Informe Pcr

Amplificación de un fragmento del gen 16S rADN mediante la técnica de PCR

RESUMEN En los diferentes laboratorios de la década de los 80, un nuevo estándar para la identificación bacteriana comenzó a desarrollarse, demostrando que las relaciones filogenéticas entre los organismos procariotas se pueden determinar por medio de la comparación de una parte estable del código genético. La parte del ADN más utilizada para propósitos taxonómicos en bacterias es el gen rADN 16S, el cual contiene regiones altamente conservadas que permiten establecer la relación taxonómica entre familias, clases y filos, además posee regiones variables que permiten diferenciar una especie dentro del mismo género. En el presente trabajo se amplificó una región del gen rADN 16s mediante la técnica de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa), se prepararon tres tratamientos, dos controles positivos, 1 y 2 (CP1 y CP2), con una muestra de ADN y un control negativo (CN) sin ADN. En el proceso de PCR se emplearon 30 ciclos y posteriormente realizó una corrida electroforética con gel de agarosa al 1%, el mismo que no mostró la amplificación de los fragmentos.

INTRODUCCIÓN Para la amplificación de segmentos específicos de ADN en una secuencia de ADN

se aplican diferentes técnicas, entre las más usadas tenemos:

PCR (Polymerase Chain Reaction)

Es un método in vitro de síntesis de ADN con el que un segmento específico de ADN es amplificado (Rodríguez etal.; 2004). Este método, según Rodríguez etal.; (2004) consta de 25 a 35 ciclos repetitivos, cada ciclo se conforma de tres pasos: -

-

-

Denaturación de las cadenas molde: Se rompen los puentes de hidrógeno del ADN, incubándolo a una temperatura alrededor de 95ºC, por un minuto o menos. Este paso expone las bases nitrogenadas del ADN blanco. Alineación de primers: Se hibridan las cadenas desnaturalizadas del ADN blanco con los cebadores o primers, a una temperatura que ayuda el apareamiento de bases nitrogenadas complementarias de ambas clases de ADN (ADN blanco y Primer). Esta temperatura depende de la temperatura de fusión de los primers, la cual oscila entre los 50 y 60 ºC. Elongación: Se efectúa a 72ºC, temperatura a la cual la polimerasa extiende la longitud de los primers, añadiendo los nucleótidos según la complementariedad de la cadena molde.

-

LAMP (Loop-mediated  Amplification)

Isothermal

La amplificación isotérmica (60-65 ºC) consiste en convertir, en forma cíclica, material genético plasmoidal de doble hebra y a partir de ella, realizar la transcripción a ARN, el cual sirve de templado para un nuevo ciclo de amplificación (Kievits etal., 1991). Según Rojas (2009), en la técnica LAMP la secuencia de ADN molde se amplifica siguiendo estos parámetros:

-

Temperatura constante (60-65ºC) Acción de dos o tres primers Una polimerasa diferente de la Taq polimerasa que se usa en PCR

Aquí se usa la Bst polimerasa, que además de la actividad de polimerización de los nucleótidos, tiene la capacidad de abrir las cadenas dobles de ADN sin la necesidad de calentamiento. La reacción se la puede detectar por la reacción de Luciferinaluciferasa (Rojas, 2009). Se diseñan cuatro primers (FIP, F3, BIP y B3) que reconocen 6 distintas regiones en el gen de interés. Los productos de amplificación tienen una estructura que consiste en repeticiones invertidas y alternadas de la secuencia a amplificar en la misma cadena (Puray, S/A).

LCR (Ligase Chain Reaction) Según Chávez etal.; (2006), la LCR es una técnica que sirve para detectar y amplificar secuencias diana de ADN, donde primero se sintetizan dos oligonucleótidos que sean complementarios a la secuencia diana completa, uno por el extremo 5’ y el otro por el 3’. Si la secuencia diana se encuentra en la muestra de ADN que se está examinando, los oligonucleótidos se fijan a ella reuniendo sus extremos en el centro y, mediante una ligasa termoestable, se unen para formar un polinucleótido completo. El ligamiento no se producirá si la muestra no contiene la secuencia diana o si el empalme entre la secuencia diana y los oligonucleótidos es imperfecto (Chávez etal.; 2006). Sometido a una temperatura elevada, el nuevo polinucleótido se disocia del molde de ADN original; después de bajar la

temperatura, éste y el ADN original servirán de moldes para un segundo ciclo de hibridación, ligamiento y disociación térmica. En cada ciclo se duplica el número de nuevos polinucleótidos completos (Chávez etal.; 2006).

10-100 pmol/Rx 200400µM (mix)

100 pmol/µL

20pmol /Rx

0.2

20mM (mix)

200µM

0.5

MgCl2

1.5-3.5mM

25mM

1.5mM

3

DDW

---

---

---

26.5

 Adyuvante (glycerol)

2.5-7.5 %

60% (en agua)

5%

4.2

Primer R dNTPs

El objetivo de la práctica es amplificar el fragmento 16s de 1000 - 1500 pb de eubacterias mediante PRC.

TOTAL

50

Condiciones termociclador

MATERIALES Y MÉTODOS Preparación de controles Para realizar la amplificación del fragmento entre 1000 y 1500 pb del gen 16s rADN, se preparó una solución “master mix”  por triplicado de las concentraciones detalladas en la tabla N° 1 sin considerar el ADN. Con un volumen final de 135µL de la misma, se tomó 90µL para los controles positivos CP1 y CP2 adicionando 10µL de ADN, así se obtuvo dos controles de 50µL cada uno y 45 µL de master mix para el control negativo, al cual se le adicionó 5µL de DDW.

Tabla N°1: Cálculos para la preparación de los tratamientos Reactivo

Conc. Recomen.

Conc. Stock

Conc. Final

Volumen (µL)

 ADN

10050ng/Rx

15ng

75ng/Rx

5

 ADN polimerasa

1-5 u/Rx

5 u/µL

2u/Rx

0.4

5x – 10x 10-100 pmol/Rx

5x 100 pmol/µL

1x 20pmol /Rx

10

Buffer Primer F

0.2

Para realizar la PCR convencional bifásica se consideraron las condiciones detalladas en la tabla N° 2, en base a un programa previamente estandarizado en el laboratorio:

Tabla N°2: Condiciones termociclador

Etapa Denaturación inicial Denaturación HibridaciónExtensión Extensión final Mantenimiento

Número Temperatura Tiempo de (°C) (min) Ciclos 96

4:00

96

0:30

66

1:30

72 4

2:00 10:00

Electroforesis en geles de agarosa Con la finalidad de comprobar el peso molecular del fragmento amplificado se realizó una electroforesis horizontal con gel de agarosa al 1% a 100V, 300mA durante 1 hora.

RESULTADOS

1 30 1 1

En la Imagen 1  se puede apreciar que no se obtuvo resultado alguno en la amplificación del gen 16S ribosomal (rADN16S) tanto en el CP1 como en el CP2.

MgCl2, que pueden reducir la eficiencia de amplificación o generar productos inespecíficos; también la desnaturalización del ADN polimerasa, inhibirá la síntesis de los fragmentos de ADN. Tomando en cuenta estas consideraciones y al observar que no se produjo resultado alguno en ambos controles positivos, se presume una serie de factores que afectaron la amplificación del gen, como son: haber tenido daños por factores mecánicos gracias a una manipulación excesiva de la muestra, la susceptibilidad del DNA para ser desnaturalizado por rupturas de la cadena, así como también la desnaturalización del DNA polimerasa, en el momento que se homogenizó el master mix en la mini centrifuga, inhibiéndose la polimerización del gen 16s y por ende, una ineficiencia en la amplificación del gen.

Imagen 1.  Electroforesis horizontal en gel de agarosa, de la amplificación del gen 16S ribosomal (16s rADN) en el CP1 Y CP2 que se muestra sin resultado alguno, mientas que el CN se encuentra ausente de ADN. El marcador utilizado fue AXYGEN 1kb leader

DISCUSIÓN Dorado (2009), menciona que existen muchos factores que pueden afectar a la eficiencia de la técnica de PCR, entre los cuales se considera: la contaminación del ADN que se va amplificar, la cual puede inhibir el ADN polimerasa; asimismo concentraciones demasiado altas o bajas de

Se puede descartar contaminación por parte de la muestra que contenía el gen 16S ribosomal, y de los reactivos utilizados, ya que no se amplificó ninguna banda correspondiente al negativo (CN); por lo que se presume haber tenido un daño mecánico de la muestra por el exceso de manipulación.

CONCLUSIÓN No se pudo visualizar ninguna banda resultante de la electroforesis en ambos controles positivos (CP1 y CP2), ya que no se obtuvo la amplificación gen 16S ribosomal, presumiblemente por daños mecánicos en la manipulación de la muestra.

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