Informe de Pcr

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INTRODUCCIÓN Introducción La invención de la reacción en cadena de la polimerasa PCR! por "# Mullis $ sus cola%oradores en &'() *a revolucionado la %iol %iolo+ o+,a ,a mole molecu cula larr $ la me medi dici cina na mole molecu cula larr -ai -ai.i .i et al#/ al#/ &'() &'()!# !# La reacción en cadena de la polimerasa es una t0cnica in vitro utili1ada para para am ampl pli2 i2ca carr en1i en1im3 m3ti tica came ment nte e una una re+i re+ión ón dete determ rmin inada ada de AD4 AD4 situada entre dos re+iones de AD4 cu$a secuencia se conoce# Mientras 5ue 5ue ante antess so solo lo pod, pod,an an o%te o%tene ners rse e ca cant ntid idad ade es m,ni m,nima mass de un +en +en espec,2co/ a*ora ora incluso un 6nico e7emplar de un +en puede ampli2carse con la PCR *asta un millón de e7emplares en tan solo unas pocas *oras# Las t0cnicas de PCR se *an *ec*o indispensa%les para muc*os muc*os proced procedimi imient entos os comune comunes/ s/ como como la clonac clonación ión de 8ra+me 8ra+mento ntoss espe es pec, c,2c 2cos os de AD4/ AD4/ la dete detecc cció ión n e iden identi ti2c 2cac ació ión n de +ene +eness para para dia+ dia+nó nóst stic ico o $ me medi dici cina na le+al le+al// $ en la inve invest sti+ i+ac ació ión n de mode modelo loss de e9pre e9presió sión n de los +enes# +enes# M3s recie reciente ntemen mente/ te/ la PCR *a permi permitid tido o la investi+ación de nuevos campos/ como el control de la autenticidad de los los alim alimen ento tos/ s/ la pres presen enci cia a de AD4 AD4 modi modi2c 2cado ado +en0 +en0ti ticam camen ente te $ la contaminación micro%ioló+ica# Para comprender los principios de la PCR $ sus aplicaciones/ de%e atenderse en primer lu+ar a la naturale1a de la mol0cula del AD4/ por lo 5ue en la sección si+uiente se descri%en la estructura $ la replicación del AD4#

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REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) OBJETIVOS: : Descri%ir el proceso del PCR# : Detallar los componentes necesarios para llevar a ca%o un PCR# : Preparar una PCR

INTRODUCCION: La reacción en cadena de la polimerasa 8ue desarrollada en &'(; por el Doctor "ar$ Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en Cali8ornia# El Dr# Mullis reci%ió en &''; el Premio 4o%el de ) a )) ?C dependiendo de la temperatura de Jusión o Tm de los primers! durante  a ; se+undos 3 E!#.aci+# ! "/%"#$i+#: En este la temperatura de la me1cla se eleva *asta  KC para 5ue la Ta5 polimerasa D4A polimerasa! comience el proceso de e9tensión en dirección ) a ; a+re+ando los nucleótidos correspondientes/ o%teni0ndose la *e%ra complementaria de D4A o AMPLIC4# En cada ciclo de PCR se duplica todo el AD4 presente en la reacción/ de manera 5ue en unas pocas *oras se o%tienen millones de copias de un solo 8ra+mento#

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Estas tres 8ases tienen lu+ar en el mismo tu%o $ constitu$en un ciclo completo de PCR/ 5ue se reali1a en menos de dos minutos#  Teóricamente/ el ciclo de PCR se puede repetir sin l,mite/ pero la polimerasa/ los nucleótidos $ los ce%adores suelen Renovarse al ca%o de unos ; ciclos# Estos ; ciclos/ 5ue duran menos de tres *oras/ %astan para producir mil millones de copias de AD4#

C!#$id"&aci!#"$: Al 2nal del primer ciclo de la PCR/ *a$ dos do%les *e%ras de AD4 id0nticas a la ori+inal/ cada nueva *e%ra producida se denomina AMPLIC4# Este ciclo de tres pasos desnaturali1ación/ alineamiento $ e9tensión! puede a*ora repetirse muc*as veces# Con8orme la PCR contin6a/ se crean primero dos/ cuatro/ oc*o/#n copias nN n6mero de ciclos!/ o%teni0ndose despu0s de ; ciclos &#;#>&#(> copias# Este proceso de la PCR tam%i0n es llamado AMPLIICACIÓN de%ido a 5ue la secuencia o%7etivo es copiada una $ otra ve1 con el o%7eto de *acer millones de copias# A*ora $a *a$ su2ciente material +en0tico para detectar la presencia $ la cantidad del pató+eno# La temperatura de 8usión o Tm a la cual se reali1a el paso de *i%ridi1ación/ representa la temperatura a la cu3l ) de un oli+onucleótido con una secuencia espec,2ca se encuentra unido $ la otra mitad se encuentra desnaturali1ado#

PROCEDIMIENTO: El procedimiento 5ue a continuación se descri%e es utili1ado para la detección del +en de resistencia a amino +lucósidos en cepas de M# tu%erculosis $o se llevara a ca%o la con2rmación de +0nero $ especie mediante ampli2cación multiple9# De acuerdo al protocolo#

01 E9tracción del AD4 por el m0todo de Boilin+/ de acuerdo a protocolo del la%oratorio de Biotecnolo+,a# )# Reali1ar la me1cla maestra de PCR master mi9!/ como se descri%e a continuación/ encontrar el volumen para 5ue la concentración 2nal

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5uede como se indica/ adicionando los Primers espec,2cos $ el AD4 en estudio# &# -e toman @> Ql de a+ua +rado &milli