Informe Final 2 Ingenieria Del Cultivo Celular Por Lotes y Medicion Del Kla

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

INFORME FINAL II “INGENIERÍA DEL CULTIVO CELULAR POR LOTE Y MEDICIÓN DEL KLa"

INTEGRANTES     

BAZÁN PLASENCIA JEIMISON JUAN LOPEZ MARTELL SIUNEY MABEL MORALES ZÚÑIGA MÉLANY MORENO VALVERDE JEFFERSON YANAMANGO CHAVEZ VERÓNICA

16 GRUPO A - 1

PROFESOR: M. S. Augusto Castillo Calderón

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INFORME FINAL II “INGENIERÍA DEL CULTIVO CELULAR POR LOTE Y MEDICIÓN DEL KLa" I. RESUMEN: Objetivo, determinar los valores y correlación matemática del coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno, KLa, por el método dinámico, de un fermentador de laboratorio BIOSTAT-Aplus, fermentando levaduras de Pichia Stipitis NRRL Y 7124, en un medio simulado de hidrolizado de cascarilla de arroz, a fin de producir etanol en condiciones de micro aireación.

Método, la experiencia se realizará con un volumen de trabajo de 2L, controlado a 30°C y operándose a diferentes condiciones de agitación(N) y la velocidad superficial de aire (Vs) en los rangos de 300 a 400 rpm.

La matriz de valores obtenidos de KLa fueron correlacionados a un modelo que tuvo como variable dependiente a N y Vs, resultando un coeficiente de correlación múltiplo de 0.961.

En las condiciones de operación ensayadas el valor de KLa obtenido mostro ser más dependiente de la velocidad superficial de aireación que de la velocidad de agitación.

II. INTRODUCCIÓN:

El etanol, es un importante químico industrial con un emergente potencial como biocombustible de reemplazo a los combustibles fósiles. La principal ventaja del uso y la producción del mismo, es la de contribuir a la disminución de la red acumulativa de gases de efecto invernadero en la atmósfera (Govindaswamy, 2007). La capacidad de los microorganismos de fermentar glucosa y xilosa es de gran importancia para un proceso económicamente factible. La producción de etanol es Página 2

dependiente de la actividad fermentativa microbiana, particularmente de las levaduras. Las levaduras naturales que pueden fermentar xilosa a etanol son Pichia stipitis,

Candida

shehatae y Pachysolen

tannophilus

(Lynd,

1999),

la

tradicional Saccharomyces cerevisiae carece de este comportamiento diáuxico. P. stipitis puede convertir xilosa a etanol con alto rendimiento y a velocidades relativamente altas (Wyman, 1999). Muchos autores han demostrado que la conversión de xilosa por P. stipitis es altamente influenciada por la presencia de oxígeno (Schneide, 1981). En condiciones aerobias se produce biomasa, sin embargo, cuando el oxígeno es limitado se forman otros productos. Es así que para esta práctica hemos centrado nuestra atención en el tratamiento de un microorganismo (Pichia stipitis NRRL Y-7124), iniciando desde su siembra partiendo desde su estado en cepa congelada , para luego sembrarlo en medio rico, empleando la xilosa como fuente de carbono , procurando su rápida activación, para que luego de un determinado tiempo podamos sembrar la bacteria pero en un medio mínimo; es decir con los mínimos requerimientos; en el cual es más factible determinar la cinética de crecimiento. El objetivo general del experimento es diseñar y realizar una experiencia de cultivo celular por lotes de Pichia Stipitis NRRL Y-7124, en un medio simulado de hidrolizado de cascarilla de arroz, a fin de producir etanol en condiciones de micro aireación, midiendo el coeficiente volumétrico de trasferencia de oxígeno a distintas condiciones de aireación y agitación. Los objetivos específicos o terminales son determinar el KLa por el método dinámico de Humphry y correlacionar los resultados y obtener los perfiles de masa celular, fuente de carbono, oxígeno disuelto (OD) y pH a través del tiempo total de fermentación en el birreactor. La preparación de medios de cultivo para estos microorganismos es nuestro punto de partida para conocer sobre su comportamiento así como también el seguimiento de la cinética nos proporciona datos mucho más prácticos y exactos sobre la velocidad y características del crecimiento del microorganismo tratado. Entre los decenios cuarenta y cincuenta se lograron grandes avances tecnológicos en el cultivo microbiano, y se desarrolló el fermentador agitado con controles automáticos para preservar las condiciones adecuadas de la fermentación. La Página 3

mayoría de los procesos utilizados en esa época son aeróbicos o con requerimientos de micro aireación y operan de manera discontinua (forma de lote o procesos batch). El biorreactor, es sin duda, uno de los equipos fundamentales de la microbiología industrial. Es el recipiente donde se realiza el cultivo, y su diseño debe ser tal que asegure un ambiente uniforme y adecuado para los microorganismos El aire se inyecta por la parte inferior del tanque y es distribuido por una corona que posee pequeños orificios espaciados regularmente. El chorro de aire que sale de cada orificio es "golpeado" por las paletas de la turbina inferior generándose de este modo miles de pequeñas burbujas de aire, desde las cuales difunde el 02 hacia el seno del líquido. El sistema de agitación se completa con cuatro o seis deflectores que tienen por finalidad cortar o romper el movimiento circular que imprimen las turbinas al líquido, generando de este modo mayor turbulencia y mejor mezclado. El tanque está rodeado por una camisa por la que circula agua, lo que permite controlar la temperatura. Para tanques mayores que 1000 o 2000 litros este sistema ya no es eficiente y es reemplazado por un serpentín que circula adyacente a la pared interior del tanque. Debe tenerse en cuenta que a medida que es mayor el volumen de cultivo también lo es la cantidad de calor generado, por lo que se hace necesario una mayor área de refrigeración. Los tanques son de acero inoxidable y están pulidos a fin de facilitar la limpieza y posterior esterilización. El aire que ingresa al biorreactor debe estar estéril, lo que se consigue haciéndolo pasar por un filtro cuyo diámetro de poro es de 0,45 micrones, que impide el paso de microorganismos y esporas. Si la bacteria crece en un medio líquido, en la mayoría de los casos las células que se producen en cada división continúan su vida independientemente formándose una suspensión de células libres. En un cultivo discontinuo de bacterias en medio líquido, se pueden diferenciar cuatro fases en la evolución de los parámetros que miden el crecimiento microbiano: Con respecto a la composición de los medios, los carbohidratos son tradicionalmente las fuentes de carbono utilizadas en la industria de la fermentación. Por otro lado, el agar presenta algunos inconvenientes; el principal consiste en ofrecer una aireación insuficiente que puede afectar el crecimiento de algunos tejidos. La composición del agar es variable y, a veces, mal definida y podría aportar Página 4

oligoelementos que actúan favorablemente sobre el crecimiento. (P. J. Slininger, 1990). Las fases, parámetros y cinética de crecimiento discutidas para el caso de los cultivos líquidos se presentan también en cultivos sólidos. La cinética de crecimiento, en este caso, se puede estudiar siguiendo la evolución del número de células viables por unidad de superficie o por unidad de masa. Cuanto más bajo el pH del medio, tanto menor el peligro de infección, pero si se trabaja con pH muy bajos la fermentación es muy lenta, ya que la levadura no se desarrolla de la forma conveniente. Como ya se dijo, la presencia de sustancias nutritivas adecuadas es una condición necesaria para el crecimiento y desarrollo de la levadura, siendo su concentración un factor primordial en la actividad vital de la levadura. (GODOY,1985)

III. MATERIALES Y MÉTODOS: 3.1 Materiales 3.1.1 Diseño de medios, preparación y cultivo del microorganismo  Preparación del medio solido de mantención agar nutriente Para la preparación de del medio de mantención se utilizó los siguientes reactivos: agar nutriente (AGAR POWDER NO.1 FOR BACTERIOLOGY, LOBA CHEMIE), peptona (PEPTONA BACTERIOLOGICA Z, BIOCEN), extracto de malta (BACTO, BD), extracto de levadura (YEAST EXTRACT CDH POWDER).y agua destilada. Los materiales usados para la preparación del medio se hizo en un tubo de ensayo, utilizando pipetas vasos de precipitado y papel aluminio, estos materiales fueron pesados en una balanza analítica (Adventurer® Analytical, OHAUS) diluido el agar utilizando el mechero bunsen y el medio esterilizados en una olla a presión (autoclave).  Preparación de soluciones de sales concentradas Para la preparación de la solución de sales se utilizó una fiola (pyrex) de litro y se utilizó las siguientes sales, cloruro de calcio di hidratado, óxido de cinc, 6.42 g/L de sulfato de hierro sexta hidratado, sulfato de magnesio 7 hidratado, sulfato de cobre penta hidratado(Baker analyzed), coluro de cobalto 7 hidratado(Baker analyzed), ácido bórico, Ácido clorhídrico concentrado medido en pipetas, Página 5

pesadas en la balanza analítica(Adventurer® Analytical, OHAUS) taradas en papel de aluminio y diluidas en vasos de precipitado, se mesclan las sales y se guarda en un envase de plástico en el refrigerador.  Esterilización de pipetas y viales Se implementó las pipetas con algodón como filtro en la zona de succión y esterilizo envuelto en papel aluminio a 85°C por 8 horas en una estufa eléctrica (p-selecta) junto con los viales y las tapas de los viales.  Resembrado de células en el medio de mantención agar sólido Se realizó el resembrado en condiciones de asepsia limpiando el espacio de trabajo con alcohol de 96° luego en el mechero bunsen se esterilizo el asa bacteriológica y se extrajo el microorganismo contenidos en tubos de ensayos y despertados previamente en la incubadora a 30°C (p-selecta) hacia los tubos contenidos de agar nutriente.  Preparación del medio de activación Los materiales utilizados para esta parte son Matraz Erlenmeyer de 250 ml y de 125ml (pyrex), Pipetas, tubos de ensayo, gradilla, Papel aluminio, Gaza (tampones) y los reactivos xilosa (d+xylose, SIGMA), extracto de levadura (YEAST EXTRACT CDH POWDER), extracto de malta (BACTO, BD), todos estos pesados utilizando una Balanza analítica (OHAUS) y diluidas en agua destilada para la esterilización se utilizó una olla a presión (autoclave) las concentración fueron las realizadas en el diseño de medio.  Preparación previa al sembrado del medio sólido al líquido Se utilizó el Matraz con el medio liquido se agito en el shaker (sartorius stedim) se despertó el microorganismo en medio solido introduciendo el tubo a la incubadora (P.SELECTA).  Inoculación con asa bacteriológica al medio líquido. Se inoculo en condiciones de asepsia usando el asa bacteriológica esterilizada en el mechero bunsen, se introdujo el asa en él tuvo que contiene el microorganismo se y se sumerge el asa en el matraz con el medio liquido (activación) se tapó el matraz con el tampón y este fue llevado al Shaker (sartorius stedim) a 220rpm y 30°C durante.  Preparación del medio líquido de fermentación Se realiza en un matraz Erlenmeyer de 250 ml con tampones de algodón y gasa forrados de papel aluminio, utilizando pipetas tubos de ensayo y pisetas para diluir los reactivos xilosa (d+xylose, SIGMA), extracto de levadura (YEAST EXTRACT CDH POWDER), sulfato de amonio (mallinckrodt, AR), fosfato de

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potasio (CDH), sulfato de potasio (SIGMA), solución de sales, tampón citrato (pH 4.5).  Esterilización de medio mínimo de cultivo Matraces (pyrex) y tubos de ensayo que contienen los componentes del medio de fermentación en la olla a presión o autoclave.  Inoculación y mezcla de medios de activación con el medio de fermentación. Se utilizó 3 Matraz Erlenmeyer dos de 125ml y uno de 250ml tubos de ensayo y el mechero bunsen, asa bacteriológica, el shaker (sartorius stedim) y la Incubadora (p-selecta).  Determinación de la cinética de crecimiento de biomasa Inicio de la cinética Entre los materiales utilizados tenemos los tubos de ensayo, la gradilla el matraz conteniendo el medio de fermentación tapados con tampón (tapa y algodón), se utilizó pipetas estériles tapadas en papel de aluminio para el retiro de muestra. El matraz se agito en el shaker (sartorius stedim) para continuar la fermentación, de la muestra retirada se retira una alícuota en donde medimos la absorbancia de la muestra en el espectrofotómetro (thermo scientific, genesys 20) y el remanente de la muestra se lleva a la centrifuga (p-selecta, Angular 6) para las disoluciones se mezcla con agua destilada. Determinación de la concentración celular por D.O  Diluciones para la curva de calibrado Los materiales usados fueron Matraz, Tubos de celda, Tubos de ensayo Pipetas estériles, Gradilla, Los equipos utilizados fueron el espectrofotómetro (thermo scientific, genesys 20).  Peso seco Los materiales utilizados para el peso seco fueron capachos de aluminio Centrifuga (p-selecta), estufa (p-selecta), balanza analítica (Adventurer® Analytical, OHAUS) espectrofotómetro (thermo scientific, genesys 20)  Determinación de la cinética de consumo de la fuente de carbono: Determinación de azúcares reductores:  Preparación del reactivo DNS. Entre los materiales usados para la preparación tenemos el matraz la balanza Analítica (Adventurer® Analytical, OHAUS) y los reactivos, 10 g/l de ácido 3.5 Página 7

dinitrosalcilico (DNS), 200 ml/l de NaOH 2N, 300 g/l de tartrato de sodio y potasio tetra hidratado (CDH).  Método del DNS (ácido dinitrosalicílico). Se utilizó 8 tubos de ensayo sin tapa, Gradilla, Micro pipeta con puntas (kcil, 1001000 uL), Vasos precipitado, Olla con trípode, Hielo, Celdas, Papel toalla, los equipos utilizados fueron mechero bunsen, agitador Maxi Mix (p-selecta, Angular 6) Espectrofotómetro (thermo scientific, genesys 20) y los reactivos DNS y Agua destilada.  Bioreactor Es un recipiente o sistema que mantiene un ambiente biológicamente activo. En algunos casos, un biorreactor es un recipiente en el que se lleva a cabo un proceso químico que involucra organismos o sustancias bioquímicamente activas derivadas de dichos organismos. Este proceso puede ser aeróbico o anaeróbio. Estos biorreactores son comúnmente cilíndricos, variando en tamaño desde algunos mililitros hasta metros cúbicos y son usualmente fabricados en acero inoxidable. Un biorreactor puede ser también un dispositivo o sistema empleado para hacer crecer células o tejidos en operaciones de cultivo celular. Estos dispositivos se encuentran en desarrollo para su uso en ingeniería de tejidos. En términos generales, un birreactor busca mantener ciertas condiciones ambientales propicias (pH, temperatura, concentración de oxígeno, etcétera) al organismo o sustancia química que se cultiva. En función de los flujos de entrada y salida, la operación de un birreactor puede ser de tres modos distintos: 1. Lote (batch) 2. Lote alimentado (fed-batch) 3. Continuo o quimiostato

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Motor La agitación requerida se realiza mecánicamente, por medio de: un eje transmisor de potencia provisto de aletas o turbinas de agitación y accionado por un motor de corriente alterna con control de potencia y velocidad.

Soporte Aquel que sostiene el tanque, en este caso de 2L de capacidad.

Tapa Es la que sostiene a los 4 sensores, con orificios en su parte superior para introducir los tubos con los flujos de aire y agua.

Tanque Este tanque o vaso es aquel que contendrá la mezcla de fermentación. Tiene una capacidad de 2L. Pero también existen otros con más volumen.

Rotores tipos turbina Existen 2 rotores, puestos tal que la fuerza que se transmite a través del eje se transmita por todo a fermentación, que la energía se transmita al máximo. El número de rotores está condicionado al volumen del tanque. Este rotor contiene 6 álabes.

Difusor de aire Tiene 6 orificios llamados toberas. El aire entra por un tubo y debido a su menor densidad, el aire asciende por las toberas para llegar a la mezcla.

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Medidas del vaso:  

Diámetro: 12.9 cm Altura: 16.9 cm

Medidas del rotor:   

Diámetro: 5.3 Distancia de rotor a rotor: 10.1 Altura: 5.3

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



Sensor de temperatura:



Sensor de pH:



Sensor de Oxigeno:

Operación: El equipo “Fermentador automatizado Biostat – A Plus de 3 litros” es operado desde el software que es accionado desde la laptop, donde podemos fijar las condiciones como pH, temperatura, velocidad de agitación, reflujo de agua. Y para el caso específico de darle la aireación se tiene el compresor de aire de diafragma, que es modulado por el centro de control en el rotámetro donde controlamos el flujo de aire.

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

Esterilización: Se esteriliza todo el fermentador menos los sensores, se coloca en el autoclave por 2 horas aproximadamente.



Carga y descarga: Para cargar primero se toman las condiciones de asepsia para evitar cualquier contaminación, luego se coloca un embudo, previamente ya esterilizado, sobre uno de los agujeros en la tapa del fermentador y se inocula el medio de fermentación con el medio de activación vaciando en el fermentador.



Toma de muestras: Las muestras son tomadas por succión, por el conducto para tomar muestras, un tubo hueco. Las muestras se van a tomar a un nivel entre los dos rotores. Con la jeringa se succiona 5ml de muestra y se vacía en el tubo de ensayo; luego se cierra el conducto a presión con las pequeñas prensas. Antes de tomar la muestra se debe sacar con la jeringa 3ml, que son los que se contienen en el conducto.

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3.2

Métodos

3.2.1 Preparación del medio de mantención DIAGRAMA DE BLOQUES DEL PROCESO

Pesar

Cada nutriente como indica en la Tabla A-1

Mezclar

En un matraz de 250 ml

Hervir

Con mechero durante 1-2 minutos

Nutrientes

Agua destilada (50ml)

Colocar

En caliente, 7 ml de solución a 6 tubos de ensayo con tapa (cubiertas con papel aluminio)

Reposar

Por 1 hora

Esterilizar

En el autoclave por 20min

Reposar

En posición inclinada

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3.2.2 PREPARACIÓN DE SOLUCIONES DE SALES CONCENTRADAS (20ml). Se precisa realizar los siguientes pasos para la preparación de soluciones de sales concentradas.  Pesar cuidadosamente las correspondientes sales que conforman nuestra solución de sales concentradas para la sepa de Pichia stipitis NRRL Y-7124.  Luego de pesar, cada compuesto lo diluiremos con agua destilada en un vaso de precipitado adicionándole 100 ml de agua destilada con la ayuda de un agitador de vidrio.  La solución se colocara en una fiola de 1litro y se enrazara con agua destilada hasta completar 1litro.  Una vez realizado el preparado se utilizara 5ml en la activación y 5ml para la fermentación. DIAGRAMA DE BLOQUES

Pesar

Cada nutriente como indica los datos en reactivos

Mezclar

Todos los nutrientes con 100 ml de agua destilada en vaso precipitado

Agregar

La solución a Fiola de 1 L

Aforar

Con agua destilada hasta el ras.

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3.2.3 PREPARACIÓN DE SOLUCIÓN TAMPÓN (100 ml) De acuerdo con la guía de Practica de Bioprocesos, para la preparación de la Solución (Tampón) del compuesto (NH4)2SO4; se utilizara un volumen de 100 ml diez veces concentrada con pH 4,5. 



Se diluirá con agua destilada cada compuesto en un vaso de precipitado y serán puestos en una fiola de 100 ml y llevados al pHmetro para ajustar su salinidad. Una vez hecho el preparado se llevara a refrigeración.

DIAGRAMA DE BLOQUES

Pesar

Cada compuesto que integra la solución tampón

Agregar

La solución a Fiola de 1 L

Aforar

Con agua destilada hasta el ras.

Ajustar pH

Refrigerar

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3.2.4 DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE AZÚCARES REDUCTORES MEDIANTE EL MÉTODO DEL DNS. La preparación del reactivo DNS se requiere de lo siguiente:   

10 g /L de ácido 3,5 dinitrosalicilico (DNS) 200 mL / L de NaOH 2N 300 g/L de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado

Para la preparación de este reactivo, se disuelve el tartrato en aproximadamente 500 ó 600 mI de agua, paralelamente se disuelve el ácido DNS. Ambas soluciones se mezclan en un matraz aforado de 1 litro y se agita hasta la completa disolución de todos los componentes, para posteriormente aforar hasta un litro.

DIAGRAMA DE BLOQUES

Añadir

Mantener

Añadir

Lee

Obtener

un volumen del reactivo DNS a un volumen de muestra a analizar.

La mezcla en un baño de agua a ebullición durante 5 minutos para luego dejar enfriar. 10 volúmenes de agua destilada.

la absorbancia a 540 nm, utilizando agua como blanco.

La concentración interceptando la medida de absorbancia en la curva de calibrado.

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3.2.5 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA POR MÉTODO ENZIMÁTICO Se utiliza un kit glucosa Monlabtest para la cuantificación de glucosa por método enzimático. El kit consta de un reactivo R y un patrón primario acuso de glucosa 10mg/dL Procedimiento: adaptado para alcanzar el volumen total de reacción para la cubeta de espectrómetro (GENESYS 20). -

Preparar solución estándar de glucosa 2g/l. hacer 6 diluciones. Blanco 30uL agua destilada + 3ml de reactivo. Acondicionar 6 tubos con soluciones de glucosa 30ul c/u + 3ml de reactivo y mesclar. Incubar tubos en baño maria 37°C durante 10 min. Medir absorbancia a 505nm.

Preparar

Realizar

Preparar

Acondicionar y mezclar

Incubar

Medir

Solución estándar de glucosa 2g/l.

6 diluciones

Blanco 30uL agua destilada + 3ml de reactivo. 6 tubos con soluciones de glucosa 30ul c/u + 3ml de reactivo y mesclar. tubos en baño maria 37°C durante 10 min.

absorbancia a 505nm.

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3.2.6 RESEMBRADO DE CELULAS EN EL MEDIO DE MANTENCIÓN AGAR SÓLIDO Para el resembrado de células:         

Desinfectar el ambiente con alcohol de 96° a un radio de 30 a 40 cm. Encender el mechero bunsen para esterilizar los materiales. Someter el asa bacteriológica al fuego hasta que llegue al rojo vivo. Enfriar por unos segundos, y luego introducir el asa en el tubo con la cepa. Con el asa extraer la cepa desarrollada. Volver a flamear el tubo y cerrar Abrir el tubo donde se va a resembrar y flamear para esterilizar. Introducir el y por la superficie dejar la cepa desde el fondo hacia afuera. Cerrar e incubar a 30°C por 48 horas. DIAGRAMA DE BLOQUES

Desinfectar

El medio de trabajo con alcohol °96

Colocar

Bajo mechero para un ambiente estéril

Someter

El asa bacteriana al fuego a rojo vivo

Enfriar

El asa por las paredes del tubo que contiene la cepa

Extraer

Una asada de la célula desarrollada

Flamear

El tubo antes de cerrarlo

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Resembrar

Por dentro del tubo del medio solido la azada

Llevar

Por dentro del tubo del medio solido la azada

Llevar

Por la superficie desde adentro hacia afuera

Arrastrar

A 30°C por 48 horas.

Incubar

3.2.7 PREPARACIÓN DEL MEDIO DE ACTIVACIÓN (20 mL) La preparación del medio líquido de fermentación requiere de lo siguiente: Se precisa realizar los siguientes pasos: 

Pesas las cantidades requeridas de cada compuesto, con mucho cuidado, en base a: Tabla B-1 Nutriente

Cantidad (g/l)

Cantidad

Glucosa

5

0.1 g

Extracto de levadura

3

0.06 g

Extracto de malta

5

0.1 g

Solución de salinas

5 ml/l

0.1ml

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    

En un matraz de 125 ml mezclar la glucosa y adicionar 100 ml de agua destilada. En un matraz de 125 ml mezclar el extracto de levadura con el extracto de malta y adicionar 50 ml de agua destilada. En un matraz de 125 ml mezclar solución de sales, adicionar 50 ml de agua destilada. Tapar los matraces con tapones de gasa y recubrir los picos con papel aluminio, llevar a esterilizar por 15 minutos en el autoclave. Dejar enfriar a temperatura ambiente.

DIAGRAMA DE BLOQUES DEL PROCESO

Pesar y medir

Matraz de125 ml

Matraz de 125 ml

C/u de los nutrientes como indica la Tabla B-1

Matraz de 125 ml

Agregar

Agregar

Agregar

Xilosa

Extracto de levadura Extracto de malta

Solución de sales

Agregar

Agregar

100 ml Agua destilada

50 ml Agua destilada

Esterilizar

Agregar 50 ml Agua destilada

Todo lo anterior en el autoclave por 15 min

Enfriar Página 20

3.2.8 PREPARACIÓN PREVIA AL SEMBRADO DEL MEDIO SÓLIDO AL LÍQUIDO   

Incubar la cepa inmovilizada en el agar solido por una hora Esterilizar el ambiente Encender el shaker. DIAGRAMA DE BLOQUES

Incubar

Acondicionar

Encender

Cepa para activar durante 1 hora

Ambiente para sembrar

Shaker

3.2.9 INOCULACIÓN CON ASA BACTERIOLÓGICA AL MEDIO RICO. Inoculación en el medio activo    

Esterilizar los matraces con el medio de activación, mezclar y homogenizar. Coger una asada de Pichia Stipitis, con el debido cuidado de esterilizar el asa y los tubos de ensayo antes y después. Sembrar en el matraz, esterilizándolo previamente y homogenizar. Colocar en el shaker por 10 horas a 220 rpm.

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DIAGRAMA DE BLOQUES

Mezclar

Medios de activación frente al mechero (tubos a matraz)

Homogenizar

Coger

Una asada de cepa Pichia Stipitis. (Solido)

Sembrar

En matraz

Homogenizar

Colocar

Shaker por 10 horas a 120 rpm

3.2.10 PREPARACIÓN DEL MEDIO LÍQUIDO DE FERMENTACIÓN (10 g/L) (200 mL) La preparación del medio líquido de fermentación requiere de lo siguiente:  Pesas las cantidades requeridas de cada compuesto, con mucho cuidado, en base a:

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Tabla C-1 Nutriente Glucosa

Cantidad (g/l) 10

Cantidad (g/200ml) 2g

Extracto de levadura

3

0,6g

(NH4)2SO4

3

0,6g

KH2PO4

2

0,4g

MgSO4.7H2O

1.1

0,22g

Solución de sales

5.0 ml/L

1ml

Tampón citrato pH

100ml/L

20ml

4,5

    



En 1 matraz de 500ml agregar la glucosa y adicionar 130 ml de agua destilada. En un matraz de 125 ml agregar el extracto de levadura, adicionar 20 ml de solución tampón. En un tubo de ensayo agregar la solución de sales y adicionar 9ml de agua destilada. En un tubo de ensayo mezclar los demás nutrientes, adicionar 20 ml de agua destilada. Tapar los matraces y tubos con tapones de gasa y recubrir los picos con papel aluminio, llevar a esterilizar por 15 minutos en el autoclave. Dejar enfriar a temperatura ambiente.

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DIAGRAMA DE BLOQUES DEL PROCESO

Pesar y medir

En matraz de 500 ml

Agregar Glucosa

Adicionar

130 ml Agua destilada

En matraz de 125 ml

C/u de los nutrientes como indica la Tabla C-1

En tubo de ensayo

En tubo de ensayo

Agregar

Agregar

Solución de sales

(NH4)2SO4 + KH2PO4 + MgSO4.7H2O

Adicionar

Adicionar

Adicionar

20 ml de tampón

9 ml Agua destilada

20 ml Agua destilada

Agregar Extracto de levadura

Esterilizar

Todo lo anterior en el autoclave 15 min

Enfriar

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3.2.11 PREPARACIÓN DEL MEDIO LÍQUIDO DE FERMENTACIÓN (10 g/L) (2000 mL) La preparación del medio líquido de fermentación requiere de lo siguiente:  Pesas las cantidades requeridas de cada compuesto, con mucho cuidado, en base a:

Nutriente Glucosa

Cantidad (g/l) 10

Cantidad (g/2000ml) 20 g

Xilosa

3

6g

Extracto de levadura

3

6g

(NH4)2SO4

3

6g

KH2PO4

2

4g

MgSO4.7H2O

1.1

22 g

Solución de sales

5.0 ml/L

10 ml

Tampón citrato pH

100ml/L

200 ml

4,5



   



En el vaso del fermentador agregar la xilosa, glucosa y adicionar 1400 ml de agua destilada. En un matraz de 500 ml agregar el extracto de levadura, adicionar 200 ml de solución tampón. En un matraz de 125 ml agregar la solución de sales y adicionar 40ml de agua destilada. En un matraz de 250 ml mezclar los demás nutrientes, adicionar 150 ml de agua destilada. Tapar los matraces y tubos con tapones de gasa y recubrir los picos con papel aluminio, llevar a esterilizar por 15 minutos en el autoclave. Dejar enfriar a temperatura ambiente.

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DIAGRAMA DE BLOQUES DEL PROCESO

Pesar y medir

En vaso de fermentador Agregar Xilosa +glucosa

Adicionar

1300 ml Agua destilada

En matraz de 500 ml

C/u de los nutrientes como indica la Tabla C-1

En matraz de 250 ml

En matraz de 250 ml

Agregar

Agregar

Solución de sales

(NH4)2SO4 + KH2PO4 + MgSO4.7H2O

Adicionar

Adicionar

Adicionar

200 ml de tampón

40 ml Agua destilada

150 ml Agua destilada

Agregar Extracto de levadura

Esterilizar

Todo lo anterior en el autoclave 15 min

Enfriar

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3.2.12 ESTERILIZACION DE MEDIO MINIMO DE CULTIVO Los matraces forrados con papel aluminio, con la fuente de carbono, nitrógeno y sales se colocaran en la estufa para esterilización en la por 15 minutos. 3.2.13 INOCULACIÓN Y MEZCLA DE MEDIOS DE ACTIVACIÓN CON EL MEDIO DE FERMENTACIÓN. Para inocular el medio de fermentación    

Mezclar los matraces con el medio de fermentación. Retirar del shaker el medio de activación y obtener 20ml del medio. Todo con los cuidados de esterilización. Inocular el medio de fermentación con el medio de activación Homogenizar en el tanque del fermentador. DIAGRAMA DE BLOQUES

Mezclar

Retirar

Medios de fermentación (Contenido de los tubos en matraz con Glucosa) Medio de activación del Sheiker previo cambio a 120 rpm

Coger

200 ml del medio de activación (inoculo)

Inocular

Medio de activación en medio de fermentación

Homogenizar

Página 27

3.2.14 DETERMINACION DE LA CINETICA DE CRECIMIENTO DE BIOMASA.  Inicio de la cinética: Para realizar el inicio de la cinética de crecimiento de biomasa se precisa a ejecutar lo siguientes pasos    

Se extrae 5 mL del medio de cultivo, se guarda el matraz en el sheiker y se colocan los 5 ml en un tubo de ensayo. Luego se hace la medición de la absorbancia mediante el espectrofotómetro. Colocar muestra en un tubo y centrifugar durante 10 min. Y por último el sobrenadante se vierte a los viales y se guarda en el refrigerador con el fin de después determinar el consumo de sustrato. DIAGRAMA DE BLOQUES

5 ml de medio inoculado

Coger

Pipeta previamente esterilizada

Agregar

A un tubo de ensayo

Medir

Absorbancia en un espectrofotómetro a 540 nm

Agregar

Contenido de la celda en un tubo para centrifuga

Centrifugar

Colocar

10 min.

Sobrenadante en viales

Congelar

Página 28

3.2.15 Determinación de la concentración celular por D.O El método se basa en el aumento de la turbidez del medio al incrementar la concentración de microorganismos, lo que puede ser detectado fácilmente por un espectrofotómetro a una densidad óptica de 640 nm. Para esta determinación fue necesario que previamente se elabore una curva de calibrado, lo cual, la concentración celular en el medio fue determinado por peso seco.  Diluciones para la curva de calibrado Para realizar las diluciones

se precisa a ejecutar lo siguientes

pasos: Dilución 1:2 

Se coloca 2 ml de caldo del matraz con una pipeta previamente esterilizada.



Añadir también 2 ml de agua destilada y homogenizar



Luego pasar a medir la absorbancia en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 640 nm.

Coger

1 ml de caldo

Agregar

7 ml de agua destilada

Homogenizar

Medir

En el espectrofotómetro a 640 nm

Página 29

3.2.16 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA POR MÉTODO ENZIMÁTICO 

Principio del método: La glucosa oxidasa (GOD) cataliza la oxidación de glucosa a ácido glucónico. El peróxido de hidrógeno (H2O2) producido se detecta mediante un aceptor cromogénico de oxígeno, fenol, 4–aminofenazona (4-AF), en presencia de la peroxidasa (POD): Β-D-Glucosa + O2 + H2O → GOD → Ácido glucónico + H2O2 H2O2+ Fenol + 4-AF → POD → Quinona + H2O La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de glucosa presente en la muestra ensayada.





Reactivos:

R

TRIS pH 7,4 Fenol Glucosa oxidasa (GOD) Peroxidasa (POD) 4 - Aminofenazona (4-AF)

CAL Glucosa

Patrón primario acuoso de Glucosa 100 mg/dL

Procedimiento: 1. Condiciones del ensayo: Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . . . 505 nm (490 Cubeta:. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 cm paso de luz Temperatura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37ºC / 15 – 25°C. 2. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada. 3. Pipetear en una cubeta: R (μl) Patron (μl) Muestra (μl)

Blanco 1 -

Patron 1 1 -

Muestra 1 1

Página 30

4. Mezclar e incubar 10 minutos a 37ºC ó 20 min a temperatura ambiente (15-25ºC). 5. Leer la absorbancia (A) del patrón y la muestra, frente al Blanco de reactivo. El color es estable como mínimo 30 minutos.



Cálculos:

(𝐴)𝑀𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 (𝐵)𝑃𝑎𝑡𝑟𝑜𝑛

x 100(Cc. Patrón) = mg/dL de glucosa en la muestra

Factor de conversión: mg/dL x 0,0555= mmol/L. 3.2.17 DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS CINÉTICOS PUESTA EN MARCHA DEL CL. EN EL CULTIVO POR LOTE DETERMINAR µMAX YX/S. 

Para calcular estos datos se necesita en primer lugar una curva de calibrado de sacarosa y una de biomasa (concentración celular), esta última se tomará de la práctica de cultivo por lote de la primera unidad.



En segundo lugar se necesita obtener la cinética de crecimiento celular y el consumo de glucosa y xilosa del medio (mediante DNS.



Obtenemos los datos



Cálculo de µmax: Se obtendrá de manera experimental integrando los datos en EXCEL, obteniendo una curva. A la concentración se le aplicará logaritmo natural y se calculará la pendiente del intervalo con mayor crecimiento (horas), obteniendo el µmax (h-1)



Calculo del tiempo de duplicación:

Página 31



Cálculo de rendimiento (Yx/s) : Sustrato en célula:





Efecto de razón:



Cálculo de productividad:

Cálculo del volumen de 𝒗𝒗𝒎 =



𝑸𝒂𝒊𝒓𝒆 𝒗𝒐𝒑

líquido por minuto: 𝒗𝒐𝒑 = 𝟐𝑳

Calcular la trasferencia de oxígeno. 𝒅𝑪𝒍 = 𝑲𝑳 𝒂(𝑪∗𝒈 − 𝑪𝒍 ) − 𝑵𝑨 𝒅𝒕 𝑵𝑨 = 𝑸𝒐𝟐 . 𝑿



Calculo de la trasferencia de oxígeno en la interface

Página 32



Método dinámico de Humphry

En este método, descrito por Bandyopadhyay, Humphrey y Taguchi (1967), se utiliza la actividad respiratoria de un cultivo en crecimiento para disminuir el contenido de oxígeno en la mezcla antes de reiniciar la aireación. La figura 1 ilustra esquemáticamente este procedimiento. Figura 1. Esquema del procedimiento de la determinación de kla por el método de desgasificación dinámica

La concentración de oxígeno en el fermentador antes del punto A, es estable. El suministro de aire se suspende repentinamente en el punto A y, por lo tanto, el valor de kla es igual a cero, y la pendiente de la línea AB es una medida de la velocidad de respiración del cultivo:

Dónde: m (O2) es la velocidad específica de respiración y X, es la concentración de biomasa La aireación se reinicia en el punto B (figura 1) y la concentración de oxígeno disuelto aumenta hasta alcanzar el valor inicial. El incremento en la concentración de oxígeno disuelto observado en el período BC, es la diferencia entre la transferencia de oxígeno hacia la solución y la demanda de oxígeno por la respiración del cultivo:

Página 33

Esta ecuación también se puede expresar como:

IV.

RESULTADOS

DETERMINACION DEL KLa POR EL METODO DINAMICO  NIVEL DE OXIGENO DISUELTO EN EL TIEMPO (RPM 300, AIREACION 1L/MIN)

DESGASIFICACIÓN

Tiempo (s) 0 11 14 16 19 21 23 25 28 30 32 35

Oxígeno disuelto(ppm) 80 77 74 70 65 60 55 50 45 40 37 30

GASIFICACIÓN

Tiempo (s) 75 77 79 81 85

Oxígeno disuelto(ppm) 36 41 44 46 44

Página 34

GRAFICA Nº 01: Oxígeno disuelto en el tiempo, por aplicación del método dinámico en BIOSTAT APLUS conteniendo 2000 ml de caldo de Pichia Stipitis NRRL Y-7124, operando a 300 RPM y una velocidad de aireación de 1L/min.

CL (%) VS. Tiempo (s) 90

OXÍGENO DISUELTO (%)

80 70 60 50 40 30 20 10 0 0

20

40

60

80

100

TIEMPO (s)

Grafica de oxígeno disuelto atreves del tiempo con y sin aire unidas. La grafica decreciente nos muestra la relación que tiene el oxígeno disuelto (sin aire) atreves del tiempo mientras la creciente es (con aire) atreves del tiempo.

GRAFICA Nº 02: Oxígeno disuelto en el tiempo sin aire (desgasificación), por aplicación del método dinámico en BIOSTAT APLUS conteniendo 2000 ml de caldo de Pichia Stipitis NRRL Y-7124, operando a 300 RPM y una velocidad de aireación de 1L/min.

OXÍGENO DISUELTO (%)

Etapa de desgacificación 100 80 60 40

y = -2.0385x + 101.89 R² = 0.9947

20 0 0

10

20

30

40

En esta grafica se hace la linealizacion para obtener la pendiente la cual sería el Na en este caso obtuvimos como resultado (2.0385)

TIEMPO (s)

Página 35

GRAFICA Nº 03: Oxígeno disuelto en el tiempo con aire (gasificación), por aplicación del método dinámico en BIOSTAT APLUS conteniendo 2000 ml de caldo de Pichia Stipitis NRRL Y-7124, operando a 300 RPM y una velocidad de aireación de 1L/min.

Etapa de gasificación

50

OXÍGENO DISUELTO (%)

45

La grafica obtenida de la aireación la llevamos a una ecuación polinómica Para asi poder derivarla en función del tiempo y poder linealizar para llegar a evaluar el KLA

40 35 y = -0.0036x4 + 1.1583x3 - 138.11x2 + 7325.8x - 145829 R² = 1

30 25 20 15 10 5 0 74

76

78

80 TIEMPO (s)

82

84

86

PERFIL PARA DETERMINAR LOS VALORES INVERSOS DE KLA A LOS DIFERENTES VALORES DE N Y VS

80.6125 85.4669 91.5093 98.0485 109.8525

82.651 87.5054 93.5478 100.087 111.891

Página 36

GRAFICA Nº 04: perfil para determinar de la pendiente el valor inverso de KLa, por aplicación del método dinámico en BIOSTAT APLUS conteniendo 2000 ml de caldo de Pichia Stipitis NRRL Y-7124, operando a 300 RPM y una velocidad de aireación de 1L/min.

Oxígeno disuelto vs. (𝑁𝐴+ 𝑑𝐶𝑙/𝑑𝑡)

OXÍGENO DISUELTO (%)

C* 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

La inversa de la pendiente, determina el 𝐾𝐿

y = -0.5944x + 125.75 R² = 0.9872

𝐶𝐿 = c* - 𝐾

1

𝐿𝐴

0

20

40

[𝑁𝐴 +

𝑑𝐶𝐿 𝑑𝑡

60 𝑁𝐴+ (𝑑𝐶𝑙/𝑑𝑡)

𝑣𝑣𝑚 = 2.035𝑥10−4

vvm =

]

80

100

120

𝑁𝐴 ∗ 𝑇 𝜀

37.104894

Cuadro resumen de los valores de Na y KLa obtenidos por los distintos grupos a distinta velocidad de agitación.

GRUPO A GRUPO B GRUPO C GRUPO D

VELOCIDAD DE AGITACION 300 rpm 400 rpm 370 rpm 350 rpm

Na (mg/L.s) 2.0385 0.9874 2.11 1.501

Kla (s^-1) 1.6823 2.6624 1.3488 0.0227

Página 37

 CONCENTRACION DE BIOMASA Y LA GRAFICA DEL pH

8.00

4.25

7.00

4.2

6.00

4.15

5.00

4.1

4.00

4.05

3.00

4

2.00

3.95

1.00

3.9

0.00

pH

x (g/l)

Concentración de biomasa y pH a través del tiempo

3.85 0

5

10

15

20

25

30

Tiempo (h) BIOMASA (g/L)

pH

PARÁMETROS CINÉTICOS

Parámetros

Valores

Y (x/s)

0.3964

Y (p/s)

0.0081

Umax (h-1)

0.2352

Qx(g/L*h)

0.2273

Qp(getanol/L*h)

0.0103

Página 38

 DETERMINACION DE LA AZUCARES REDUCTORES MÉTODO ENZIMÁTICO PARA LA DETERMINACIÓN DE GLUCOSA:

concentracion de glucosa 14.00 12.00

Glucosa g/L

10.00 8.00 6.00 4.00 2.00 0.00 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Tiempo

 MÉTODO DNS PARA LA DETERMINACIÓN DE GLUCOSA Y XILOSA:

concentración (g/L)

Glucosa + Xilosa 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0

5

10

15

20

25

30

Tiempo (h)

Página 39

Concentración Xilosa 4 3.5

Xilosa g/L)

3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Tiempo (h)

DETERMINACIÓN DE ETANOL POR CROMATOGRAFÍA DE GASES

Concentracion de etanol 0.14 0.12

Etanol (g/L)

0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0

5

10

15

20

25

30

Tiempo (h)

Página 40

V.

DISCUSIONES

1. De acuerdo con Pauline M. Doran. 1998, indican que una forma de incrementar la disponibilidad de oxigeno es a través del manejo de los fenómenos de transporte: incrementar el KLa para hacer más eficiente la trasferencia de oxígeno a través del manejo de la hidrodinámica del sistema (tipo de fermentador, velocidad de aireación, velocidad de agitación, etc). O bien de la termodinámica (Temperatura, presión total, presión parcial de oxígeno en el aire, etc). El valor del KLA, aumenta sobre todo con el aumento de la velocidad de agitación, para valores de N menores que 647 rpm, además, se verifica que independiente de la naturaleza de la fase liquida no hay aumento de la trasferencia de oxígeno para N mayor que 647 rpm. Se debe tener en cuenta, para procesos fermentativos que una exagerada o moderada velocidad de agitación y la alta viscosidad también afectan enormemente la KLa. En laboratorio se ha trabajado con 4 diferentes velocidades de agitación, 300, 350, 370 y 400 rpm, y de acuerdo con la teoría, de que la velocidad de agitación es inversamente proporcional al KLa, mientras más alto sea nuestra velocidad de agitación, obtendremos un mayor valor del KLa. La menor velocidad de agitación, a la que se ha trabajado ha sido 300 rpm, pero no obtiene el menor valor de los KLa, es muy posible que se deba a una incorrecta agitación, o actividad en el momento de la fermentación. 

Con respecto a la biomasa, esta va creciendo debido al consumo propio del sustrato. Cuando la concentración de sustrato es el factor limitante del crecimiento se obtiene más biomasa en aerobiosis, debido a que la asimilación de xilosa en presencia de oxígeno contribuye a la respiración celular, ya que el oxígeno actúa como sustrato, en este caso nosotros calculamos una determinada cantidad de rpm y flujo de aire, pero por cuestiones de fermentador, se le tuvo que aumentar el flujo de aire y las revoluciones, esto influyó en el crecimiento de la biomasa, ya que se esperó tener una baja concentración de biomasa y una mayor concentración de etanol. La concentración de glucosa iba disminuyendo ya que iba siendo consumida por la Pichia, hasta que en la hora 5,5 ya se había consumido totalmente; luego de la glucosa, el sustrato a consumir fue la xilosa, que fue consumida luego de la glucosa, acabándose en la hora 12,5. Esta xilosa presentó una gráfica con caídas y subidas, esto debido a que la gráfica fue una diferencia entre el método enzimático y el DNS, ya que no se utilizó un método exclusivo para su determinación, por esta razón se encontraron estas fluctuaciones.

Página 41



Según Peña Maribel, Cristhian Carrasco, Carla Crespo y Terrazas S. L. Enrique en su trabajo de investigación “Influencia de la concentración de oxígeno en la producción de etanol a partir de la fermentación de mezclas D-glucosa/D-xilosa e hidrolizados de aserrín de Curupaú por Pichia Stipitis”: La fermentación del medio definido (mezcla de D-glucosa/D-xilosa) fue utilizada como referencia comparativa a la fermentación del hidrolizado de aserrín deCurupaú (medio complejo). La concentración de azúcares fermentables fue preparada de acuerdo a la concentración de azúcares obtenida en el hidrolizado de aserrín de Cururpaú después de su pretratamiento. La fermentación de ambos medios fue llevada a cabo en condiciones aerobias y microaerobias. Estudios realizados demuestran que en condiciones limitadas de oxígeno, P. stipitis utiliza el 10% del substrato para la producción de biomasa y el 90% para la producción de etanol. Estos resultados son confirmados en los resultados, debido a que la producción de biomasa es mayor cuando se lleva a cabo la fermentación en condiciones aerobias. También se observó la influencia negativa en la producción de biomasa cuando un substrato complejo es utilizado, esto debido a la presencia de inhibidores del metabolismo fermentativo. La concentración máxima de etanol producida fue de 1.46g/L y 1,45g/L, ambas obtenidas a las 24 horas de fermentación en condiciones microaerobias utilizando medio complejo constituido (hidrolizado de aserrín deCurupaú) y medio definido (mezclas D-glucosa/D-xilosa), respectivamente. Los rendimientos de la producción de etanol respecto al rendimiento teórico (0,51 g etanol/g xilosa consumida) fueron de 52% y 79%, en medio complejo y definido, respectivamente. El rendimiento de la producción de etanol cuando un medio definido es utilizado demuestra una adecuada adaptación del microorganismo en el medio, a diferencia del rendimiento de la producción de etanol en medio complejo. Esto debido a la presencia de inhibidores en el hidrolizado de aserrín de Curupaú como sustrato.

-

Por lo realizado en la experiencia pudimos observar que tuvimos bajas concentraciones de etanol al igual que su rendimiento y productividad en comparación con el de biomasa:

Página 42

Podemos observar que el rendimiento y la productividad son mayores en la biomasa que el producto, esto se puede deber por la aireación en el fermentador no fue mucha de manera que ya no sería micro aireada sino aireada lo cual aumentaría la biomasa y reduciría la producción de etanol ya que no seria como en la micro aireada en que la P. stipitis utiliza el 10% del substrato para la producción de biomasa y el 90% para la producción de etanol. Antes de realizar la experiencia calculamos basándonos en datos teóricos para tomar decisiones sobre las condiciones y debíamos realizar la fermentación a 175 rpm y un caudal de aire de 0.6 L/min, pero al comenzar la cinética debimos aumentar estos porque el sensor no detectaba oxígeno disuelto por lo cual prácticamente duplicamos las condiciones a 300 rpm y un caudal de aire de 1 L/min, lo cual influyo en la producción de etanol. 

Según; Owen P. Ward, 1989: La velocidad de transferencia de masa entre las fases liquidas y gaseosa está fuertemente influenciada por la solubilidad del gas en la fase liquida. El oxígeno es poco soluble en soluciones acuosas, y en consecuencia, en muchos procesos de fermentación aerobios el suministro de oxígeno es el factor crucial determinante de las velocidades metabólicas por la que la transferencia de masa del oxígeno tiene un papel importante en el diseño del fermentador.



Según (Kurtzman, 1987) Pichia stipitrs NRRL Y- 7124 (CBS 5773) es una importante levadura fermentadora de xilosa porque es capaz de acumular suficiente etanol para la recuperación económica.Sus requisitos de temperatura y de pH de esta cepa han sido descritos Van Dijken y Scheffers que identificó por primera vez la capacidad de la levadura para fermentar xilosa. Sus datos indicaron los rangos de temperatura para el crecimiento inicial óptima y las tasas de fermentación para ser 28-32°C y 32-34 "C, respectivamente y el pH correspondiente oscila ser 3-7 y 3-8 respectivamente.

Página 43



Según (P.J Slininge, 1989) el pH 4,5 se recomienda para Y - 7124, ya que minimiza la probabilidad de contaminación. Sin embargo, un sistema automático controlador de pH 4,5 es deseable porque se encuentra cerca del menor límite para la fermentación óptima.

El pH es un parámetro crítico en el cultivo de microorganismos ya que estos sólo pueden crecer en un rango estrecho de pH fuera del cual mueren rápidamente. O el microorganismo no funciona eficientemente, El pH intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las células ya que, en muchos casos, la obtención de energía metabólica depende de la existencia de una diferencia en la concentración de protones a ambos lados de la membrana citoplasma. Hay que considerar que, como consecuencia del metabolismo, el pH del medio de cultivo suele tender a bajar durante el cultivo. El decremento del pH se puede deber a varios factores, uno de los cuales es la liberación de ácidos orgánicos de cadena corta. Por consiguiente, es necesario controlar el pH de los cultivos para evitar que un descenso excesivo pueda producir la auto esterilización del cultivo, en el laboratorio de bioprocesos el bioreactor de tanque agitado tiene la función de controlar el pH mediante un flujo de ácido y base pero para la experiencia no se utilizó obteniendo valores de pH desde 4.2 hasta de 3.9 lo cual influye negativamente en la fermentación.

VI.

CONCLUSIONES



En la experiencia se pudo lograr plenamente el objetivo general de la practica, que fue realizar la fermentación de un cultivo celular por lote de Pichia Stipitis NRRL-Y-7124 en un medio simulado de hidrolizado de cascara de arroz, en el cual se pudo lograr la producción de etanol y comprobar cómo influye las condiciones de aireación y agitación en aumento de la biomasa y el etanol, asimismo conocer los procedimientos para determinar el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno.



Se observó con respecto a los parámetros cinéticos que el Qx(0,2273 g/L*h) fue mayor que el Qp(0,0103 g/L*h), ya que hubo mayor concentración de biomasa y la producción de etanol fue menor, esto debido Página 44

a la modificación de flujo de aire en el procedimiento, hubo una mayor concentración de oxigeno que actuó como sustrato e hizo que aumentara la concentración de biomasa. En condiciones aerobias se obtiene menos etanol que en condiciones microaerobias, lo cual conlleva a que el rendimiento Yp/s se comporte de la misma manera. 

Identificamos el fermentador y realizamos la cinética de crecimiento ya antes realizadas en matraces agitadas con un shaker, este fermentador de tanque nos permite escalar y simular el proceso para poder obtener nociones de lo que se realiza en la industria. Sabemos que la medición de transferencia de oxígeno en grandes recipientes presenta dificultades especiales tales como que la fase gas y liquido estén perfectamente mezcladas y con turbulencias uniformes. En los reactores de tamaño comercial >10 m3 y en la experiencia, la mezcla perfecta es difícil de alcanzar por lo que el valor de Kla calculado dependen del tanque donde se realicen las medidas de concentración. Incluso cuando exista una buena mezcla la variación en la composición es inevitable debido a los cambios en la presión estática y a la continua disolución del oxígeno.



El comportamiento del pH disminuye con el tiempo, y se debe al proceso fermentativo que ha ocurrido, ya que durante la fermentación la levadura toma el nitrógeno de los aminoácidos orgánicos, perdiendo su carácter anfótero y pasando a ácidos, lo cual origina una disminución del pH del medio. El sustrato resulta ser inversamente proporcional a la biomasa, ya que el comportamiento del sustrato disminuye, con el aumento de la biomasa. Porque la biomasa, suele alimentarse del sustrato, en este caso la glucosa y la xilosa, provocando un aumento de su concentración. El comportamiento del oxígeno disuelto, tiende a incrementar con el tiempo, hasta que llega a un 46% de oxígeno disuelto en el tiempo 81 segundos, y empieza a disminuir hasta los 85 segundos, que el final del tiempo.

VII.

REFRENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Govindaswamy S, Vane LM. Kinetics of growth and ethanol production on different carbon substrates using genetically engineered xylose-fermenting yeast. Bioresour Technol. 2007; 98: 677–685. 2. Lynd LR, Wyman CE, Gerngross TU. Biocommodity engineering. Biotechnol Prog. 1999; 15 (5): 777–793.

Página 45

3. Bothast RJ, Saha BC. Ethanol production from agricultural biomass substrates. Adv Appl Microbiol. 1997; 44: 261–286. 4. Schneider H, Wang PY, Chan YK, Maleszka R. Conversion of D-xylose into ethanol by the yeast Pachysolen tannophilus. Biotechnol Lett. 1981; 3: 89– 92. 5. Ertola Rodolfo, Yantorno Osvaldo y Mignone Carlos. “Microbiología Industrial”, Sistemas de cultivo y aspectos generales de biorreactores, Capítulo 7 6. Peña M. Y Carrasco C. (2009). Influencia de la concentración de oxígeno en la producción de etanol a partir de la fermentación de mezclas Dglucosa/D-xilosa e hidrolizados de aserrín de Curupaú por Pichia stipitis CBS 5773. Universidad Mayor de San Andres, Facultad de Cs Farmacéuticas y Bioquímicas Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas, Av. Saavedra 2224 La Paz Bolivia 7. Pauline M. Doran. 1998 “Principios de Ingenieria de los Bioprocesos”. Editorial ACRIBIA, 482 paginas 8. J. van Dijken and A. Scheffers, United States Patent No. 4,701,414, October 20, 1987 9. P. J. Slininger, P. L. Bolen, and C. P. Kurtzman, Enzyme Microb. Technol.. 9, 5 (1987)

Página 46

VI. ANEXOS INSTRUMENTOS

Fig 1: Autoclave

Fig 4: pHmetro

Fig 7: Espectrofotómetro

Fig 2: Mechero Bunsen

Fig 5: Balanza analítica

Fig 3: Incubadora

Fig 6: Biorreactor

Fig 8: Shaker

Página 47

DETERMINACION DEL NA, VVM Y CAULA (Q) -

DETERMINACION DEL NA:

Parámetros cinéticos y rendimientos determinados en la experiencia con Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando Xilosa como fuente de carbono a 120rpm. μm (h-1)

0.48

Y x/s

0.215 g/g xilosa

Qx(g/L*h)

0.1633

td (h)

1.4583

qs

2.5081

El rendimiento YO2 = 1g/g 𝐘 𝐱/𝐬 =

%𝑪 𝒔𝒖𝒔𝒕𝒓𝒂𝒕𝒐 %𝐂 𝐜𝐞𝐥𝐮𝐥𝐚𝐫

𝟎. 𝟐𝟏𝟓 =

𝛥𝑋 13

𝛥𝑋 = 2.8 g/L

𝑁𝐴 =

𝑁𝐴 =

𝑈𝑋 YO2

0.48 ∗ 13 1

𝑁𝐴 = 1.384 gr. O2/L*h

Página 48

-

DETERMINACION DEL VVM:

𝐕𝐕𝐦 =

𝑪𝒂𝒖𝒅𝒂 %𝐂 𝐜𝐞𝐥𝐮𝐥𝐚𝐫

(2.035 ∗ 10−4 ) ∗ 𝑁𝐴 ∗ 𝑡 𝑉𝑣𝑚 = 𝐸 (2.035 ∗ 10−4 ) ∗ 6.19 ∗ 30 ∗ 60 𝑉𝑣𝑚 = 14

𝑉𝑣𝑚 = 0.161

-

DETERMINACION DEL CAUDAL (Q): 𝑉𝑣𝑚 =

𝐶𝐴𝑈𝐷𝐴𝐿 𝑉𝑂𝐿𝑈𝑀𝐸𝑁 𝐷𝐸𝐿 𝑀𝐸𝐷𝐼𝑂

𝐶𝐴𝑈𝐷𝐴𝐿 = 𝑉𝑉𝑚 ∗ 𝑉𝑂𝐿𝑈𝑀𝐸𝑁 𝐷𝐸𝐿 𝑀𝐸𝐷𝐼𝑂 𝐶𝐴𝑈𝐷𝐴𝐿 = 0.61 ∗ 2 𝐶𝐴𝑈𝐷𝐴𝐿 = 1.21 𝐿/𝑚𝑖𝑛

Página 49

CURVA DE CALIBRADO "GOD-POD" PARA DETERMINACIÓN DE GLUCOSA

Concentración VS Absorbancia 0.7 y = 0.3123x - 0.0079 R² = 0.9986

0.6

Absorbancia

0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 -0.1

0

0.5

1

1.5

2

2.5

ABS.

Concentración [g/L]

CURVA DE CALIBRADO AZUCARES REDUCTORES

"DNS"

PARA

DETERMINACIÓN

DE

1.2 1 y = 0.4775x - 0.0016 R² = 0.9996

0.8

Series1 0.6

Lineal (Series1)

0.4 0.2 0 0

0.5

1

1.5

2

2.5

-0.2

Página 50

CURVA DE CALIBRADO ETANOL: Conc.(x100) 0.04

0.03

0.03

0.02

0.01

Y = aX + b a = 4.06299e-007 b = 0.1068245 R^2 = 0.9985262 R = 0.9992628

0.01

0.01

0.00 0

2500000

5000000

7500000

Area

Biomasa celular: TIEMPO (h) 0 1 2 3 4 5.5 6 8 10.5 12.5 15.5 18.5 20.5 23.5 27.5

ABS 0.817 0.353 0.363 0.502 0.529 0.868 0.658 0.517 0.606 0.702 0.682 0.746 0.748 0.821 0.645

DILUCION 4 4 4 4 4 8 10 10 10 10 10 10 10 14

BIOMASA (g/L) 0.62 1.07 1.11 1.53 1.61 2.64 4.01 3.94 4.61 5.34 5.19 5.68 5.69 6.25 6.87

lnx 0 0.547123323 0.575058101 0.899255386 0.951643698 1.446846981 1.863007378 1.844988873 2.003825984 2.150879402 2.121975656 2.211671598 2.214348976 2.307469108 2.402668552

etanol 0 0 0.109 0.109 0.111 0.11 0.122 0.128 0.128 0.128

0.124

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BIOMASA CELULAR (𝟔𝟒𝟎𝐧𝐦)𝑨𝑩𝑺 = 𝟏. 𝟑𝟏𝟑𝟕 (𝑿 𝒈/𝒍)

crecimiento de biomasa 3 2.5

ln(x0)

2 1.5 lnx

1 0.5 0 0

5

10

15

20

25

30

pH

tiempo

4.25 4.2 4.15 4.1 4.05 4 3.95 3.9 3.85 0

5

10

15

20

25

30

Tiempo

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Umax 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0

y = 0.2352x + 0.1154 R² = 0.9521

0

1

2

3

4

5

6

Sustrato: Corrida de datos:

Curva de calibrado DNS:

tiempo 0 1 2 3 4 5.5 6 8 10.5 12.5 15.5 18.5 20.5 23.5 27.5

Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

ABS=0.5331X-0.0106 R=0.9994

Absorbancia (540nm) 0.836 0.643 0.632 0.546 0.533 0.058 0.436 0.282 0.147 0.028 0.048 0.024 0.019 0.045 0.047

dilución 01:10 01:10 01:10 01:10 01:10 01:10 01:04 01:04 01:02 01:02 01:01 01:01 01:01 01:01 01:01

Concentración 15.88069781 12.26036391 12.05402364 10.44081786 10.19696117 1.286812981 3.350966048 2.195460514 0.591258676 0.144813356 0.109923091 0.064903395 0.055524292 0.104295629 0.108047271

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concentración (g/L)

Glucosa + Xilosa 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0

5

10

15

20

25

30

Tiempo (h)

Determinación de glucosa método enzimático. Datos de glucosa: y= 0.3123x - 0.0079 R2 = 0.9986

Vial 1 2 3 4 5 6 7 8

Dilucion Dilución 01:10 01:10 01:10 01:10 01:10 01:10 01:10 01:10

10 ABS 0.377 0.306 0.271 0.253 0.226 0.019 0 0

ABS final 3.77 3.06 2.71 2.53 2.26 0.19 0 0

Tiempo 0 1 2 3 4 5.5 6 8

concentracion 12.10 9.82 8.70 8.13 7.26 0.63 0.03 0.03

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Cálculos de los parámetros cinéticos: 𝑌𝑥⁄𝑠 =

∆𝑥 6.87 − 0.62 = = 0.3964 −∆𝑆 15.880 − 0.108

𝑌𝑝⁄ =

∆𝑃 0.128 − 0 = = 0.0081 −∆𝑆 15.880 − 0.108

𝑠

𝑄𝑥 =

∆𝑋 6.87 − 0.62 = = 0.2273 ∆𝑇 27.5 − 0

𝑄𝑝 =

∆𝑃 0.128 − 0 = = 0.0103 ∆𝑇 27.5 − 0

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