Informe III Unidad

G-A2 "AÑO DE LA DIVERSIFICACIÓN PRODUCTIVA Y DEL FORTALECIMIENTO DE LA EDUCACIÓN"

FACULTAD DE INGENIERÍA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA  AGROINDUSTRIAL

“INGENIERÍA DE ENZIMAS” CURSO: LAB. ING. DE BIOPROCESOS.

CICLO: VII

DOCENTE: Dr.Ing. CASTILLO CALDERON Augusto.

INTEGRANTES:     

CORTEZ CRUZ Cristhian. MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela. VEGA VIERA, Jhonas Abner ALVA DE LA CRUZ Katherine Jhovana. CRUZADO RODRIGUEZ RODRIGUEZ Febe Noemi.

UNIDAD III

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PRE- INFORME DEL EXPERIMENTO

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I.

INTRODUCCION: Las enzimas, los llamados, catalizadores de la vida, son sustancias de alta especificidad que permiten que las reacciones biológicas, normalmente poco probable, se realicen y permitan el continuo movimiento y avance de las reacciones vitales. Podría decirse que son las moléculas dadoras de vida, que han permitido la evolución de las especies a lo largo de los años. Pese a estar presentes desde el origen de la vida, su conocimiento se reduce a tan solo algunos siglos. Uno de los primeros desarrollos de este tipo se dio hacia la finalización los siglos XVIII. Se descubrió la acción química de ciertas sustancias en la digestión, así como ciertos extractos sacarificantes. A finales del siglo XIX Buchner obtuvo una solución liquida, extraída de levaduras, que cumplía la misma función fermentativa. Con esto se pudo inferir que un agente químico concreto realizaba tales cambios dentro de los microorganismos. microorganismos. Las enzimas son catalizadores de origen biológico que parecen cumplir muchos de los requisitos necesarios para impulsar esta nueva industria química: i.-son catalizadores muy activos en medios acuosos y en condiciones muy suaves de temperatura, temperatura, presión, pH, etc. 11.-son catalizadores muy específicos: pueden modificar un único substrato en una mezcla de substratos muy similares e incluso pueden discernir entre dos isómeros de una mezcla racémica de un compuesto quiral, iii.- son catalizadores muy selectivos: selectivos: pueden modificar un único enlace o un único grupo funcional en una molécula que tenga varias estructuras modificables. Así pues, las enzimas parecen en principio muy útiles para un gran numero de procesos de enorme interés social e industrial.

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II.

OBJETIVOS: Objetivos Generales:

2.1. 

Diseñar y realizar diferentes experiencias de estudios cinéticos de la enzima Inulinasa (2,1-β-D-fructan fructanohidrolasa [EC 3.2.1.7]) de un caldo crudo libre de células Kluyveromyces marxianus  NRRL Y-7571 en sus formas soluble e inmovilizada.

Objetivos Específicos:

2.2. 

Preparar reactivos y obtener curvas de calibrados de proteínas y azucares reductores DNS.



Obtener un caldo crudo Kluyveromyces marxianus NRRL Y-7571 producido por fermentación de un medio optimizado, en matraces.



Determinar el rango de linealidad y actividad enzimática (actividades volumétrica y específica) de la enzima en el caldo crudo.



Determinar los parámetros cinéticos de la enzima soluble e inmovilizada.



Inmovilizar inulinasa en geles.



Diseñar, montar y poner en marcha el sistema mini-reactor con Inulinasa inmovilizada. Analizar su comportamiento. comportamiento.

III.

CONSIDERACIONES

Para el diseño debes considerar: 

Usar soluciones concentradas de sacarosa:0.2M – 0.6M



Utilizar como soporte alginato alginato de sodio al 1.5% - 4.0% (p/v)



Usar un sistema mini-reactor enzimático por lote agitado.

Definición de UI: Una Unidad Internacional de inulinasa es aquella cantidad de enzima necesaria que hidroliza un micromol (1  ) de azucares de sacarosa por minuto a 55 °C y pH 5.0 (tampón citrato-fosfato 0.05M).

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IV.

RESUMEN: En esta practica de III unidad trataremos y enfocaremos nuestra atención en la Ingeniería de Enzimas, diseñando y realizando los mismos estudiantes diferentes experiencias de estudios cinéticos de la enzima inulinasa de un caldo crudo libre de células de Kluyveromyces marxianus NRRL Y-7571, llevaremos a cabo la obtención de curva de calibrado de proteínas (Bradford) y DNS (azucares reductores), determinaremos el rango de linealidad y actividad enzimática de la enzima en el caldo crudo e inmovilizaremos la inulinasa en geles. A partir de ellos determinaremos los parámetros cinéticos de la enzima soluble e inmovilizada, además de diseñar, y poner en marcha el sistema mini-reactor con inulinasa inmovilizada, al cual analizaremos su comportamiento. Se utilizaran soluciones concentradas de sacarosa: 0,2 M –  0.6 M y como soporte, alginato de sodio al 1.5%-4.0 % (p/v)

V.

FUNDAMENTO TEORICO:

5.1.

ENZIMAS: Los enzimas son proteínas que catalizan reacciones químicas en los seres vivos. Los enzimas son catalizadores, es decir, sustancias que, sin consumirse en

una

velocidad.

reacción, No

aumentan

hacen

factibles

notablemente las

su

reacciones

imposibles, sino que solamente aceleran las que espontáneamente podrían producirse. Ello hace posible que en condiciones fisiológicas tengan lugar reacciones

que

sin

catalizador

requerirían

condiciones extremas de presión, temperatura o pH.

5.1.1. CARACTERISTICAS DE LAS ENZIMAS: Desde el punto de vista químico, las enzimas están formadas de carbono (C), Hidrógeno (H), oxigeno (O), Nitrógeno (Ni), y Azufre (S)  combinados, pero siempre con peso molecular bastante elevado y común propiedades catalíticas específicas. Su importancia es tal que puede considerarse la vida como un "orden

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sistemático de enzimas funcionales". Cuando este orden y su  sistema funcional son alterados de algún modo, cada organismo sufre más o menos gravemente y el trastorno puede ser motivado tanto por la falta de acción como por un exceso de actividad de enzima. Las enzimas son catalizadores de naturaleza proteínica que regulan la velocidad a la cual se realizan los procesos fisiológicos, producidos por los organismos vivos. En consecuencia, las deficiencias en la función enzimática causan patologías. Las enzimas, en los sistemas biológicos constituyen las bases de las complejas y variadas reacciones que caracterizan los fenómenos vitales. La fijación de la energía solar y la síntesis de sustancias alimenticias llevadas a cabo por los vegetales dependen de las enzimas presentes en las plantas.  Los animales,  a su vez, están dotados de las enzimas que les permiten aprovechar los alimentos con fines energéticos o estructurales; las  funciones del  metabolismo interno y de la vida de relación, como la locomoción, la excitabilidad, la irritabilidad, la división celular, la reproducción, etc. Están regidas por la actividad de innumerables enzimas responsables de que las reacciones se lleven a cabo en condiciones favorables para el individuo, sin liberaciones bruscas de energía a temperaturas fijas en un medio de pH, concentración salina, etc.; prácticamente constante. A diferencia de un catalizador inorgánico que interviene en numerosas reacciones las enzimas producidas por los organismos vivos habitualmente solo catalizan un tipo de reacción o solo una reacción determinada; la especificidad de las enzimas es tan marcadas que en general actúan exclusivamente sobre sustancias que tienen una configuración precisa; por ejemplo, si solo atacan a los aminoácidos que tienen su carbono , asimétrico, con estructura L-, no muestran la menor actividad sobre formas idénticas de dichos aminoácidos, pero que sean del tipo D.

5.1.2. CINÉTICA DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS: Las reacciones químicas en los sistemas biológicos sólo ocurren en presencia de catalizadores, que son proteínas específicas denominadas enzimas. La presencia de una enzima se detecta por las reacciones específicas que cataliza. Toda reacción enzimática puede esquematizarse como sigue: E+S

[ES]

E+P

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Así, la enzima se combina con un sustrato (S) que se transforma en un producto (P). El tiempo que tarda una determinada cantidad de S en transformarse en P es lo que caracteriza a la enzima, y se denomina velocidad o actividad enzimática (v) que se define como cantidad de sustrato transformado o de producto formado en la unidad de tiempo.

Para muchas enzimas, la velocidad de catálisis, v, varía con la concentración de sustrato (S) y además depende de una constante de velocidad K y de su inversa, en la forma que muestra la fig.1 y 2.

Figura 1: representación de v en función de [S], para una enzima que obedece la cinética de MichaelisMenten.

Figura2: representación de dobles recíprocos de la cinética enzimática

Los parámetros cinéticos de una enzima, V máx. y KM  pueden calcularse utilizando distintos tipos de representación gráfica. Uno de ellos es el de dobles recíprocos que aparece en la figura 2 y se utiliza posteriormente en esta práctica. Cálculo gráfico.

Figura 3: Gráfico V vs S

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Transformamos la ecuación en la de los dobles inversos con lo que sale la ecuación de una recta, calculando sólo algunos puntos se puede obtener: 1 v0



 S    K   1  1 V   S  V  S  V 

 K m



m

En base al modelo, la velocidad de la reacción catalizada enzimáticamente será: v  = k 3 [E

– S]

El valor [E – S] no es fácilmente estimable de modo que se necesita una expresión equivalente con valores conocidos. Mediante desarrollo matemático se ha desarrollado la siguiente ecuación:

Así tendremos:

(Simplificando)

Si reordenamos la ecuación tendremos que: [S] + km = 2 [S] (despejamos) km = [S] Esto significa que la concentración del sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad es el valor de km de la enzima.

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5.1.3. EFECTO DEL PH Y DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA. -

Efecto del pH:

Afecta al estado de disociación de los grupos, aunque todas las proteínas no se ven afectadas de igual forma porque algunas no tienen grupos disociables. La mayor parte de los enzimas tienen un pH óptimo. Si hay pequeños cambios de pH no se desnaturaliza el enzima. El pH puede afectar de dos maneras: 

La unión del sustrato es mejor o peor que antes.



Que afecte a la velocidad catalítica de la reacción.

La velocidad enzimática se mide en M/t y la actividad enzimática en mol/t, y la unidad internacional mol/min, cantidad de enzima que transforma un micromol de sustrato en producto en un minuto en condiciones óptimas. Otra unidad es la cantidad enzimática que se requiere para transformar 1 mol/s y se la llama katal. -

Efecto de la temperatura:

Cuando la temperatura sube la velocidad de reacción aumenta. Existe una temperatura máxima a la cual la proteína se desnaturaliza dejando de ser funcional. La mayor parte de las enzimas se desnaturalizan a unos 50º C. La ribonucleasa se desnaturaliza a temperaturas superiores a los 70 º C.

5.2.

INULINASA:

En 1900, se observó por primera vez, que Saccharomyces marxianus, poseía la capacidad de crecer sobre sustratos que contenian inulina como fuente de carbono, hecho que se atnbuyó a la producción de un tipo de enzima, a la cual se le denominó como inulinasa (2p-D-fiuctan fructohidrolasas EC. 3.2.1.7), ya que es capaz de degradar este tipo de sustrato. Se han aislado enzimas con actividad de D-fructosidasa (inulinasa) de plantas, bacterias, hongos y levaduras. Esta actividad de inulinasa representa un uso potencial para la obtención de fructosa a nivel industrial a partir de desechos agrícolas, por lo que estas enzimas han sido estudiadas ampliamente La obtención de estas enzimas a partir de plantas presenta el inconveniente de que es muy difícil aislarlas y, además, tienen una marcada actividad de invertasa, por lo que actualmente se utilizan las enzimas de fuentes microbianas. Las enzimas del tipo inulinasa producidas por diferentes microorganismos como los hongos:  Aspergillus ficuum y

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Fusarium oxysporum; las bacterias: Bacillus subtilis; y levaduras: Candida salmenticend, Kluyveromices_fragilis y Debaryomices antarelli, además de la actividad de inulinasa,

presentan también diferentes grados de actividad de invertasa, y todas pertenecen al tipo P-hctosidasa. Estudios realizados sobre la producción de inulinasa por Kluyveromices marxianus, demostraron que el extracto de levadura es la mejor fuente de nitrógeno para la producción de esta enzima. Se ha reportado que K. fiagilis  produce cantidades equivalentes de inulinasa en un intervalo amplio de pH (3.5-6.0), que la aireación es un factor determinante para el crecimiento de esta levadura y para la producción de la enzima, y que la temperatura óptima para obtener una mayor actividad se encuentra entre 30 y 40°C. En diferentes especies de Kluyveromices se ha demostrado que a diferencia de la invertasa, la cual se encuentra principalmente dentro de la célula, la inulinasa es una glicoproteína extracelular, parcialmente asociada a la pared celular y parcialmente excretada al medio de cultivo, aunque también se ha encontrado enzima unida a la célula en cantidades apreciables. La diferencia en la localización de estas enzimas se (atribuye, principalmente, al papel fisiológico que desempeñan en el metabolismo del microorganismo que las produce. Se han desarrollado y reportado diferentes procedimientos para la purificación y caracterización de la inulinasa producida por diferentes microorganismos. En el caso de la inulinasa producida por K. fragilis, esta fue semipurificada inicialmente por Snyder y Phaff", los cuales introdujeron el uso de la relación S/I para diferenciar la actividad de inulinasa, (valores menores a 50 de esta relación, indican actividad de inulinasa); y posteriormente fue purificada por Grootwasink y colaboradores (tabla II), así como por otros investigadores. Workman y Day  purificaron la inulinasa producida por Kluyveromices fiagilis, encontrando que dicha enzima es una glicoproteina con un contenido de carbohidratos del 66% en peso, estable a 50 °C, con un pH óptimo de 4.5, cuya actividad disminuye a temperaturas mayores de 55 °C, con un pI de aproximadamente 4.0. Estos autores sugieren que además de los estudios de electroforesis, se debe considerar la determinación del punto isoeléctrico (PI) como un parámetro para demostrar la pureza de la enzima. También determinaron los valores de Km de la inulinasa sobre sacarosa (1 3.6 mM a pH 5.0) y sobre rafinosa (46.1 mM a pH 5.0), encontrando que la actividad enzimática es lnhibida por la configuración de furanosa de la fructosa, pero no mencionan

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el peso molecular de la enzima purificada, la posible conformación de ésta, y tampoco reportan datos acerca de la determinación de la Km sobre inulina .

5.2.1. HIDROLISIS ENZIMATICA DE LA INULINA: INULINASAS La inulinasa o β-1,2-fructan-fructanohidrolasa  es la enzima encargada de hidrolizar los enlaces β-1,2 fructano de la inulina. La hidrólisis completa de la inulina

lleva a la formación de fructosa y glucosa, cuya concentración es proporcional al grado de polimerización (DP) inicial de la inulina. La inulinasa puede obtenerse de dos orígenes diferentes: origen vegetal (Diente de león, achicoria, alcachofa de Jerusalén, etc.) y origen microbiano.

5.2.2. MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE INULINASAS

La inulinasa puede ejercer dos efectos sobre las moléculas de inulina, por lo que se puede clasificar dos tipos de inulinasas: endo-inulinasas y exo-inulinasas. La exoinulinasa comienza con la fragmentación de la primera molécula de D-fructosa y

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continúa hasta romper el último enlace dentro de la molécula de inulina y liberar una molécula de D-glucosa; la endo-inulinasa hace cortes internos en la molécula de inulina produciendo así inulo-oligosacáridos. La propiedad de ser endo- o exo- enzima depende de la fuente microbiana de la cual se obtuvo la inulinasa. De las diferencias en las propiedades moleculares entre los dos tipos de enzima destaca el peso molecular.

5.2.3. PROPIEDADES CINETICAS

Estudios realizados sobre la bioquímica de las inulinasas producidas por diferentes microorganismos demostraron que éstas tienen la misma especlficidad por el tipo de sustrato, pero muestran diferencias en la estabilidad, pH y temperatura óptimos para la actividad enzimática.

5.2.4.  APLICACIONES: Durante las últimas tres décadas se ha desarrollado un nuevo método de obtención de jarabes de fructosa: la hidrólisis enzimática de la inulina empleando inulinasas. El uso de inulinasas de Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus inmovilizadas en gelatina para la conversión de inulina en fructosa se ha utilizado para fabricar jarabes de alta fructosa. La conversión de inulina en fructosa produce jarabes con un 95% de fructosa.

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5.3.

INMOVILIZACION DE ENZIMAS:

La inmovilización de enzimas es una técnica que se viene estudiando desde hace mucho tiempo. Si nos remontamos al año 1916, encontramos que, dos científicos, Nelson y Griffin utilizaron preparaciones de invertasa inmovilizada por adsorción a carbón activo. Pero la historia más reciente de la utilización de estas técnicas se remonta allá por los años 50, cuando Grubhofer y Schleith inmovilizaron pepsina, carboxipeptidasa, ribonucleasa y diastasa en poliaminoestireno diazotizado. En 1956, Mitz empleó la unión iónica de catalasa a DEAE-Celulosa y más tarde, en 1963, se intentan inmovilizar los primeros compuestos por atrapamiento, por Bernfeld y Wan que realizaron preparaciones de tripsina, papaína, amilasa y ribonucleasa inmovilizadas en geles de poliacrilamida. En 1971, Gregoriadis inmovilizó amiloglucosidasa sobre liposomas (Battaner 1998.). Varios científicos, han estudiado muy a fondo todo tipo de interacciones que se establecen entre la enzima y el soporte, el tipo de grupos que se encuentran involucrados y las características más importantes de las mismas (Guisan y col. 1993). Las enzimas son biocatalizadores con excelentes propiedades para su utilización como catalizadores industriales, pero presentan algunos problemas. Uno de estos problemas es que son moléculas solubles, con lo que, su separación de los medios de reacción y su posterior reutilización puede ser complicada. Por ello se hace conveniente la inmovilización de la enzima previa a su utilización. La inmovilización de las enzimas simplifica la recuperación y reutilización del soporte, evitando la contaminación de los productos por la enzima (muy importante sobre todo en tecnología de alimentos), permite simplificar el diseño y control de los reactores, etc.

5.3.1. REACTORES CON ENZIMAS INMOVILIZADAS: Por ser este tipo de reactores únicos en cuanto a sus características y en virtud de que la ingeniería de enzimas inmovilizadas aún se encuentra en sus inicios, es muy difícil establecer generalizaciones, pues en el mejor de los casos la experiencia es limitada. En cierta forma los problemas son parecidos a los de la catálisis heterogénea clásica, pero como existen pocos casos prácticos, se toman éstos a manera de ejemplos ilustrativos. El tipo de reactor, su comportamiento cinético y la transferencia de masa son factores que afectan y determinan el proceso enzimático y su operación.

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5.3.2. COMPORTAMIENTO DE REACTORES DE ENZIMAS INMOVILIZADAS: Se puede anticipar el comportamiento de reactores ideales conociendo la cinética de la reacción y el modo de operación del reactor. Ya han sido considerados dos tipos de reactor; solo resta por analizar el batch. Los otros reactores, no ideales, generalmente se comportan en regiones delimitadas por los casos ideales. Para un reactor batch, considerando una cinética de tipo Michaelis-Menten, se puede obtener la ecuación integrada entre el tiempo cero al tiempo t:

 =   − ln(1−)   Donde t= tiempo para alcanzar la conversión X Se pueden obtener ecuaciones similares para una cinética de tipo Michaelis-Menten reversible, para casos de inhibición competitiva por producto e inhibición por sustrato.

5.4.

MÉTODO DE LOS INVERSOS O LINEWEAVER – BURKE

Emplearemos el método de los inversos o Lineweaver – Burke, para un modelo cinético simple.

El diagrama de Lineweaver-Burk   se emplea como herramienta gráfica para calcular los parámetros cinéticos de una enzima. Su utilidad consiste en que el recíproco de la cinética de Michaelis-Menten es fácilmente representable y que de él emanan mucha información de interés.

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Cuyo recíproco es:

Donde V es la velocidad de reacción, Km es la constante de Michaelis-Menten, Vmax es la velocidad máxima, y [S] es la concentración de sustrato.

La representación gráfica de Lineweaver-Burk permite identificar el Km y Vmax; el punto de corte con el  eje de ordenadas es el equivalente a la inversa de Vmax, y el de abscisas el valor de -1/Km. Fuente: Lineweaver, H; and Burk, D. (1934). «The Determination of Enzyme

Dissociation Constants». Journal of the American Chemical Society 56: 658 —666.

5.4.1. INCONVENIENTES DEL MÉTODO 



Como requiere de dobles inversos, pequeños errores experimentales pueden conducir a grandes errores. A altas concentraciones los puntos se aglutinan al principio de la gráfica.

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VI.

MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS

6.1.

Determinación de proteína: Método de Bradford a) Materiales 

Tubo de ensayo



Matraz



Celdas para espectrofotómetro



Micropipeta

b) Instrumentos y Equipos 

Balanza analítica



Espectrofotómetro

c) Reactivos

6.2.



Agua destilada



Azul de Coomassie G-250



Etanol al 98%



Ácido fosfórico al 85%



Reactivo de Bradford

Determinación de azucares reductores mediante el método del DNS a) Materiales 

Pipetas



Tubos de ensayo



Celdas



Hielo

b) Instrumentos e Equipos 

Equipo baño maría



Espectrofotómetro

c) Reactivos 

Agua destilada



DNS

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6.3.

Metodología de la obtención del caldo crudo de Kluyveromyces Marxianus NRRL Y-7571 a) Materiales 

Vaso precipitado



Probeta



Tubo para centrifuga

b) Instrumentos e Equipos 

Centrifuga



Refrigeradora



pH metro

c) Reactivos

6.4.



Levadura desecada



Fosfato de sodio

Determinación del rango de linealidad y actividad de la enzima a) Materiales 

Tubos de ensayo



Vaso precipitado



Micropipeta

b) Instrumentos e Equipos 

Cubos de hielo



Equipo de baño maría



Agitador automatico



pH metro

c) Reactivos 

Solución de sacarosa

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6.5.

Método de inmovilización de Invertasa en Alginato de Sodio a) Materiales 

Matraces



Tubos de ensayo



Vaso precipitado



Jeringa

b) Instrumentos e Equipos 

Equipo de baño maría

c) Reactivos

6.6.



Alginato de sodio



Invertasa



Solución de CaCl 2 0.1M y 0.05M

Diseño y montaje del sistema mini reactor con invertasa inmovilizada, para determinar los parámetros cinéticos de la enzima. a) Materiales      

Matraces Tubos de ensayo Pipeta Micropipeta Viales Pinzas

b) Instrumentos e Equipos     

Shaker Olla Mechero bunsen Espectrofotómetro Refrigeradora

c) Reactivos   

Buffer acetato 0.05 M, pH 4.7 Preparad Enzimático Solución de Sacarosa

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VII.

PROCEDIMIENTO:

7.1.

Determinación de proteínas: Método de Bradford

Bradford, M. 1976, un método rápido y sensible para la cuantificación de las cantidades de microgramos de proteína utilizando el principio de unión a proteínas del tinte.

0.1 azul de coomassil G-250

DISOLVER

AÑADIR

100 ml de H3PO4 al 85%

AFORAR

A 1 litro con agua destilada

AGITAR

FILTRAR

GUARDAR

Por una hora

Con al odón

En un frasco

ETIQUETAR

REPOSAR

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7.2.

Determinación de azucares reductores mediante el método de DNS

Para la preparación de este reactivo, se disuelve el tartrato en aproximadamente 20 ml de agua, paralelamente se disuelve el DNS en pequeñas cantidades con ayuda de un agitador magnético y calentando. Ambas soluciones se mezclan en un matraz aforado de 50 mL y se agita hasta la completa disolución de todos los componentes, para posteriormente aforar hasta 50 mL.

AÑADIR

1 ml de DNS

CALENTAR

Por 5 minutos

ENFRIAR

Agua helada

AÑADIR

10 ml de agua destilada

AGITAR

LEER

Absorbancia

La concentración se obtiene interceptando la medida de absorbancia en la curva de calibrado.

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La curva de calibrado para el azúcar se obtiene a partir de muestra de concentración conocida y analizadas según este procedimiento.

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7.3.

Metodología de la obtención del caldo crudo de Kluyveromyces Marxianus NRRL Y-7571

Tomamos con una jeringa 50 ml del caldo de kluveromyces marxianus que se encontraba en el biorreactor

Centrifugamos el caldo para poder eliminar las celulas de kluveromyces marxianus y quedarnos solamente con el sobrenadante, es decir un caldo crudo de inulinasa libre de celulas kluveromyces marxianus NRRL7571

Obtenemos el caldo crudo de inulinasa

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Mantenemos el caldo bajo refrigeracion

Guardamos 3 ml del caldo en viales para los demas grupos

El caldo crudo contiene sustancias químicas, subproductos o residuos que pueden inhibir la actividad catalítica de la enzima inulinasa, por ello hay que concentrar para que la actividad enzimática aumente, es decir aumentar el poder catalítico de la enzima.

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7.4.

Determinación del rango de linealidad y actividad enzimática (actividades volumétrica y específica) de la enzima en el caldo crudo.

La experiencia se realizará a diferentes diluciones del extracto bruto enzimático, 1:1, 1:2, 1:3………, se graficará la concentración de Sustrato o Producto contra

Tiempo de reacción y se expresará correctamente los valores de las actividades volumétrica (UI/ml) y específica (UI/mg).

5 Tubos de ensayo

PREPARAR

AGREGAR

2,9 ml de solución sacarosa

COLOCAR

A baño maría (40ªC  –  3 min)

AGREGAR

0.1 ml caldo crudo

CALENTAR

Por 3 min a 100ªC

LLEVARLOS

DETERMINAR

Refrigeración

Azúcares reductores

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7.5.

Método de inmovilización de invertasa en alginato de sodio El método de inmovilización es por unión química. Se debe procurar que la inmovilización incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibición, amplia el intervalo de pH óptimo y reduce las posibles contaminaciones microbianas.

Solución de alginato de sodio 2%

PREPARAR

CALENTAR

15 min a 80ªC

MEZCLAR

1 ml de invertasa y cargar en una jeringa

GOTEAR

La mezcla en 30 ml de solución CaCl2

REPOSAR

En refri eración or 30 min

LAVARLOS

Con solución CaCl2 al 0.5 M

EMPACAR

Dentro de un mini reactor

TOMAR

1020 ml por cada 4 horas

PONER

A hervir por 3 min y enfriar

REALIZAR

Curva de DNS

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En la práctica de inmovilización de inulinasa, se utilizó un mini-reactor. Este está comprendido por un recipiente rígido de vidrio, el cual desempeña la función de un reactor por lotes. Este está empacado por otro recipiente más grande el cual cumple la función de chaqueta térmica, que va permitir mantener la temperatura ideal de reacción enzimática

En la figura también se puede notar unas mangueras, las cuales permiten el transporte del oxígeno, ya que la baja solubilidad del oxígeno en el medio acuoso significa que éste debe suministrarse de manera continua mientras se elimina el dióxido de carbono y otros gases producidos en el proceso. El agitador magnético cumple la función de homogenizar, ya que si el reactor está bien mezclado, el roducto osee la misma com osición ue el lí uido resente en el reactor.

Baño María a 45°C

Ingreso de oxigeno

Agitador magnético

Salida de CO2 otros ases

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INMOVILIZACION DE ENZIMAS METODO (ATRAPAMIENTO EN GEL)

FUNDAMENTO TEORICO: El método de inmovilización es por unión química. Se debe procurar que la inmovilización incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibición, amplia el intervalo de pH óptimo y reduce las posibles contaminaciones microbianas.

MATERIALES: Alginato de sódio al 2% Solución de CaCl2 0,1M y 0,5M. Jeringa Matraces Mechero Mini-reactor

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UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL PRIMERA ETAPA: 25ml agua destilada

PREPARAR

Una disolución de 25ml de Alginato de Sodio al 5%

0.5g alginato

CALENTAR

En baño María a 80ºC por algunos minutos

AGITAR

Con la varilla, hasta que se diluya toda la solucion

COLOCAR

En la estufa durante 15 minutos

ENFRIAR

A baño María a 45ºC por 5 minutos

DIVIDIR

Lo obtenido en 3 vasos pequeños para cada grupo(A, B y C)

5ml de solución

5ml de solución

OBTENER

Del vasito correspondiente para nuestro grupo.

AGREGAR

Vaso precipitado

COLOCAR

A 45ºC en baño María

AGITAR

Con la varilla hasta obtener una solución

1ml caldo crudo

uniforme

UNIDAD III

30

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

SEGUNDA ETAPA:

COLOCAR

En el agitador magnético un vaso a baño con hielo

35ml CaCl2

COLOCAR

A una bureta completando con 15ml de agua destilada

(0.1M)

AGREGAR

Al vaso a baño con hielo en el agitador magnetico

TERCERA ETAPA: EXTRAER

5ml con la jeringa de lo obtenido en la primera etapa

AGREGAR

Al vaso de la segunda etapa que se encuentra en el agitador GOTA A GOTA

DEJAR

Reposar en refrigeración por 2 horas

LAVAR

Con CaCl2 los beats

ELIMINAR

El sobrenadante

COLOCAR

Los beats en el vaso en el agitador

UNIDAD III

31

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

CUARTA ETAPA (En el mini-reactor): 45ml Sacarosa

AGREGAR

Al mini-reactor que se encuentra a 55ºC

TOMAR

Muestras cada 30 minutos durante 4 horas

HERVIR

Cada muestra por 3 minutos

Beats, 20ml tam on

ENFRIAR

En agua helada

GUARDAR

Cada muestra en cada vial

LEER

Absorbancias tras haber realizado DNS con las 8 muestras tomadas.

UNIDAD III

32

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

PROCEDIMIENTO Y GRAFICOS

MÉTODO DE INMOVILIZACIÓN DE INVERTASA EN ALGINATO DE SODIO

1

•Prepara

una disolución de alginato de sodio al 2% y calentar a 80ºC por 15 minutos y luego enfriar a 45ºC.

2

•De

la disolución anterior tomar 5 mL, mezclar con 1 mL del preparado invertasa y cargar toda una jeringa provista de aguja.

3 •Con

la jeringa gotear la mezcla dentro de 30 mL de solución agitada de CaCl20.1 M.

UNIDAD III

33

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

4

•Empacar

los   “beads” dentro del minireactor a 40°C, que tiene 20ml de tampon y 25ml std.

5

•

Luego tomar 1000ul de muestra cada 30min por 4 horas.

6 •

Cada muestra se pone a hervir por 3min, luego se enfría en agua helada y guardar en cada vial.

Finalmente realizar DNS a las 8 muestras obtenidas

UNIDAD III

34

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

RESULTADOS 1. DETERMINACION DEL RANGO DE LINEALIDAD Y ACTIVIDAD ENZIMATICA Cuando se efectúa una reacción enzimática, se observa, un aumento en la concentración del producto y una disminución en la concentración del sustrato hasta que la reacción termina o alcanza su punto de equilibrio. Se trabajó a diferentes concentraciones de enzima. Donde obtuvimos absorbancias de las muestras, a diferentes concentraciones de enzima para diferentes tiempos donde a cada uno se le restó el error de los blancos de enzima y sustrato, y obtuvimos nuevos datos los cuales son mostrados a continuación:

TABLA A.1-GRUPO A: DATOS DE ABSORVACIA PARA LA DETERMINACIÓN DEL RANGO DE LINEALIDAD Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA ENZIMA EN EL CALDO CRUDO (SOLUCION SATD. SACAROSA 20 G/L) A-3 Tiempo (h) 0 0.08 0.17 0.25 0.33

Tiempo (Min)

Tubo

0 5 10 15 20

1 2 3 4 5

Blanco sustrato Blanco enzima

Lectura (540 nm) 0.787 0.395 0.79 0.506 0.495 0.037 0.003

A-2 Lectura (540 nm) 0.383 0.696 1.234 0.794 0.976 0.002 0.036

A-1 Lectura (540 nm) 0.575 0.635 0.977 1.135 1.203 0.043 0.055

TABLA A.1-GRUPO B: DATOS DE ABSORVACIA PARA LA DETERMINACIÓN DEL RANGO DE LINEALIDAD Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA ENZIMA EN EL CALDO CRUDO (SOLUCION SATD. SACAROSA 20 G/L)

Tiempo (h) 0 0.08 0.17 0.25 0.33

Tiempo (Min)

Tubo

0 5 10 15 20

1 2 3 4 5

Blanco sustrato Blanco enzima

B-3

B-2

Lectura (540 nm) 0.151 0.314 0.675 0.462 0.479 0.071 0.018

Lectura (540 nm) 0.079 0.562 0.9 0.693 0.785 0.053 -0.006

B-1 Lectura (540 nm) 0.065 0.655 0.416 0.739 0.864 0.039 0.002

UNIDAD III

35

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

TABLA A.1-GRUPO C: DATOS DE ABSORVACIA PARA LA DETERMINACIÓN DEL RANGO DE LINEALIDAD Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA ENZIMA EN EL CALDO CRUDO (SOLUCION SATD. SACAROSA 20 G/L)

Tiempo (h)

Tiempo (Min)

Tubo

0

0

1

0.08

5

2

0.17

10

3

0.25

15

4

0.33

20

5

Blanco sustrato Blanco enzima

C-3

B-2

Lectura (540 nm)

Lectura (540 nm)

0.155

0.221

0.389

0.398

0.599

0.749

0.411

0.375

0.45

0.618

0.011

0.042

0.075

-0.008

DETERMINACIÓN DEL RANGO DE LINEALIDAD DE LA ENZIMA Para determinar la actividad de la enzima, tenemos que obtener la cantidad de producto (azucares reductores) que estas degradando a partir del sustrato Sacarosa. Así tenemos que:

 )  = ∆ ( ∆ ∗ 

Tenemos que: CURVA DE CALIBRADO DE AZUCARES REDUCTORES ABS= A(AZUCARES REDUCTORES) + B ABS=0.6012 Azucares reductores +0.0037

Donde: A: PENDIENTE=0.6012 B: INTERCEPTO=0.0037 Así tendremos:

– 0.0037    = .0.6012 UNIDAD III

36

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

TABLA A.1-GRUPO A: OBTENCIÓN DEL PRODUCTO EN LA DETERMINACIÓN DEL RANGO DE LINEALIDAD Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA ENZIMA EN EL CALDO CRUDO (SOLUCION SATD. SACAROSA 20 G/L)  A-3 1:4 TIEMPO Tubo (Min)

ABS (540 nm)

P (g/L)

P' (g/L)

A-2 1:2 P'' (g/L)

 A-1 1:1

ABS (540 nm)

P (g/L)

P' (g/L)

P'' (g/L)

ABS (540 nm)

P (g/L)

P' (g/L)

P'' (g/L)

0

1

0.787

1.315

1.315 1.236

0.383

0.643

0.643

0.568

0.575

0.963

0.963

0.787

5

2

0.395

0.663

2.653 2.574

0.696

1.164

5.819

5.744

0.635

1.062 10.624

10.448

10

3

0.79

1.320

5.281 5.202

1.234

2.059 10.294 10.218

0.977

1.631 16.312

16.137

15

4

0.506

0.848

6.782 6.704

0.794

1.327 13.268 13.193

1.135

1.894 18.940

18.765

 20

5

0.495

0.830

6.636 6.557

0.976

1.630 16.296 16.220

1.203

2.007 20.072

19.896

Blanco sustrato

0.037

0.068

0.068

0.002

0.009

0.009

0.043

0.078

0.078

Blanco enzima

0.003

0.011

0.011

0.036

0.066

0.066

0.055

0.098

0.098

UNIDAD III

37

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

TABLA A.1-GRUPO B: OBTENCIÓN DEL PRODUCTO EN LA DETERMINACIÓN DEL RANGO DE LINEALIDAD Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA ENZIMA EN EL CALDO CRUDO (SOLUCION SATD. SACAROSA 20 G/L) B-3 1:4 TIEMPO Tubo (Min)

B-2 1:2

B-1 1:1

ABS (540 nm)

P (g/L)

P' (g/L)

P'' (g/L)

ABS (540 nm)

P (g/L)

P' (g/L)

P'' (g/L)

ABS (540 nm)

P (g/L)

P' (g/L)

P'' (g/L)

0

1

0.151

0.257

0.257

0.097

0.079

0.138

0.138

0.047

0.065

0.114

0.114

0.034

5

2

0.314

0.528

2.114

1.953

0.562

0.941

9.410

9.319

0.655

1.096

5.478

5.398

10

3

0.675

1.129

4.516

4.355

0.900

1.503

15.032

14.941

0.416

0.698

6.981

6.901

15

4

0.462

0.775

6.197

6.037

0.693

1.159

17.383

17.292

0.739

1.235

12.354

12.273

20

5

0.479

0.803

6.423

6.263

0.785

1.312

19.678

19.588

0.864

1.443

14.433

14.352

Blanco sustrato

0.0710

0.1243

0.1243

0.053

0.094

0.094

0.039

0.071

0.071

Blanco enzima

0.0180

0.0361

0.0361

-0.006

-0.004

-0.004

0.002

0.009

0.009

UNIDAD III

38

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

TABLA A.1-GRUPO B: OBTENCIÓN DEL PRODUCTO EN LA DETERMINACIÓN DEL RANGO DE LINEALIDAD Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA ENZIMA EN EL CALDO CRUDO (SOLUCION SATD. SACAROSA 20 G/L) C-3 1:5

C-2 1:3

TIEMPO (Min)

Tubo

ABS (540 nm)

P (g/L)

P' (g/L)

P'' (g/L)

ABS (540 nm)

P (g/L)

P' (g/L)

P'' (g/L)

0

1

0.155

0.264

0.264

0.109

0.221

0.374

0.374

0.218

5

2

0.389

0.653

2.613

2.457

0.398

0.668

3.341

3.185

10

3

0.599

1.002

4.010

3.855

0.749

1.252

6.260

6.105

15

4

0.411

0.690

5.518

5.363

0.375

0.630

6.299

6.144

20

5

0.450

0.755

6.037

5.882

0.618

1.034

10.341

10.186

Blanco sustrato

0.011

0.024

0.024

0.042

0.076

0.076

Blanco enzima

0.075

0.131

0.131

-0.008

-0.007

-0.007

UNIDAD III

39

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

FIGURA A.2 - GRUPO A: PERFIL PARA DETERMINAR EL VALOR DEL PRODUCTO Y ATRAVES DE ESO DETERMINAR RANGO DE LINEALIDAD Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA ENZIMA EN EL CALDO CRUDO (SOLUCION SATD. SACAROSA 20 G/L) 25.000

20.000

    ) 15.000    L     /    g     (    P

10.000

5.000

0.000 0

5

10

15

20

25

Tiempo (min) (1:4)

"(1:2)"

"(1:1)"

FIGURA A.2 – GRUPO B: PERFIL PARA DETERMINAR EL VALOR DEL PRODUCTO Y ATRAVES DE ESO DETERMINAR RANGO DE LINEALIDAD Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA ENZIMA EN EL CALDO CRUDO (SOLUCION SATD. SACAROSA 20 G/L) 20 18 16 14     )     L     /    g     (

12 10

    P

8

6 4 2 0 0

5

10

15

20

B-1 1:2

C-2 1:3

25

Tiempo (min) B-3 1:4

B-2 1:1

UNIDAD III

40

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

FIGURA A.2 – GRUPO C: PERFIL PARA P ARA DETERMINAR EL VALOR DEL PRODUCTO Y ATRAVES DE ESO DETERMINAR RANGO DE LINEALIDAD Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA ENZIMA EN EL CALDO CRUDO (SOLUCION SATD. SACAROSA 20 G/L) 7.000

6.000 5.000     )     L     /    g     (

4.000 3.000

    P

2.000 1.000 0.000 0

5

10 Tiempo (min)

15

20

C-3 1:5

La Gráfica nos indica el rango de linealidad de la enzima; la curva obtenida se basa en la reacción enzimática enzimática y su dependencia con el tiempo. La forma de la curva representa la velocidad de formación de productos en el tiempo a diferentes concentraciones de enzima, los cuales demuestran que a una mayor concentración de enzimas el rango de linealidad de reacción es mayor y por lo tanto mantiene su capacidad catalítica durante más tiempo y mientras éste se vaya diluyendo la capacidad catalítica de la enzima disminuye, entonces entonces diríamos si se trabajara con diluciones menores, como lo realizó el grupo A-3 (1:4), A-2 demostraríamos que a una mayor concentración (1:4), A-2 (1:2) y A-1 (1:1) demostraríamos de enzimas el rango de linealidad de reacción es mayor y por lo tanto mantiene su capacidad catalítica durante más tiempo y mientras éste se vaya diluyendo la capacidad catalítica de la enzima disminuye. Inicialmente, Inicialmente, las reacciones transcurren linealmente, linealmente, pudiéndose tomar la pendiente de esta recta como velocidad velocidad inicial .A(1:1) y B(1:1) tiempos tiempos mas largos, el progreso de la reacción se aparta de la linealidad. Esta caída de la velocidad de reaccion se debe a la disminución significativa de la concentración de sustrato, aunque tambien puede influir otros factores como el aumento de la concentración de producto, cambios de pH,

UNIDAD III

41

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

inactivación de enzima, etc. La máxima fiabilidad en la determinación de la actividad de un enzima la suministra el valor de velocidad inicial o velocidad durante el tramo inicial de progreso lineal de la reacción. La actividad catalítica de la enzima depende tanto de su capacidad de adsorción sobre el sustrato, como de la formación del complejo activo enzima-sustrato. Este último aspecto estará controlado por aquellos factores que afectan a la accesibilidad del sustrato (configuración física, morfología, cristalinidad y estructura química), a las características de la proteína enzimática a las concentraciones relativas de sustrato y enzima, así como de los parámetros físicos de reacción como temperatura y transferencia de masa. La literatura para explicar la hidrólisis de la sacarosa, mediante la Inulinasa nos dice:

El proceso de extracción de la inulinasa, además de determinar el rendimiento y si la enzima es extracelular o intracelular, determina otras características como su peso molecular (MW), su modo de acción sobre la molécula de inulina, su actividad hidrolítica sobre la sacarosa, respuesta a los cambios de pH y temperatura, propiedades cinéticas y efecto de la concentración de sustrato (Chi et al., 2009). Se ha determinado que las inulinasas pueden ejercer dos modos de acción diferentes sobre la molécula de inulina, una acción extrema y una acción interna, correspondiendo dos clases de inulinasas llamadas exo-inulinasas y endo-inulinasas respectivamente. Las exo-inulinasas (74 KDa, pH 5.1 –  7.0) empiezan con la separación de la primera molécula de D-fructosa y va hasta el último enlace para liberar glucosa de la unidad de sacarosa y la endo-inulinasa (64 KDa) actúa sobre enlaces internos y rinde un conjunto de inulo-oligosacáridos (inulotriosa, inulotetrosa y inulopentosa) pero sin actividad invertasa. Estas propiedades dependen del origen microbiano de la enzima. De este punto de vista la mejor cepa sería la que tenga ambas propiedades, como el caso del A. ficuum (Pandey et al., 1999), dado que una mezcla de endo y exo inulinasa puede resultar en una mejor conversión de inulina a fructosa que solo utilizar enzimas puras aisladas, dado que las endo-inulinasas romperían las moléculas de inulina en muchos oligosacáridos, aumentando así los puntos de ataque para las exo-inulinasas, con el consecuente incremento de la velocidad de reacción de inulina a fructosa.

UNIDAD III

42

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

Por tanto queda probado que las exo-inulinasas también ejercen actividad catalítica sobre la sacarosa, desdoblándola en glucosa y fructosa, es decir tienen actividad de invertasa. Se afirma que la actividad invertasa es mayor en enzimas producidas por levaduras que en aquellas obtenidas a partir de mohos (Ricca et al., 2007). Notoriamente una actividad invertasa de inulinasa es deseable. Laloux et al. (1991) sostienen que las inulinasas poseen sitios catalíticos comunes, pero diferentes sitios de enlace para la hidrólisis de inulina y sacarosa. La actividad y estabilidad depende de la respuesta de la enzima a los cambios de temperatura y pH. Los valores de temperatura y pH dependen del tipo de microorganismo usado como fuente, generalmente se da valores más altos para bacterias y levaduras que mohos. Así se tienen los rango de valores de pH, para mohos 4.5 – 7.0, para levaduras 4.4- 6.5 y para las bacterias 4.8 – 7.0 (Ricca et al., 2007). Singh et al. (2007b), determinaron que la exo-inulinasa de Kluyveromyces marxianus YS-1 exhibió considerable actividad a un valor de pH óptimo de 5.5 en que mantuvo estable su actividad catalítica al 100% durante 3 h a la temperatura óptima de 50 ºC. Se observa que todavía existe la necesidad de investigar la actividad y estabilidad de la inulinasa contra la temperatura, así como los modelamientos y simulación de procesos o cinética de desactivación de la enzima.

Efecto de la temperatura: La temperatura es un factor que puede influir considerablemente en la velocidad de la reacción. Los pequeños cambios tienen una influencia considerable. La temperatura óptima para la mayoría de las reacciones está entre los 30 a 40º C. Cuando la temperatura llega a cierto valor variable, según la enzima de que se trate, esta empieza a desnaturalizarse y la velocidad de las reacciones comienza a disminuir. La temperatura óptima es la resultante de dos procesos: el incremento de la velocidad de reacción con la temperatura y el incremento de la desnaturalización térmica de la enzima por encima de la temperatura crítica. La mayor parte de las enzimas se inactivan a temperaturas superiores a 55 – 60º C. es por ello que en la presenta práctica se trabajó a una temperatura de 55 ºC.

UNIDAD III

43

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS Efecto del pH:

La mayor parte de las enzimas tienen un pH característico en el cual su actividad es máxima. Ese pH se llama pH óptimo. Por encima y por debajo de este pH la actividad declina. La curva de actividad de la Enzimas con el pH tiene generalmente una forma acampanada. Cuando los valores de pH son muy ácidos o muy alcalinos, no solo se modifica el sitio activo, sino que se altera la estructura terciaria de toda molécula, pudiendo llegar a la desnaturalización y no habrá actividad enzimática. Mientras que en la práctica utilizamos una solución tampón citrato-fosfato 0.05M a un pH de 5.

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA (ACTIVIDADES VOLUMÉTRICA Y ESPECÍFICA) DE LA ENZIMA EN EL CALDO CRUDO. Cinética enzimática:

Se entiende por cinética enzimática, el análisis cuantitativo del efecto de cada uno de los factores que intervienen en la expresión de la actividad enzimática, evaluada a través de la velocidad de la reacción catalizada. Las variables más importantes en cinética enzimática son el tiempo de hidrólisis, la concentración de enzima, de sustrato y la temperatura Ahora, calculamos la actividad enzimática, a partir de:

     ∗   =  ∗ () ∗ ∗ ∗  ∗   

UNIDAD III

44

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

18

18

y = 1.535x + 1.4494 R² = 0.9782

16

14

14 12     )     L     /    g     (

12

y = 0.965x + 0.6846 R² = 0.9982

10

    P

y = 0.7102x + 0.689 R² = 0.9713

y = 1.4894x + 0.6554 R² = 0.9804

16

    )     L     /    g     (

8

10

    P

y = 0.5886x + 0.3129 R² = 1

8 6

6

4

4 y = 0.3806x + 1.0745 R² = 0.9838

2

y = 0.4044x + 0.0775 R² = 0.9957

2 0

0 0

5

A-3 1:4

10 Tiempo (min) A-2 1:2

15

0

20

B-3 1:4

A-1 1:1

TABLA A.4-GRUPO A: RESULTADOS DE LA DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ATRAVES DE LA PENDIENTE DE LA GRÁFICA (SOLUCION SATD. SACAROSA 20 G/L)  

DILUCION

PENDIENTE RL (g/l.hr.)

PENDIENTE e (g/l)

t (min) linealidad

 A-1  A-2  A-3

E 1:1

1.5350

0.2169

10

E 1:2 E 1:4

0.9650 0.3806

0.2169 0.2169

10 15

5

B-2 1:1

B-1 1:2

20

25

C-2 1:3

TABLA A.5-GRUPO B: RESULTADOS DE LA DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ATRAVES DE LA PENDIENTE DE LA GRÁFICA (SOLUCION SATD. SACAROSA 20 G/L) DILUCION B-2 B-1 C-2 B-3

UNIDAD III

10 15 Tiempo (min)

E 1:1 E 1:2 E 1:3 E 1:4

45

PENDIENTE RL (g/l.hr.) 1.4894 0.7102 0.5886 0.4044

PENDIENTE e (g/l) 0.3797 0.3797 0.3797 0.3797

t (min) linealidad

10 20 10 15

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS 6.000

5.000

4.000 y = 0.3432x + 0.3719 R² = 0.9844

    )     L     /    g     (

3.000

    P

2.000

1.000

0.000 0

2

4

6

Series2

8 10 Tiempo (min)

12

14

16

Linear (Series2)

TABLA A.6-GRUPO C: RESULTADOS DE LA DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ATRAVES DE LA PENDIENTE DE LA GRÁFICA (SOLUCION SATD. SACAROSA 20 G/L) DILUCION

PENDIENTE RL (g/l.hr.)

PENDIENTE e (g/l)

t (min) linealidad

E 1:5

0.3432

0.0545

15

C-3

La actividad volumétrica se determina para los rangos de linealidad, indicando la cantidad de enzima que es capaz de transformar 1 micromol de sustrato en un minuto. La actividad específica se determina para los rangos de linealidad, indicando que para cada miligramo de proteína hay una cantidad de enzimas que transforman 1 micromol de sustrato en un minuto Ahora, si queremos determinar la actividad específica, tendremos que determinar la concentración de enzima en mg/ml, a partir de:

UNIDAD III

46

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

CURVA DE CALIBRADO DE PROTEINAS (GRUPO A) ABS= A(PROTEINA) + B

y = 0.4187x - 0.0068 Donde: A: PENDIENTE=8.0803 B: INTERCEPTO=0.1062 Así tendremos:

+ 0.0068 (/) =  0.4187 Tiempo (hr)

mg Proteina/L caldo

CONCENT PROTEINA (g/L)

ABS(595nm)

0 2 4 6

154.765

0.155

0.058

133.270

0.133

0.049

116.551

0.117

0.042

83.114

0.083

0.028

8 10 12 24 26 28 30

319.561

0.320

0.127

142.823

0.143

0.053

321.949

0.322

0.128

209.697

0.210

0.081

114.163

0.114

0.041

221.638

0.222

0.086

216.862

0.217(PROMEDIO)

0.084



Entonces, tendremos que:

DILUCION

PENDIENTE RL (g/l.min.)

 A-1

E 1:1

1.5350

 A-2

E 1:2

 A-3

E 1:4

PENDIENTE E (g/l)

 ACVTIVIDAD (UI/ml)

 A.E (UI/mg)

0.2169

25.583

25.583

0.9650

0.2169

16.084

32.168

0.3806

0.2169

6.343

25.373

UNIDAD III

47

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

CURVA DE CALIBRADO DE PROTEINAS (GRUPO B) ABS= A(PROTEINA) + B

y = 0.4187x - 0.0068 Donde: A: PENDIENTE= 0.4187 B: INTERCEPTO= -0.0068 Así tendremos:

+ 0.0068  =  0.4187 mg Proteina/L caldo

1:1

Tiempo (hr) 0

1:3 1:5

Dilucion



 ABS(595nm)

147.600

CONCENT PROTEINA (g/L) 0.148

2

306.663

0.307

0.036

4

379.747

0.380(PROMEDIO)

0.025

0.055

Entonces, tendremos que:

DILUCION

PENDIENTE RL (g/l.min.)

B-2

E 1:1

1.4894

B-1

E 1:2

C-2 B-3

PENDIENTE E (g/l)

 ACVTIVIDAD (UI/ml)

 A.E (UI/mg)

0.3797

24.8234

24.8234

0.7102

0.3797

11.8375

23.6750

E 1:3

0.5886

0.3797

9.8104

29.4311

E 1:4

0.4044

0.3797

6.7402

26.9610

UNIDAD III

48

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

CURVA DE CALIBRADO DE PROTEINAS (GRUPO C) ABS= A(PROTEINA) + B

y = 0.4187x - 0.0068 Donde: A: PENDIENTE= 0.4187 B: INTERCEPTO= -0.0068 Así tendremos:

− 0.0068  = − 0.4187 mg Proteina/L caldo

"1:1"

Tiempo (hr) 0

 ABS(595nm)

95.056

CONCENT PROTEINA (g/L) 0.095

"1:2"

2

95.056

0.095

0.033

"1:3"

4

133.270

0.133

0.049

"1:4"

6

54.454

0.054(PROMEDIO)

0.016

Dilucion



C-3

0.033

Entonces, tendremos que:

DILUCION

PENDIENTE RL (g/l.min.)

E 1:5

0.3432

PENDIENTE E (g/l) 0.0545

 ACVTIVIDAD (UI/ml)

 A.E (UI/mg)

5.720

28.600

FIGURA A.3 – GRUPO A,B y C: PERFIL Que muestra la actividad específica versus concentración de enzima de la SOLUCION SATD. SACAROSA 20 G/L.

UNIDAD III

49

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS 30.000 25.000     )    g    m20.000     /    I    U     (     d 15.000    a     d    i    v    i    t 10.000    c    A

5.000 0.000 E 1:1

E 1:1

E 1:2

E 1:2

E 1:3

E 1:4

E 1:4

E 1:5

CONCENTRACION DE ENZIMA

 A-1 B-2  A-2 B-1 C-2 B-3  A-3 C-3

[ ] de Enzima E 1:1 E 1:1 E 1:2 E 1:2 E 1:3 E 1:4 E 1:4 E 1:5

av (UI/ml) 25,583 24,8234 16,084 11,8375 9,8104 6,7402 6,343 5,720

ae (UI/mg) 25,583 24,8234 32,168 23,6750 29,4311 26,9610 25,373 28,600

La Gráfica anterior nos indica que la actividad catalítica de la enzima no sólo se ve afectada por el tiempo, sino también va disminuyendo conforme la concentración de la misma disminuya en el medio, ya que mientras más diluida se encuentre menor será el poder catalítico. Por otro lado, si la concentración de la enzima aumenta la actividad aumenta. Es decir la actividad se hace mayor cuando el extracto enzimático no está diluido, pero cuando se hace diluciones, la actividad disminuye. Esto se hace principalmente con el fin de poder obtener mayor linealidad a cualquier concentración de enzima, empleando menores tiempos.

UNIDAD III

50

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

2. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS: MÉTODO DE BRADFOR

1. GRUPO A La curva de calibrado se obtiene a partir de muestras de concentración conocida de una solución estándar de albumina suero de bovino y analizadas según este procedimiento

Nº 1 2 3 4 5 6 7 8

sol. Std (µl) 100 80 60 50 40 20 10 0

TAMPON (µl) 0 20 40 50 60 80 90 100

CONCENT PROTEINA (g/L) 0.5 0.4 0.3 0.25 0.2 0.1 0.05 0

Absorbancia leída 595 nm 0.796 0.729 0.683 0.667 0.657 0.617 0.589 0.577

Absorbancia corregida 0.219 0.152 0.106 0.090 0.080 0.040 0.012 0.000

0.250 y = 0.4187x - 0.0068 R² = 0.9825

0.200

0.150    a    i    c    n    a     b    r    o    s     b    A

CURVA DE CALIBRADO DE BRADFORD

0.100

Linear (CURVA DE CALIBRADO DE BRADFORD)

0.050

0.000 0 -0.050

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

[] g/L

Representación lineal de absorbancia, con respecto a la concentración de albúmina en cada tubo.

UNIDAD III

51

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

PARA DETERMINAR:

e

mg (enzima ) 

ሾ ሿ/= +. .

ml (enzima ) Conc. Proteína a 30h

Nº

Tiempo (hr)

mg Proteína/L caldo

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

0 2 4 6 8 10 12 24 26 28 30

154.765 133.270 116.551 83.114 319.561 142.823 321.949 209.697 114.163 221.638 216.862

0.216861715

CONCENT PROTEINA (g/L) 0.155 0.133 0.117 0.083 0.320 0.143 0.322 0.210 0.114 0.222 0.217

ABS(595nm)

0.058 0.049 0.042 0.028 0.127 0.053 0.128 0.081 0.041 0.086 0.084

0.14 y = 0.4187x - 0.0068 R² = 1

0.12 0.1 0.08

   S    B    A

0.06 0.04 0.02 0 0.000

0.050

0.100

0.150

0.200

0.250

0.300

0.350

[ ]P

UNIDAD III

52

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

2. GRUPO B Nº sol. Std (µl) TAMPON (µl)

CONCENT PROTEINA (g/L)

Absorbancia leida

 Absorbancia corregida

1

100

0

0.5

0.796

0.219

2 3 5

80 60 50 40

20 40 50 60

0.4 0.3 0.25 0.2

0.729 0.683 0.667 0.657

0.152 0.106 0.090 0.080

6

20

80

0.1

0.617

0.040

7

10

90

0.05

0.589

0.012

8

0

100

0

0.577

0.000

4

0.250 y = 0.4187x - 0.0068 R² = 0.9825

0.200

0.150    a    i    c    n    a     b    r    o    s     b    A

CURVA DE CALIBRADO DE BRADFORD

0.100

Linear (CURVA DE CALIBRADO DE BRADFORD)

0.050

0.000 0

0.1

0.2

-0.050

0.3

0.4

0.5

0.6

[] g/L

PARA DETERMINAR:

ሾ ሿ/= +. . UNIDAD III

53

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

Conc. Proteina a 30h

Nº 1 2 3

Tiempo (hr) 0 2 4

0.379746835

mg Proteina/L caldo

147.600 306.663 379.747

CONCENT PROTEINA (g/L) 0.148 0.307 0.380

ABS(595nm)

0.055 0.036 0.025

a) Concentración Proteínica vs. Absorbancia 0.06 0.05 0.04    S    B0.03    A

0.02

y = -0.0001x + 0.0742 R² = 0.9967

0.01 0 0.000

50.000 100.000 150.000 200.000 250.000 300.000 350.000 400.000

P (Mg proteina/Lcaldo)

b) Mg de proteínas vs. Absorbancia 0.06 0.05 0.04    S    B0.03    A

y = -0.1276x + 0.0742 R² = 0.9967

0.02 0.01 0 0.000

0.050

0.100

0.150

0.200

0.250

0.300

0.350

0.400

[ ]P

UNIDAD III

54

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

3. GRUPO C Nº sol. Std (µl) TAMPON (µl)

CONCENT PROTEINA (g/L)

Absorbancia leida

 Absorbancia corregida

1

100

0

0.5

0.796

0.219

2 3 5 6

80 60 50 40 20

20 40 50 60 80

0.4 0.3 0.25 0.2 0.1

0.729 0.683 0.667 0.657 0.617

0.152 0.106 0.090 0.080 0.040

7

10

90

0.05

0.589

0.012

8

0

100

0

0.577

0.000

4

0.250 y = 0.4187x - 0.0068 R² = 0.9825

0.200    a    i    c    n    a     b    r    o    s     b    A

0.150 0.100

CURVA DE CALIBRADO DE BRADFORD

0.050

Linear (CURVA DE CALIBRADO DE BRADFORD)

0.000 0

0.1

0.2

-0.050

0.3

0.4

0.5

0.6

[] g/L

PARA DETERMINAR:

ሾ ሿ/= +. . UNIDAD III

55

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

Conc. Proteina a 30h

0.054454263

Nº

Tiempo (hr)

mg Proteina/L caldo

CONCENT PROTEINA (g/L)

ABS(595nm)

1

0

95.056

0.095

0.033

2

2

95.056

0.095

0.033

3

4

133.270

0.133

0.049

4

6

54.454

0.054

0.016

a) Concentración Proteínica vs. Absorbancia 0.06 0.05

y = 0.4187x - 0.0068 R² = 1

0.04    S    B0.03    A

0.02 0.01 0 0.000

0.020

0.040

0.060

0.080

0.100

0.120

0.140

[ ]P

b) Mg de proteínas vs. Absorbancia 0.06 0.05 y = 0.0004x - 0.0068 R² = 1

0.04    S    B0.03    A

0.02 0.01 0 0.000

20.000

40.000

60.000

80.000

100.000 120.000 140.000

P (Mg proteina/Lcaldo)

UNIDAD III

56

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

# Muestra

Sol. A (ml) Sol. B (ml)

Sol. C (ml) Conc. Sacarosa (g/L)

1

26

1

3

2,00

2-A

23

1

6

4,00

3-B

20

1

9

6,00

4-C

18

1

11

7,33

5-A

15

1

14

9,33

6-B

12

1

17

11,33

7-C

9

1

20

13,33

8-A

6

1

23

15,33

9-B

3

1

26

17,33

10 - C

0

1

29

19,33

ABSORBANCIAS

min

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0

0,079

0,098

0,146

0,149

0,092

0,141

0,109

0,369

0,201

2

0,136

0,141

0,103

0,148

0,102

0,050

0,05

0,058

0,087

6

0,291

0,352

0,278

0,326

0,204

0,125

0,181

0,161

0,235

10

0,407

0,503

0,450

0,508

0,292

0,185

0,282

0,259

0,410

15

0,557

0,708

0,670

0,782

0,439

0,260

0,408

0,404

0,598

Reemplazando en: Concentraciones de sustrato (g/l):

  = .(   (/)) +.

+ .  ×   =  . Para obtener la concentración de productos, así tendremos

min

PRODUCTOS 2

3

4

5

6

7

8

9

10

0

0,014

0,146

0,112

0,130

0,126

0,104

0,064

0,565

0,203

2

0,806

0,870

0,750

1,138

1,142

0,578

0,769

0,972

1,372

6

1,837

2,273

2,206

2,618

2,499

1,576

2,948

2,685

3,833

10

2,609

3,278

3,636

4,132

3,670

2,374

4,628

4,315

6,744

15

3,607

4,642

5,466

6,411

5,626

3,372

6,724

6,727

9,871

UNIDAD III

57

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

A 8.000 7.000 6.000

    )    L     / 5.000    g     (    s    t 4.000    c    u     d    o    r 3.000    P

y = 0.4092x + 0.1851 y = 0.4517x + 0.0456

A1 A2

2.000

A3

y = 0.2328x + 0.238

1.000 0.000 0

5

10

15

20

Tiempo (min)

B 8.000 7.000 y = 0.4169x + 0.3014

6.000

    )    L     / 5.000    g     (    s    t 4.000    c    u     d    o    r 3.000    P

y = 0.3543x + 0.2742

B1 B2

y = 0.2976x + 0.2774

2.000

B3

1.000 0.000 0

5

10

15

20

Tiempo (min)

C 12.000 10.000     )    L     /    g     (    s    t    c    u     d    o    r    P

8.000 y = 0.6515x + 0.105

6.000

y = 0.3584x + 0.0683

C1 C2

4.000

C3

2.000

y = 0.2181x + 0.1608

0.000 0

5

10

Tiempo (min)

15

20

UNIDAD III

58

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

# Muestra

S(gr/L)

V (g/l*min)

1

2,00000

2  –A1

4,00000

0,23279

3-B1

6,00000

0,29763

4-C1

7,33333

0,35844

5.A2

9,33333

0,40919

6-B2

11,33333

0,35430

7-C2

13,33333

0,21814

8-A3

15,33333

0,45171

9-B3

17,33333

0,41688

10-C3

19,33333

0,65147

Determinacion de V 12.000 A1

10.000

B1     )    L     /    g     (    o    t    c    u     d    o    r    P

8.000

C1 A2

6.000

B2 4.000

C2 A3

2.000

B3 C3

0.000 0

2

4

6

8

10

12

14

16

Tiempo(min)

Si la concentracion de la Enzima aumenta, la actividad aumenta. Asimismo si se tiene una mayor concentracion de sustrato, la velocidad de reaccion aumenta, esto debido a que la enzima tendra un mayor poder catalítico, esto se debe a que existira un mayor numero de sitios activos mientras mas sustrato se tenga. En el caso de una concentracion de sacarosa 4 g/l tiene mas velocidad de reaccion. La forma de la curva representa la velocidad de formacion de productos en el tiempo a diferentes concentraciones de enzima, los cuales demuestran que a una mayor concentracion de enzimas el rango de linealidad de reaccion es mayor y por lo tanto mantiene su capacidad catalítica durante mas tiempo.

UNIDAD III

59

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

Como las reacciones catalizadas por enzimas son saturables, la velocidad de catálisis no muestra un comportamiento lineal en una gráfica al aumentar la concentración de sustrato. Si la velocidad inicial de la reacción se mide a una determinada concentración de sustrato (representado como [S]), la velocidad de la reacción (representado como V) aumenta linealmente con el aumento de la [S], como se puede ver en la figura. Sin embargo, cuando aumentamos la [S], la enzima se satura de sustrato y alcanza su velocidad máxima (Vmax), que no sobrepasará en ningún caso, independientemente de la [S]. Otros muchos factores ambientales pueden afectar la actividad enzimática; éstos incluyen la fuerza iónica del medio, la presión (especialmente si uno de los reactivos es gaseoso), los buffers empleados, la pureza de los reactivos y de la enzima, etc. Todos ellos deben determinarse experimentalmente, o por lo menos escogerse arbitrariamente y mantenerlos constantes durante cualquier estudio enzimático

PARAMETROS CINETICOS Vmax Y Kmax Las velocidades intrínsecas de reacción dependen de los parámetros cinéticos de las células o enzimas. Por ejemplo, la velocidad de reacción para una enzima inmovilizada que obedezca la cinética de Michelis – Menten depende de los valores de Vmax y Kmax para la enzima para su estado inmovilizado. Estos parámetros son los que a veces se denomina parámetros cinéticos verdaderos o parámetros cinéticos intrínsecos. Debido a que los parámetros cinéticos pueden alterarse durante la inmovilización como resultado del daño producido a la célula o enzima, así como los debidos al cambio de configuración o al impedimento esférico, los valores medidos antes de la inmovilización pueden no aplicarse. Desafortunadamente, los parámetros cinéticos intrínsecos para biocatalizadores inmovilizados son difíciles de determinar porque las velocidades de reacción medidas incluyen los efectos de la transferencia de materia. El modelo cinético se ajusta a la ecuación: v = Vmax [S] / (Km + [S]) Dónde: Km es la constante de Michaelis e indica la afinidad del enzima por su sustrato, y Vmax es la velocidad máxima e indica la capacidad catalítica. La determinación de los anteriores parámetros cinéticos (Vmax y km) se puede realizar utilizando las representaciones de Lineweaver-Burk  (1/v : 1/[S]) Los valores de Km de las enzimas varían ampliamente. Para la mayoría de las enzimas Km varía entre 10-1 y 10-6 M. El valor de Km para una enzima depende de cada sustrato particular y también de las condiciones ambientales como la UNIDAD III

60

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

temperatura y la fuerza iónica. Km es la concentración de sustrato a la cual la mitad de los centros activos están ocupados, Km se relaciona con la constante de velocidad de las etapas individuales. Un km alto indica una unión débil, un Km bajo indica una unión fuerte. Km indica la afinidad del complejo ES. La Vmax revela además el número de recambio de una enzima, si se conoce la concentración de los centros activos. Los números de recambio de la mayoría de las enzimas para sustratos fisiológicos oscilan entre 1 y 104 por segundo. A continuación se harán el análisis de los parámetros Kmax y Vmax trabajados en los diferentes grupos. Así tenemos: # Muestra

S(gr/L)

V (g/l*min)

1/S

1/V

1

2,00000

2 - A1

4,00000

0,23279

0,25000

4,29565

3 - B1

6,00000

0,29763

0,16667

3,35982

4 - C1

7,33333

0,35844

0,13636

2,78984

5 - A2

9,33333

0,40919

0,10714

2,44383

6 - B2

11,33333

0,35430

0,08824

2,82243

7 - C2

13,33333

0,21814

0,07500

4,58429

8 - A3

15,33333

0,45171

0,06522

2,21383

9 - B3

17,33333

0,41688

0,05769

2,39878

10 - C3

19,33333

0,65147

0,05172

1,53498

0,50000

DIAGRAMA DE LINEWEAVER-BURK 5.00000 y = 8.9604x + 1.9445 R² = 0.3435

4.50000 4.00000 3.50000 3.00000    V     / 2.50000    1

2.00000

Series1

1.50000 1.00000 0.50000 0.00000 0.00000

0.05000

0.10000

0.15000

0.20000

0.25000

0.30000

1/S

UNIDAD III

61

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

Se tomaron valores que no arrojen error, fueron los siguientes: Muestra

1/S

1/V

2  –A1

0,2500

4,2956

3-B1

0,1667

3,3598

4-C1

0,1364

2,7898

5.A2

0,1071

2,4438

10-C3

0,0517

1,5350

Diagrama de Lineweaver-Burk 6.00000 y = 13.931x + 0.9014 R² = 0.9914

4.00000 2.00000 0.00000 -1.00000 -0.80000 -0.60000 -0.40000 -0.20000 0.00000 0.20000 0.40000 -2.00000    S     /    1

-4.00000

Series1 Linear (Series1)

-6.00000 -8.00000 -10.00000 -12.00000 1/v

X Y 0,0500 1,5349 0,9014 0 0,0647 0

 =,  − = , 

Vmax = Kmax =

1,10939 15,4548

UNIDAD III

62

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

Los valores de Kap y/o Vap están en función de la concentración de otros efectores, por ello el diseño experimental realizado, debe considerar mediciones de velocidad de reacción a distintas combinaciones de concentraciones de éstos. Determinamos los parámetros cinéticos de la enzima, dando como resultado Kap = 15,4548 gr/L, el valor del Vap que fue de 1,109339 gr/*min. Estos mismos pueden ser afectados por las temperatura y pH, además de inhibidores que puede contener el propio caldo.

UNIDAD III

63

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

3.

MONTAJE DEL SISTEMA MINI-REACTOR CON ENZIMA INULINASA INMOVILIZADA

La inmovilización de enzimas es un proceso en el que se confina o localiza a la enzima en una región definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que retienen su actividad catalítica y que pueden ser reutilizadas repetidamente. Posteriormente esta definición se ha ampliado a aquel proceso por el cual se restringen, completa o parcialmente, los grados de libertad de movimiento de enzimas, orgánulos, células, etc. por su unión a un soporte. La inmovilización altera significativamente el comportamiento de las enzimas. En primer lugar se producen cambios en su estabilidad. En segundo lugar, la enzima inmovilizada es un sistema heterogéneo en el cual todos los componentes que intervienen en el proceso catalítico (pH, sustratos, productos, inhibidores, cofactores, activadores, etc.) se encuentran en internase: en el medio de reacción y en la fase constituida por el soporte con la enzima. Como consecuencia, la actividad enzimática se ve afectada por efectos de tipo difusiones, esférico y del microentorno. Cinética:

Un gran número de investigadores han tratado de encontrar medios para utilizar una cinética tipo Michaelis-menten y explicar la acción de las enzimas inmovilizadas. Estos estudios han concluido que existen diversos factores que afectan directamente a la cinética de este tipo de enzimas. La cinética de todas las enzimas inmovilizadas es afectada por la carga del soporte, la del sustrato, el diámetro de poro del soporte, las velocidades de difusión y muchos otros parámetros. Además de estos factores, otros como las velocidades de agitación y las tasas de flujo desempeñan también un papel importante en la cinética aparente de las enzimas inmovilizadas.

Comportamiento del reactor enzimático por lotes: Reactor Enzimático: El reactor enzimático es la unidad de proceso en la que se efectúa la conversión de sustratos a productos, bajo condiciones ambientales controladas. La operación de un reactor enzimático puede ser por lotes o continua. La modalidad por lotes, tradicional emplea generalmente enzimas libres en solución y utiliza equipos del tipo tanque agitado. Se puede anticipar el comportamiento de reactores ideales conociendo la cinética de la reacción y el modo de operación del reactor. Ya han sido considerados dos tipos de reactor; sólo resta por analizar el batch. Los otros reactores, no ideales, generalmente se comportan en regiones delimitadas por los casos ideales. UNIDAD III

64

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

Para un reactor batch, considerando una cinética de tipo Michaelis-Menten, se puede obtener la ecuación integrada entre el tiempo cero al tiempo t: Donde t = tiempo para alcanzar la conversión X Se pueden obtener ecuaciones similares para una cinética de tipo MichaelisMenten reversible, para casos de inhibición competitiva por producto e inhibición por sustrato. Como: Vmáx = ke Kmáx = k

Curva de calibrado DNS Concentracion (g/L) 2  1.6  1.2  0.8  0.4  0.2  0

ABS 540 nm 1.063 0.842 0.627 0.393 0.212 0.095 0

UNIDAD III

65

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

CURVA CALIBRADO DNS 1.2

y = 0.5319x - 0.0094 R² = 0.9992

1    m    n    0 0.8    4    5    a 0.6    s    a    i    c    n 0.4    a     b    r    o 0.2    s     b    A

Series1 Linear (Series1)

0

-0.2

0

0.5

1

1.5

2

2.5

concentracion (g/L)

Obtenemos la ecuación de la curva de calibrado de DNS:

Y = 0.5319 X – 0.0094

Del seguimiento de inmovilización de inulinasa en geles, obtenemos las sgtes absorbancias por el método DNS, para determinar azucares reductores:

GRUPO A tiempo (h)

ABS 540 nm

Factor Dilucion

P (g/L)

P' (g/L)

0 0.5 1

0.168 0.724 0.688

01:01 01:10 01:15

0.33352 1.37883 1.31115

0 8.785485 14.6644

1.5 2 2.5 3 3.5 4

0.808 0.837 0.839 0.843 0.845 0.878

01:15 01:15 01:15 01:15 01:15 01:15

1.53676 1.59128 1.59504 1.60256 1.60632 1.66836

18.04850 18.86632 18.92272 19.03553 19.09193 20.02256

UNIDAD III

66

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

35 y = 4.6434x + 10.468 R² = 0.6185

30 25     ) 20    L     /    g     (    P 15

10 5 0 0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

t (h)

En la figura se puede notar que durante las primeras 2 horas la formación de producto (glucosa+fructosa) va en aumento, y a partir de las siguiente horas, pasado las 2 horas la producción va disminuyendo esto debido la inmovilización altera significativamente el comportamiento de las enzimas. En primer lugar se producen cambios en su estabilidad. En segundo lugar, la enzima inmovilizada es un sistema heterogéneo en el cual todos los componentes que intervienen en el proceso catalítico (pH, sustratos, productos, inhibidores, cofactores, activadores, etc.) se encuentran en interface: en el medio de reacción y en la fase constituida por el soporte con la enzima. El tiempo también puede afectar ya que la enzima actua por tiempos cortos, luego de esto pierde su poder catalítico.

GRUPO B tiempo (h)

ABS 540 nm

Factor Dilucion

P (g/L)

0 0.5 1

0.153 0.272 0.279

01:01 01:10 01:15

0.30532 0.52905 0.54221

0 4.985147 7.827787

1.5 2 2.5

0.429 0.454 0.474

01:15 01:15 01:15

0.82422 0.87122 0.90882

12.05790 12.76292 13.32694

3 3.5

0.494 0.542

01:15 01:15

0.94642 1.03666

13.89095 15.24459

UNIDAD III

67

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS 4

0.591

01:15

1.12878

16.62643

20 18

tiempo (h)

ABS 540 nm

16 14

0    L 0.5     /    g 10     ( 1     ) 12    P

8

1.5 2 4 2.5 6 2

3

y = 3.6893x + 3.6737 Factor R² = 0.8712 Dilucion

P (g/L)

0.064 0.27 0.254 0.258 0.34 0.344

01:01 01:05 01:10 01:10 01:10 01:10

0.138 0.52529 0.49521 0.50273 0.65689 0.66441

0 5.25287 7.42809 7.54089 9.85336 9.96616

0.416

01:10

0.79977

11.9966

0 0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

tiempo (hr)

En la figura se puede notar que durante el transcurso de las horas la producción de azucares reductores es casi líneal. Además, la cinética de todas las enzimas inmovilizadas es afectada por la carga del soporte, la del sustrato, el diámetro de poro del soporte, las velocidades de difusión y muchos otros parámetros. Además de estos factores, otros como las velocidades de agitación y las tasas de flujo desempeñan también un papel importante en la cinética aparente de las enzimas inmovilizadas.

GRUPO C

UNIDAD III

68

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS 0.417 0.486

3.5 4

01:10 01:10

0.80165 0.93138

12.0248 13.9707

16 y = 2.907x + 2.8718 R² = 0.9004

14 12     )    L     /    g     (    p

10 8 6 4 2 0 0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

t (hr)

En la figura se puede notar que durante el transcurso de las horas la producción de azucares reductores es lineal, sin embargo se genera menos producto ya que se trabaja con menos concentración de sustrato. La inmovilización de enzimas en soportes insolubles puede mejorar la estabilidad enzimática como también permite reciclar la enzima y separarla fácilmente del producto, lo cual tiene beneficios económicos.

Comportamiento y diseño de reactor enzimático por lotes agitado UNIDAD III

69

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

Ecuación de comportamiento de reactor por lotes o discontinuo:

Si/K (x) - Ln(1-x) = (k.e.t)/K

GRUPO A De la ecuación de la curva de DNS, hallamos la concentración de producto, y con ellos el valor de la conversión a cada concentración de sustrato inicial.

Si= 20 g/L DILUCIÓN

Tiempo (min)

Abs (540 nm)

P (g/L)

P' (g/L)

P'' (g/L)

X

01:01 01:10 01:15 01:15 01:15 01:15 01:15 01:15 01:15

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4

0.168 0.724 0.688 0.808 0.837 0.839 0.843 0.845 0.878

0.333521339 1.378830607 1.311148712 1.536755029 1.591276556 1.595036661 1.602556872 1.606316977 1.668358714

5.002820079 13.78830607 19.66723068 23.05132544 23.86914834 23.92554992 24.03835307 24.09475465 25.02538071

0 8.785485994 14.6644106 18.04850536 18.86632826 18.92272984 19.03553299 19.09193457 20.02256063

0 0.4392743 0.73322053 0.902425268 0.943316413 0.946136492 0.95177665 0.954596729 1.001128032

DILUCIÓN

Tiempo (h)

Abs (540 nm)

P (g/L)

P' (g/L)

P'' (g/L)

X

01:01 01:10 01:15 01:15 01:15 01:15 01:15 01:15 01:15

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4

0.153 0.272 0.279 0.429 0.454 0.474 0.494 0.542 0.591

0.305320549 0.529046813 0.542207182 0.824215078 0.871216394 0.908817447 0.9464185 1.036661027 1.128783606

0.305320549 5.290468133 8.133107727 12.36322617 13.06824591 13.6322617 14.1962775 15.5499154 16.93175409

0 4.985147584 7.827787178 12.05790562 12.76292536 13.32694115 13.89095695 15.24459485 16.62643354

0 0.249257379 0.391389359 0.602895281 0.638146268 0.666347058 0.694547847 0.762229742 0.831321677

GRUPO B Si= 30 g/L

UNIDAD III

70

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

GRUPO C Si= 20 g/L DILUCIÓN

Tiempo (h)

Abs (540 nm)

P (g/L)

P' (g/L)

P'' (g/L)

X

01:01 01:10 01:15 01:15 01:15 01:15 01:15 01:15 01:15

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4

0.064 0.27 0.254 0.258 0.34 0.344 0.416 0.417 0.486

0.137995864 0.525286708 0.495205866 0.502726076 0.656890393 0.664410603 0.799774394 0.801654446 0.931378079

0.137995864 5.25286708 7.428087986 7.540891145 9.853355894 9.966159052 11.99661591 12.02481669 13.97067118

0 5.114871216 7.290092123 7.402895281 9.71536003 9.828163189 11.85862004 11.88682083 13.83267531

0 0.118497032 0.229241085 0.232822138 0.306233717 0.30981477 0.374273718 0.375168981 0.436942139

Valores para hallar ket/K PARAMETROS

VALOR

UNIDADES

k

186.187459

h-1

e

35.0667667

g/L

Kmax

16.09

g/L

Vmax

34.74432

g/L.h

UNIDAD III

71

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

CURVA DE COMPORTAMIENTO DE REACTOR POR LOTES AGITADO

1 0.9

Si/K= 1.1187

0.8

Si/K = 1.2430

0.7 0.6

   X0.5

Si/K = 1.3052

0.4 0.3 0.2

Si= 18 g/L

0.1

Si= 20 g/L

Si= 21 g/L

0 0

1

2

3

4

5

6

7

8

ket/K

En el grafico se puede observar que cuando el sustrato es mas alto, la conversión de sustrato en producto es menor. Podemos obervar que cuando el valor de si/k = 1.1187, entonces hay menor cantidad de sustrato .conforme va aumentando la carga enzimatica al transcurso del tiempo en el reactor. pero llega hasta un nivel en donde el producto generado por la conversion de sustrato es casi constante. con el valor de si/k =1.243, se aumento el sustrato, por ende se podria trabajar con una cantidad de enzima mayor a la anterior. ahora cuando el valor de si/k = 1.3052 , la grafica que se muestra es casi lineal, por ende, jamas se llegaria a un punto de saturacion. Obtener el perfil de ket/K vs X es importante para determinar la conversión de sustrato en productos en función de la velocidad máxima de reacción, el tiempo y la constante de saturación; la gráfica X vs (ket/K) presenta un comportamiento casi ideal en comparación a los curvas características de un reactor enzimático por lote. Esto nos permite elaborar un esquema que prefiere el comportamiento real de un reactor agitado a diferentes concentraciones de sustrato inicial.

UNIDAD III

72

9

UNIDAD III

INGENIERÍA DE ENZIMAS

Un sistema con reactor enzimático por lotes que utiliza la isomerización de la sacarosa (conversión en glucosa y fructosa), importante en la industria, con inulinasa como catalizador. El propósito de la unidad es la demostración de la cinética de las reacciones enzimáticas por lotes, y las características de las enzimas. La reacción tiene lugar dentro de un recipiente agitado en el que el agitador es una cesta porosa dentro de la cual la enzima queda

Los reactores discontinuos tienen la forma tradicional de reactor, como por ejemplo los usados en cervecería, y son muy adecuados para el uso de enzimas solubles, o cuando se requiere un volumen de producción pequeño o la producción es infrecuente. En general consisten en un tanque donde se mezcla el substrato o el enzima y una vez alcanzado el grado de reacción deseado el contenido del reactor se descarga. Las desventajas de estos reactores discontinuos se deben a los cambios en las condiciones de operación durante la reacción, por lo que requieren un control más complejo de proceso. Otra dificultad es también el mantenimiento de un buen grado de mezcla en reactores con mayor escala de producción, debido a la imposibilidad de asegurar una entrada de potencia proporcional al aumento de tamaño de reactor. Otros problemas que se presentan en los procesos discontinuos son las variaciones en la calidad del producto, el tiempo de paso entre las reacciones discontinuas, la demanda discontinua de servicios y equipo auxiliar y trabajo, y también la imposibilidad de reutilizar el enzima o la tendencia a perderlo durante su recuperación entre dos lotes (aunque también se puede usar de forma semicontinua). Estas desventajas pueden ser secundarias especialmente cuando se necesita una buena transferencia de masa o de gases.

Por ejemplo, le producción de acido 6-aminopenicilánico se hace en un reactor discontinuo con agitación que contiene penicilina acilasa inmovilizada, neutralizándose el ácido formado durante la reacción mediante la adición continua de álcalis (Carleysmith y Lilly, 1979). En la industria el reactor que se utiliza más frecuentemente es el de columna con flujo pistón. En varias aplicaciones en sistemas discontinuos de los enzimas, como por ejemplo en la producción de extracto de malta o en la industria cervecera, es necesario que exista una actividad enzimática elevada durante la reacción y que no quede enzima activo residual en el producto, lo que generalmente se consigue incrementando la temperatura del reactor de forma que la ultimas moléculas de substrato sediscontinuos consuman justo antes que se desnaturalicen la ultimas moléculas Los procesos operan ende sistemas cerrados de manera que el sustrato se añade al comienzo del proceso y los productos son retirados sólo al finalizar el UNIDAD III

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mismo. Las reacciones aerobias no son operaciones discontinuas en el sentido estricto de la palabra. La baja solubilidad del oxígeno en el medio acuoso significa que éste debe suministrarse de manera continuada mientras se elimina el dióxido de carbono y otros gases producidos en el proceso. Sin embargo, los reactores en los que no existe ni entrada ni salida de líquidos se consideran como discontinuos. Si no existen fugas o evaporación en el reactor, el volumen de líquido en los reactores discontinuos puede considerarse constante.

Figura. Esquema de un r eactor  enzimático por lotes discontinuo agitado.

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7.6.

Diseño y montaje del sistema mini reactor con invertasa inmovilizada, para determinar los parámetros cinéticos de la enzima. La forma usual de usual de determinar los parámetros cinéticos es a través de mediciones de velocidad inicial de reacción a diferentes concentraciones de sacarosa en un reactor por lote. La manera más adecuada de obtenerlos es por linealización de la ecuación cinética. Para ello emplearemos el método de los inversos o Lineweaver – Burke, para un modelo cinético simple

 +  ⇆  →  +  Union del sustrato

V 

Etapa catalítica  K   s 

 K 

  s

Métodos de linealización para determinar parámetros cinéticos Método

Eje Y

Eje X

Intercepto Eje X -1/k

Pendiente

1/s

Intercepto Eje Y 1/v

Lineweaver – Burke

1/v

Hames Eadie – Hofstee

s/v V

S v/s

k/V V

-k v/k

1/v -k

k/V

1/v

KAP/VAP 1/VAP

-1/KAP 

1/s

Figura 01: Determinación de parámetros cinéticos mediante método de inversos de Lineweaver – Burke

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TÉCNICA EXPERIMENTAL Sol. A: Buffer Citrato-fosfato 0,05 M, pH 5 Sol. B: Concentración enzimático inulinasa. Sol. C: Solución sustrato sacarosa 20 g/L Tabla 01: Técnica experimental para determinación de parâmetros cinéticos: Solución A

Solución B

Solución C

(ml)

(ml)

(ml)

1

26

1

3

2

23

1

6

3

20

1

9

4

18

1

11

5

15

1

14

6

12

1

17

7

9

1

20

8

6

1

23

9

3

1

26

10

0

1

29

Nº muestra

Concentración de sacarosa g/l

Tabla 02: Datos experimentales azucares DNS DNS min

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 2 6 10 15

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VIII.

BIBLIOGRAFIA 

GACESA P., y HUBBLE J.; Tecnología de Enzimas 1990; Editorial Acribia S.A; ZARAGOZA – ESPAÑA; cap. 6.

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Guisan, J.M.; Bastida, A.; Balnco, R.M.; and Fernández-Lafuente, R. 1997 A. Immobilization of enzymes on gíioxil-agarose: Strategies for enzyme stabilization by multipoint attachment. En: immobilization of Enzymes and cells. 1, 277-287. (Ed: Gordon, F.) Editorial: Bickerstaff. Humana Press Inc

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Guisan J.M; Polo, E.; Agudo, J.; Romero, M.D.; Alvaro, G. and Guerra, M.J. 1997 B. Immobilization-stabiiization of termolysin onto activated agarose gels. Biocatal. Biotransf. 15, 159-173.

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Ingeniería Bioquímica, QUINTEROS RAMIREZ Rodolfo, primera edición. México, edit. Alhomba, 1981

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SCRIBAN RENE; Biotecnologia Segunda Edicion 1985; Editorial El Manual Moderno, S.A., de C.V. ; Mexico, D.F.; pp. 254 – 315.

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Zhenming Chi & Zhe Chi & Tong Zhang & Guanglei Liu & Lixi Yue. Inulinaseexpressing microorganism and applications of inulinases. Appl Microbiol Biotechnol, 82:211–220, enero 2009.

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https://davidbq3.wordpress.com/2013/04/15/ingenieria-de-enzimas-y-susdiversas-aplicaciones/

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http://digital.csic.es/bitstream/10261/2715/1/05200202.pdf

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MESES

ACTIVIDAD

JUNIO

JULIO

Martes 16 Jueves 25 Martes 30 Miércoles 1 Martes 7 Martes 14 Viernes 17 Jueves 23 Viernes 24 Recoleccion de materiales: (instrumentos, reactivos esterilización)

X

Preparación de reactivos

X

Obtención de curva de calibrado de proteínas y de azúcares reductores DNS

X

Recolección de Guía e Información

X

Presentación del pre-informe

X

Obtención de un caldo crudo de Kluyveromyces marxianus NRRL Y-7571

X

X X

Rango de Linealidad y Actividad Enzimática Determinación de los parámetros cinéticos de la Enzima Soluble

X

Inmovilizar Inulinasa en Geles

X

Diseñar y montar el sistema mini-reactor con Enzima inmovilizada, para determinar los parámetros cinéticos de la enzima.

X X

Presentación final del informe

X

Sustentación de informes

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 ANEXOS MÉTODO BRADFORD. Un procedimiento simple para la determinación de la concentración de la proteína en soluciones es el análisis de la proteína de Bradford que fue descrito primero por Bradford (Bradford et el al., 1976). Este método se basa en utilizar un colorante hidrofóbico (comassie blue G-250) cuyas disoluciones acuosas en presencia de ácido fosfórico tienen un color pardo que al entrar en contacto con la parte hidrofóbico del interior de una proteína se fija. Las proteínas se unen a la forma azul para formar un complejo proteína-colorante con un coeficiente de extinción mayor que el colorante libre. La determinación del contenido proteico de una muestra requiere la comparación del valor de absorbancia de la muestra con los obtenidos a partir de cantidades conocidas de proteínas, con los que se construye una curva de calibración: a mayor cantidad de proteínas, mayor color desarrollado y por lo tanto, mayor absorbancia, es por ello que se considera un cromóforo exógeno. Es un método que depende de la interacción relativamente inespecífica entre un colorante hidrofóbico y las proteínas, por lo que es sensible a la presencia de contaminantes tales como los restos de detergentes y líquidos orgánicos, ya que las proteínas pueden perder su estabilidad y perder su forma nativa, lo que provocaría la perdida de la unión entre el cromóforo y la zona hidrofóbica de las proteínas. Para determinar la concentración total de proteína se realiza una curva de calibración empleando una proteína patrón que generalmente es la seroalbumina bovina. Se preparan tubos testigos con distintas cantidades de proteína y otra disolución llamada “blanco” que solo contiene agua y reactivo Bradford y en los tubos testigos se les mantiene constante el reactivo Bradford siendo los volúmenes de todos los tubos iguales. Una vez preparados los tubos se mide la absorbancia a cada uno de ellos a una longitud de onda de 595nm, es calibrado el equipo con el tubo blanco (no contiene proteína) de esta manera se construye la gráfica de absorbancia vs concentración. GACESA P. y HUBBLE J. Tecnología de Enzimas 1990 Preparación del reactivo: -

-

-

-

-

-

Añadir 1 ml del reactivo de Bradford a los tubos estándar y muestras problemas preparadas. Dejar a temperatura ambiente. Leer Absorbancia a 595 nm frente al blanco. El color es estable 1 hora. Representa la curva estándar. Calcula el coeficiente de extinción. Procedimiento:

-

Se agrega 10 ml de agua destilada a cada uno de los tubos falcon que contienen las muestras tras las diferentes centrifugaciones, y se remueve con una espátula para poder diluir.2.

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-

-

-

Se tomó 10 microlitros de cada muestra ya diluidas y se depositó en diferentes alícuotas, a cada una de ellas se le adicionó 990 microlitros de agua destilada.3. Colocar en siete tubos de ensayo albumina en diferentes proporciones 0, 5, 10, 25,40, 50 y 60 microlitros, añadir agua destilada hasta tener un volumen de 200microlitros y posteriormente agregar 800 microlitros de reactivo de Bradford. Colocar en otros diez tubos de ensayo 10 microlitros de albumina de las diferentes alícuotas, 2 muestras de cada alícuota, 190 microlitros de agua destilada y 800microlitros de reactivo de Bradford. Posteriormente se medirá la absorbancia a cada una de las soluciones que contienen los tubos. Estas soluciones deberán ser depositadas en las celdas para que puedan ser leídos por el espectrofotómetro. El tubo uno se tomará como muestra blanco ya que no contiene albumina. SCRIBAN RENE; Biotecnología Segunda Edición 1985 Comparación con otros métodos:

Este método de BRADFORD (con un rango de linealidad entre 1 y 1.5 ug) es derivado de los colorímetros al igual que método de lowry, una de las ventajas de este método es que es muy sensible pero al trabajar con detergentes muestra cierta interferencia. A comparación del método de LOWRY que es o tiene bastante sensibilidad pero en el trabajo muestra inconvenientes por que no todas las proteínas reaccionan igual, muestra muchas interferencias como detergentes no iónicos, sulfato amónico etc. Se forma un complejo coloreado de cobre con el enlace peptídico, también se forma un derivado de las tirosinas que contribuye a la absorbancia total. Emilio Fernández (Departamento de Bioquímica y Biología Molecular). Suelter CH (1985). MÉTODO DEL DNS Los azúcares reductores son monosacáridos que poseen grupos carbonilos libres, que se obtienen de la hidrólisis ácida y térmica de los polisacáridos. Además de ser la inulinasa una enzima nativa de la levadura lechera Kluyveromyces marxianus, es especialmente adecuada para la aplicación industrial, por tener la mejor velocidad de crecimiento que cualquier otro microbio eucariote, termo tolerante, con habilidad para crecer sobre los 52 ºC, capacidad de asimilar un amplio rango de azúcares claves, como la lactosa e inulina y una alta capacidad secretoria de enzimas líticas, hacen de éste microorganismo líder de todas las levaduras para muchos procesos biotecnológicos.   Kluyveromyces marxianus es una especie que incorpora muchos sinónimos, se describe como una levadura homotálica, hemiascomyceto, es filogenéticamente relacionada a Saccharomyces cerevisiae  y es una especie hermana de la mejor conocida Kluyveromyces lactis. (Lane y Morrissey, 2010). Preparación del reactivo: -

-

Se disuelve el tartrato en aproximadamente 20 ml de agua. Paralelamente se disuelve el DNS en pequeñas cantidades con ayuda de un agitador magnético y calentando.

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INGENIERÍA DE ENZIMAS -

-

Ambas soluciones se mezclan en un matraz aforado de 50 mL. Se agita hasta la completa disolución de todos los componentes, para posteriormente aforar hasta 50 mL. Procedimiento:

-

-

-

-

-

-

-

Se precisa realizar los siguientes pasos para el análisis de la muestra: Se añade 1 mL de reactivo DNS a un 1 mL de muestra a analizar. Se mantiene la mezcla en baño de agua a ebullición durante 5 minutos para luego enfriar con agua helada. Añadir 10 ml de agua destilada, y se deja reposar por 15 minutos, luego agitar. Se lee la absorbancia a 540 nm, utilizando agua como blanco. La concentración se obtiene interceptando la medida de absorbancia en la curva de calibrado. La curva de calibrado para el azúcar se obtiene a partir de muestra de concentración conocida y analizadas según este procedimiento.

Seminario, J.; Valderrama, M.; Manrique, I. 2003



SEGÚN INMOBILIZED ENZYMES: THEORY, METHODS OF STUDY AND APPLICATIONS.PDF: Aunque se han desarrollado y aplicado muchas técnicas de inmovilización a numerosos enzimas, se reconoce que no existe un método universal válido para todos los enzimas en todos los casos. No obstante, gracias a toda la información disponible en la actualidad, se pueden hacer generalizaciones sobre cada método de inmovilización (Tabla 2) y así, podremos seleccionar el más adecuado para cada aplicación específica. La elección ha de tener en cuenta las condiciones de la reacción biocatalizada, el tipo de reactor que se vaya a utilizar, el tipo de sustrato que tenga que ser procesado y otros factores.

Tabla 2. Comparación de los diferentes métodos de inmovilización

Método Preparación

Inclusión en membranas Intermedia

Atrapamiento Reticulado Difícil

Intermedia

Adsorción

Unión

química

covalente

Sencilla

Difícil

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INGENIERÍA DE ENZIMAS Fuerza de

Débil

Media

Media-Alta

Baja

Posible

Coste Proceso

Débil-

Media

Fuerte

Baja

Media

Alta

Imposible

Imposible

Posible

Difícil

Medio-Alto

Medio

Medio

Bajo

Alto

Estabilidad

Media

Alta

Alta

Baja

Alta

Validez

General

General

Limitada

General

Limitada

SI

SI

SI

NO

NO

Unión Actividad Enzimática Regeneración Soporte

Resistencia Microbiana

Media

En general, los métodos de preparación difícil y de mayor coste proporcionan biocatalizadores más estables y duraderos; en cambio aquellos métodos más sencillos como el atrapamiento o la adsorción, donde la unión de la enzima con el soporte es débil, originan derivados inmovilizados que presentan pérdidas de actividad y que deben ser repuestos continuamente. Una vez elegido el método más conveniente, los derivados que preparemos deben estar caracterizados según las indicaciones establecidas por el Working Party on Immobilized Biocatalysts (16):

Descripción general 1. Esquema de reacción 2. Enzimas a insolubilizar 3. Tipo de soporte empleado 4. Método de inmovilización

Preparación: 1. Condiciones de reacción 2. Rendimiento en peso seco

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INGENIERÍA DE ENZIMAS 3. Actividad residual del sobrenadante

CARACTERIZACIÓN DE UN DERIVADO INMOVILIZADO

Caracterización físico-química: 1. Configuración del biocatalizador 2. Grado de hinchamiento 3. Grado de compresibilidad en columna 4. Abrasión en sistemas de agitación 5. Velocidad mínima de fluidización

Cinética: 1. Estabilidad de la enzima almacenada 2. Estabilidad operacional 3. Posibilidad de reutilización 4. Grado de conversión 5. Limitaciones difusionales



SEGÚN (LEE Y HUANG, 2000). La cinética de todas las enzimas inmovilizadas es afectada por la carga del soporte, la del sustrato, el diámetro de poro del soporte, las velocidades de difusión y muchos otros parámetros. Además de estos factores, otros como las velocidades de agitación y las tasas de flujo desempeñan también un papel importante en la cinética aparente de las enzimas inmovilizadas. A manera de ejemplo se presenta la tabla 1.1, en que se muestran los cambios de KM  al inmovilizar la enzima; Weetall informa de un caso muy claro en que el valor de KM  depende directamente del flujo del sustrato; encontró que KM  disminuye cuando el flujo aumenta, lo que explica que a medida que se incrementa el flujo, la turbulencia también aumenta y disminuye la capa estática del liquido alrededor de cada partícula, lo que lógicamente reduce el efecto de transferencia de masa.

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Tabla 1.1 Comparación de valores de KM de algunas enzimas en solución e inmovilizadas

ENZIMA Invertasa Arilsulfatasa Glucoamilasa Ureasa Glucosa oxidasa L-amioacido oxidasa Alcalino fosfatasa

SUSTRATO Sacarosa pnitrofenilfosfato Almidón urea glucosa L-leucina pnitrofenilfosfato

K M (milimolar) SOLUCIÓN 0.448 1.85

INMOVILIZADA 0.448 1.57

1.22 10.0 7.70 1.00

0.30 7.60 6.80 4.00

0.10

2.90

* Las enzimas están inmovilizadas en partículas de vidrio poroso (96% sílice)

SEGÚN (NGUYEN ET AL., 1999). El reactor enzimático es la unidad de proceso en la que se efectúa la conversión de sustratos a productos, bajo condiciones ambientales controladas. La operación de un reactor enzimático puede ser por lotes o continua. La modalidad por lotes, tradicional emplea generalmente enzimas libres en solución y utiliza equipos del tipo tanque agitado. Se puede anticipar el comportamiento de reactores ideales conociendo la cinética de la reacción y el modo de operación del reactor. Ya han sido considerados dos tipos de reactor; sólo resta por analizar el batch. Los otros reactores, no ideales, generalmente se comportan en regiones delimitadas por los casos ideales.

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SEGÚN LIBROS (Belcarz et al., 2002, Mátrai et al., 2000, Luxhoi et al., 2002, Huang et al., 2003). El proceso de inmovilización, especialmente cuando el enzima está atrapado en un gel, copolimerizado o adsorbido o unido covalentemente dentro de los poros de una matriz, puede ocasionar problemas difusionales que han de ser considerados. Para que el sustrato pueda actuar, debe difundir desde la disolución externa hasta la capa de líquido más bien estático que rodea la partícula, y luego dentro del poro donde se localiza el enzima, y donde la disolución es casi estancada. El producto debe difundir en el sentido inverso. Estos efectos de transferencia de masa pueden crear problemas en el ensayo y en el uso del sistema de enzima inmovilizado: las velocidades de difusión de sustratos y productos suelen ser menores que la velocidad de reacción, y constituyen el factor limitante de estos procesos, alterando en muchos casos las expresiones cinéticas.

SEGÚN GACESA P., y HUBBLE J.; Tecnología de Enzimas 1990; Editorial  Acribia S.A; ZARAGOZA – ESPAÑA; cap. 6. La inmovilización de enzimas en soportes insolubles puede mejorar la estabilidad enzimática como también permite reciclar la enzima y separarla fácilmente del producto, lo cual tiene beneficios económicos. Dichas ventajas pueden aplicarse a la producción de jarabes fructosados a partir de sacarosa si se cuenta con un método para inmovilizar y un soporte barato, que no afecte la especificidad de sustrato y la velocidad de reacción de la invertasa (β-fructofuranosidasa EC: 3.2.1.26).

SEGÚN REACTORES ENZIMÁTICOS. PROFESOR AGUSTÍN LÓPEZ MUNGUIA. DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA. UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO. La difusión externa es el transporte de sustratos hasta la superficie del catalizador, y la liberación de los productos desde éste, y tiene lugar en los procesos con poca o ninguna agitación. La constante de velocidad de difusión

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depende de la naturaleza del componente que se difunde, de las condiciones de turbulencia en la vecindad de la partícula del catalizador y de las propiedades de toda la mezcla. La difusión interna es el transporte de los sustratos desde la superficie de la partícula del catalizador a través de los poros del soporte hasta el centro activo del enzima, y el recorrido contrario de los productos.

SEGÚN CINÉTICA ENZIMÁTICA. PROFESOR ANDRÉS ILLANES FRONTAURA. ESCUELA DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA. UNIVERSIDAD CATÓLICA DE VALPARAÍSO. Gelificación ionotrópica; cuyo fundamento es la formación de redes con reacción química (intercambio de iones) debido al entrecruzamiento de cadenas poliónicas con contraiones multivalentes. El extracto enzimático se inmoviliza con alginato de sodio. El alginato es un polisacárido producido por algas soluble en agua, en una solución con iones divalentes como el Ca2+ polimeriza ya que los iones producen entrecruzamiento de los polisacáridos. Al polimerizar una solución de alginato conteniendo enzimas estas quedan atrapadas dentro de las esferas que se generan 

Los resultados entre los grupos con las variaciones de diluciones difieren debido a muchos factores entre ellos la preparación enzimática no es homogénea lo que dificultó la interpretación de los datos.

 Workman y Day6 purificaron la inulinasa prabducida por Kluyveromices

fiagilis, encontrando que dicha enzima es una &coproteha con un contenido de carbohldratos del 66% en peso, estable a 5O oC, con un pH óptimo de 4.5, cuya actividad disminuye a temperaturas mayores de 55 OC, con un PI de aproximadamente 4.0. Estos autores sugieren que además de los estudios de electroforesis, se debe considerar la determinación del punto isoeléctrico (PI) como un parámetro para demostrar la pureza de. la enzima. También determinaron los valores de Km de la inulinasa sobre sacarosa (13.6 mM a pH 5.0) y sobre rafiiosa (46.1 mM a pH 5.0), encontrando que la actividad enzimática es lntvbida por la configuración de UNIDAD III

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furanosa de la fructosa, pero no mencionan el peso molecular de la enzima purificada, la posible conformación de ésta, y tampoco reportan datos acerca de la determinación de la Km sobre inulina. 

En la presente práctica de laboratorio se realizaron los procedimientos para un caso de biocatalisis enzimática utilizando inulinasa inmovilizada con alginato de sodio al 2% y actuando con sacarosa como sustrato. Los procedimientos incluyeron la determinación del rango de linealidad de la enzima, los parámetros cinéticos de la enzima libre y el análisis del comportamiento de un sistema minireactor por lotes.



En la determinación del rango de linealidad, se observa que a partir de 10 minutos de reacción enzimática, la formación de producto decae invariablemente en todos los casos analizados, alcanzándose un mayor concentración de producto cuando el extracto enzimático esta menos diluido



La variación en la actividad enzimática de la invertasa puede deberse a su condición de inmovilizada.

La cinética de todas las enzimas inmovilizadas es afectada por la carga del soporte, la del sustrato, el diámetro de poro del soporte, las velocidades de difusión y muchos otros parámetros. Además de estos factores, otros como las velocidades de agitación y las tasas de flujo desempeñan también un papel importante en la cinética aparente de las enzimas inmovilizadas. Weetall informa de un caso muy claro en que el valor de K M   depende directamente del flujo del sustrato; encontró que K M  disminuye cuando el flujo aumenta, lo que explica que a medida que se incrementa el flujo, la turbulencia también aumenta y disminuye la capa estática del liquido alrededor de cada partícula, lo que lógicamente reduce el efecto de transferencia de masa .

Tabla 1.1 Comparación de valores de KM de algunas enzimas en solución e inmovilizadas UNIDAD III

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ENZIMA Invertasa Arilsulfatasa Glucoamilasa Ureasa Glucosa oxidasa L-amioacido oxidasa Alcalino fosfatasa

SUSTRATO Sacarosa pnitrofenilfosfato Almidón urea glucosa L-leucina pnitrofenilfosfato

K M (milimolar) SOLUCIÓN INMOVILIZADA 0.448 0.448 1.85 1.57 1.22 10.0 7.70 1.00

0.30 7.60 6.80 4.00

0.10

2.90

* Las enzimas están inmovilizadas en partículas de vidrio poroso (96% sílice) 

Según “HIDRÓLISIS DE LA SACAROSA POR INULINASA INMOVILIZADA

EN NYLON-6 EN UN REACTOR CONTINUO.PDF”: La inmovilización de enzimas en soportes insolubles puede mejorar la estabilidad enzimática como también permite reciclar la enzima y separarla fácilmente del producto, lo cual tiene beneficios económicos. Dichas ventajas pueden aplicarse a la producción de jarabes fructosados a partir de sacarosa si se cuenta con un método para inmovilizar y un soporte barato, que no afecte la especificidad de sustrato y la velocidad de reacción de la inulinasa. 

Según INMOBILIZED ENZYMES: THEORY, METHODS OF STUDY AND

 APPLICATIONS.PDF: A menudo, la inmovilización altera significativamente el comportamiento de las enzimas. En primer lugar se producen cambios en su estabilidad, además de que la enzima inmovilizada es un sistema heterogéneo en el cual todos los componentes que intervienen en el proceso catalítico (pH, sustratos, productos, inhibidores, cofactores, activadores, etc.) el cual se encuentran en interface: en el medio de reacción y en la fase constituida por el soporte con la enzima. Como consecuencia, la actividad enzimática se ve afectada por efectos de tipo difusional, estérico y del microentorno

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Como producto del avance de la biotecnología y su aplicación en procesos industriales para la obtención de productos químicos, farmacéuticos o alimentarios se ha recurrido al uso de enzimas. Éstas presentan grandes ventajas sobre catalizadores no biológicos, entre ellas gran actividad catalítica, a temperatura ambiente y presión atmosférica, y gran especificidad de sustrato. La inestabilidad que presentan en los procesos químicos industriales y la dificultad de poder separarse de sustratos y productos, todos solubles en agua, hacen que las enzimas no se puedan reutilizar. Como alternativa se ideó el método de inmovilizarlas a un soporte inerte para hacer factible que un proceso biotecnológico sea rentable.



Se denomina una “enzima inmovilizada”  aquella que está físicamente localizada en una región definida del espacio, manteniendo su actividad catalítica y pudiendo ser usada repetida y continuamente.

Las ventajas del proceso: a) aumento de la estabilidad b) reutilización de los componentes c) la enzima no permanece en la solución al finalizar el tratamiento y d) diseño de reactores adaptables para cada enzima inmovilizada, permitiendo un reciclado de producto que aumente su pureza.

Las desventajas: a) alteración de la enzima respecto de su estado nativo b) heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir distintas proteínas inmovilizadas c) pérdida de actividad d) el sistema puede ser más caro que la enzima nativa.



Los métodos de inmovilización se pueden clasificar en 2 grandes categorías: 1. Retención física. UNIDAD III

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2. Unión química. Retención física:

 Atrapamiento: es la retención de la enzima en cavidades interiores de una matriz sólida porosa constituida por prepolímeros entrecruzables o polímeros de tipo poliacrilamida, colágeno,   carraginato  o resinas de poliuretano. Una suspensión de la enzima a inmovilizar se la incluye en una solución del monómero. Se inicia la polimerización con cambio de temperatura o adición de reactivo químico. El atrapamiento pueden ser

en geles  o en fibras, más resistentes éstas últimas. No hay alteración estructural de la enzima pero hay que vigilar el proceso de polimerización. En la práctica de laboratorio se utilizó como soporte alginato de sodio al 2 %,

con ello se obtuvieron los “beads” luego de 2 horas. El alginato de sodio absorbe el agua del medio, se gelatiniza y forman puentes de hidrogeno (H+). También se utilizó CaCl2 (0.1 M) para gelificar los beads y hacerlos resistentes

a la fuerza de agitación. En los “beads” las enzimas quedan atrapadas, algunos beads quedan en la superficie entonces hay que lavar con CaCl2 al 0.05 M. Los beads dejan salir los productos, la sacarosa se funde a traves de los poros y se obtiene fructosa + glucosa, estos son cuantificados por el método DNS para azucares reductores. 

La inmovilización altera el comportamiento de las enzimas. Generalmente se incrementa la estabilidad conformacional de las mismas (métodos de uniones de tipo covalente y aún más, con la adición de grupos bifuncionales), se aumenta la protección frente a proteasas y se evita la agregación intermolecular. Se produce una alteración del microentorno de la enzima debido a su interacción con el soporte, haciendo por ejemplo que enzimas sensibles al oxígeno, como nitrogenasas ó hidrogenasas, vean favorecida su actividad cuando están inmovilizadas, debido a que la fuerza iónica que tiene el entorno disminuye la concentración efectiva de oxígeno en el medio. Pueden perder total o parcialmente la actividad por interacciones con el soporte, por impedimento del paso del sustrato al sitio UNIDAD III

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INGENIERÍA DE ENZIMAS

activo, por interacción con grupos cargados del soporte o por cambios conformacionales que den formas inactivas. Otros cambios que afectan la actividad enzimática, aumentándola o disminuyéndola, son producidos por efectos de difusión del sustrato al sitio activo (por insolubilidad del soporte en el medio de reacción, por impedimentos estéricos o por efectos electrostáticos entre el sustrato y el soporte) y por efectos en el microentorno enzima-soporte. 

Cuando S/Km es bajo, es decir, cuando se ha tenido un grado de conversión alto (o se ha usado una concentración de substrato baja) la velocidad de reacción es de primer orden, y el tiempo de reacción requerido para obtener un grado de conversión particular es directamente proporcional de S/Km, la reacción es esencialmente de orden cero, y en este caso el tiempo necesario para conseguir un grado de conversión dado que es virtualmente independiente de S/Km. para que un proceso resulte útil a nivel industrial se requiere usualmente un alto grado de conversión de substrato en producto. Un enzima inmovilizado opera generalmente en condiciones cinéticas de primer orden, en especial si se consideran las altas densidades

de enzima que con frecuencia se

utilizan en las

preparaciones comerciales de enzimas inmovilizados. En estos casos el tiempo requerido para conseguir un incremento relativamente pequeño del grado de conversión depende claramente del valor de S/Km logrado en la operación, de forma que este parámetro tiene gran importancia experimental. 

Si se tienen en cuenta las ecuaciones que describen los reactores de flujo pistón y los reactores continuos con agitación, las prestaciones de ambos tipos de reactores son prácticamente idénticas cuando se usan concentraciones elevadas de substrato y S>Km, mientras que a concentraciones bajas de substrato S