Informe Final

“Año de la Diversificación Productiva y del Fortalecimiento de la Educación” UNIVERSIDAD CIENTIFICA DEL SUR FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA DE MEDICINA HUMANA

INFORME SOBRE LA EXTRACCIÓN, CUANTIFICACIÓN Y LECTURA DEL ADN Profesora: Francesca Falconi Agapito Integrantes:  Guillen Aquino, Nicol Oriana  Guerra Cabrera, Milagritos del Pilar

20 15

INTRODUCCIÓN El ADN que constituye el material genetico de los seres vivos y que ha sido punto de investigación desde hace ya tiempo, ahora es posible ser observada y anlizada atraves de distintos procesos. En este presente informe explicaremos los procesos realizados en el laboratorio que sirvieron para poder observar las bandas finales del ADN (muestra). Para poder hacer esto posible se debe llevar a cabo tres procedimientos fundamentales, que son:  Extracción de ADN (muestra).  Proceso de PCR.  Electroforesis. La extracción de ADN es una metodologia mediante la cual podemos obtener material genetico que nos permite la manipulación del producto obtenido. Es un metodo por el cual podemos estudiar mutaciones que esten involucradas con diferentes potologias humanas, mapeos y secuenciación de genes con fines terapeuticos. El proceso de PCR (reaccion en cadena de la polimerasa) es una tecnica utilizada para obtener un gran numero de copias de un fragmento de ADN en una amplificación in vitro, ademas de ser una amplificación selectiva la cual se basa en una capacidad de la enzima ADN polimerasa para fabricar una cadena ADN complementaria a la existente. La electroforesis es una tecnica utilizada para observar la concentración e integridad del ADN, proteinas y otras biomoleculas. Ya que permite las separación de las proteinas y acidos nucleicos a traves de una matriz tamponada de pH 8. Estos procedimientos hacen posible una amplificación del ADN para asi poder detectar o determinar ciertas patologias como errores geneticos, además de la determinación de paternidad; esto nos permite tener un mejor conocimiento acerca de la aplicación de estos metodos en el campo de la medicina y asi poder ponerlos en practica en el momento adecuado.

1.MARCO TEORICO La extracción de DNA a partir de muestras de distinta naturaleza, constituye la etapa previa de todo análisis genético. En general; los métodos de extracción de DNA tienen una serie de pasos básicos, que se cumplen independientemente del origen de la muestra. Estos son, a saber: disrupción celular (ruptura de la bicapa lipídica de las membranas celulares por tratamiento con detergentes, agentes quelantes que secuestran cationes estabilizantes de la membrana, etc.), eliminación de las proteínas (que constituyen los principales contaminantes del extracto), concentración del DNA (por precipitación con alcoholes), lavado (para eliminar restos de reactivos y solventes que puedan inhibir la Taq polimerasa) y resuspensión. El PCR (Reacción en la cadena de la polimerasa) es una técnica "in vitro" que imita la habilidad natural de la célula de duplicar el ADN. Técnica usada para crear un gran número de copias de un segmento de ADN, que utiliza ciclos de desnaturalización, apareamiento con cebadores y extensión por una ADN polimerasa termoresistente. Es una técnica que permite duplicar un número ilimitado de veces un fragmento de ADN en un tubo de ensayo, pueden generarse millones de moléculas idénticas, a partir de una molécula de ADN. Esto se puede conseguir en unas horas. La reacción es muy sencilla, necesita cantidades de ADN muy pequeñas y sólo se precisa un tubo de ensayo, algunos reactivos, una fuente de calor y unas pequeñas cadena de nucleótidos que actúan como cebadores. La electroforesis es una técnica de laboratorio utilizada para separar moléculas cargadas colocadas en un campo eléctrico. Las moléculas cargadas positivamente se desplazarán hacia el polo negativo y las cargadas negativamente hacia el polo positivo. Uno de los factores que afecta la separación de las moléculas en una electroforesis es su carga. Para el caso del DNA, los grupos fosfato le dan la carga a la molécula. Los grupos

fosfato son grupos ácidos con pK bajos, esto significa que a pH neutro (7.0 – 7.5) sus grupos hidroxilo pierden los protones (H+) y quedan cargados negativamente. Por lo anterior, los ácidos nucleicos (DNA y RNA) son moléculas cargadas negativamente a pH neutro, en un sistema electroforético se desplazarán hacia el polo positivo, es decir, separación de moléculas por diferencia en su movilidad electroforética. Para separar moléculas de DNA de diferente tamaño se incluye en el sistema la utilización de geles, tanto de agarosa como poliacrilamida (acrilamida más bis-acrilamida).

2.OBJETIVOS 1. Extracción ADN a partir de muestras biológicas. 2. Realización de una comparación entre dos técnicas de aislamiento de DNA. 3. Conocimiento los fundamentos en lo que se basa la técnica de PCR. 4. Conocemos la importancia del uso de la técnica de PCR para el diagnóstico de enfermedades en los seres humanos. 5. Amplificamos una secuencias especifica del ADN genómico humano utilizando la técnica de PCR. 6. Describimos las funciones de las enzimas de restricción. 7. Conocimos cómo las enzimas de restricción cortan el ADN. 8. Observación el ADN cortado con diferentes enzimas de restricción como EcoRI. 9. Familiarización con la técnica de electroforesis en gel. 10. Comprensión de los conceptos que están involucrados en la separación de ácidos nucleicos en una corrida electroforética. 11. Visualización la muestra de ADN aislada de la práctica anterior.

3.MATERIALES MATERIALES DEL LABORATORIO PARA LA EXTRACCIÓN DE ADN  Kit de extracción de ADN  Micropipetas de 20 – 100, 100 -1000 μl.  Puntas de 10 -100 μl y de 100 -1 000 μl

 Tubos ependorf de 1,5 mL  Microcentrífuga16000 rpm  Vortex MATERIALES DEL LABORATORIO PARA LA CUANTIFICACIÓN DEL ADN  Qubit Kit (cuantificación de ADN)  Micropipetas de 20 – 100, 100 -1000 μl.  Puntas de 10 -100 μl y de 100 -1000 μl  Tubos de PCR (250 μl)  Vortex MATERIALES DEL LABORATORIO PARA EL PCR  Micropipetas de 20 – 100, 100 -1000 μl.  Puntas de 10 -100 μl y de 100 -1 000 μl  Tubos ependorf de 1,5 mL      

Microcentrífuga16000 rpm Tubos ependorf Termociclador Agua estéril Muestras de ADN Mix de PCR (taq polimerasa, dNTPs, primer, Mg, agua)  Primers Alfa tubiluna y Beta actina. MATERIALES DEL LABORATORIO PARA LA ELECTROFORESIS  Muestra de ADN obtenida de la práctica anterior.  Marcador de peso molecular.  Cámara de electroforesis y accesorios (peines, soporte, tabla niveladora, etc).  Fuente de poder.  Micropipetas para volúmenes de 0,5 - 20 μl.  Guantes.  Gradilla para tubos de 1,5 mL.  Puntas para volúmenes de 0,5 - 20 μl.

 Agarosa al 2 %.  Buffer Tris – borato – EDTA 1X (TBE) pH 88.3.  Buffer carga para ADN.  Colorante Sybr green  Transiluminador de luz UV.

4. PROCEDIMIENTO

Extracción de ADN usando kit de extracción Purelinkgenomic (Invitrogen) Extracción de ADN de sangre Total. 1. En un tubo ependorff, adicionamos una muestra de 20 μl de sangre fresca. 2. Transferimos 20 μl de células o sangre a un tubo que contiene 20 μl proteinasa K. 3. Añadimos 20 μl de RNasa a la muestra. Luego sometimos en el vórtex por 15 segundos e incubamos a temperatura ambiente durante 2 min. 4. Después añadimos 100 μl de Buffer lisis y homogenizamos utilizando vórtex por 15 segundos. 5. Incubamos a 55 ° C durante 10 min. 6. Añadimos 100 μl de etanol 96-100%. Mezclando en el vórtex por 15 segundos. 7. Por ultimo incubamos la lisis por 5 min a temperatura ambiente. Proceso de purificación: 1. Colocamos la lisis (260 μl) en la columna de extracción. 2. Centrifugamos la columna a 8500 rpm por 1 min, descartando el filtrado por la columna y colocando la columna en un nuevo tubo de lavado. 3. Lavamos la columna con 200ul de buffer de lavado, luego centrifugamos a 8500 rpm por 1 min y eliminando el filtrado. 4. Colocamos la columna en un nuevo tubo de lavado, adicionando 200ul de buffer de lavado y centrifugando la columna a velocidad máxima por 3 min para filtrar cualquier residuo del buffer de lavado. 5. Colocamos la columna en un nuevo tubo de recolección (1,5ml). 6. Añadimos 100 μl de Buffer de elución a la columna.

7. Incubamos a temperatura ambiente durante 1 min. Centrifugando la columna a velocidad máxima durante 1 min a temperatura ambiente. 8. El tubo contiene ADN genómico purificado. 9. Almacenamos el ADN purificado a -80ºC para otras aplicaciones. Cuantificación de ácidos nucleicos (Qubit) 1. En un tubo ependorf de PCR colocamos 1 μl de la muestra en 199 μl de buffer. 2. Calibramos el Qubit según se indique el manual. 3. Medimos todas las muestras y anotamos los resultados, para comparar los resultados. PCR 1. En un tubo de PCR colocamos 25 μl de solución de reacción final (mix de PCR):

2. Centrifugamos brevemente para mezclar bien los componentes. 3. Colocamos los ependorf con la solución de mix de PCR en el termociclador, el cual ya debe tener programado las condiciones de amplificación. 4. Finalizado el proceso de amplificación, retiramos los ependorf del termociclador y guardamos las muestras a 4°C si el amplificado se llegara a utilizar en un lapso de poco tiempo. Si no fuese el caso mantener a –20°C. Electroforesis 1. Preparamos 50 ml de agarosa al 2% y adicionamos 20 μl de colorante Sybr green, dejando polimerizar por 10 min aproximadamente. Sumergiendo el sistema que

2.

3. 4.

5.

6.

7. 8.

contenia los geles polimerizados en su tanque (cámara electroforética) con el buffer TBE 1X para ADN. Al momento de sumergir los geles en el tanque, aseguramos que los pocillos del gel estén totalmente saturados de buffer. Sobre un pedazo de lámina extensible de parafilm, preparamos una mezcla de 5 μl ADN con 1μl de buffer carga repartida en alícuotas de acuerdo al número de muestras que se colocaron en los pocillos (considerar el uso de un marcador de peso molecular estándar de ADN). Con el uso de puntas de 20 μl procedimos a cargar cuidadosamente la muestra en los pocillos del gel de agarosa evitando la contaminación del pocillo contiguo. Finalizando con la colocación de las muestras ADN en los pocillos, cubrimos el tanque con la tapa y conectamos los cables de los electrodos en la fuente de poder. Encendiendo la fuente de poder y proceder a seleccionar el voltaje adecuado (puede estar comprendido entre 75 a 120 voltios). Luego de seleccionar las condiciones de voltaje, iniciar el proceso de la electroforesis. Durante el proceso se evidenciarán dos frentes de corrida de diferente color y distancia de migración. Ambos colores, azul oscuro y azul claro corresponden a los colorantes azul de bromofenol y xilenecianol, que conforman el buffer de la muestra. El xilenecianol en geles de agarosa al 2 % migra de manera similar a un fragmento de ADN de 160 pares de base (pb), mientras que el azul de bromofenol a esta misma concentración de agarosa es equivalente a un fragmento de 45 pb. Transcurrido el tiempo de corrida de la electroforesis, procedimos al desmontaje del equipo empezando con la desconexión de los electrodos de la fuente de poder, removiendo el sistema que contiene el gel de agarosa. Removimos el gel del soporte, para realizar este proceso se requiere tener mucho cuidado, pues el gel es muy frágil y puede romperse con facilidad. Desplazamos el gel hacia el transiluminador para el revelado, encender el equipo y verificar que este a una longitud de onda de 420 nm.

9.

Dejamos hasta que empiecen a aparecer las bandas y registrar el resultado final.

5.

ANÁLISIS RESULTADOS

Y

DISCUSIÓN

DE

LOS

En la extracción del ADN, utilizamos la proteinasa K para romper las proteínas, al igual que el RNasa que en este caso rompió el RNA, ya que lo que utilizamos fue el ADN. Luego se utilizó el buffer lisis para la estabilización de las proteínas, ya que funciona como un detergente no ionico, lo cual no maltrato al ADN. Utilizamos el etanol para estabilización del ADN, porque se pliega a sí mismo y evita que se solubilice. En el proceso de purificación utilizaremos la micro centrifugadora para poder obtener tan solo el ADN purficado. Luego en la cuantificación usamos el Quibit para pesar la masa del ADN. En el proceso de PCR, utilizamos el mix de PCR que contenia: Taq: es el ADN polimerasa, el cual tiene la característica de ser termoestable; la taq actúa en el paso de la replicación ya que constituye cada cadena simple de ADN marcada por un iniciador en una cadena doble de ADN. Primers: secuencias de oligonucleótidos que flanquean y delimitan la secuencia blanco que se desea amplificar y son complementarios a ésta. Encargadas de continuar las cadenas ya que se utilizan dos primers diferentes (Forward y Reaward). dTNP’s: bases nitrogenadas con los que la Taq polimerasa construye las nuevas cadenas de ADN. Son factores importantes que contribuyen a la especificidad de la reacción, por ello es importante que su concentración sea la adecuada ya que de lo contrario pueden afectar la función de la Taq polimerasa. Tampon: es la solución amortiguadora que se usa en la reacción y generalmente está compuesta de TrisHCL (pH = 8) cuya concentración final de trabajo debe ser 1X.

Mg++: El magnesio es un cofactor enzimático que influye en la especificidad de la reacción, por eso se debe tener una concentración adecuada para que no afecte el rendimiento de la Taq polimerasa. Luego, se centrifuga para la mezcla de los componentes, para luego ponerlos en el termociclador el cual logra las tres etapas del PCR. Para finalizar se guarda a una termperatura baja para conservar la masa. Electroforesis, el sybr Green se asocia a la molécula de ADN interactuando con la hendidura menor del ADN. Esto ocasiona la tinción de ADN para el análisis por electroforesis de productos de PCR, o como fluorocromo utilizado como medio de visualización. TBE X1 : Reacciona como un amortiguador AEDT: ácido etilendiamino

tetraacético. En sus formas desprotonadas (2− y 4−), es un conocido agente quelante de cationes divalentes, en especial Ca 2+ y Mg2+. Dado que el Mg2+ es un cofactor requerido por la mayoría de nucleasas, su secuestro por el EDTA evita la degradación del DNA durante la preparación y la electroforesis.

1 8

2 9

3 10

1= Marker (marcador) Grupo 1 3= Grupo 2 4= Grupo 3 5= Grupo 4 6= 7= 8= Marcador 9= 10=

4

2=

5

6

7

EXTRACCION  ADN La Resultado

Tubo 1

6.58ng/ml

Tubo 2

13.3ng/ml

Tubo 3

10.8ng/ml

Tubo 4

6.84ng/ ml

electroforesis en gel de agarosa ha demostrado ser una manera eficiente y eficaz de separar los ácidos nucleicos. En general, cuanto mayor sea la concentración de agarosa, menor es el tamaño de los poros. Tradicionales geles de agarosa son más eficaces en la separación de los fragmentos de ADN entre 100 pb y 25 kb. De este modo grandes fragmentos de ADN de tamaño están separados por la velocidad a la que ellos mismos reorientar con los cambios en la dirección de la corriente. Los fragmentos de ADN más pequeñas que 100 pb se separó más eficazmente mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. El uso de tubos capilares permite la aplicación de altas tensiones, lo que permite la separación de fragmentos de ADN (y la determinación de la secuencia de ADN) de forma rápida.

DEL

Tintes de carga utilizados en electroforesis en gel sirven para tres propósitos principales. Primero se añade a la densidad de la muestra, Permitiendo que se hunda en el gel. En segundo lugar, los tintes proporcionar color y simplificar el proceso de carga. Finalmente, los colorantes se mueven a velocidades estándar a través del gel, lo que permite la estimación de la distancia que los fragmentos de ADN han migrado. Los tamaños exactos de los fragmentos de ADN separados pueden determinarse trazando el registro del peso molecular de las distintas bandas de un estándar de ADN contra la distancia recorrida por cada banda. El estándar de ADN contiene una mezcla de fragmentos de ADN de tamaños predeterminados que pueden ser comparados contra las muestras de ADN desconocidos. Es importante señalar que las diferentes formas de ADN se mueven a través del gel a diferentes velocidades. ADN plásmido superenrollado, debido a su conformación compacta, se mueve a través de la más rápida en gel, seguido por un fragmento de ADN lineal del mismo tamaño, con la forma circular abierta viajar el más lento.

Pero puede existir factores que alteren los resultados de la electroforesis, asi como la carencia de las bandas en la agarosa, que puede darse por diferentes causas tales como:  La cantidad o la concentración de DNA en la muestra cargada al gel fuesen insuficientes.  La degradación del DNA.  Que el DNA se halla salido por el extremo del gel durante la electroforesis.

6.CONCLUSIONES  La extracción del ADN es una etapa muy importante ya que en esta vamos a buscar extraer el ADN puro para luego dar secuencia a las otras etapas.

 La técnica del PCR es de gran utilidad en distintos campos como de la biología molecular, biotecnología entre otros, además brinda un resultado mucho rápido y seguro.  Desde la adopción de geles de agarosa para la separación de ADN, se tiene demostrado ser una de las técnicas más útiles y versátiles en la investigación ciencias biológicas.

 Estos simples procesos son de gran ayuda para la investigación de ciertos patógenos que pueden ser heredados, ayuda para las investigación de los medico forenses entre otras áreas, a nosotros como futuros médicos, para la determinación de enfermedades genéticas. 7. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS  Contreras J. Electroforesis de DNA. Guía Unificada de Laboratorios. [Consultado el: 01 de noviembre de 2015] Pp: 1-3. Disponible en: http://www.geocities.ws/jorgecon/electroforesisagarosa.p df  Blogspot.pe. Marco Teórico. [Consultado el: 01 de noviembre de 2015].Disponible en : :http://biotecnologiagrupo3.blogspot.pe/2011/05/marcoteorico.html  Advincula. Extracción del ADN .Santiago,Chile:Ministerio de Salud Consultado el: [01 de noviembre de 2015].Disponible en http://www.scielo.org.ar/scielo.php? pid=S1851-75872010000200001&script=sci_arttext  Choque B. Extracción del ADN.Colombia.Zuckta.Consultado el: [01 de noviembre de 2015].Disponible en: http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/extra ccion.pdf

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