UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA-UNAD INFORME DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA AMBIENTAL PRESENTADO POR:
CODIGO
GRUPO COLABORATIVO
NOMBRE DEL TUTOR VIRTUAL
CORREO DEL TUTOR VIRTUAL
NOMBRE DEL DIRECTOR DEL CURSO
1098623437
358010_45
Diana García Vargas
[email protected]
Diana García Vargas
María Teresa Pinto Gómez 1102714097
358010_36
Diana García Vargas
[email protected]
NOMBRE
Karol Ibeth Meza Acosta Claudia Garzón Gamba
Diana García Vargas
Liliana
[email protected] Orlando Hernández Arenas
358010_18
Diana García
CAROLINA JAIME Vargas PRESENTADO A:
Ing. María Fernanda Domínguez Amorocho FECHA DE REALIZACION DE LA PRÁCTICA: 12 y 27 de Abril del 2014 ENTREGA DE INFORME:
BUCARAMANGA
NFORME LABORATORIO 1 Y 2 - COMPONENTE PRÁCTICO
1. OBJETIVOS 1.1 OBJETIVO GENERAL Identificar diferentes especies de microorganismos como hongos y bacterias mediante toma de muestras en laboratorio de agua de charco y evaluación microbiológica en alimentos. Realizando procedimientos de siembra, coloración, tinción e identificación macroscópica y microscópica de estos. 1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Identificar diferentes especies de microorganismos mediante métodos microbiana. Realizar métodos de tinción mediante coloración simple y compuesta. Clasificación de hongos mediante la observación microscópica. Identificar medios de cultivo diferencial y selectivo. Controlar el crecimiento bacteriano de Gram- positivo y Gram -negativos. Identificar mediante el método microscópico cianobacterias. Identificar unidades formadoras de colonias. Establecer normas y principios básicos de comportamiento en el laboratorio.
de siembra
2. MARCO TEORICO BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO Los laboratorios de microbiología están regidos por normas de seguridad e higiene que deben cumplirse a cabalidad para garantizar la protección contra infecciones de los estudiantes u otro personal que labora en estas instalaciones, así como garantizar la calidad de las técnicas y la confiabilidad de los resultados. METODOS DE SIEMBRA Siembra en Estría Compuesta: Con éste procedimiento se puede conseguir una buena separación de las colonias y aislarlas fácilmente. Pará ello Se flamea el asa redonda, se toma la muestra del material a estudiar (agua residual), se coge parte de la muestra para colocarla en el tubo de ensayo que contiene el agua peptonada Homogenizar, luego se Colca el inoculo en uno de los extremos de la caja de Petri con el medio de cultivo indicado. Extienda el cultivo
haciendo 4 estrías paralelas, sin romper el agar y Terminado la siembra, marcar las cajas en el borde de la base de la caja y envolverla en papel vinipel para llevarlas a incubar a 37 °C. TÉCNICAS DE TINCIÓN
La tinción es una técnica en la que se utilizan diferentes colorantes, que son captados por las estructuras de las muestras biológicas que se observan al microscopio, siendo cada estructura a fin a un tipo determinado de colorante, por lo que se pigmentan de diferente color y se pueden diferenciar e identificar. Tinción simple: Un solo colorante. Se basan en el hecho de que las células tienen una composición química diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un colorante. Tinción de Gram: Fue desarrollada empíricamente por Christian Gram en 1884, a pesar del tiempo transcurrido la tinción apenas se ha modificado y es unos de los primeros pasos que se realiza para cualquier identificación bacteriana. Ayuda a determinar rápidamente las características morfológicas, por lo que es útil en la indicación de los antibióticos. Esta tinción también permite establecer si el material enviado al laboratorio para su cultivo posee la calidad adecuada. Es la tinción usada más comúnmente en los laboratorios de microbiología. Constituyen el criterio básico para separar los grandes grupos de bacterias (Gram positivas y Gram negativas), Ahora se sabe que la discrepancia en las propiedades de tinción de estos dos grupos refleja una diferencia fundamental en la naturaleza química de sus paredes celulares y en la naturaleza de estas. Después de la fijación de la muestra en un portaobjetos de cristal (por calentamiento o tratamiento con alcohol), esta se expone a cristal violeta y después se agrega Lugol para formar un complejo con el pigmento principal. Durante la decoloración con alcohol o acetona, las bacterias Gram positivas teniendo una gruesa capa de peptidoglicano es capaz de retener el complejo, mientras que los microorganismos gramnegativos teniendo una capa delgada de peptidoglicano lo pierden; se añade saponina como contra colorante, que es retenido por los microorganismos gramnegativos (de ahí su color rosado).
MEDIOS DE CULTIVO Un medio de cultivo es un material alimenticio que se usa en el laboratorio para el desarrollo de los microorganismos. Una vez que ha sido preparado, un medio de cultivo puede ser inoculado (es decir, se le añaden organismos) y a continuación incubado en condiciones que favorezcan el crecimiento microbiano. El crecimiento de los microorganismos es el cultivo.Un cultivo axénico o puro contiene un único tipo de microorganismos. Los medios de cultivo deben contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y deben estar exentos de cualquier microorganismo contaminante. Los medios de cultivo contienen como mínimo: carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de o tras. El agar es el principal agente solidificante utilizado en medios bacteriológicos. Se disuelve completamente a 100°C y se solidifica al enfriarse a 40°C. De acuerdo a su consistencia, los medios de cultivo pueden clasificarse en: Líquidos: Se utilizan para el crecimiento de cultivos puros en lote. Se denominan caldos de cultivo y no tienen agar en su formulación. Semisólidos: Contienen 0.5% de agar en su formulación. Se utilizan para estudiar la movilidad de las bacterias (presencia o ausencia de flagelo). Sólidos: Contienen de 1.5 a 2% de agar en su formulación. Estos mediosinmovilizan a las células, permitiéndoles crecer y formar masas aisladas visibles llamadas colonias. Las colonias permiten al microbiólogo reconocer la pureza del cultivo; las placas que contengan más de un tipo de colonia no provienen de un cultivo puro. Las placas de agar también se utilizan para la determinación de células viables (recuento en placas). De acuerdo a su composición, los medios de cultivo pueden clasificarse en:
Definidos: es aquél medio de cultivo del cual se conoce su composición exacta. Son muy utilizados en estudios fisiológicos. Los medios mínimos son medios definidos que únicamente le proporcionan al microorganismo los nutrientes necesarios para crecer, pe ro no para desarrollarse óptimamente. Complejos: es aquél del cual no se conoce la composición exacta del medio. A menudo, los medios complejos emplean sangre, leche, extracto de levaduras, extracto de carne u otras sustancias muy nutritivas pero de las cuales se desconoce la composición química exacta. Estos medios son muy utilizados para cultivar bacterias desconocidas o bacterias de requerimientos nutricionales muy complejos. De acuerdo a su función, los medios de cultivo se clasifican como: Medios Selectivos: Son aquéllos que poseen uno o más componentes añadidos, los cuales inhibirán o prevendrán el crecimiento de ciertos tipos de especies de bacterias y/o promoverán el crecimiento de las especies deseadas. Uno puede ajustar las condiciones físicas de un medio de cultivo tales como el pH, la temperatura, para hacerlo selectivo para los organismos de interés. Medios Diferenciales: Permiten al investigador distinguir entre diferentes tipos de bacterias con base en alguna característica observable en su patrón de crecimiento en el medio, ya sea por producción de algún pigmento o por cambios de color en el medio debido a indicadores de pH, o por halos de degradación de algún componente en el medio de cultivo. Medios de Enriquecimiento: Contienen algún componente que permite el crecimiento de cierto tipo específico de bacteria, pero no contienen sustancias inhibidoras. Medios Enriquecidos: Se emplean para cultivar microorganismos que requieren un gran número de factores de crecimiento. Generalmente contienen extractos biológicos poco usuales como sangre, suero en polvo, extracto de cerebro de res, yema de huevo, etc.El procedimiento se hace mediante una siembra de la muestra en caja de Petri por medio del método ecométrico y determinar el índice de crecimiento absoluto (ICA). CONTROL DEL CRECIMIENTO BACTERIANO Los factores físicos y químicos tienen un efecto notable sobre la vida de los microorganismos en su medio ambiente natural. Algunos estimulan su desarrollo en tanto que otros lo retardan o lo impiden. El conocimiento del efecto de esos parámetros medio ambientales no solo permitió estudiar los microorganismos bajo condiciones controladas de laboratorio para favorecer su crecimiento sino que posibilitó aprender la forma de controlarlos. El crecimiento bacteriano es la división de una bacteria en dos células hijas en un proceso llamado fisión binaria. Previniendo que no se produzca ningún caso de mutación las células hijas resultantes serán genéticamente idénticas a la célula original. De este modo tiene lugar la "duplicación local" de la población bacteriana. Las dos células hijas creadas tras la división no
sobreviven necesariamente. Sin embargo, si el número de supervivientes supera la unidad, en promedio, la población bacteriana experimenta un crecimiento exponencial. La medición de una curva del crecimiento exponencial de las bacterias en un cultivo ha sido tradicionalmente una parte de la formación de todos los microbiólogos. Los procesos fundamentales empleados para ello son la enumeración bacteriana (conteo bacteriano) por métodos directos e individuales (microscopía, citometría de flujo1), por métodos directos y masivos (biomasa), por métodos indirectos e individuales (conteo de colonias), o por métodos indirectos y en bloque (número más probable, turbidez, absorción de nutrientes). Los modelos permiten conciliar la teoría con las mediciones.
OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE CIANOBACTERIAS Cyanobacteria: Es el nombre de un filo del reino Bacteria (único del dominio del mismo nombre) que comprende a las cianobacterias y, en algún sentido, a sus descendientes por endosimbiosis, los plastos. Las cianobacterias se caracterizan por ser los únicos procariotas que llevan a cabo fotosíntesis oxigénica, por ello también se les denomina oxyphotobacteria.El procedimiento se hace Colocando en el centro de la lámina portaobjeto una gota del agua que trajo como muestra y colocar luego una laminilla encima de esta preparación y esperar 2 minutos. Finalizado este tiempo montar al microscopio y observar en 10X, 40X y 100X con el fin de ver las características de la bacteria mejor.
RECUENTO DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (UFC) Microorganismo aerobio mesófilo son todas las bacterias, levaduras y hongos capaces dedesarrollarse en condiciones de aerobiosis a 30°C. Es un parámetro que sirve para estimar laflora total, pero sin especificar tipos de microorganismos. Es uno de los indicadores más útilesdel estado microbiológico de un alimento, agua, suelo entre otros. Tiene un valor limitadocomo indicador de la presencia de patógenos o sus toxinas. Altos recuentos microbianos seconsideran poco aconsejables para la mayor parte de los alimentos.
PRUEBAS DE ANTAGONISMO La composición de la micro flora y de la micro fauna de un ecosistema está regulada por las interacciones de los microorganismos de una comunidad entre sí y de los mismos con el medio no biótico de lo cual surge un equilibrio dinámico. Si dos o más especies que coexisten en un lugar no se afectan mutuamente la relación es neutralismo. Cuando algo de esto se modifica, las especies comienzan a interactuar y las relaciones que se presentan pueden ser: comensalismo, protocooperación, simbiosis, amensalismo, predación, parasitismo. La evaluación de estas relaciones in vitro permiten aislar y seleccionar microorganismos con capacidad de Biocontroladores. En las pruebas de antagonismo se trabaja con la técnica por enfriamiento, el Método de Igarashi y técnica de estrías. En la técnica por enfriamiento se toma la caja de Petri con el medio de cultivo nutritivo y se divide en la parte trasera por la mitad con un marcador de vidrio y se señala la mitad de cada una de las mitades previamente divididas. Se marca cual microorganismo va a inocular en cada lado y finalmente por punción sembrar los microorganismos. Incubar a 37ºC si uso bacterias o a 25ºC si uso hongos. En método de Igarashi Se toma una caja de Petri y se divide en 4/4 y sembrar por siembra masiva con un asa redonda, en un espacio de tres (3) centímetros un microorganismo seleccionado y finalmente siembre en el centro por punción. La técnica por estrías su proceso se hace en caja de Petri en la cual previamente usted sembró con una estría en el centro una bacteria, sembrar a 0.5 cm, por medio de estrías, cuatro bacterias a evaluar. En el revés de la caja con marcador de vidrio señale que microorganismos sembró. Incubar a 37ºC. 3. METODOLOGÍA 3.1 INSTRUMENTOS Asa redonda Cajas de Petri Mechero Incubadora Vinipel Marcador de vidrio Portaobjetos Cubreobjetos Tubos de ensayo Asa redonda o curva
Asa recta Pipetas estériles de 1 y 2 ml Estufa Vaso de Precipitado de 500 ml Contador de colonias Microscopio 3.2 REACTIVOS Muestra contaminada con microorganismos Agua peptonada al 0,1% estéril Agar nutritivo Agua destilada estéril Azul de metileno Cristal violeta Lugol Alcohol cetona Fucsina básica o safranina Azul de lactofenol Cultivo de Hongos 2. Agar Baird Parker (selectivo para estafilococos) Medio de cultivo nutritivo en cajas de Petri Caldo nutritivo Agua con cianobacterias
4. PROCEDIMIENTO PRACTICAS LABORATORIO 4.1 PROCEDIMIENTO PRACTICA No 1: METODO DE SIEMBRA
1. Desinfectar el área de trabajo, prender el mechero y preparar el material de trabajo. El material previamente esta esterilizado. 2. Colocar 1ml de la muestra de Agua sucia y colocarla con el asa redondo en el tubo de ensayo que contiene aproximadamente 35ml de agua peptonada. Esta mezcla se tapa y agita por un periodo de tiempo de 15 minutos para que se homogenice.
3. Colocar la muestra en la incubadora por un periodo de tiempo de 20 – 30 minutos.
4. Realizar un diagrama de aislamiento de colonias, en un círculo de papel, aproximadamente de 8 cm, esto se hace como guía para distribuir correctamente la muestra dentro de la Caja Petri. Este se coloca debajo de la caja de Petri cuando se está sembrando. 5. Finalizado el tiempo de incubación, se procede a realizar la siembra. Se toma el asa redonda y se esterilizarla, colocándola sobre el mechero hasta quela punta muerte un color rojo, se deja enfriar cerca al mechero agitándolo y se procede a tomar la muestra del tubo de ensayo. 6. Abrir el tubo de ensayo con la muestra, e introducir el asa, esta tomara residuos líquidos que se adhieren. 7. Cerrar el tubo y colocarlo en la gradilla. Teniendo cuidado de que el asa no toque nada y deno pasarla por encima del mechero, pero siempre estar cerca de este.
8. Abrir la caja de Petri y seguir el esquema para el aislamiento dibujado en el papel, siguiendo todas las precauciones y seguridad necesaria para que la muestra no se contamine.
9. Terminado la siembra, marcar la Caja Petri en el borde de la base. 10. Colocar el tubo y la caja a incubar a una temperatura de 37°C. La Caja Petri debe estar boca abajo siempre.
11. Desinfectar el área de trabajo, apagar el mechero y entregar el material.
Por cuestiones relacionadas con el clima, cuando regresamos al laboratorio para continuar con las practicas, los cultivos no crecieron, por tal motivo la tutora de practica consiguió un Ecoli el cual fue sembrado por Estrías y unos hongos tricoderma (ambiental) para poder continuar con el desarrollo de la actividad. PROCEDIMIENTO PRACTICA No 2: TÉCNICAS DE TINCIÓN (Coloración Simple)
1. En una lámina portaobjetos limpia, colocar una gota de agua estéril, se esteriliza el agar hasta que quede rojo, se toma una muestra de EMB (Ecoli) se extiende a un área no superior a dos centímetros cuadrados.
2. Dejar que la preparación se seque al aire. Una vez seca la muestra, se fija con calor sobre el mechero aproximadamente se pasan tres veces.
3. Dejar enfriar la lámina. Lo anterior se conoce como la realización de un frotis y se hace para coloraciones donde la muestra debe ser fijada y luego si iniciar las coloraciones respectivas.
4. Colocar la preparación sobre una rejilla encima del vertedero. 5. Cubrir la suspensión con los siguientes colorantes, en los siguientes tiempos establecidos, así: Cristal violeta: 1 minuto Azul de Metileno: 5 minutos Fucsina: 1 minuto Una vez aplicada cada uno de los anteriores colorantes de debe lavar con agua teniendo cuidado en no destruir la muestra.
6. Terminado el tiempo de coloración según el colorante empleado, eliminar el colorante lavando con agua suavemente.
7. Dejar secar y colocar la preparación en la platina del microscopio y observar.
PROCEDIMIENTO PRACTICA No 2: TÉCNICAS DE TINCIÓN (Coloración Compuesta)
1. En una lámina portaobjetos limpia, colocar una gota del cultivo bacteriano con ayuda del asa redonda estéril realizar un frotis de la muestra seleccionada.
2. Dejar que la preparación se seque al aire. Una vez seca la muestra, se fija con calor sobre el mechero aproximadamente se pasan tres veces. Dejar enfriar la lámina.
3. Colocar en la rejilla para coloración y cubrir el frotis con cristal violeta esperando que transcurra 1 minuto. Lavar con agua el colorante. 4. El segundo colorante es el lugol, el cual se deja por 1 minuto sobre el frotis. 5. Realizar la decoloración con la mezcla alcoholacetona, por 25 segundos. Lavar inmediatamente con agua.
6. Finalmente adicionar el colorante de contraste, fucsina o safranina, por 30 segundos. Lavar con agua.
7. Escurrir el exceso de agua, dejar secar y montar al microscopio para hacer las observaciones respectivas.
PROCEDIMIENTO PRACTICA No 2: COLORACIÓN ESPECIAL (Tinta China)
1. En una lámina portaobjetos limpia, colocar una gota de agua estéril, se le adiciona una gota de tinta china.
2. Con el agar estéril se toma una muestra de Ecoli y se mezcla.
3. Se le coloca una lamina, montar al microscopio para hacer las observaciones respectivas.
4.2 PROCEDIMIENTO PRACTICA No 3: OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE HONGOS
1. Colocar en el centro de la lámina portaobjeto una gota de azul de lactofenol.
2. Luego tomar con el agar previamente estéril parte del hongo y resuspenderlo en la gota del colorante.
3. Colocar luego un cubreobjetos o laminilla encima de esta preparación que está en el portaobjetos y esperar 3 minutos.
4. Finalizado ese tiempo montar al microscopio y observar.
4.3 PROCEDIMIENTO PRACTICA CIANOBACTERIAS
No
7:
OBSERVACIÓN
MICROSCÓPICA
1. Colocar en el centro de la lámina portaobjeto una gota del agua sucia que sirve como muestra.
2. Colocar luego el cubre objetos encima de esta preparación y esperar 2 minutos.
DE
3. Finalizado este tiempo montar al microscopio y observar en 10X, 40X y 100X.
5. RESULTADOS PRACTICAS LABORATORIO 5.1 RESULTADO PRACTICA No 1:METODOS DE SIEMBRA Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Es decir, es un soporte que proporciona sustancias nutritivas que permitan el desarrollo y reproducción de microorganismos. La diversidad metabólica de los microorganismos es enorme, por ello, la variedad de medios de cultivo también lo es, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos. Las condiciones que reúne un medio de cultivo artificial para que los microorganismos crezcan son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad El medio de cultivo empelado en esta práctica es: Medios Selectivos: favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en particular, con la diferencia de ser sólidos, diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos. Durante la práctica se empleó la técnicas de siembra por estría, para la elaboración de esta técnica de siembra se usó agar nutritivo que estaba dentro de una caja Petri previamente esterilizada; este tipo de siembra se utiliza para un aislamiento primario. Los medios sólidos en placas Petri, ocupan una superficie lo suficientemente grande como para poder visualizar perfectamente las colonias microbianas. El sistema en placa es uno de los medios que permite mejor el aislamiento de microorganismos que puedan crecer en él. Por cuestiones relacionadas con el clima, cuando regresamos al laboratorio para continuar con las practicas, los cultivos no crecieron, por tal motivo la tutora de practica consiguió un Ecoli el cual fue sembrado por Estrías y unos hongos tricoderma (ambiental) para poder continuar con el desarrollo de la actividad.
5.2 RESULTADO PRACTICA No 2: TÉCNICAS DE TINCIÓN(Coloración Simple) LECTURA AGRUPACIONES BACTERIANAS Bacteria:
Bacilos
Color:
Morado
Tamaño:
1,3 mm de diámetro por 3 a 5 mm de largo.
Cilíndrica – Bacilar, cadenas cortas. Estreptobacilos, agrupaciones de bacilos a modo Agrupación bacilar: de cadena. En esta práctica se realizó tinción simple, donde se utilizan unos colorantes, con el objeto de permitir la observación de lamorfología bacteriana. Se aplicó la coloración para endosporas bacterianas, para determinar tipo de pared y la morfología de las células bacterianas, así como el tipo de agregación, mediante observación microscópica. En la caracterización microscópica, se identificó la especie bacilos de 1,3 mm de diámetro por 3 a 5 mm de largo con bordes redondeados aproximadamente, que forman cadenas cortas. Se observan esporas cilíndricas subterminales.
Forma:
RESULTADO PRACTICA No 2: TÉCNICAS DE TINCIÓN(Coloración Compuesta) LECTURA AGRUPACIONES BACTERIANAS Bacteria:
Bacilos Gram Positivo
Color:
Morado
Tamaño:
1 a 1,3 mm de diámetro por 3 a 10 mm de largo.
Cilíndrica – Bacilar, cadenas largas. Estreptobacilos, agrupaciones de bacilos a modo Agrupación bacilar: de cadena. En esta práctica se realizó tinción compuesta, donde se utilizan varios colorantes, con el objeto de permitir la observación de lamorfología bacteriana. Se aplicó la coloración de Gram, para determinar tipo de pared y la morfología de Forma:
las células bacterianas, así como el tipo de agregación, mediante observación microscópica. En la caracterización microscópica, se identificó la especie bacilos Gram positivos, de 1 a 1,3 mm de diámetro por 3 a 10 mm de largo, con bordes cuadrados o cóncavos.
RESULTADO PRACTICA No 2: COLORACIÓN ESPECIAL (Tinta China) Falta………….
5.3 RESULTADO PRACTICA No 3: OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE HONGOS
OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE HONGOS Hongo: Estructura observada: Color:
Tricoderma Redondeados u ovales, se observa la formación de hifas. Verde suave
5.4 RESULTADO PRACTICA No 7:OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE CIANOBACTERIAS
Microscópio 10X,
Microscópio 40X.
Microscópio 100X.
6. CONCLUSIONES
Los medios químicamente definidos se preparan añadiendo al agua destilada cantidades precisas de compuestos orgánicos o inorgánicos altamente purificados. Los diferentes medios y técnicas de cultivo son esenciales en el laboratorio de microbiología pues sirven para identificar las bacterias causantes de las enfermedades infecciosas y los antibióticos a los que son sensibles esas bacterias. FALTA……………..
7. BIBLIOGRAFÍA
NORMAS DE LA AMERICAN PSYCHOLOGICAL ASSOCIATION (APA) PARA LA CONFECCIÓN DE REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: Biblioteca Central Luis Demetrio Tinoco, http://www.cibem.org/paginas/img/apa6.pdf. Universidad Nacional Abierta y a Distancia, Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente, Guía de Laboratorio, Microbiología Ambiental,http://datateca.unad.edu.co/contenidos/358010/358010A_MICROBIOLOGIA_PRACT ICAS_2014.pdf.
