inhibición por fosfatasa ácida

PRACTICA Nº 11 INHIBICIÓN DE FOSFATASA ÁCIDA POR PRODUCTO

INTRODUCCIÓN

Para el entendimiento del mecanismo de acción de fosfatasa ácida, es necesario saber cual de los dos productos sale primero de la reacción, si el para nitro fenol o el fosfato. Para este fin, utilizaremos a ambos productos de la reacción como inhibidores, entendiéndose que el que se comporte como inhibidor competitivo (por la misma forma enzimática, con el paranitro fenil fosfato), es el último compuesto en dejar la reacción; en tanto que el inhibidor no competitivo será el primero en salir. Para el desarrollo de este experimento es necesario determinar primero la Velocidad máxima en las condiciones experimentales en que trabajamos; asimismo, confirmaremos el valor de K M determinado en la práctica práctica 4. Luego en las mismas condiciones experimentales, agregaremos los inhibidores. OBJETIVOS: 1.- Determinar Vmax y K M de fosfatasa ácida 2.- Determinar el tipo de inhibición por producto del paranitrofenol 3.- Determinar el tipo de inhibición por producto del fosfato 4.- Hacer la representación de Cleland del mecanismo de fosfatasa ácida. PARTE EXPERIMENTAL: EXPERIMENTO 1:  Determinación de la K  M  de  de fosfatasa ácida: Procedimiento: Rotular diez tubos de ensayo y adicionar de acuerdo al siguiente esquema: B1

1

Buffer acetato 0,1M pH 5

1,0

1,0

1,0

1,0

 p-nitro fenil fosfato 0,01M

0,1

0,1

-

 p-nitro fenil fosfato 0,001M

-

-

0,9

0,8

H2 O

B2

2

B3

3

B4

4

B5

5

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

-

-

-

-

-

-

-

0,4

0,4

0,2

0,2

0,1

0,1 0,05 0,05

0,6

0,5

0,8

0,7

0,9

0,8

0,95 0,85

 ENZIMOLOGÍA

Preincubar los 10 tubos a 37ºC por lo menos 5 minutos (también la enzima) Adicionar a los tubos 1, 2, 3, 4 y 5, 0,1ml de la muestra enzimática, utilizando intervalos de tiempo. Incube en el mismo baño todos los tubos por exactamente 1 minuto. Cumplidos los tiempos, adicione 1ml de OHNa 0,1N para detener la reacción Leer en el espectrofotómetro las absorbancias, a una longitud de onda de 405nm (regular el cero de cada muestra a leer en el espectrofotómetro, con su blanco correspondiente) RESULTADOS Coloque en la siguiente tabla sus resultados y haga las gráficas que considere mas convenientes (en papel milimetrado), para la determinación de la K M y Vmax (por lo menos haga las gráficas de Michaelis Menten y Lineweaver-Burk) Título____________________________________________________________ TUBO Absorbancia  Neta

1

2

3

4

5

[para nitrofenil fosfato (mM) Absorbancia con  paranitrofenol 24μM

Absorbancia con fosfato 24 μM

Título_________________________________________________________________

 ENZIMOLOGÍA

Título_________________________________________________________________   __ EXPERIMENTO Nº 2  Determinación del tipo de inhibición del para nitro fenol sobre fosfatasa ácida: PROCEDIMIENTO.Rotular y preparar diez tubos de ensayo de acuerdo al siguiente esquema: B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 Buffer acetato 0,1M pH 5 1,0 1,0 1,0 1,0  p-nitro fenil fosfato 0,01M 0,1 0,1  p-nitro fenil fosfato 0,001M - 0,4 0,4  p-nitro fenol (*) 0,2 0,2 0,2 0,2 H2 O 0,7 0,6 0,4 0,3

1,0 0,2 0,2 0,6

B5

5

1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 0,2 0,1 0,1 0,05 0,05 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,5 0,7 0,6 0,75 0,65

(*): La concentración del producto debe ser tal, para que la concentración final en cada tubo sea de 2,4 x 10 -5 M o 24 μM Preicubar por 5 minutos como mínimo a 37ºC (también la muestra de enzima) Adicionar a los tubos 1, 2, 3, 4 y 5 la muestra enzimática en un volumen de 0,1ml Tomar el tiempo e incubar ahora por exactamente 1 minuto en el mismo baño, los diez tubos. Detener la reacción adicionando OHNa 0,1N al cumplir exactamente el tiempo de incubación Leer las absorbancias en el espectrofotómetro

 ENZIMOLOGÍA

RESULTADOS Exprese sus resultados en la fila correspondiente de la tabla anterior y grafíquelos en las mismas gráficas del experimento anterior Determine el tipo de inhibición, explique

EXPERIMENTO Nº 3. Determinación del tipo de inhibición del fosfato sobre fosfatasa ácida.PROCEDIMIENTO: Proceda exactamente como en el experimento 2, solamente reemplace el para nitro fenol  por fosfato monobásico de la misma concentración calculada. RESULTADOS: Coloque sus resultados también en la tabla anterior y grafíquelos en las mismas anteriores gráficas Determine el tipo de inhibición. Haga la representación de Cleland de la reacción ¿A qué producto corresponden las letras “P” y “Q”?

 ENZIMOLOGÍA

PRÁCTICA Nº 12 INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

INTRODUCCIÓN

La inmovilización de enzimas es un proceso que localiza a una enzima en una región definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que retienen su actividad y que aumentan su vida media. Una de las grandes ventajas del proceso es la posibilidad de diseñar un reactor enzimático de fácil manejo y control, adaptado a la aplicación de la enzima inmovilizada. Los métodos de inmovilización se clasifican en dos categorías: Retención física y Unión química. En el primero se localiza a la enzima en las cavidades interiores de una matriz sólida y porosa o en microcápsulas, esto permite el paso del sustrato y del producto, mas no de la enzima por su alto peso molecular. En el segundo se une a la enzima a una matriz orgánica o inorgánica, ya sea a través de interacciones eléctricas o por medio de enlaces covalentes. OBJETIVO:

1.- Desarrollar un método de inmovilización enzimática en el laboratorio 2.- Evaluar el comportamiento de una enzima inmovilizada PARTE EXPERIMENTAL

En la presente práctica inmovilizaremos a la enzima alfa amilasa en el interior de una  bolsa de diálisis, en ella colocaremos también el sustrato de la enzima, el cual por su alto peso molecular no saldrá de la bolsa a menos que haya sido hidrolizado por la enzima. La bolsa de diálisis será colocada y fijada en el interior de un recipiente que contiene agua destilada. Evaluaremos el transcurso de la reacción a través de la determinación de azúcar reductor (maltosa y maltotriosa principálmente), con el método de Benedict, fuera de la  bolsa, en distintos tiempos (cada 3 minutos, incluyendo el resultado a tiempo cero). Asimismo, seguiremos la reacción a través de la evaluación del almidón utilizando el método del yodo (Lugol), dentro de la bolsa, a distintos tiempos (cada 30 segundos, incluyendo el resultado a tiempo cero). PROCEDIMIENTO:

Colocar en el interior de una bolsa de diálisis 10 ml de almidón soluble al 1%

Amarrar la parte superior de la bolsa con un trozo de sorbete, para poder colocar y sacar muestras del interior de la bolsa.  ENZIMOLOGÍA

Sujetar la bolsa con hilo a una varilla de vidrio e introducirla en el interior de un beaker de 50 ml conteniendo agua destilada, hasta cubrir el nivel del líquido dentro de la bolsa, tal como lo indica el esquema:

Colocar el recipiente en un agitador magnético y lleve la temperatura del mismo a 37ºC Agregarle 1ml de una muestra de alfa amilasa* utilizando una pipeta Pasteur de punta larga y con chupón. Mantener el recipiente en agitación con un agitador magnético, mientras dure el experimento. Retirar alícuotas de 0,5 ml, tanto del interior de la bolsa como fuera de ella, para hacer determinaciones de Yodo y Benedict respectivamente (para sacar las muestras, use la  pipeta Pasteur de punta larga, a la cual previamente se le ha marcado el nivel de 0,5 ml aproximadamente con plumón marcador). Haga las determinaciones de yodo con la muestra del interior de la bolsa a tiempo cero y cada 30 segundos, hasta que la reacción se haga negativa. Haga determinaciones de Benedict con muestras del exterior de la bolsa a tiempo cero y cada tres minutos, hasta alcanzar como resultado un precipitado rojo ladrillo. * Obtención de la muestra de amilasa: Se elegirá a un estudiante que no esté resfriado: Enjuagarse la boca con agua potable y luego ingerir aproximadamente 20 ml de agua destilada y retenerla en la boca por un tiempo de entre 2 a 3 minutos. Vaciarla luego en un beaker de 50ml. Si no se usa inmediatamente, mantenga la muestra en baño de hielo. DETERMINACIÓN DE BENEDICT: Procedimiento: En diferentes tubos de ensayo colocar 2 ml de reactivo de Bénedict y agregar 0,5 ml de la muestra a evaluar.

Colocar en baño hirviente por 5 minutos y observar el cambio de color  ENZIMOLOGÍA

DETERMINACIÓN DE YODO: Procedimiento: En diferentes tubos de ensayo colocar una gota de lugol y agregar 0,5 ml de la muestra a evaluar. Observar el cambio de color (se puede agregar 1 ml de agua destilada adicionalmente a cada tubo para apreciar mejor el color) RESULTADOS

Para presentar sus resultados diseñe una tabla y gráficas, que nos permitan observar el transcurso de la reacción; explique el por qué de esos colores obtenidos. INTERROGANTES

1.- ¿A qué tipo de inmovilización corresponde el experimento?

2.- Presente sus resultados en una tabla