Inmovilizacion de Enzimas

 

Inmovilización de enzimas

 

Inmovilización de enzimas 

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Se entiende por enzima inmovilizada (EI) aquella física/químicamente asociada a, o contenida en, un soporte/matriz no esencial para su actividad. La inmovilización permite la utilización de las enzimas en procesos continuos, lo que permite aumentar su productividad, ó bien para facilitar la separación del catalizador de sus productos, simplificando la etapa posterior de purificación.

 

Inmovilización de enzimas

 

Inmovilización de enzimas 

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La utilización de enzimas inmovilizadas o no dependerá de una evaluación económica de las alternativas, donde se considerarán datos de cinética y estabilidad, costo, propiedades fisicoquímicas, eficiencia de inmovilización y carga del soporte. Se torna evidente que si el costo de una enzima es muy bajo, la factibilidad de su utilización en forma inmovilizada es poco probable.

 

Inmovilización de enzimas

 

Ejemplos de enzimas inmovilizadas

 

Soportes Un soporte para inmovilización debe tener las siguientes propiedades:  Elevada resistencia mecánica, química y biológica  Insolubilidad  Hidrofilicidad  Elevada razón área/volumen  Regenerabilidad Bajo costo Por regla, no todas estas propiedades están simultáneamente presentes en un determinado soporte: necesario evaluar todas las alternativas.

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Soportes Los soportes orgánicos presentan:  Buena relación área/volumen  Muy flexibles en su configuración  Bajo costo en algunos casos (residuos orgánicos) Los soportes inorgánicos a su vez presentan:  Mayor resistencia  Mayor regenerabilidad  Propiedades físicas (ej. porosidad) controlables

 

Sistemas de inmovilización 

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Las enzimas normalmente se inmovilizan a través de algún tipo de interacción entre sus residuos aminoacídicos y el soporte. Esto puede deproducir perdidas considerables actividad, al comprometer los aminoácidos en el, o vecinos del, sitio activo. Para minimizar este problema se inmoviliza por intermedio de las moléculas de carbohidratos (enzimas glicoproteicas) o por la utilización de espaciadores.

 

Sistemas de inmovilización 

Los métodos de inmovilización se pueden dividir en:

 

Sistemas de inmovilización - Adsorción 

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Este un método simple de inmovilización, en el que el soporte es mezclado con las enzimas, en condiciones apropiadas de pH y fuerza iónica, dejados en contacto por un determinado periodo y después lavado para remover la proteína no adsorbida. Este método permite valores elevados de carga enzimática (hasta 1 gramo de enzima por gramo de soporte). Las interacciones implicadas son resultantes de fuerzas de van der Waals, efectos hidrofóbicos y de carga iónica

 

Sistemas de inmovilización - Adsorción 

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La selección del soporte pasa por su capacidad de retener la enzima, sin dejar desorber nuevamente al seno del liquido, actividad enzimática obtenida, posibilidad de regeneración y costo. Como ejemplos de soporte tenemos materias orgánicas neutras (carbón activo y celulosa) y cargadas (quitina, intercambiadores aniónicos y catiónicos), además de materia inorgánica (bentonita, alúmina, vidrio y sílica porosa).

 

Sistemas de inmovilización - Adsorción 

Ejemplo: preparación de invertasa inmovilizada Soporte DEAE-Sephadex (intercambiador (intercambia dor aniónico)

CM-Sephadex (intercambiador catiónico)

pH 2.5

0

100

pH 4.7

100

75

pH 7.0

100

34

 

Sistemas de inmovilización  – Enlace Covalente 

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La unión covalente se produce entre grupos funcionales del soporte y determinados grupos en los residuos aminoacídicos de la molécula enzimática. Estos grupos son reactivos según la siguiente orden: -S- > -SH > -O- > -NH2 > -COO- > -OH >> -NH3+

La reacciones químicas que se pueden utilizar incluyen la acilación, la alquilación, la diazotación, la disulfuración y la activación a través de sales de metales de transición.

 

Sistemas de inmovilización  – Enlace Covalente 

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Ejemplo de químicos son la carbodiimida y el glutaraldeído. Este ultimo es ampliamente utilizado para, además de inmovilizar enzimas aentre soportes, hacer el entrecruzamiento las enzimas ó mezcladas con otras proteínas inertes, hasta se producir agregados insolubles de tamaño considerable.

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Se puede combinar la adsorción con la formación de enlaces covalente, con lo que se obtiene un aumento sustancial de la estabilidad del catalizador.

 

Sistemas de inmovilización  – Enlace Covalente 

Como ejemplo tenemos la inmovilización de invertasa en quitina de camarón:

 

Sistemas de inmovilización  – Inclusión en matrices 

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En este método, la enzima es contenida entre las cadenas de una red polimérica, lo suficientemente compacta para retener la enzima, pero capaz de permitir el libre flujo de reactantes. Esto tiene la implicación que solo es útil este tipo de inmovilización cuando se pretende procesar sustratos y productos de muy bajo peso molecular.

 

Sistemas de inmovilización  – Inclusión en matrices 

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Este método es más adecuado para inmovilizar células, donde el alginato de calcio es ampliamente utilizado. Otros ejemplos de matrices son los geles de poliacrilamida y el almidón. Estos presentan las desventajas de: ser no regenerables, una baja estabilidad, tener pobres propiedades mecánicas y severas restricciones difusionales.

 

Sistemas de inmovilización  – Retención por membranas 

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En este tipo de sistemas la enzimas permanece libre el solución, separada del medio de reacción por una membrana protectora que solo permite el libre paso de los reactantes (sustrato/producto). Como ejemplo, tenemos las membranas de ultrafiltración y diálisis. Otro método consiste en la microencapsulación, en la cual se produce una reacción de polimerización en la superficie de las gotas de solución enzimática, dispersas en un solvente inmiscibles con agua, que produce una delgada película (nylon), casi sin restricciones difusionales.

 

Principales características de los métodos de inmovilización: Características

Adsorción

Enlace covalente

Inclusión en matrices

Retención por Membranas

Preparación

Simples

dificil

dificil

Simples

Costo

bajo

elevado

moderado

elevado

Fuerza de ligación

variable

fuerte

flaca

fuerte

Liberación de enzima

si

no

si

no

Aplicabilidad

amplia

selectiva

amplia

Muy amplia

Problemas en la utilización

elevados

bajos

elevados

elevados

Efectos de la matriz

si

si

si

no

Restricciones difucionales

no

no

si

si

Protección microbiana

no

no

si

si

 

Parámetros de inmovilización 

Hay dos parámetros a considerar en la inmovilización: el rendimiento de inmovilización y la capacidad de carga del



soporte. El rendimiento de inmovilización (RI) es dada por:



Algunos autores usan:

 

Parámetros de inmovilización 

Ejemplo del rendimiento inmovilización (%) glucoamilasa:

de de

 

Parámetros de inmovilización 



La capacidad de carga (CC) del soporte se define como la actividad cargada expresada en el catalizador (EI) por unidad de peso seco del soporte (W), lo que viene dada por:

Ambos los parámetros, EI y CC, están frecuentemente en compromiso, es decir, para aumentar la CC se tiene que sacrificar el EI y viceversa.