Informe laboratorio biotecnología

PONTIFICA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CHILE FACULTAD DE INGENIERÍA DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA Y BIOPROCESOS

Laboratorio 2 - Informe

Curso: IIQ3682 Sección 1 “Biotecnología Microbiana” Profesor: Eduardo Agosín Ayudantes: Benjamín Sánchez, Daniela Soto

Phammela Abarzúa I. Guillermo Gutierrez H. Pradyumna Sepulveda D.

Miércoles 20 de Junio, 2012

Indice Resumen.............................................................................................................................................. 5 Introducción ........................................................................................................................................ 6 Objetivos ............................................................................................................................................. 6 Fundamentos Teóricos ........................................................................................................................ 7 Cultivo batch ................................................................................................................................... 8 Cultivo Continuo.............................................................................................................................. 9 Cultivo Fedbatch ............................................................................................................................. 9 Metodología ...................................................................................................................................... 11 Seguridad....................................................................................................................................... 11 Obtener volumen se desecho y volumen de muestra .................................................................. 11 Medición de peso seco .................................................................................................................. 11 Centrifugación ............................................................................................................................... 12 HPLC .............................................................................................................................................. 12 Espectrofotometría ....................................................................................................................... 12 Resultados ......................................................................................................................................... 13 Cultivo Batch ................................................................................................................................. 14 Cultivo Continuo (Quimiostato) .................................................................................................... 17 Cultivo Fed-batch .......................................................................................................................... 21 Discusión ........................................................................................................................................... 26 Cultivo continuo ............................................................................................................................ 26 Cultivo fed-batch ........................................................................................................................... 28 Cultivo Batch ................................................................................................................................. 29 Conclusiones y Recomendaciones .................................................................................................... 31 Nomenclatura.................................................................................................................................... 32 Bibliografía ........................................................................................................................................ 33 Anexos ............................................................................................................................................... 34

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Indice de Tablas Tabla 1 ............................................................................................................................................... 12 Tabla 2 ............................................................................................................................................... 13 Tabla 3 ................................................................................................ 1¡Error! Marcador no definido. Tabla 4 ................................................................................................ 1¡Error! Marcador no definido. Tabla 5 ............................................................................................................................................... 17 Tabla 6 ................................................................................................ 1¡Error! Marcador no definido. Tabla 7 ............................................................................................................................................... 19 Tabla 8 ............................................................................................................................................... 20 Tabla 9 ............................................................................................................................................... 22 Tabla 10 ............................................................................................................................................. 23

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Indice de Figuras Figura 1 ................................................................................................................................................ 7 Figura 2 ................................................................................................................................................ 7 Figura 3 .............................................................................................................................................. 13 Figura 4 .............................................................................................................................................. 14 Figura 5 .............................................................................................................................................. 15 Figura 6 .............................................................................................................................................. 16 Figura 7 .............................................................................................................................................. 16 Figura 8 .............................................................................................................................................. 17 Figura 9 .............................................................................................................................................. 18 Figura 10 ............................................................................................................................................ 18 Figura 11 ............................................................................................................................................ 19 Figura 12 ............................................................................................... ¡Error! Marcador no definido. Figura 13 ............................................................................................... ¡Error! Marcador no definido. Figura 14 ............................................................................................................................................ 21 Figura 15 ............................................................................................... ¡Error! Marcador no definido. Figura 16 ............................................................................................................................................ 23 Figura 17 ............................................................................................... ¡Error! Marcador no definido. Figura 18 ............................................................................................................................................ 26 Figura 19 ............................................................................................... ¡Error! Marcador no definido.

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Resumen Este laboratorio consistió en realizar análisis sobre las muestras tomadas a los tres tipos de cultivos disponibles (quimiostato, batch y fed batch), los análisis se realizaron en base a las herramientas de cálculo y balances entregadas en el curso biotecnología microbiana. Así, de los diferentes cultivos se tomaban cada treinta minutos muestras de aproximadamente 5mL para los cultivos batch y fed batch y 7mL para el cutivo continuo de las cuales se medía absorbancia a 600nm (valor que mediante un ajuste lineal nos entregaría la biomasa), y se guardaba el sobrenadante de su centrifugado (3600 rpm por 5 minutos) para posteriormente sería sometido a un HPLC entregándonos las concentraciones de glucosa y acetato. Para llevar a cabo el análisis de los datos entregados por el muestreo nos servimos principalmente de balances de masa y la ecuación de Monod. Ecuaciones mediante las cuales fue posible calcular datos como coeficiente de mantención, μ máximo y Ysx° entre otros. En el cultivo continuo se observo una lavado completo del sistema para una dilución de 0.6 1/hr. Para el cultivo fed-batch tenemos que se realiza una etapa previa de crecimiento de un cultivo batch normal. Por lo tanto, para todos los cálculos de parámetros y coeficientes se tomó como tiempo cero T= 7,7 horas. La diferencia entre batch y fed-batch es que el segundo tiene una entrada de alimentación con sustrato limitante, glucosa. En este caso el flujo que ingresa se calcula según ecuaciones que dependen de (XV)0 al inicio del fed-batch y parámetros de rendimiento, tasa de crecimiento y sustrato en alimentación fijas. De hecho, el cultivo por lotes alimentados permite mantener un crecimiento a una tasa seteada ( =0, 3 para este caso). El flujo Fin presenta un aumento en su magnitud con el tiempo, pues debe alimentar con suficiente sustrato limitante a un volumen creciente de biomasa. Se calculó el experimental al realizar un gráfico Ln (XV)t vs. Tiempo (hr.), ya que la pendiente de la recta que ajusta para el grupo de datos corresponde a este valor. Se encontró que , menor que lo previsto. Posibles causas de este crecimiento “restringido” se discuten en la sección correspondiente.

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Introducción Un cultivo es un método para la multiplicación de microorganismos. En biotecnología se han desarrollado distintos tipos de cultivo para maximizar distintos componentes tales como biomasa o un cierto producto. Los 3 tipos de cultivos más utilizados para optimizar el crecimiento de microorganismos son batch, fed-batch y continuo. En un cultivo batch, no hay flujos de entrada ni salida. Todos los componentes del sistema se ingresan el sistema el principio del proceso. El sistema se deja funcionando solo hasta que los el sustrato limitante y/u otros nutrientes se van limitando u se producen productos inhibitorios tal como acetato. En un cultivo fed-batch hay flujo de entrada pero no hay flujo de salida. Por esta razón el volumen va aumentando continuamente en el tiempo. En un cultivo continuo hay un flujo de entrada y un flujo de salida. Al ser ambos flujos iguales, el volumen se mantiene constante. Además, el cultivo opera en fase estacionaria, es decir, no hay acumulación de producto, biomasa ni sustrato. Por ende, las variables del proceso son constantes. En este laboratorio se analizaron los 3 tipos de cultivo para poder compararlos y entender cómo se diferencian. También, con las mediciones tomadas y utilizando las ecuaciones de balance de masa se podrá construir modelos para poder explicar y predecir el comportamiento de los componentes en los cultivos.

Objetivos 1. Tomar sistemáticamente mediciones a cultivos batch, fed batch y continuo (quimiostato) de Escherichia coli para posteriormente analizarlas y asì familiarizarse y comprender a cabalidad el funcionamiento de estos tres tipos de cultivo. 2. Poder construir un modelo que describa el comportamiento de los cultivos y comparar los valores teóricos del modelo con los datos experimentales.

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Fundamentos Teóricos Para los distintos cálculos de concentración y los parámetros de cultivos, utilizamos las ecuaciones de balance de materia para cada tipo de cultivo. La ecuación general de balance es:

La ecuación general para el sustrato es:

Con: S (t): concentración de sustrato dado en un tiempo t: tiempo (hr) Ff = flujo de alimentación (L/hr) F = flujo de salida (L/hr) Sf = concentración de sustrato en el flujo de alimentación (g/L) V= volumen (L) qS=tasa volumétrica de generación de sustrato La ecuación general para la biomasa es:

Con: X (t): concentración de sustrato dado en un tiempo t: tiempo (hr) Ff = flujo de alimentación (L/hr) F = flujo de salida (L/hr) Xf = concentración de sustrato en el flujo de alimentación (g/L) V= volumen (L) qX=tasa volumétrica de generación de biomasa Para describir la tasa de crecimiento de la biomasa utilizamos la ecuación de Monod. Esta es un modelo de cinética simple. Su ecuación esta dado por:

Con, μ: tasa de crecimiento celular (1/hr) μ max: tasa de crecimiento celular máxima (1/hr) Ks : medida inversa de la afinidad entre el microorganismo y el sustrato limitante (También se describe como el valor de S(t) cuando ) Si se reordena la ecuación de Monod se llega a la siguiente expresión:

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Esta expresión corresponde a la ecuación de una recta como se observa en la Figura 1.

Figura 1 – Grafico de la ecuación de Monod

Cultivo batch En un cultivo batch, no hay flujo de entrada ni salida. Solo hay términos de acumulación y generación y/o consumo. Luego desde el balance de biomasa se tiene:

Para obtener μ, se integra ambos lados de la ecuación anterior obteniendo:

Con X0 = concentración inicial de biomasa (g/L). Para obtener μmax (la tasa de crecimiento celular máxima) se usa la zona fase de crecimiento exponencial donde la pendiente de la curva es mayor (Fig. b) La pendiente de esta zona es μmax.

Figura 2 – Fases de un cultivo batch. Cuando interesa maximizar el crecimiento de un microorganismo, se asume que el sustrato no se utiliza para formar producto, sino que solamente se usa para el crecimiento y el mantenimiento de la célula. Luego la ecuación de balance para el sustrato queda: 8

Con,

m = coeficiente de mantenimiento celular YSX = rendimiento de sustrato para producir biomasa (g/g) =

Igual que la ecuación de Monod, la ecuación de sustrato se puede reordenar para que represente una recta

Cultivo Continuo En un cultivo continuo hay flujos de entrada y salida. También se opera en fase estacionaria. Por lo tanto, las ecuaciones de balance no van a tener un término de acumulación y el volumen del reactor va a ser constante. Además, la alimentación es estéril, es decir no tiene biomasa. Entonces, la ecuación de balance para la biomasa queda: Como F/V es lo mismo de la tasa de dilución D, entonces la ecuación queda: Con D: tasa de dilución (1/hr) La ecuación para el sustrato queda:

Con la ecuación anterior y reemplazando la condición D=μ se puede obtener una expresión para X(t):

Específicamente en este laboratorio vamos a trabajar con un quimiostato, lo cual es un cultivo continuo donde todos los parámetros se mantienen constante, menos la alimentación de sustrato para así maximizar la producción de biomasa.

Cultivo Fedbatch El cultivo fedbatch tiene 2 etapas. La primera etapa se parece a un cultivo batch y la segunda es un cultivo fedbatch. En un cultivo fedbatch hay un flujo de entrada pero no de salida. Luego la ecuación de balance tiene términos de acumulación, entrada y consumo y/o generación. Ademas se asume que el flujo de alimentación no tiene biomasa. Luego, el balance de biomasa queda:

Integrando la ecuación, se tiene: 9

La ecuación para el sustrato es:

Integrando lo anterior, despejando Ff y reemplazando la ecuación de biomasa se tiene:

Ley de Lambert-Beer Esta ley relaciona la absorción de luz con las propiedades de un material. Se ve expresado como:

Siendo: A: absorbancia I: intensidad de luz transmitida I0: intensidad de luz incidente ε: coeficiente de absorción molar (M/cm) L: la distancia que viaja la luz (cm) c: concentración del material (g/cm3) Esta ley describe una función lineal entre absorbancia y concentración, pero solo dentro de un cierto rango de absorbancia. Lambert-Beer solo es aplicable a soluciones diluidas. Esto se debe a varios factores. Por ejemplo, a altas concentraciones, las moléculas del material están mas cercas entre si y se producen interacciones entre ellas lo que produce una alteración en la capacidad de absorción.

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Metodología Seguridad 1. Para establecer condiciones mínimas de seguridad e higiene en laboratorio se ocupó un delantal de laboratorio. 2. Las manos previamente lavadas se cubren con guantes de látex. 3. Para proteger los ojos se ocuparon antiparras

Obtener volumen se desecho y volumen de muestra Cultivo batch y fedbatch: 1. Se rocía la manguera donde se sacan muestras con etanol 70% 2. Se abre el sello de la manguera donde se va a extraer la muestra. Luego se conecta la jeringa a la manguera. 3. Se abre la válvula del reactor y se extrae aproximadamente 3mL de desecho para ambientar el tubo falcon y sacar el cultivo que está dentro de lo largo del tubo donde se sacan muestras. Se anota el volumen de desecho y luego se descarta. 4. Repetir paso anterior pero con 5mL y sin descartarlo. Esta será la muestra para hacer las mediciones. El tubo se mete en un envase con hielo. Esto es para que las células no sigan creciendo. 5. Cerrar la válvula y sellar manguera Cultivo continuo: 1. Se rocía la manguera de salida con etanol 70%. 2. Se obtiene 5mL de volumen de desecho de la manguera de salida donde continuamente sale cultivo. Esto se hace para eliminar el cultivo dentro de la manguera y para ambientar el tubo falcon. El volumen se anota y luego se descarta. 3. Se obtiene 7mL de muestra en el tubo falcon. El tubo se pone en hielo.

Medición de peso seco 1. Cuidar que la implementación sea apropiada, usando implementos de seguridad personales como lentes o guantes. 2. Se pesa el filtro en la balanza infrarroja 3. Se coloca el filtro (seco) sobre el embudo, el cual esta acoplado a un matraz y a la bomba. 4. Se pipetean 20 mL (10mL + 10mL) desde el falcon con la muestra de S.cerevisiae al filtro. 5. Se lava la muestra usando agua. 6. Se inicia el proceso de filtrado, con la bomba que permite alcanzar los 10 mbar, hasta que no se aprecie más escurrimiento de fluido. 7. Una vez terminado se quita cuidadosamente el filtro del embudo (tomándolo desde el costado) para evitar su ruptura. 8. Se lleva el filtro con la muestra a la balanza infrarroja (no superar 65 °C) dejándolo hasta que la variación de peso en el tiempo sea despreciable. 11

9. Se le quita al peso encontrado el del filtro, obteniéndose el peso seco de la muestra.

Centrifugación 1. 2. 3. 4.

Se mide 2 muestras de 1.5mL cada uno en tubos eppendorf. Se programa la centrifuga a 6°C, 14000 RPM y 5 minutos. Se colocan las muestras idénticas en lados opuestos de la centrifuga para balancearla. Se inicia el proceso de centrifugado, después de verificar que este bien cerrado. Corroborar que no hayan ruidos extraños que indiquen algún malfuncionamiento de la centrífuga. 5. Una vez terminado el proceso se abre la centrífuga y se sacan ambas muestras. 6. Se extrae el sobrenadante en otro tubo eppendorf rotulado y se guarda en el refrigerador a -80°C . Este se va a usar para el análisis de glucosa y acetato con HPLC. El pellet se descarta.

HPLC 1. Seleccionar la fase estacionaria y móvil adecuada para la realizar la separación. 2. Para calibrar el HPLC se realiza el proceso de cromatografía con una sustancia de concentración conocida, luego el área bajo la curva en el cromatograma correspondiente se calibra hasta la concentración de la sustancia introducida. Además, mediante software es posible regular los tiempos de retención para cada compuesto y el área bajo la curva para la concentración del compuesto, todo esto para mejorar la identificación y cuantificación de las sustancias en la muestra. 3. Para realizar la medición, se carga la muestra a analizar en la matriz de tubo. 4. Se selecciona la posición en que se colocó la muestra y se inicia el proceso de cromatografía. La duración del muestreo es cercana a los 30 minutos. 5. En el cromatograma se identifican y cuantifican los componentes de la muestra según su tiempo de residencia e índices de refracción. Dada una base de datos previa donde se identifican estos datos para los compuestos probables, el programa identificará los peaks y determinará el (los) compuesto (s) correspondiente.

Espectrofotometría 1. Se lavan y limpian las cubetas evitando el daño a la superficie de esta, lo cual podría impedir la correcta medición de absorbancia. 2. Se calibra el espectrofotómetro con una muestra blanco de 1mL de, en este caso, NaCl 0.9%. 3. Se pipetea la muestra en la cubeta. La dilución dependerá del valor de la absorbancia. La dilución se hace con NaCl 0.9% (medio isotónico) para evitar la lisis de las células. 4. Se mide la absorbancia de la muestra con materia orgánica: de estar entre 0 a 0.6 se puede considerar la medición ya que estamos en el rango lineal en la relación concentración vs. Absorbancia, es decir, se puede usar la ley de Lambert-Beer. Si es que se supera este valor, es necesario diluir la muestra hasta cumplir ese rango y extrapolar luego a la concentración inicial. 12

Resultados Se hicieron mediciones para 3 tipos de cultivos: batch, continuo y fed-batch. Obtuvimos datos para la densidad óptica, y concentraciones de glucosa y acetato. Con estos datos luego se procedió a calcular los parámetros cinéticos de cultivos tales como YSX, μ y ks. Primero se calculo la ecuación para la curva de calibración. Utilizando los datos dados de 3 experimentos para cada uno de las 5 muestras se obtuvo la masa de cada experimento, la masa promedio de cada muestra y un valor promedio de la densidad óptica (OD600). Los valores se muestran en la Tabla 1. Tabla 1 – Mediciones para la curva de calibración.

Muestra (g) 0.008427 0.00834726 0.008379 0.009959 0.0098028 0.0097414 0.01319954 0.0129926 0.0119 0.029289 0.027994 0.029994 0.03242 0.03286 0.03382

Promedio OD600

Promedio Muestra (g)

Biomasa (g/L)

4.2

0.00838442

4.19221033

5.92

0.0098344

4.9172

9.64

0.01269738

6.34869

27.8

0.02909233

14.5461667

31.3

0.03303333

16.5166667

Con los valores de OD600 promedio y concentración de biomasa se hizo un grafico de absorbancia de OD vs biomasa (Fig. 3). Luego se ajusto una recta a esos puntos. La ecuación de la recta obtenida (ec. 17) es la ecuación de la curva de calibración. Este se va a usar para calcular la concentración de biomasa en función de OD.

Luego se procedió hacer los cálculos respectivos para cada tipo de cultivo.

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Curva Calibrado de Absorbancia 40 OD600

30

y = 2,212x - 4,8087 R² = 0,999

20 10 0 0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Biomasa (g/L)

Figura 3 - Curva de calibración con densidad óptica vs concentración de biomasa

Cultivo Batch La tabla A1 en anexos muestra los datos de las condiciones del cultivo. Las mediciones que se obtuvieron se encuentran en la tabla 2. Tabla 2 – Mediciones de cultivo batch Volumen Volumen Hora Desecho Muestra (mL) (mL) 14:00 3 5 15:48 4 5 17:13 3.75 4 17:33 4.25 5.75 17:56 1 4 18:37 2.3 4 19:19 3 4 19:43 2 4.5 20:00 2.5 10 20:49 4 6.5 21:17 3 7

OD600

Factor de Dilución

Glucosa (g/L)

Acetato (g/L)

0.275 0.114 0.261 0.342 0.425 0.55 0.405 0.497 0.545 0.537 0.554

1 10 10 10 10 10 20 20 20 20 20

9.028 8.189 7.010 6.570 5.784 4.351 2.205 0.546 0.011 0.009 0.005

0.040 0.030 0.035 0.028 0.032 0.024 0.079 0.133 0.123 0.041 0.004

De los datos de la Tabla 2, calculamos el tiempo en horas, con 14:00hr como t=0, y la biomasa en g/L con la ec. 1. De esta manera se obtuvieron los siguientes valores (Tabla 3).

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Tabla 3 – Cantidad de concentración de biomasa (X) en el tiempo Tiempo (hr)

X (g/L)

0 2.3049175 1.8 2.695638 3.21666667 3.359637 3.55 3.725514 3.93333333 4.100425 4.61666667 4.66505 5.31666667 5.83947 5.71666667 6.670598 6 7.10423 6.81666667 7.031958 7.28333333 7.185536 Utilizando los valores de las concentraciones de glucosa, acetato y biomasa (Tablas 2 y 3), se hizo un grafico de concentración vs tiempo (Fig. 4) para ver el comportamiento de cada componente en el tiempo.

Concentracion (g/L)

Biomasa, glucosa y acetato vs tiempo 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 -1 0

Biomasa Glucosa Acetato

2

4 Tiempo (hr)

6

8

Figura 4 – Concentraciones de biomasa, glucosa y acetato vs tiempo en cultivo batch. Se grafico el acetato por separado para ver con más detalle su comportamiento en el tiempo (Fig. 5).

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Conentracion (g/L)

Concentracion de acetato en el tiempo 0,160 0,140 0,120 0,100 0,080 0,060 0,040 0,020 0,000 0

1

2

3

4

5

6

7

8

Tiempo (hr)

Figura 5 – Producción de acetato en el tiempo en cultivo batch Para el cálculo de los parámetros de rendimiento YSX, se utilizo los valores de la biomasa de la Tabla 3 y sabiendo que YSX = se obtienen los valores de la Tabla 4. Tabla 4 – Valores calculadas de parámetros de crecimiento

X (g/L) 2.3049175 2.695638 3.359637 3.725514 4.100425 4.66505 5.83947 6.670598 7.10423 7.031958 7.185536

ln(X) 0.83504488 0.99163491 1.21183293 1.31520483 1.41109063 1.54009855 1.76464004 1.89770951 1.96069038 1.95046519 1.97207012

Ysx OD600*FD Rendimiento 0.46539521 0.56301558 0.8319887 0.47683973 0.39413763 0.54738617 0.50095051 0.8094528 -54.2333377 34.9591162

0.275 1.14 2.61 3.42 4.25 5.5 8.1 9.94 10.9 10.74 11.08

Dejando fuera los últimos 2 valores de YSX, se hizo un promedio de YSX con los valores de la Tabla 4, llegando a un valor de YSX_promedio = 0.57364579 g/g Además se construyó un grafico de ln(x) en el tiempo para obtener el valor de la pendiente de la curva, o sea, μ. Específicamente se deseaba encontrar μmax, o sea, μ en la fase de crecimiento exponencial. Desde la figura 6 se puede observar que el valor de μmax es 0.3246 (1/hr)

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Ln(X) v/s t , en la fase exponencial 2 ln(X)

1,5

y = 0,3246x + 0,0408 R² = 0,9999 Ln(X)

1 0,5

Lineal (Ln(X))

0 0

2

4

6

8

Tiempo (hr)

Figura 6 – ln(X) en el tiempo para la fase exponencial de crecimiento en cultivo batch. Para el cálculo de Ks se hizo algo similar a lo anterior pero tratamos que encontrar el valor de μ tale que μ = μmax/2. El valor de la concentración de glucosa en ese punto es el valor de Ks. La pendiente de los puntos 2, 3 para tiempos y ln(X), daba una pendiente de μ =0.1554, lo cual es muy cercano a μmax /2 = 0.1623 (Fig. 7). Se tomo un promedio de los tiempos y concentración de glucosa en los puntos 2 y 3 y se obtuvo que aproximadamente en el tiempo t=2.5 hr, la concentración de glucosa es 7.6 g/L, lo que es el valor de Ks buscado.

ln(X) vs tiempo 1,4 1,2

ln(X)

1 y = 0,1554x + 0,7119 R² = 1

0,8 0,6 0,4 0,2 0 0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

Tiempo (hr)

Figura 7 - ln(X) en el tiempo para la fase lag de crecimiento en cultivo batch

Cultivo Continuo (Quimiostato) Las condiciones del cultivo se pueden ver en la Tabla A2 en Anexos. Se midió las cantidades de glucosa, acetato, oxigeno y CO2 disuelto en el medio para diluciones distintas hasta que se observa un lavado del sistema (Tabla 5).

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Tabla 5 – Mediciones del cultivo continuo

D (OD600)*F (1/h) D 0.2 0.3 0.3 0.4 0.4 0.5 0.6

Glucosa (g/L)

Acetato (g/L)

%O2 (v/v)

%CO2 (v/v)

Oxigeno Disuelto (ppm)

0.047 0.073 0.115 0.171 0.266 0.476 10

0.004 0.003 0.003 0.003 0.003 0.016 0

0.209 0.209 0.209 0.208 0.208 0.209 0.21

0.086 0.097 0.108 0.120 0.131 0.143 0.04

5.273 5.109 4.765 4.643 4.265 4.070 6.2

10.99 10.34 11.34 10.54 11.46 11.22 0

Con la ecuación 1, se calcula la concentración de biomasa en el reactor para cada dilución, obteniéndose los valores de la Tabla 6. Con estos datos se construyo un grafico de concentración de biomasa vs dilución (Fig. Tabla 6 – Concentración de biomasa para distintas diluciones

D (1/h)

Biomasa (g/L)

0.2 0.3 0.3 0.4 0.4 0.5 0.6

7.14306258 6.85110054 7.30090347 6.94290078 7.35850603 7.24889268 2.1807

Luego se grafico la producción de acetato y biomasa y el consumo de glucosa para las distintas diluciones. (Fig. 8)

Biomasa, glucosa y acetato vs dilucion 12,000 Concentracion (g/L)

10,000 8,000 6,000

Glucosa (g/L)

4,000

Acetato (g/L)

2,000

Biomasa

0,000 -2,000

0,0

0,1

0,2

0,3 0,4 Dilucion (1/hr)

0,5

0,6

0,7

Figura 8 – Concentración de biomasa, glucosa y acetato para distintas diluciones en cultivo continúo 18

Para observar mejor el comportamiento de acetato (Fig. 9), y glucosa (Fig. 10), se construyeron gráficos separados. Para el grafico de glucosa, solo se grafico hasta la dilución 0.5 1/hr dado que a 0.6 1/hr la concentración de glucosa se dispara y aumenta en 2 órdenes de magnitud (desde 0.476 g/L hasta 10 g/L). Luego para ver cómo se comporta la glucosa antes del lavado (dilución 0.6 1/hr) se grafica hasta la dilución 0.5 1/hr.

Acetato Concentracion (g/L)

0,020 0,015 0,010 0,005

0,000 0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

Dilucion (1/hr)

Figura 9 – Concentración de acetato para distintas diluciones en cultivo continúo

Glucosa Concentracion (g/L)

0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Dilucion (1/hr)

Figura 10 – Concentración de glucosa hasta antes del lavado del sistema en cultivo continúo. También se grafico la cantidad de O2 y CO2 en %v/v en el reactor para cada dilución. (Fig. 11)

19

O2 y CO2 vs dilucion 0,250

% (v/v)

0,200 0,150 %O2 (v/v)

0,100

%CO2 (v/v) 0,050 0,000 0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

Dilucion (1/hr)

Figura 11 – Cantidad de oxigeno y CO2 disuelto en el reactor (0.4L) para cultivo continuo Luego se procedió a calcular los valores de la Tabla 7.

Ysx

1/Ysx

1/Mu

1/Glucosa

Mu

0.71768092 1.39337688 5 21.266755 1.39337688 0.69014069 1.44897992 4 13.71876 1.44897992 0.73861114 1.35389239 3.33333333 8.66833666 1.35389239 0.70638726 1.41565407 2.85714286 5.83927175 1.41565407 0.7559785 1.32278894 2.5 3.75587376 1.32278894 0.76111411 1.31386344 2.22222222 2.10108329 1.31386344 1.66666667 0.1 Tabla 7 – Valores de Rendimiento y tasa de crecimiento para distintas diluciones Con los valores de la tabla 7 se construyeron las figuras 12 y 13

1/Ysx v/s 1/Mu y = 0,032x + 1,2686 1/Ysx v/s 1/Mu R² = 0,3829

2 1,5 1 0,5 0 0

2

4

6

Figura 12 – Relación entre rendimiento y tasa de crecimiento celular

20

1/Mu v/s 1/s 6

y = 0,1522x + 1,8772 R² = 0,9876 1/Mu v/s 1/s

5 4 3

El intercepto es Mu max La pendiente Ks/Mu max

2 1 0 0

10

20

30

Mu max=0,532 Ks=0,0810

Figura 13 – Relación entre tasa de crecimiento celular y tiempo

Cultivo Fed-batch Las condiciones del cultivo fed-batch se pueden observar en la Tabla A3 en los Anexos. Utilizando los datos de medición (Tabla A4 en Anexos) y la ecuación 1, calculamos la concentración de biomasa en el reactor en el tiempo (Tabla 8). Tabla 8 – Valores calculados para biomasa (X)

Tiempo (hr)

X (g/L)

ln (X)

0 2.338795 0 2 2.347829 0.85349107 3.06666667 2.528509 0.9276298 3.93333333 2.731774 1.00495122 4.83333333 3.070549 1.12185637 5.61666667 3.49063 1.25008224 6.31666667 4.104942 1.41219161 7.1 4.827662 1.57436229 8.48333333 7.23974 1.97958529 8.96666667 8.5045 2.14059544 10.05 10.67266 2.36768533 10.7 12.97633 2.56312693 11.35 15.46068 2.73830003 12.4333333 19.3453 2.9624495 12.9666667 20.83591 3.03667794 13.4666667 22.484615 3.1128313 14.0166667 23.5762233 3.16023872 14.7166667 24.314 3.19105232 21

15.2333333 15.7333333 16.2666667 16.8833333

25.39808 25.62393 25.39808 25.03672

3.23467358 3.24352668 3.23467358 3.22034355

Considerando que el proceso fed-batch no comienza al mismo tiempo que el muestreo, se debe considerar el punto en el que comienza la alimentación. Esto es aproximadamente a los 7.7 hr desde el comienzo del muestreo. El perfil del desarrollo de este proceso se ve en las figuras siguientes.

Biomasa vs tiempo 30 Biomasa (g/L)

25 20 15 10

Biomasa (g/L)

5 0 0

10

20

Tiempo (hr)

Figura 14 – Perfil de biomasa durante todo el tiempo de muestreo del cultivo fed-batch

Biomasa (g/L)

Biomasa vs tiempo 30 25 20 15 10 5 0

Biomasa (g/L)

0

10 Tiempo (hr)

20

Figura 15- Perfil para la fermentación fed-batch (ya que se dice que la alimentación se conecta cerca de 7.7 horas después de iniciado el muestreo). Para el cálculo del flujo que ingresa se usa la fórmula:

(ecuación 18) 22

En el que los valores vienen dados y son:

Siendo M el volumen correspondiente a las muestras tomadas antes de la conexión del flujo de entrada. Con esto nos queda que Fin es:

Para tener el volumen a cada instante es necesario saber cuál es el volumen que ha ingresado por Fin hasta cierto instante, esto lo podemos obtener al integrar la ecuación de en el tiempo (se resta 7,7 pues es tiempo en el que comienza el fed-batch):

En esta situación el volumen estará dado en cada instante por:

Con M(t) el volumen para realizar el muestreo (aunque es un valor marginal al considerar el tamaño total, a la postre puede influir en el resultado). Así, tenemos que el

y el volumen del reactor en función del tiempo es de:

Tabla 10 - Flujo de alimentación y volumen en el cultivo fed-batch. Tiempo (hr) Volumen (L) (L/hr) 8,48333333 0,02019841 0,00288319 0,32718319 8,96666667 0,02134921 0,00504209 0,32234859 10,05 0,02392857 0,01118445 0,33419795 10,7 0,02547619 0,01595076 0,34145854 11,35 0,02702381 0,0217433 0,34764859 12,4333333 0,02960317 0,03429944 0,35790434 12,9666667 0,03087302 0,04215113 0,36715832 13,4666667 0,03206349 0,05074509 0,37415088 14,0166667 0,03337302 0,06181319 0,38622059 14,7166667 0,03503968 0,07881691 0,4032233 23

15,2333333 15,7333333 16,2666667 16,8833333

0,03626984 0,03746032 0,03873016 0,04019841

0,09386745 0,11083089 0,13196161 0,16100436

0,41687384 0,43383868 0,4542694 0,48281286

Para el cálculo de la tasa de crecimiento es necesario dibujar un gráfico ln(XV) vs tiempo en el cual es posible estimar μ según la correspondencia entre el ajuste lineal y el logaritmo de la ecuación de biomasa en función del tiempo (ecuación 3) (ecuación 19) ln(XV)t = ln(XV)0 + µ*t y = b + m*x En este caso el ajuste a los datos queda como en la figura 16.

Ln (XV) vs tiempo (hr) 3 y = 0,1977x - 0,6592 R² = 0,9592

2,5 2

Ln (XV) vs tiempo (hr)

1,5

Lineal (Ln (XV) vs tiempo (hr))

1 0,5 0 0

5

10

15

20

Figura 16 – Grafico de ln(XV) en el tiempo para el cultivo batch Tabla 11 – valores de ln(XV) calculado en cultivo fed-batch Tiempo (hr) 8,48333333 8,96666667 10,05 10,7 11,35 12,4333333 12,9666667 13,4666667 14,0166667 14,7166667 15,2333333 15,7333333

Ln (XV)t 0,86235025 1,00847369 1,27166353 1,48859793 1,68173692 1,93495995 2,03471581 2,12973517 2,20889212 2,28278755 2,35970194 2,40844416 24

16,2666667 2,44560871 16,8833333 2,49221739 Luego, de la figura 16 se obtuvo que el valor de μ (la pendiente) es 0.1977 (1/hr). Finalmente se grafica XV por el tiempo para el proceso batch completo (Fig. 15) 14 y = 1,2355x - 8,4457 R² = 0,995

12 10 8

XV vs tiempo XV batch previo

6

Lineal (XV vs tiempo) 4 2 0 0

5

10

15

20

Figura 17 - Gráfico VX vs tiempo para el cultivo fed-batch. Cuadrados rojos: gr. de biomasa del cultivo batch previo, rombos celestes: gr. de biomasa del fed-batch.

25

Discusión Según la ley de Lambert-Beer, las mediciones de biomasa solo sirven dentro un cierto rango de OD. En este caso, el rango en que la curva de calibrado es válido es entre 4.2 y 31.3 OD600. Cuando se produce el lavado, el OD es 0 lo cual queda debajo del rango mencionado. Por esta razón, la curva de calibración no se puede utilizar para calcular biomasa cuando ocurre el lavado. Esto explica la cantidad positiva de biomasa para OD600 = 0 en el quimiostato, cuando debería ser 0 g/L.

Cultivo continuo De los datos de cultivo continuo se obtuvo un coeficiente de mantención 0.032 y un rendimiento real en glucosa variable a través del tiempo que promediaba 0.728. El coeficiente de mantención es despreciable ya que la tasa a la que se reproduce el microorganismo es elevada implicando un consumo de sustrato mucho mayor. El coeficiente demantencion pasa a ser relevante cuando la velocidad de crecimiento es pequeña Los valores de μmax y Ks resultaron 0,532 y 0,0810 respectivamente. Ks o constante de saturación corresponde a la concentración de sustrato para la cual se crece a μmax/2. La constante de saturación es inversa a la afinidad del organismo por el sustrato, es decir que a mayor Ks el organismo es menos afín al sustrato por lo que se debe poner en contacto con el organismo una mayor cantidad de sustrato para que este “la perciba”. Podemos dar mayor razón a este hecho mediante a la ecuación de Monod; Para una determinada concentración de sustrato, a Ks bajo nos aproximamos cada vez más a μmax, mientras que si aumentamos Ks, Mu disminuye, en fin, mientras Ks

= rCo2

Respecto a la produccion de acetato se tienen variadas teorías, que El flujo de carbono se va hacia acetato porque el ciclo de Krebs ya está funcionando a su máxima capacidad o que se produce debido a la falta de oxigeno por mencionar solo dos. Si tomamos la producción de acetato desde el último punto de vista podremos modelar la produccion de acetato em función de la incorporacion de oxigeno al microorganismo. Y diremos que se produce acetato cuando la tasa específica esperada de consumo de oxigeno del organismo es menor a la incorporación posible debido a limitaciones de solubilidad.

27

Cultivo fed-batch Debemos considerar que para el caso batch anterior se calculó la máxima tasa, siendo el promedio seguramente de menor magnitud, ya que luego del periodo lag y antes de la fase estacionaria hay un descenso de la tasa de crecimiento con respecto al máximo. Si observamos la cantidad de biomasa al alcanzarse el estado estacionario del proceso batch (6 horas aproximadamente) tenemos que la concentración es de 7.1 g/L. En este caso se observa una etapa de crecimiento exponencial, que seguramente debe ajustar a una cinética como la que describe Monod (ecuación 3). Si vemos los gráficos de μ para el cultivo por lotes alimentados vemos que ajusta bastante bien a una curva lineal (R > 90), en la que la tasa de crecimiento (μ) se mantendría constante durante el proceso. Por lo tanto, en este caso el crecimiento no depende de la concentración de sustrato como en batch sino que es constante durante el proceso. La variable del proceso que diferencia el caso batch del fed-batch es la presencia de alimentación, por lo tanto es esperable que ahí este la causa de las diferencias que se puedan esperar entre los cultivos. Gracias a esta alimentación podemos fijar μ a un valor específico, el cual se calculó y se presenta en los resultados. Cabe destacar, que a pesar de que la aproximación lineal es buena para este caso, la tasa presenta un ligero pero sostenido descenso a medida que va pasando el tiempo. Sin embargo, la tasa de crecimiento que se fijó no corresponde a la que se observa experimentalmente. En el cultivo el microorganismo crece más lentamente de lo presupuestado, = 0.3 [1/h] y [1/h] es el experimental. Una de las posibles causas es la aparición de un crecimiento restringido desde el punto de vista limitante, como se presentó en la clase 7 del profesor Agosin. El siguiente gráfico representa esta situación:

Figura 18 - Crecimiento del microorganismo en cultivo por lotes alimentados (CLA) en condiciones de crecimiento no restringido (exponencial) y de crecimiento restringido (limitado) desde el punto de vista del nutriente limitante. Notamos que hacia el final el crecimiento de la biomasa (VX) deja su comportamiento exponencial (y constante) para llegar a un crecimiento lineal (y decreciente). La primera condición se da cuando S >> Ks, es decir estamos alimentado al microorganismo con sustrato mayor a la tasa de saturación (Ks), así no verá su crecimiento afectado por la falta de glucosa. En el caso restringido tenemos que S es despreciable frente a X/Y X/S, lo cual corresponde al S consumido por L de reactor. Es decir, está consumiendo más rápido de lo que alimentamos, lo que lleva a que se limite el crecimiento de la bacteria. En nuestro caso si graficamos VX (Fig. 15).

28

Vemos que ajusta todo muy bien a una función lineal lo cual correspondería a un cultivo de crecimiento restringido. Lo mismo se obtiene de la tasa calculada en resultados. Se observa un decrecimiento con el tiempo en vez de ser lineal. Una explicación para esto es que E. coli aumenta tanto su biomasa que empieza a estresarse a concentraciones muy altas. Debido a este estrés E. coli disminuye su tasa de crecimiento. También empieza a producir acetato bajo condiciones de estrés, lo cual es un inhibidor de crecimiento. Con respecto al muestreo, en este caso, el volumen de muestra que se saca del reactor para realizar el estudio de absorbancia y el de desecho puede ser un factor que incida en el crecimiento, quizás no en una magnitud importante, pero aún así considerable. Por ejemplo, en la primera parte del cultivo batch, se comienza con 0.4 L y producto del muestreo se queda (al momento en el que se conecta la alimentación) con 0.33 L. En total, se retiran 0.17 L de muestra lo cual es casi la mitad del volumen total con el que comenzamos en el reactor. Si se desprecian, el cambio que generan en las otras variables es considerable, más no crítico. Por ejemplo, la tasa de crecimiento aumentaría a 0.19 [1/h] pero no hay valores q cambien de signo, o que cambie la condición de crecimiento (sigue observándose como restringido). Por lo tanto, la limitación en el muestreo tiene como fundamento no interferir en el crecimiento normal del cultivo fed-batch. Entre las posibles causas de la limitación de la biomasa hasta 50 OD, podemos encontrar la ya nombrada restricción ligada al crecimiento del nutriente limitante, en la que al hacia el final (cuando se queda estancado el valor de OD) se hace cada vez más insuficiente el sustrato alimentado para la biomasa presente. Oxigeno: puede ser que se estén quedando sin lo necesario al aumentar en tal proporción la biomasa, mejorar alimentación. La otra medición posible de realizar es la del acetato. Según Yee et al. (8) el acetato inhibe el crecimiento celular y reduce la producción de proteínas recombinantes, en este caso solo la primera consecuencia es la que observamos. El volumen del sistema va aumentando con el tiempo (Tabla A2 en Anexos) lo cual es consistente con un cultivo fed batch. Dado que hay flujo de entrada y no de salida y que el volumen de muestras y desecho (8mL aproximadamente) no es tan grande en comparación con el volumen del medio (400mL), el flujo de entrada es mayor que el volumen retirado y por esta razón aumenta el volumen en el tiempo. Para alcanzar valores de biomasa mayores se puede regular el de modo tal que no se produzca tanto acetato, podemos mejorar las condiciones de aireación y agitación para obtener una transferencia de oxigeno más eficiente y aumentar la alimentación de glucosa a valores mayores para que no se vea afectado el crecimiento por su carencia.

Cultivo Batch El lag-time corresponde a la fase en la que la biomasa no presenta un aumento observable en su concentración. Esto se puede deber a que las células están preparándose para la división, recolectando nutrientes o aumentando su tamaño, crecimiento celular (como se observa en Wade (2)). En el gráfico y en la tabla de los resultados no se observa ningún intervalo en el que la cantidad de biomasa se mantenga constante. Entre 0 y 1.8 hrs. se produce un aumento de biomasa (2.3 g/L a 2.69 g/L). En consecuencia, lo que podemos decir de la duración del lag es que es menor a 1.8 hrs, pero no se distingue debido a que no se realizó muestreo más exhaustivo. Sin embargo, debido a la baja tasa de crecimiento que se observa en este primer intervalo, podríamos decir que puede ser un valor cercano a esas 1,8 horas. La duración del lag time está determinada por factores como el tamaño del inóculo, tiempo necesario para recuperarse de daño físico o 29

shock en la transferencia, tiempo requerido para la síntesis de enzimas (que pueden ser inducidas por el medio en el que se encuentra) o cofactores esenciales para metabolizar los nutrientes específicos presentes en el medio (7). En consecuencia, un modo de acortar el periodo lag puede ser manteniendo las células, previo a la inoculación, en un cultivo de características similares a las que se encontrarán en el medio batch definitivo y de este modo evitar el shock de las células y la necesidad de sintetizar nuevas enzimas para el metabolizar los nutrientes del nuevo cultivo. Acetato es una producto lateral que produce Escherichia coli cuando está realizando fermentación aeróbica. La tasa en la que se produce acetato es directamente dependiente de la tasa en la que célula crece, consumiendo su sustrato glucosa. La producción se produce específicamente cuando hay overflow metabolism en E. coli. Esto es, se llega a un punto en la saturación de la tasa de captura de oxigeno por parte de la célula, pasando a fermentación como su metabolismo (5).

Fig 19 - Tasas de captura de oxigeno (azul) y de formación de acetato (rojo) cuando E. coli pasa a overflow metabolism En el caso de la presente experiencia, se mantiene en niveles muy reducidos a lo largo de todo el cultivo, pero cuando la biomasa de la célula está comenzando a detener su crecimiento (estado estacionario) el acetato presenta un súbito peak para luego decaer nuevamente. El bajo nivel remanente en el primer tramo puede indicar que algunas bacterias a) tienen menos oxigeno del requerido y están realizando fermentación anaerobia, o b) tienen más oxigeno del que soportan y hacen fermentación en condiciones aeróbicas. Esta diferencia en las concentraciones de oxigeno es debido a que el medio no es homogéneo y no todas las zonas reciben la misma transferencia de oxígeno. Para remediar esto medidas como aumentar la velocidad de la agitación pueden ayudar. Al estar cercano a las 6 horas la tasa de captura de oxigeno se eleva por sobre los niveles de soportables por la célula a nivel más generalizado lo cual provoca un aumento en los niveles de acetato (la tasa de crecimiento comienza a disminuir por lo tanto la cantidad de oxigeno disponible para cada bacteria aumenta repentinamente), sin embargo, al pasar este estado de transición (de crecimiento exponencial a estado estacionario) ya se readecuan los sistemas a los nuevos niveles, evitando la producción de acetato. Parámetros a considerar para la cinética de crecimiento? Puede ser el consumo de oxigeno, pues nos indica que tan rápido crece en función de lo rápido q baja el oxigeno (o generación de CO2 cuando hay mas biomasa). También la tasa de consumo de glucosa nos permite ver cómo va variando el crecimiento celular (el consumo es como una exponencial invertida al crecimiento de la biomasa). Supuestos? Que solo tenemos una bacteria 30

por lo tanto lo que se consuma será lo que E. coli consume. Además no hay ni entrada ni salida, así que es más fácil de determinar, no hay alteraciones externas.

Conclusiones y Recomendaciones En conclusión se observo que los 3 cultivos se comportaron de manera esperada. Los datos obtenidos eran similares a los valores obtenidos a partir de los balances de masa y la ecuación de Monod (modelo). Para mejorar los cálculos en el cultivo batch se necesitaría tener más datos para la fase lag para así poder calcular Ks de manera más precisa. Para el cultivo continuo, se podría hacer diluciones más pequeñas para poder ver y analizar mejor el efecto del coeficiente de mantención. Para el cultivo batch se podría haber tomado muestras más seguidas (tiempo de intervalo menor) para tener más puntos en los gráficos y de esa manera calcular una tasa de crecimiento más preciso.

31

Nomenclatura A: absorbancia c: concentración del material (g/cm3) C02: concentracion de O2 (g/L) Cc02: concentracion de CO2 (g/L) D: tasa de dilución (1/hr) F = flujo de salida (L/hr) F = flujo de salida (L/hr) FD: factor de dilucion Ff = flujo de alimentación (L/hr) Ff = flujo de alimentación (L/hr) I: intensidad de luz transmitida I0: intensidad de luz incidente KLa: coeficiente de transferencia de oxigeno (1/hr) Ks : medida inversa de la afinidad entre el microorganismo y el sustrato limitante (También se describe como el valor de S(t) cuando ) l: la distancia que viaja la luz (cm) m: coeficiente de mantenimiento celular OD600 = densidad óptica a longitud de onda 600nm qS=tasa volumétrica de generación de sustrato qX=tasa volumétrica de generación de biomasa S (t): concentración de sustrato dado en un tiempo Sf = concentración de sustrato en el flujo de alimentación (g/L) t: tiempo (hr) V= volumen (L) X (t) o X: concentración de sustrato dado en un tiempo X0 concentración inicial de biomasa (g/L). Xf = concentración de sustrato en el flujo de alimentación (g/L) YSX rendimiento de sustrato para producir biomasa (g/g) ε: coeficiente de absorción molar (M/cm) μ: tasa de crecimiento celular (1/hr) μmax: tasa de crecimiento celular máxima (1/hr) μset: tasa de crecimiento celular fija para el sistema (1/hr)

32

Bibliografía 1. 2. 3. 4.

5. 6.

7. 8.

Agosin, E. “Clase 4- Cultivo batch”. 2012. Agosin, E. “Clase 5- Cultivo continuo”. 2012. Agosin, E. “Clase 7- Cultivo por lote alimentado”. 2012. Beer-Lambert Law. “Stage 2 Chemistry Social Relevance Projects”. The University of Adelaide. http://www.chemistry.adelaide.edu.au/external/socrel/content/beerslaw.htm Eiteman , Mark A. , Altman,Elliot. “Overcoming acetate in Escherichia coli recombinant protein fermentations”. TRENDS in Biotechnology 2006 Vol.24 No.11 http://mic.sgmjournals.org/content/7/1-2/18.full.pdf Wade H.E, Observations on the Growth Phases of Escherichia coli, American Type ' B '. J . gen. Microbiol. 7. 1952 , 1823 http://textbookofbacteriology.net/growth_3.html Yee, L. “Blanch HW. Recombinant protein expression in high cell density fed-batch cultures of Escherichia coli”. 1992, Dec;10(12):1550-6.

33

Anexos Tabla A1 – Condiciones de cultivo batch Volumen Reactor 600 mL Agitación 800 rpm Flujo Aire 2 VVM Kla 202 1/h Temperatura 37 C pH 6.7 -

Tabla A2 – Condiciones del quimiostato Volumen Reactor 400 mL Agitación 500 rpm Flujo Aire 1.5 VVM Kla 140 1/h Temperatura 37 C pH 6.7 Glucosa feed 10 g/L Tabla A3 – Condiciones de cultivo fed-batch Volumen Batch 400 mL Agitacion Max 800 rpm Flujo Aire Max 2 VVM Flujo Oxigeno Max 0.5 VVM Kla max 202 1/h Temperatura 30 C pH 6.7 Glucosa Batch 10 g/L Glucosa feed 300 g/L mu_set 0.3 hr-1 Ysx 0.42 gDCW/gGlucosa

34

Tabla A4 – Datos de muestras de cultivo fed-batch

Hora OD600 Volumen Desecho Volumen Muestra 2:00 4:00 5:04 5:56 6:50 7:37 8:19 9:06 10:29 10:58 12:03 12:42 13:21 14:26 14:58 15:28 16:01 16:43 17:14 17:44 18:16 18:53

0.35 0.37 0.77 1.22 1.97 2.9 4.26 5.86 11.2 14 18.8 23.9 29.4 38 41.3 44.95 47.37 49 51.4 51.9 51.4 50.6

3.5 3 5.5 3 4 4 4 2.7 7 2 1.8 1.5 2.4 1 1.9 2.6 2.5 2.8 2.5 2 3

3 6.5 8.5 5 7.5 4.5 3.5 3.7 3.8 6.5 5.8 3.5 3.4 4.8 4.8 5.5 3.8 3.9 5 5.3 6.5 6

Tabla A5 – Cálculos para Cultivo fed-batch gramos F in tiemp ln biomas acumula Volu concentrac XV o (XV) a Fin do (L) men ion teorica M (t) 0.928 5016 0 0.074 2 18316 0.397 0.908 6098 2 0.095 2 83951 0.387 0.949 3.066 4551 6666 0.051 0.375 3 7 86701 5 0.997 3.933 0975 3333 0.002 1 3 90671 0.365 1.088 4.833 5096 3333 0.084 0.354 2 3 80944 5 35

1.207 7579 8 1.389 5228 7 1.596 9905 9 2.368 7212 4 2.741 4135 7 3.566 7810 7 4.430 8787 5 5.374 8836 2 6.923 7667 7 7.650 0777 3 8.412 6385 9 9.105 6228 3 9.803 9714 2 10.58 7795 2 11.11 6652 11.53 7570 5

5.616 6666 7 6.316 6666 7

0.188 76573

0.346

0.328 96043

0.338 5

0.468 7.1 12098 8.483 0.004 3333 0.862 1.75741 1843 0.002883 3 35025 365 2 19 8.966 0.004 6666 1.008 2.03163 8372 0.005042 7 47369 972 4 09 0.006 1.271 2.81185 6948 0.011184 10.05 66353 163 8 45 0.008 1.488 3.41727 1363 0.015950 10.7 59793 418 7 76 0.009 1.681 4.15305 8882 0.021743 11.35 73692 085 2 3 12.43 0.013 3333 1.934 5.74794 6855 0.034299 3 95995 965 9 44 12.96 0.016 6666 2.034 6.74528 0601 0.042151 7 71581 141 9 13 13.46 0.018 6666 2.129 7.83689 6592 0.050745 7 73517 891 8 09 14.01 0.022 6666 2.208 9.24278 0066 0.061813 7 89212 465 3 19 14.71 6666 2.282 11.4026 0.027 0.078816 7 78755 206 1491 91 15.23 0.031 3333 2.359 13.3143 7008 0.093867 3 70194 608 6 45 15.73 0.036 3333 2.408 15.4690 8311 0.110830 3 44416 803 4 89 16.26 0.043 6666 2.445 18.1531 2217 0.131961 7 60871 338 5 61

0.330 8 0.327 1831 9 0.322 3485 9 0.334 1979 5 0.341 4585 4 0.347 6485 9 0.357 9043 4 0.367 1583 2 0.374 1508 8 0.386 2205 9

Suma volumen muestras antes de q comience batch

0.0692

5.3713445 4

-0.0065

6.3026170 8

-0.0134935

8.413731

-0.00778651

10.007874 3

-0.00529221

11.946117 3

-0.00489471

16.060016 8

-0.00719511

18.371588

-0.0057928

20.945824 9

-0.00739421

23.931361 9

-0.00639261

0.403 28.278674 2233 7 0.416 8738 31.938585 4 3 0.433 8386 35.656295 8 7 0.454 39.961163 2694 8

-0.00639361

-0.00779361

-0.00779221

-0.00849221 36

12.08 16.88 0.482 8050 3333 2.492 21.8421 0.052 0.161004 8128 45.239444 3 3 21739 854 0052 36 6 4

-0.00899151

Gramos biomasa al inicio del fedbatch 1.38936

37