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ELABORACIÓN DEL PATRÓN DE MCFARLAND Y MEDICIÓN DE CONCENTRACIÓN BACTERIANA POR TURBIDIMETRÍA Gutiérrez Paula Andrea, Londoño Maria Alejandra, Merchán Angie Maryuri, Neifi Geritza Parra Jaimes Fundación Universitaria de San Gil Unisangil Yopal-Casanare 2016

INFORME N°4 DE MICROBIOLOGÍA. I.

OBJETIVO

Establecer la cantidad de microorganismos de una muestra mediante el método turbidimétrico. II.

En cuanto a los resultados de Abs experimental, se puede apreciar que fueron los esperados en cuanto a que el espectrofotómetro arrojó valores en orden ascendente, lo que significa que, hubo precisión en la medida de los mL correspondientes a cada tubo de cada disolución.

CONCEPTOS

EL PATRÓN DE MCFARLAND El patrón de McFarland es una escala de turbidez elaborada con una mezcla, utiliza un serie de disoluciones de Cloruro de Bario (BaCl 2) y Ácido Sulfúrico (H2SO4) que reaccionan generando un precipitado de Sulfato de Bario (BaSO 4) que produce turbidez. La cual equivale a una concentración determinada de bacterias en suspensión, las equivalencias entre la turbidez de las soluciones de BaCl2/ H2SO4 y la turbidez de los microorganismos en suspensión son indicadas en la conocida escala de McFarland.

III.

RESULTADOS Y ANÁLISIS

Tabla Número 1: se indican los volúmenes en mililitros (mL) de BaCl2 y H2SO4 que se agrega a cada tuvo, las equivalentes unidades formadoras de colonia (U.F.C), la absorbancia teórica y la absorbancia experimental. ABS ABS Teórico Experimental 1,0 1 0,1 9,9 3,00E+08 0,096 2,0 2 0,2 9,8 6,00E+08 0,255 3,0 3 0,3 9,7 9,00E+08 0,313 4,0 4 0,4 9,6 1,20E+09 0,53 5,0 5 0,5 9,5 1,50E+09 0,56 6,0 6 0,6 9,4 1,80E+09 0,612 7,0 7 0,7 9,3 2,10E+09 0,794 8,0 8 0,8 9,2 2,40E+09 0,799 9,0 9 0,9 9,1 2,70E+09 0,955 10,0 10 1 9 3,00E+09 0,966 Tabla N°1. Resultados experimentales de Abs y datos teóricos de Abs.

TUBO

Cl2Ba 1%

H2SO4 1%

U.F.C/ml

Grafica N°1. Curva patrón experimental de Abs teóricas frente a las UFC respectivas.

En la gráfica número 1, donde está representada la curva patrón experimental de valores de absorbancia frente a U.F.C/mL, se ha utilizado una tendencia lineal, lo que significa que cuando aumenta una variable, la otra también lo hace con una proporción constante. La curva patrón sirve para medir la concentración de una sustancia problema a través de la comparación de una serie de elementos con concentración y volumen conocido. La curva de tendencia describe una aproximación con relación a los cambios de las variables, con esa tendencia es posible obtener una función que muestra la relación de las variables. Se observa la línea de tendencia central donde se acercan los valores de la curva, con un coeficiente de determinación (coeficiente de correlación de Pearson:

R2), el cual nos dice qué tan cerca están esos puntos a la línea de la pendiente. Esos puntos entre más cercanos sean o entre más se alineen, quiere decir que hay una correlación más exacta y precisa de los valores de absorbancia relacionados con los valores de U.F.C y por lo tanto esta curva patrón es una buena curva patrón para interpolar y también determinar concentraciones y, entre más se alineen, más cercanos serán a 1 (la unidad). En nuestro caso el valor es de 0.9728, el cual se acerca bastante a la unidad y por lo tanto es una buena curva patrón para interpolar el valor de la muestra problema.

x=

0.668−0.0545 0.0323

x= 18,99380805 Este valor que se obtuvo a través de la ecuación, representa un alto grado de relación cercana con respecto al anterior. Indica que se hizo una acertada distribución de los mL en los tubos y re realizo un buen manejo del espectrofotómetro para la determinación de valores de Abs. U.F.C/mL (10 -8)

Abs teórico 3

1,0

6

2,0

9

3,0

12

4,0

15

5,0

18

6,0

21

7,0

24

8,0

27

9,0

30

10,0

Tabla N°2. Datos teóricos y U.F.C/mL.

CURVA PATRÓN TEÓRICA

Grafica N°2. Curva patrón experimental Abs vs U.F.C, interpolada por el valor de la Abs de la muestra problema.

15

En la gráfica número dos, la cual se encuentra interpolada por el valor que se obtuvo de la muestra problema de su absorbancia (0.668), se determina por este primer método que las U.F.C/ml que le corresponden son más o menos un valor de 18 aproximándose a 19. El otro método para determinar el valor de U.F.C/mL que le corresponden a ese valor de Abs de la muestra problema, se hallaba por medio de la ecuación de esa línea, despejando x, así: y=mx+b y= valor de Abs muestra problema. m=0.0323 (pendiente de la recta). x=? b= 0.0545 x=

𝑦−𝑏 𝑚

ABS

Abs de muestra problema (1mL): 6.668

y = 0.3333x R² = 1

10 5 0 0

5

10

15

20

25

30

UFC/mL Grafica N°3. Curva patrón teórica Abs vs U.FC.

m= 3,3242x b= 0,8 El estándar de McFarland va de 0,5 a 10, pero iniciando desde 1,5 U.F.C/mL, en nuestro caso se toma entonces la escala desde uno porque nuestros datos de U.F.C/mL inician en 3,00E+08. En la gráfica N°3 igual que en la gráfica de curva patrón experimental, se presenta una línea de tendencia central donde se acercan los valores TEÓRICOS de la curva con un coeficiente de determinación (coeficiente de correlación de Pearson: R2), el que nos indica si la relación entre cada variable es positiva o no, y si la dependencia de las variables es perfecta o no, en otros

términos nos indica qué tan cerca están esos puntos a la línea de la pendiente. Para estos datos hay una correlación más exacta y precisa de los valores de absorbancia relacionados con los valores de U.F.C, y por lo tanto esta curva patrón es una buena curva patrón para interpolar y también determinar concentraciones. En este caso el valor es de R2 =1, el cual es el valor de unidad (1) y por lo tanto es una excelente y perfecta curva patrón lineal.

Figura N°1. Curva patrón experimental vs curva patrón teórica.

La relación que hay entre la curva patrón experimental y la curva patrón teórica, parte de que en las dos graficas se utilizó una tendencia lineal en la que cuando aumenta una variable, la otra también lo hace con una proporción constante. También existe relación entre los resultados de coeficiente de correlación de Pearson: R2 entre gráficas, ya que por un lado, la experimental es cercana a la unidad y la teórica es 1; el valor de la unidad. Son buenas curvas patrón, excelentes para interpolar y determinar concentraciones. Las diferencias parten en que los datos experimentales son menores a los datos teóricos y los resultados de R2; por el lado experimental 0.9728 y por el lado teórico 1, con una diferencia de 0,0271. IV.

PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS

1). Existen diferencias entre turbidimetría espectrofotometría, ¿en qué consisten?

y

La turbidimetría permite cuantificar la cantidad de microorganismos en suspensión mediante la construcción de una gráfica que consiste en dibujar en el eje de las ordenadas los valores de densidad óptica. La espectrofotometría es la medición de la cantidad de energía radiante que absorbe o transmite un sistema químico en función de la longitud de onda.

La turbidimetría y la espectrofotometría son dos técnicas complementarias que se utilizan para el análisis cuantitativo de disoluciones coloidales, emulsiones, humos o nieblas. La dispersión no supone la pérdida neta de potencia radiante, solo es afectada la dirección dela propagación, porque la intensidad de la radiación es la misma en cualquier ángulo -En la turbidimetría se compara la intensidad del rayo de luz que emerge con la del que llega a la disolución. -En cambio, en la espectrofotometría, la medida de la intensidad de luz se hace con un ángulo de 90º con respecto a la radiación incidente. El instrumento usado en la espectrofotometría es el espectrómetro se asemeja al fluorómetro. En cambio en turbidimetría se utiliza el turbidímetro que es un fotómetro de filtro. (Edwar Camarillo, 2016). 2) ¿En qué consiste la ley de Beer Lambert? La Ley de Lambert-Beer introduce el concepto de absorbancia (A) de una muestra como A=logII0. Donde I0 representa la intensidad de la luz incidente e I la intensidad de la luz que atraviesa la celda. También podemos expresar la absorbancia en función de la longitud de la cubeta y de la concentración de soluto. A=logI0I=ϵ⋅c⋅l (1) Donde l es la longitud de la cubeta en cm, representa la concentración de soluto en mol/l y ϵ es la absortividad molar (coeficiente de extinción molar) medido en l/mol.cm. La ley de Lambert-Beer establece que la absorbancia está directamente relacionada con las propiedades intrínsecas del analito, con su concentración y con la longitud de la trayectoria del haz de radiación al atravesar la muestra. La expresión matemática de la ley de Lambert-Beer es: A = C.

.L

Donde: A = Absorbancia de la muestra. C = Concentración del cromóforo. L = Longitud del paso óptico que contiene la muestra.

= Absortividad molar. Depende del cromóforo en sí mismo, de la y de las condiciones de medida (pH, T...). Ya que la absorbancia es adimensional las unidades son concentración-1 longitud-1. (Vivian Pérez, 2010).

concentración distinta y por ende una absorbancia distinta. Luego una vez que tienes los puntos, haces la recta de regresión, que es la recta que mejor aproxima al conjunto de puntos que estas analizando. Una vez que tienes la recta, sacas su ecuación.

3) ¿Qué es un espectrofotómetro y qué utilidades tiene en el área ambiental?

Entonces supongamos que tienes una solución que contiene el mismo compuesto que el que usaste para construir la curva, le mides la absorbancia y con la ecuación de la recta calculas la concentración de dicha muestra problema.

El espectrofotómetro es un instrumento que sirve para determinar la concentración de una sustancia en una solución, utiliza las propiedades de la luz En general, la luz de una lámpara de características especiales es guiada a través de un dispositivo que selecciona y separa luz de una determinada longitud de onda y la hace pasar por una muestra. La intensidad de la luz que sale de la muestra es captada y comparada con la intensidad de la luz que incidió en la muestra y a partir de esto se calcula la transmitancia de la muestra, que depende de factores como la concentración de la sustancia. (N, A p.p7). Un ejemplo de la utilización del espectrofotómetro en el área ambiental se produce en uso en el depósito de agua, realizado en el estudio de la calidad del agua utilizada. (Feira Do Livre de Porto, 2011). 4 ¿Qué es una curva patrón? De un ejemplo del empleo de una curva patrón en el análisis de una variable ambiental. Una curva patrón es un marco de referencia que se construye de cantidades conocidas de una sustancia por ejemplo la albumina sérica bovina que se utiliza para medir la cantidad de proteínas presentes en una muestra incógnita igualmente para determinar la cantidad de cobre presente en una muestra incógnita. Para realizar la experiencia debemos preparar una solución de una sal de cobre y realizar diferentes diluciones de modo de disponer, por lo menos de 4 o 5 concentraciones, luego realizaremos la reacción química correspondiente y mediremos la DO de cada solución, así vamos a construir una curva dosisrespuesta que en este caso será nuestra curva patrón de referencia. Se construye usando soluciones de concentraciones conocidas de un compuesto determinado. Por ejemplo se grafica concentración Vs absorbancia y se establece una recta en la que cada punto corresponde a una

En una de las variables ambientales se emplea una curva patrón para la obtención de microorganismo en una muestra de agua y así llegar a un porcentaje de calidad. (Cecilia Coto, s.f). BIBLIOGRAFÍA Alumnos de Ingeniería Biológica en la UAM Unidad Cuajimalpa. (Productor). (2015). Curva de calibración. [Video en línea]. De https://www.youtube.com/watch?v=5tABHtOe5Xw Bioquímica dental. (Productor). (2013). Cuantificación de proteínas. [Video en línea]. De https://www.youtube.com/watch?v=ZA1lzPMyCMU Bustos, M. (Abril, 2011). Consulta. Trabajo de estudio. Universidad Central de Ecuador. Facultad de Ciencias Químicas. Escuela de Bioquímica y Farmacia. Recuperado de http://isabelitalinda.wikispaces.com/file/view/Turbidimetr%C3%ADa.docx/22105 2850/Turbidimetr%C3%ADa.docx Camarillo, E. (Mayo, 2016). Análisis químico instrumental. Blogspot. Recuperado de http://quimicabasica2014.blogspot.com.co/2014/10/nefelometria-yturbidimetria.html?m=1 Coto, C. (s.f). Las curvas patrón. Curso de introducción al conocimiento científico experimental. QuimicaViva. ISSN 1666-7948. Recuperado de http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/contratapa/aprendiendo/capitulo3.htm Manual de Practicas de Laboratorio Microbiología Ambiental- UNISANGIL YOPAL. Practica número 4. Elaboración del Patrón de McFarland y medición de concentración bacteriana por turbidimetría. Medios de Diagnostico Microbiológico. (s.f). Inserto patrón de McFarland. Recuperado de file:///C:/Users/usuario/Downloads/O-P.PD311%20INSERTO%20Patr%C3%B3n%20McFarland%20(1).pdf N.A. (s.f). Métodos espectroscópicos y curvas patrón. Recuperado de https://bioquimexperimental.files.wordpress.com/2009/08/metodosespectroscopicos-y-curva-patron.pdf Pérez, V. (Septiembre, 2010). Ley de Beer-Lambert. La guía. Recuperado de http://matematica.laguia2000.com/general/ley-de-beer-lambert Porto, F. (Mayo, 2011). Espectrofotometría aplicada en el área ambiental. Site do fecunha. Recuperado de http://fecunha.com.br/espectrofotometria-aplicados-naarea-ambiental/ Wikipedia. (Agosto, 2015). Estándar de McFarland. Wikipedia enciclopedia libre. Recuperado de https://es.wikipedia.org/wiki/Est%C3%A1ndar_de_McFarland

ANEXOS

Imagen N°1. Momento en que se sirve H2SO4.Fuente: los autores.

Imagen N°5. 10 tubos que se sella para poder revolver su contenido. Fuente: los autores.

Imagen N°2. 10 tubos que contienen sus respectivas cantidades de las dos disoluciones. Fuente: los autores.

Imagen N°6. Espectrofotometro. Fuente: los autores Imagen N°3. 10 tubos que contienen sus respectivas cantidades de las dos disoluciones. Fuente: los autores.

Imagen N°4. Tubos listos para pasar al espectrofotometro. Fuente: los autores.