INMUNOHISTOQUÍMICA
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DiAPOSITIVAS VI CICLO UNIVERSIDAD PRIVADA SAN PEDRO...
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INMUNOHISTOQUÍMICA
Introducción
Son
técnicas
de
inmunotinción
que
permiten
demostrar los antígenos presentes en las células o los tejidos utilizando anticuerpos marcados.
Esta se basa en la capacidad de los anticuerpos para unirse
específicamente
a
los
correspondientes
antígenos y la reacción se hace visible sólo si el anticuerpo está marcado con una sustancia que absorbe o emite luz o produce coloración. coloración.
En
la
actualidad
la
utilización
de
las
técnicas
inmunohistoquímicas va dirigida a: 1. Determinar la estirpe o diferenciación de una neoplasia 2. Determinar el pronóstico de la neoplasia 3. Diferenciar procesos neoplásicos benignos de malignos 4. Determinar la arquitectura molecular de un tejido 5. Detectar agentes infecciosos en las células o tejidos
Fundamento
El principio se basa en que el anticuerpo primario (negro) reconoce el antígeno celular buscado. Sobre éste se aplica un anticuerpo secundario (verde) que amplifica la señal y, finalmente,
una
sustancia
coloreable
(avidina,
estreptavidina, en rojo) que permite la visualización de la señal en el microscopio óptico.
Utilidad
Diagnóstico
y
clasificación
de
tumores
malignos
indiferenciados.
Identificación de agente infecciosos en tejidos (virus, bacterias, hongos, parásitos.)
Clasificación de leucemias y linfomas.
Determinación del origen de tumores metásticos.
Bases conceptuales
Inmunohistoquímica es toda técnica que permite detectar in situ antígenos por medio de anticuerpos específicos (de ahí “inmuno”), empleando
para
ello
sistemas
de
detección
enzimático (por eso “histoquímica”).
Tres factores son responsables del gran avance de la inmunohistoquímica:
1.
Disponibilidad de gran número de anticuerpos
2.
Desarrollo de técnicas de recuperación antigénica
3.
Aparición de sistemas de detección muy sensibles
Antígeno
En inmunohistóquica denominamos antígeno a la sustancia que queremos detectar en una sección tisular o frotis celular.
Un epítopo o determinante antigénico es la parte del antígeno que induce la respuesta inmune. La parte del anticuerpo que reconoce al antígeno se denomina paratopo.
Las moléculas de pequeño tamaño (menos de 10KDa) son incapaces de inducir una respuesta inmune y se denominan haptenos. Para adquirir carácter inmunogénico los haptenos requieren su acoplamiento a una proteína transportadora grande.
Esquema que representa en rojo la secuencia de un determinante Antigénico continuo (arriba) y de un discontinuo (abajo).
Tiroides marcado con un anticuerpo antiparathormona, que muestra tinción inespecífica del coloide tiroideo obtenida al emplear tiroglobulina como proteína transportadora (40x)
Anticuerpo
Los anticuerpos o inmunoglobulinas (Ig) son glicoproteínas en forma de Y sintetizadas por las células plasmáticas.
Las
Ig
están
constituidas
por
dos
pares
de
cadenas
polipeptídicas idénticas: un par de cadenas ligeras (k, λ) y un par de cadenas pesadas (α, γ, δ, ε, μ) que determinan la clase de Ig: IgA, IgG, IgD, IgE e IgM.
Moléculas de Ig formada por cadenas pesadas y cadenas ligeras unidas entre sí por puentes disulfuro.
Molécula de Ig en la que se especifican los extremos carboxilo-amino y amino-terminal.
Molécula de Ig digerida por papaína que da lugar a 3 fragmentos: un fragmento Fc (fragmento cristalizable) y dos Fab (Fragmentos antigen binding)
Molécula de Ig digerida por pepsina que da lugar a dos fragmentos: Fc y F(ab)´
Ag + Ac
AgAc
Complejo de la IgM formado por 5 moléculas de Ig unidas por su Fc a un anillo pentagonal central.
El anticuerpo primario se une por medio de sus fragmentos Fab al antígeno, siendo reconocido su fragmento Fc por un anticuerpo secundario.
La unión entre el paratopo de un anticuerpo y el epítopo de un antígeno se realiza por medio de enlaces no covalentes.
La unión es por tanto reversible, pudiendo disociarse durante los lavados. Se trata de una reacci ón de equilibrio expresada por:
Ag + Ac
AgAc
Tipos de anticuerpos: Policlonales y Monoclonales. Policlonales. se
obtienen
por
extracción
del
suero
de
un
animal
previamente inmunizado con el antígeno que se pretende estudiar.
Obtención de un anticuerpo policlonal. La inyección de una proteína extraña (Ag) con diferentes epitopos da lugar a la síntesis de Ig específicas para los mismos por parte de las células plasmáticas. El conjunto de esas Ig constituyen un anticuerpo policlonal.
Ventajas
Una gran avidez por el antígeno.
Anticuerpo policlonal con diversos epitopos son reconocidos por las correspondientes moléculas Ig.
Una alta sensibilidad .
Reconocimiento de epitopos de un antígeno por parte de un anticuerpo policlonal. Aunque uno de los epitopos (azul) se altere, el antígeno será rreconocido por las Ig dirigidas contra los epitopos preservados.
Desventajas
Puede dar origen a reacciones cruzadas con otras moléculas.
Extracción del suero del animal implica variaciones entre diferentes
lotes,
con
el
consiguiente
problema
de
reproductibilidad.
El
método
de
obtención
también
implica
disponibilidad del anticuerpo sea limitada.
que
la
Monoclonales Obtención de anticuerpos monoclonales mediante la técnica de los hibridomas. Tras inmunizar al animal, se fusionan células plasmáticas procedentes del bazo con células tumorales con el fin de obtener células híbridas que sinteticen Ig específicas y que sean inmortales.
Una vez aislada la célula hibridada se procederá al cultivo de la misma, comprobando la especificidad y afinidad del anticuerpo segregado por el epitopo correspondiente. Un anticuerpo idóneo para immunoblotting no siempre funcionará bien en inmunohistoquímica, y uno que funcione bien en cortes de congelación no tiene que necesariamente que hacerlo igual en cortes de parafina.
Ventajas
Especificidad, al reconocer el anticuerpo monoclonal un único epitopo.
Reproducibilidad,
ya
que
su
homogeneidad
intrínseca
impide que haya diferencias entre lotes.
Disponibilidad, puesto que la cantidad que puede obtenerse de un anticuerpo monoclonal es prácticamente ilimitada.
Reconocimiento de epitopos lineales.
Desventajas
Menor sensibilidad que los anticuerpos policlonales, ya que estos reconocen varios epitopos y los nonoclonales solo uno.
Posibilidad de obtención de falsos negativo, ya que si el epitopo reconocido se altera, podremos obtener un falso negativo.
Menor estabilidad al pH y concentraciones salinas que los anticuerpos policlonales.
Imposibilidad de eliminación de reactividad cruzada en caso de epitopos compartidos por dos o más antígenos. En los anticuerpos policlonales puede eliminarse mediante adsorción (cromatografía de afinidad).
Dilución
Suelen presentarse liofilizados (generalmente 100 ul o 1 ml).
pH próximo al fisiológico (7,0 – 7,2)
Contiene un preservante, generalmente azida sódica, que evita el crecimiento bacteriano.
Un detergente que facilita la penetración del anticuerpo y disminuye la reactividad inespecífica.
Como regla general se expresa en 1ug/ml
La dilución óptima de un anticuerpo será aquella que propor proporcione cione la máxima relación señal/fondo, es decir, decir, la máxima intensidad de tinción específica esp ecífica y la mínima tinción inespecífica.
Efecto prozona. Si concentramos excesivamente un anticuerpo podemos obtener una disminución de la señal o un resultado negativo, debido a que la acumulación de moléculas de Ig impide el acceso de las mismas a los antígenos.
Campana de Gaus la zona 1 se debe al empleo del anticuerpo demasiado diluido y la zona 2 se debe al empleo del anticuerpo demasiado concentrado (efecto prozona)
Incubación La reacción antígeno-anticuerpo también se verá influida por el tiempo y la temperatura de incubación.
En la técnica manual es de 1 hora.
Los inmunoteñidores automáticos es entre 10-30 min.
La
temperatura
empleada
suele
ser
la
temperatura
ambiente (20-25°C).
En casos de incubación larga debe realizarse en cámara húmeda.
Para acelerar la reacción (alcanzar el equilibrio más rápido) y/o aumentar la señal pueden incubarse los anticuerpos a 37°C.
Almacenamiento
Los anticuerpos mientras están liofilizados no plantean problema alguno de conservación.
Los anticuerpos en forma líquida pueden almacenarse a 4°C durante algunos meses o bien congelados (a -20°C o -80°C) durante años.
Los
anticuerpos
prediluidos
listos
para
usarse
se
almacenarse a 4°C.
En el caso de anticuerpos congelados, deben evitarse los procesos repetidos de congelación-descongelación del anticuerpo
Dividir el anticuerpo en alícuotas, de forma que se descongele una única alícuota de cada vez, la cual ya no se vuelve a congelar.
Mezclar el anticuerpo con glicerol a partes iguales. El glicerol es una sustancia inerte que disminuye el punto de congelación de forma que tendremos en anticuerpo frío (a -20°C), pero no congelado, con lo que podemos usarlo las veces que queramos sin necesidad de alicuetarlo y sin que se altere.
Marcadores inmunohistoquímicos MARCADORES DE CITOQUERIATINAS
ESTIRPE
EPITELIAL
-
Las citoqueratinas (CKs) constituyen el mayor grupo de filamentos intermedios y son proteínas filamentosas que, junto con otros filamentos, forman el citoesqueleto de las células eucariotas. Se clasifican numéricamente del 1 al 20 según su peso molecular (PM) y su punto isoeléctrico.
Se distinguen dos grandes grupos de CKs: a) CKs de epitelios simples (CK7, CK8, CK18, CK19, CK20); y b) CKs de epitelios más complejos, como el de la piel (CK5/6, CK10, CK14, CK15).
MARCADORES DE DIFERENCIACIÓN MESENQUIMAL VIMENTINA (V9)
–
La vimentina está presente prácticamente en todas las células embrionarias y células mesenquimales. En la piel se expresa en los melanocitos de la unión dermo-epidérmica, fibroblastos, dendrocitos, vasos sanguíneos y linfáticos, músculo liso de la dermis y los adipocitos de la hipodermis.
En oncología, la expresión de vimentina se ha demostrado en
todo
tipo
de
sarcomas,
melanomas,
carcinomas
fusocelulares y algunos no fusocelulares, mesoteliomas y gliomas.
Citoesqueleto de filamentos
Fibroblastos y células endoteliales
MARCADORES DE DIFERENCIACIÓN MUSCULAR DESMINA
–
La desmina es un filamento intermedio que se encuentra en las células de origen muscular, ya sea esquelético, cardíaco o liso, así como en fibroblastos submesoteliales se identifica tanto tumores benignos (leiomiomas, rabdomiomas) como malignos (leiomiosarcomas, rabdomiosarcomas).
MARCADORES DE DIFERENCIACIÓN NEUROENDOCRINA - LA ENOLASA O HIDRATASA.
La enolasa o hidratasa de fosfopiruvato es una enzima que cataliza
la
transformación
de
2-fosfo-D-piruvato
a
fosfoenolpiruvato. Se expresa principalmente en neuronas, células neuroendocrinas, células ganglionares del tracto gastrointestinal y fibras nerviosas. Es positiva en tumores gliales, neurales y neuroendocrinos (carcinoma microcítico de pulmón, tumor de Merkel, tumor de Wilms y tumor carcinoide)
PRESERVACIÓN Y PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS TIPOS DE MUESTRA Muestras citológicas
Cultivos celulares.
Frotis o extensiones.
Cytospins
Citología monocapa en medio líquido
Bloques celulares
Muestras histológicas
Estudio de órganos o tejidos tras:
Congelación
Inclusión en parafina
Corte mediante vibratomo
FIJACIÓN
Consiste en la estabilización de las proteínas tisulares mediante la penetración, a través de la fase acuosa de las células, de ciertos productos químicos llamados fijadores.
Su objetivo es detener su metabolismo celular, inactivar las enzimas
lisosómicas
y
eliminar
los
microorganismos,
conservando la morfología celular lo más parecida posible al estado vivo.
Temperatura,
pH
Duración
Tiempo transcurrido desde la extracción del tejido
Tamaño de la muestra
Fijadores reticulantes o aditivos.
Se trata de fijadores muy penetrantes que actúan por formación
de
puentes
metilo
(CH=CH)
entre
los
aminoácidos. La formación de puentes se ve favorecida a pH fisiológico.
Es necesario emplear una cantidad de fijador abundante ya que se va incorporando progresivamente al tejido.
Se recomienda emplear un volumen de fijador de al menos 4 veces mayor que el volumen de la muestra.
Hay fijadores reticulantes como por ejemplo: Formaldehído o aldehído fórmico y Paraformaldehído
Ventajas de los fijadores reticulantes
Buena preservación de la morfología.
Penetración rápida (24 – 48h)
Buenos estabilizantes de proteínas.
Esterilizan las muestras.
Económicos.
Inconvenientes de los fijadores reticulantes
El formol representa un riesgo para la salud ya que es tóxico y carcinógeno. Puede producir irritación de ojos, nariz, garganta y piel, bronquitis, alteraciones neurológicas, e incluso cáncer de faringe, cavidad nasal y senos.
Alteración del paraformaldehído tras su dilución, ya que no contiene estabilizantes.
Fijadores precipitantes o coagulantes Inducen la precipitación o coagulación de las proteínas.
Etanol (CH3CH2OH)
Se emplea frecuentemente para citologías y cultivos celulares.
Metanol (CH3OH)
Permiten una fijación molecularmente respetuosa.
Ventajas de los fijadores precipitantes
Buena preservación de la antigenicidad.
Estabilidad.
Penetración rápida.
No requieren el empleo de recuperación antigénica.
Carecen de los efectos tóxicos del formol.
Inconvenientes de los fijadores precipitantes.
Fijadores mediocres en cuanto a la preservación morfológica (retracción celular). Provocan un endurecimiento de las muestras (dificultad al
Mezclas fijadoras.
Con el empleo de las mezclas se tratan de aunar las ventajas de diferentes fijadores, compensando los puntos débiles de cada uno.
B5 (formaldehído, cloruro de mercurio y acetato sódico) y el Zenker son útiles para la fijación de órganos linfoides y hematopoyéticos por la excelente morfología que se obtiene.
Paraformaldehido-glutaraldehído, pequeñas cantidades a otros fijadores mejoran la preservación tisular. Se emplea en inmunocitoquímica ultraestructural.
Carnoy, fija bién los núcleos.
Metacarn, consigue una menor retracción de los tejidos.
Protocolos de fijación Muestras citológicas
En etanol de 96° durante un tiempo de 20 minutos a temperatura ambiente.
Muestras histológicas
La fijación ideal para IHQ será el que logre el mejor balance entre una buena morfología y una buena antigenicidad. La fijación histológica se lleva a cabo en formol al 10% (formaldehído al 4%) durante 24 horas.
El formaldehído en forma de metilenglicol penetra en el tejido aproximadamente 1mm/h.
En muestras pequeñas un mínimo de 6 h es suficiente.
A fin de estandarizar el procesamiento, se recomienda fijar todo tipo de muestras durante 24 horas.
Si
acortamos
la
fijación,
se
acaba
provocando
una
postfijación.
Debe evitarse también la sobrefijación de las muestras no sobrepasando las 48 h, ya que de lo contrario se reducirá la antigenicidad al enmascarar los epitopos.
Linfoma en ganglio linfático. A) Con CD20 se tiñe bien la periferia, pero no la zona central debido a una fijación inadecuada (4x). B) Con MIBI, sin embargo, se observa tinción exclusiva de la zona central menos fijada (4x).
CONGELACIÓN
El frio provoca una detención de todos los procesos biológicos y un endurecimiento de la pieza, la dureza en un parámetro importante para la obtención de cortes. Una congelación homogénea constituye uno de los mejores medios de preservación de la morfología celular.
Agentes criogénicos
Nitrógeno líquido (-196°C)
Isopentano
enfriado en nitrógeno líquido (-160°C) o en
baño isotérmico (-50°C).
Protocolos de congelación
En
general
las
muestras
se
congelarán
sumergiéndolas
en
isopentano a -50°C o a -160°C durante 1 minuto. Para la mayoría de las muestras es suficiente la congelación a -50°C.
Una congelación directa en nitrógeno líquido conlleva la formación de cristales de hielo con importante alteración de la morfología de las fibras musculares.
Almacenamiento de las muestras
Las muestras congeladas son almacenadas hasta su utilización a una temperatura de:
-196°C (nitrógeno líquido)
-20°C o 80°C (congelador)
Sección
Las muestras se cortan a 5 micras en un criostato y las secciones se
recogen
en
portaobjetos
tratados
con
poli-L-lisina
o
aminopropiltrietoxisilano.
Las cargas electrostáticas positivas resultantes en el portaobjeto interactúan con las cargas negativas de las proteínas atrayéndolas.
El pretratamiento de los portaobjetos asegura la adherencia del corte,
evitando
su
desprendimiento
y
rotura
durante
su
recuperación antigénica y la incubación en los diferentes pasos de la técnica de inmunohistoquímica.
Almacenamiento de los cortes
Los cortes pueden almacenarse congelados a -20°C o -80°C hasta el momento de realizar la técnica de inmunohistoquímica.
PROCESAMIENTO EN PARAFINA Inclusión
La inclusión en parafina tiene por objetivo transformar el material biológico semilíquido en otro sólido, homogéneo y duro, de esta forma es posible la realización de cortes finos preservando la muestra.
Deshidratación
Para conseguir una buena inclusión es necesaria una deshidratación perfecta de las piezas y la eliminación de todo resto de alcohol. La deshidratación se realiza mediante baños de alcohol a concentraciones crecientes (el alcohol es miscible en agua y la sustituye).
Aclaramiento
Se emplea un disolvente del medio de inclusión que a su vez se mezcle con el alcohol. La parafina no es miscible con el alcohol por lo que este debe ser reemplazado por un líquido intermediario tal como el xilol o sustitutivos.
Inclusión
El medio de inclusión más comúnmente utilizado es la parafina.
Sección
Los bloques de parafina se cortan a 4 micras y las secciones se recogen en portaobjetos tratados. Al recogerse las secciones en el baño termostático deben eliminarse todos los pliegues, que podrían ocasionar artefactos de tinción.
Las secciones se secan a 60°C durante una hora o a 45°C durante toda la noche.
Los pliegues impiden la realización de lavados adecuados, con retención de cromógeno en los mismos (4x)
Desparafinado
Las preparaciones se desparafinan con xilol o sustitutivos (se recomienda realizar 2 pasos de 5 min cada uno)
Hidratación
La hidratación se lleva a cabo con etanol de concentración decreciente (Realizamos pasos de 3 min en etanol de 100°, 96° y 70°).
Almacenamiento de los cortes
Si la técnica no va a realizarse inmediatamente se omiten los dos pasos
anteriores,
aunque
debe
tenerse
en
cuenta
que
el
almacenamiento de los cortes de parafina produce pérdida de antigenicidad por inestabilidad de los epitopos.
La pérdida de antigenicidad se produce por fotooxidación y desecación de los tejidos.
Amígdala teñida con K167/MIB-1.A) Tras almacenamiento del corte de parafina durante un mes a 20°C antes de la realización de la técnica se observa una intensa inmunotinción (20x) B) En un corte seriado mantenido a temperatura ambiente durante el mismo tiempo, la intensidad es claramente menor (20x)
SECCIÓN MEDIANTE VIBRATOMO Ventajas
No precisa deshidratación ni inclusión en parafina.
No es necesario desparafinar ni rehidratar las secciones antes de la reacción inmunohistoquímica.
No se emplea altas temperaturas ni tratamientos químicos agresivos que puedan producir pérdida de antigenicidad.
Menor número de artefactos.
Inconvenientes
Las secciones son delicadas y su manejo es más difícil.
Las secciones son más gruesas que las secciones de parafina lo que puede dificultar la penetración de los anticuerpos.
La adhesión de las secciones a los portaobjetos son laboriosas y se dificultadas por su elevado grosor.
RECUPERACIÓN ANTIGÉNICA
La
fijación
mediante
agentes
reticulantes
como
el
formaldehído de enlaces de hidroximetileno, puede hacer que los epitopos queden enmascarados, es decir, que sean inaccesibles a los anticuerpos.
Esquema en el que se observa que el epitopo (circulo verde) de la proteína (rojo) queda enmascarado por una red de enlaces (azul), impidiendo el acceso del anticuerpo.
Tras recuperación antigénica los enlaces se rompen y el epitopo queda accesible al anticuerpo
RECUPERACIÓN ENZIMÁTICA La digestión enzimática induce una rotura de enlaces cruzados que facilita el acceso del anticuerpo primario al antígeno. Los parámetros a tener en cuenta en la digestión enzimática son:
Tipo de enzima, en donde esta está relacionada con el tipo de epitopo a desenmascarar.
Concentración de la enzima, va a depender de la enzima que se emplee.
Temperatura, la temperatura suele ser a 37°C, pero con algunas otras enzimas pueden trabajarse a temperatura ambiente.
Tiempo de incubación, de 5 a 30min.
El problema más grave de esta técnica es la sobredigestión del tejido, ya que provoca una gran alteración morfológica.
RECUPERACIÓN TÉRMICA
La recuperación térmica actuaría mediante la rotura de enlaces
cruzados
intramoleculares
e
intermoleculares
producidos por la fijación con formol. La fijación con formol induce la formación de puentes metilo o enlaces cruzados entre el epitopo y proteínas próximas, produciéndose una interferencia esférica.
MÉTODOS DE DETECCIÓN
La localización antígeno-anticuerpo a nivel tisular exige la unión de anticuerpos a marcadores que permitan su detección. Estos marcadores pueden ser fluorescentes o enzimáticos.
La
técnica
de
visualización microscopio
inmunofluorescencia
directa de
del
permite
fluorocromo
fluorescencia,
mientras
en que
la un la
inmunohistoquímica exige el revelado de la enzima antes
de
su
convencional.
visualización
mediante
microscopía
MÉTODOS DE CONJUGACIÓN Método de conjugado directo
En este método el marcador va conjugado directamente al anticuerpo primario.
Los inconvenientes de este método son: •
•
Necesidad de conjugación de la enzima a cada anticuerpo primario, lo que resulta complejo y costoso. El anticuerpo primario debe ser empleado a una alta concentración.
Método conjugado indirecto
En este caso el marcador va conjugado a un anticuerpo secundario
Las ventajas de este método son las siguientes: •
•
Simplificación de la conjugación, ya que solo hay conjugar un anticuerpo (el secundario). Versatilidad, ya que el anticuerpo conjugado puede emplearse para detectar múltiples anticuerpos primarios
MÉTODO DEL PUENTE
El anticuerpo primario y el anticuerpo anti-peroxidasa quedan unidos por un anticuerpo puente que reconoce el fragmento Fc de ambos anticuerpos.
Las ventajas de este método son:
Eliminación del proceso de conjugación con la enzima, ya que esta se acopla por unión inmunológica. Incremento de la sensibilidad.
MÉTODO DEL COMPLEJO PEROXIDASA ANTIPEROXIDASA (PAP)
Se diferencia del método puente en que la 3° capa consiste en un complejo formado por anticuerpos anti-peroxidasa que se une a 3 moléculas de peroxidasa.
Ventajas: •
•
•
•
Tamaño pequeño, que no crea problemas para la unión de los anticuerpos. Fácil de obtener en forma purificada. Enzima estable. Amplio rango de cromógenos utilizables.
MÉTODO DE LA FOSFATASA ALCALINA ANTIFOSFATASA ALCALINA (APAAP) Este método es similar al método del puente, pero en este caso la peroxidasa es sustituido por la fosfatasa alcalina
Consta de un anticuerpo primario (verde), un anticuerpo secundario de unión (rojo) y un anticuerpo anti-fosfatasa alcalina (azul) que se une a 2 moléculas de enzima (rosa, FA)
METODO DEL COMPLEJO AVIDINA-BIOTINA (ABC) la unión entre avidina y biotina se realizada mediante enlaces covalentes y representa una de las uniones químicas más frecuentes que se conocen.
Unión avidina-biotina. La avidina (azul) tiene 4 puntos de unión a la biotina (naranja)
Biotina conjugada. La biotina se une al anticuerpo por medio de un brazo, que facilita la unión de múltiples moléculas de biotina. Por otra parte, la biotina puede conjugarse con enzimas o fluorocromos.
El método ABC consiste en tres etapas: 1. Anticuerpo primario. 2. Anticuerpo secundario biotinado. 3. Complejo avidina-biotina-enzima.
Método ABC. En este método el anticuerpo primario (verde) es reconocido por un anticuerpo secundario (rojo) que lleva acoplada moléculas de biotina (naranja). En esta tercera etapa se une al complejo ABC constituido por una molécula de avidina (azul) a la que se acoplan moléculas de biotina marcadas con peroxidasa (marrón, P).
MÉTODOS DE POLÍMEROS
Este método se basa en el uso polímeros a los que se unen moléculas de anticuerpos y enzimas, de esta forma se evita el
empleo
de
la
biotina,
manteniéndose,
o
incluso
aumentando, la sensibilidad de la técnica.
Método EPOS
Este método consta de única etapa. Al antígeno se une un complejo constituido por el anticuerpo primario (verde), un polímero (azul) que sirve de andamiaje y la peroxidasa (marrón).
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