografía Inmunolog Inmun ología ía de Kuby Kuby 6ta Edición Edición

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