Informe de Papaina enzima

RESUMEN

En el presente trabajo se realizara Proteolíticas del fruto

la extracción de las Enzimas

de la papaya y su aplicación en la industria

alimenticia. El látex se extraerá mediante incisiones verticales en la fruta verde como de la papaya, la cual será sometida al proceso de extracción del látex y al proceso de secado del látex mediante el método

de

secado

con

estufa,

al

igual

que

se

realizaron

experimentaciones para determinar la actividad enzimática de la enzima papaína presente en el látex mediante el método de coagulación de leche (Balls and Hoover).

Página | 1

1. OBJETIVOS 1.1. OBJETIVO GENERAL Comparar la papaína cruda proveniente de tres variedades de Carica papaya a través de la medición de la actividad enzimática y el rendimiento gravimétrico con el fin de proponer la mejor materia prima para la extracción de látex a nivel comercial.

1.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 

Extraer látex de frutos de Carica papaya de 2.5 a 3 meses de edad.



Determinar el rendimiento de látex y papaína cruda.



Experimentar y determinar la actividad enzimática de la enzima de la papaya presente en el látex.

2. MARCO TEÓRICO 2.1. LA PAPAÍNA

La papaína es una enzima que se extrae del fruto llamado papaya y que pertenece

a

una

familia

de

proteínas

relacionadas,

que

incluye

endopeptidasas, aminopeptidasas, dipeptidilpeptidasas y otras enzimas con actividades tanto exo-peptolíticas como endo-peptolíticas. Las propiedades peptolíticas de la papaína provocan la ruptura de múltiples

enlaces

en las

proteínas

animales, lo que

tiene por

consecuencia que se pueda utilizar para ablandar la carne destinada al consumo humano. La papaína también hidroliza proteínas vegetales, y Página | 2

es útil para evitar la formación de los sedimentos protéicos que produce la proteína de la cebada en el proceso de fabricación de cerveza. También posee propiedades antiinflamatorias cuando es consumida directamente, por lo que los frutos que la contienen han sido usados como medicamento natural. Un entorno alcalino con pH mayor de 8, o una temperatura mayor de 37ºC desnaturaliza la papaína rápidamente. El crecimiento del negocio relacionado con su uso para ablandar carnes para consumo humano y para evitar la sedimentación durante la producción de cerveza ha causado que el consumo mundial de papaína haya aumentado hasta unos cien millones de dólares anuales.

La papaína se consigue por la extracción del látex, que es un líquido blanco obtenido mediante cortes en los frutos de papaya inmaduros. Luego, en el laboratorio se separa la enzima y se purifica hasta alcanzar un nivel óptimo de calidad para su comercialización y uso. Las enzimas, como catalizadores naturales son una riqueza de creciente importancia. Su uso produce el tiempo invertido en un proceso determinando,

la

cantidad

de

energía

consumida

disminuye

la

posibilidad de subproductos indeseables. El látexextraído de la papaya común por incisiones en la superficie de frutos verdes, contiene un complejo enzimático proteolítico compuesto de papaína, quimopapainas A y B, papaya peptidasa, siendo las papaína y las quimopeptidasas, las principales proteasas del látex. La papaína es muy utilizada en el procesamiento de alimentos: suavizado de carne, clarificado de la cerveza, extracción de proteínas; en la industria farmacéutica (por sus propiedades antihelmínticas), de cosméticos, textiles, de cueros, en el tratamiento de desechos y en la elaboración de medios de cultivos, entre otros. Página | 3

Actualmente, en BOLIVIA solo se explota lo que es la papaya y no se extrae la papaína. Una utilización más racional, presentara una nueva fuente de

ingresos para el productor, y su exportación, una nueva

fuente de divisas para el país. Otros beneficios que presenta la extracción del látex del fruto de papaya son:  

Maduración uniforme del fruto(que implica una mejor coloración) Disminución de algunos aromas desagradables presentes en la



papaya. Aumento de azucares en el fruto.

Uno de los factores que afectan la calidad de la enzima, es el método utilizado para su deshidratación.

Así, solo llevando a cabo un estudio de los diferentes métodos de los secados del látex, se puede determinar cuál es el método que, brindando

un

producto

de

calidad

aceptable

en

el

mercado

internacional, sea adecuadamente rentable.

Página | 4

2.2. PROPIEDADES Es un polvo blanco o blanco-grisáceo. Tiene un olor ácido pungente y algo agresivo. Es ligeramente higroscópico. Moderadamente soluble en agua y glicerol y prácticamente insoluble en la mayoría de los solventesorgánicos. Su temperatura óptima es de 65ºC y su rango de pH óptimo está entre 5-7. Tiene un punto isoeléctrico de 9.6. El tiempo de vida útil es corto; por lo tanto, se debe mantener en ambiente seco y frío. No congelar en suspensiones acuosas. Como material de embalaje se utilizan recipientes de polietileno o acero inoxidable pues la papaína es potencialmente peligrosa; el contacto Página | 5

prolongado con esta produce daños en la piel de los trabajadores incluso reacciones alérgicas. Los enzimas vegetales no producen fenómenos tóxicos cuando se administran por vía oral. La administración por vía inyectable puede producir

disminución

de

la

coagulación

y

fenómenos

de

hipersensibilidad 2.3. ASPECTOS SOBRE EL CULTIVO DE LA PAPAYA Es una planta herbácea, de crecimiento rápido y vida útil corta (10 años). De tallo hueco excepto en los nudos. Los frutos se forman en las axilas de las hojas. Tienen raíces ramificadas y penetrantes. Pertenece al género de Carica, de la familia CARICACEANE. La carica papaya, es la especie de mayor importancia comercial. Presenta tres formas sexuales: femenino, masculino y hemafrodito. La importancia del sexo radica en que los machos son improductivos, los femeninos son productores continuos, mientras que los hemafroditos pueden ser productores continuos o temporales. La forma del fruto está determinada por el sexo del árbol. Frutos hemafroditos son más alargados que los femeninos; presentan forma de CAHCO. Entre los frutos femeninos y hemafroditos, no existe diferencia en relación con el grosor, diámetro, porcentaje de solidos solubles y días de madures del primer fruto. 2.4. CARACTERÍSTICAS DE LA SIEMBRA  Temperatura optima de crecimiento:25°C  Altura recomendada: menor a 1000 msnm.  Suelos: ricos en materia orgánica, con buen drenaje, pH entre 6.5 y 7.0.

Página | 6

 La fruta se recolecta a las 8-10 meses después de la siembra. Produce durante 10 años, pero el rendimiento óptimo es durante los primero cuatro años.  Densidad de la siembra: se recomienda una separación de 2.5x2.5m, o de 3x2.5m: aproximadamente 1350 árboles por hectárea. 2.5.

CARACTERÍSTICAS DEL LÁTEX DE PAPAYA

La papaína utilizada como comerciante, es el látex seco extraído del fruto de papaya por incisiones sobre la superficie del mismo. Se aplica indistintamente el término papaína, a todo el látex, pese a que este contiene diferentes fracciones de enzimas proteolíticas y lizocima (carbohidratasa). Las enzimas proteolíticas presentes en el látex son: papaína, papaya peptidasa A y quimopapaina A y B, cada una de estas enzimas, difiere de las otras en relación a su actividad proteolítica, concentración en el látex, resistencia a la temperatura y productos resultantes después de su acción sobre el sustrato. Las principales proteasas del látex son: la papaína y la quimopapainas A y B (presentes en las últimas en mayor cantidad, pero con menor actividad proteolítica). La acción proteolítica de la papaína, es menos específica que de las otras proteasas, produciendo n gran cantidad amidas y aminoácidos libres. La estructura de la molécula de la papaína, fue descrita por DRENT en 1963 utilizando rayos X. consiste en un único péptido, que modifica su estructura por tres residuos de cisteína que se encuentra en la molécula. Esta última, se divide en 2 partes, Estando el sitio activo en la mitad. La presencia de grupos sulfhidrilo en el sitio activo, interactuando con la cisteína-25 y la histidina-159 de la molécula, fueron estudiados por

BROKLEURST y

SHIPTON en 1973,

llegando a la conclusión que el sistema interactivo de la papaína es de carácter nucleofilico. Página | 7

2.6. RECOLECCIÓN DE LA MATERIA PRIMA Para la incisión de la fruta debe utilizarse una navaja de acero inoxidable y la recolección debe realizarse por la mañana (entre cinco y nueve de la mañana), de dos a tres incisiones. El látex exudado debe recogerse en receptáculos de plástico. Es evidente, de acuerdo a la naturaleza ácida del látex, la necesidad de utilizar guantes en este proceso.

2.7.

EXTRACCIÓN DEL LÁTEX

Las muestras de látex se recogieron del sembradío de papaya. Para la extracción, se fijaron los siguientes parámetros: -selección de árboles femeninos y hemafroditos, con frutos entre 2.5-3 meses de edad-hora de sangrado: entre las cinco y las ocho horas del día. .sangrado: incisiones longitudinales sobre la superficie del fruto de 2.53mm de profundidad -número de zanjas por fruto: cinco. Inmediatamente después de la recolección del látex, se adicionaron bisulfito de sodio sólido y químicamente puro en una concentración de 0.5%, como agente preservante, regulador de pH , antioxidante y citrato de sodio sólido y químicamente puro, como anticoagulante, en una concentración de 4.0%.

El látex coagulado sobre la superficie del fruto de desecho.

Página | 8

2.8.

LA ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA

La actividad proteolítica secretada por las células es un elemento indispensable para la proliferación y migración celular. Esta actividad está dada por una batería de enzimas y zimógenos secretados por la célula hacia el espacio extracelular. Las colagenasas, metaloproteasas, elastasas y otras enzimas degradativas conforman el amplio mundo de proteasas

que

se

encargan

de

degradar

la

matriz extracelular.

En condiciones normales la actividad proteolítica es modulada por el entorno celular e inclusive por la propia matriz extracelular. Por ejemplo, los factores de crecimiento (Growthfactors) al estimular la proliferación modulan, muchas veces, la actividad proteolítica . De esta forma una célula estimulada secreta los agentes que le permiten crear las condiciones adecuadas para la progenie.

La plasmina es una importante enzima degradativa que es secretada por

la

célula

como

zimógeno,

denominado plasminógeno.

El

plasminógeno queda retenido en la matriz extracelular no teniendo actividad

proteolítica

sobre

ella.

La

molécula

que

convierte

al

plasminógeno en plasmina se denomina Activador de Plasminógeno y es secretada por la célula en respuesta a ciertos estímulos. Existen dos tipos

de activadores

de

plasminógeno

el

uPA

(urokinaseplasminogenactivator) que se describió originalmente en la orina,

de

donde

proviene

(tissueplasminogenactivator).

su

Estos

nombre

convierten

y al

el

tPA

plasminógeno

enplasmina que a su vez actúa sobre la fibronectina, la laminina y colagenasas

latentes

que

resultan

así

son

activadas.

Las metaloproteasas (MMP, de matrixmetalloproteinase) son una familia de

proteasas

que

incluye

más

de

diez

componentes.

Estas proteasas dependen para su accionar de la presencia de cationes bivalentes (Zn++), actuando sobre una serie de sustratos según el tipo Página | 9

de MMP. Los distintos tipos de colágeno son los sustratos principales de estas proteasas.

2.9.

MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA

El parámetro de control de calidad de la papaína es la medición de su actividad proteolítica; se expresa como el incremento en la velocidad de reacción de la conversión de un sustrato en producto por intervención del enzima. Esta acción catalítica se la puede medir también en referencia a la digestión de un péptido o proteína y la extensión de tal digestión es medida de diferentes formas; existen tres: Métodos que se encargan de la medición de los residuos de un péptido no digerido por el enzima. Métodos que miden los grupos amino liberados en la catálisis. Métodos que miden la rotación óptica de los residuos digeridos, el tiempo de coagulación de una muestra de leche, el color producido por un reactivo en los residuos digeridos y el aumento de los sólidos solubles en el medio de reacción.

2.10. ESTRUCTURA QUÍMICA DE LA PAPAÍNA

Página | 10

2.11.

RENDIMIENTO DEL LÁTEX

Entre los principales factores que influyen en el rendimiento del látex están: variedad de papaya, las condiciones ecológicas, el sistema de siembra, la edad del fruto y del árbol. Algunos autores concluyen que el número de incisiones que se

realicen sobre el fruto, la frecuencia y la hora que se recolecte el látex, depende del rendimiento del látex fresco y por consiguiente, el látex seco.

2.12.

FACTORES

QUE

AFECTAN

LA

ACTIVIDAD

PROTEOLÍTICA  OXIDACION QUIMICA Agentes oxidantes como el yodo, bromo, peróxido de hidrogeno, el oxígeno y los metales pesados, inactivan la enzima, mientras que

el

ácido cianhídrico, la cisteína, el glutatión reducido, restauran u actividad. Esto se explica debido a la participación de sulfhidrilos en la acción catalítica de la enzima, que se activa en estado reducido y se inactiva al oxidarse. Otros agentes que impiden la oxidación de los grupos sulhhidrilos son el sulfito de sodio o potasio, el dióxido de azufre, bisulfitos de sodio. Potasio o amonio, el ácido tioglicolico y el ácido ascórbico.  COAGULACION Debido a la naturaleza proteica y a la presencia de peptonas y albuminoides en el látex fresco, este tiende a coagular después de su extracción. Página | 11

 CAMBIOS DE pH Una de las peculiaridades de la papaína es que mantiene su actividad proteolítica en un amplio margen de Ph, desde 3 hasta 12, presentando mayor actividad entre 5 y 6. El pH optimopara que la enzima actué, depende del tipo de sustrato sobre el cual ejerce su acción, ya que coincide con el punto isoeléctrico del sustrato. Entre los agentes amortiguadores más utilizados se encuentran: citrato de sodio y potasio, fosfato de sodio o potasio.

 CRECIMIENTO MICROBIANO Debido a la naturaleza proteica del látex y la forma de recolección, esta propensa a contaminación con microorganismos, que realizan sobre el acción putrefactiva. Como agentes antimicrobianos se utilizan los sulfitos y los bisulfitos de sodio y potasio, el fenol, el paranitrofenol, los benzoatos, el resorcinol y el etil-fenol. También encontró que tiene mayor actividad proteolítica el látex extraído de los frutos femeninos que de los frutos hemafroditos.

 OXIDACION POR LUZ Se inactiva con

luz ultra violeta, oxidándose rápidamente por

exposición a los rayos solares y el oxígeno.

 HORA DE RECOLECCIÓN Existen diferentes criterios, siendo el más corriente que la recolección debe hacerse a horas tempranas del día, para evitar fuerte acción de los rayos solares. No obstante algunos autores mencionan que no existe diferencia significativa en actividad proteolítica de la papaína, al realizar las extracciones entre las 5:30 am y las 14:00 pm del día: y que la Página | 12

actividad proteolítica de la papaína extraída de frutos hemafroditos, es mayor recolectarse al látex entre las 9 y las 10 horas del día. Para evitar la oxidación química dl látex, las incisiones deben realizarse con

instrumentos

cortantes,

de

materiales

no

corrosivos:

acero

inoxidable, vidrio, plástico. La profundidad de las incisiones, para obtener un buen rendimiento y no dañar la superficie del fruto, debe ser de 2.5 a 3 mm de profundidad. Los recipientes de recolección, deben ser de plástico o lona, para evitar la oxidación del látex.

2.13. SISTEMA DE SECADO Al ser la papaína un compuesto fácilmente alterable por agentes tales como el oxígeno, la luz solar y la temperatura, el sistema de secado determina la cantidad de la enzima. El secado bajo la oscuridad rinde un producto oscuro, de baja actividad proteolítica, por lo que no se recomienda su utilización. Además, este sistema

de

secado

está

sujeto

a

contaminaciones

ambientales,

resultando un producto que deberá purificarse para ser utilizado en la industria de alimentos o farmacéutica. El secado por corrientes de aire caliente, rinde un mejor producto de mejor calidad que el método anterior, más claro y con mayor cantidad proteolítica. Se encontró que la temperatura óptima para el secado está entre 50-55°C.

2.14. USOS Y APLICACIONES

Página | 13

En el área de la cosmética: donde se utiliza en la fabricación de cremas desmanchadoras de la piel, que consumen aproximadamente un 10% de la producción mundial, y van en alza. En el área farmacéutica: a) En Estados Unidos, se le han descubierto propiedades a la hora de tratar males hepáticos y dolores lumbares: su uso médico ha sido aprobado para el tratamiento de estos últimos, mediante la inyección de la enzima al líquido cefaloraquídeo de la espina dorsal con el fin de disipar los molestos dolores del disco intervertebral. Todo esto con un éxito de hasta un 60% en los pacientes tratados y un riesgo mínimo de alergia. b) Es uno de los componentes utilizados por laboratorios oftalmológicos para fabricar tabletas enzimáticas para la limpieza de lentes de contacto. c)También forma parte de suplementos dietarios, debido a su capacidad de favorecer el proceso digestivo, y de procesos de depuración de aguas. Paralelamente, se comienzan a descubrir otras aplicaciones de la papaína en negocios como la industria textil, papelera, curtiembre de cuero, en procesos de depuración de resíduos líquidos y en investigación de química analítica. Entre los países que la exportan se encuentran Tanzania, Uganda, Zaire, Sri Lanka, Tailandia e India. Como dato anexo, muchas de sus cualidades no han podido ser reproducidas en una enzima sintética, lo que vuelve a la papaína insustituible en muchas de estas áreas. Las enzimas son, básicamente, agentes de transformación. En el caso de las tecnoenzimas, estas son usadas en calidad de aditivos para mejorar la aceptación de los productos tratados. La papaína presente en ella tiene similares características a las de la bromelina, una enzima presente en la piña. Sin embargo, esta última tiene Página | 14

menos propiedades y aplicaciones, tanto en el área de la alimentación como en la creación de fármacos y terapias. Por esta y otras razones, y si bien las tradicionales confituras y conservas al jugo siguen teniendo gran aceptación en el mercado, es en el área biotecnológica donde se cree que este fruto tendrá importantes aplicaciones en un futuro inmediato.

3. MATERIALES Y REACTIVOS 3.1. MATERIALES CANTIDAD

MATERIAL

CAPACIDAD

1

EQUIPO

-2

FOLTRACION

-2

VACIO

-2

-1

-MATRAZ QUITASATO

-1

-1

- MANGUERAS

1

PARA AL

-2

-MOTOR -EMBUDO

DE

3

BUCHNER VASO

DE

2 1 1 1 3 1 1 1 1 10 1 1

PRECIPITADO Papel filtro piseta Pipeta propipeta Vidrio reloj espátula cepillo Estufa de secado gradilla Tubos de ensayo termómetro Mortero y pilón

100 ml

10ml

Página | 15

3.2.

REACTIVOS CANTIDAD 2 ml 5g

REACTIVO buffer BISULFITO

5g

DE SODIO CITRATO DE

20ml

SODIO AGUA

FORMULA 7.01 pH

H2O

DESTILADA

4. PROCEDIMIENTO 4.1.

PLANEACIÓN DEL TRABAJO EXPERIMENTAL

El punto de congruencia entre la parte teórica y la experimental, que ayuda a definir las variables sujetas a estudio, lo constituye la planeación del trabajo experimental; en ésta se definirá la estrategia que ayudará a conseguir los objetivos planteados en este anteproyecto. Es importante recalcar, además, que dicha estrategia será elaborada de acuerdo a la disponibilidad de equipos y materiales; además, se pretende evitar cualquier eventualidad que se presente a lo largo de la experimentación.

Página | 16

Entonces, para facilitar su desenvolvimiento y asegurar la confiabilidad de sus procedimientos y resultados, se propone que la estrategia consista en dividir el trabajo en tres etapas:  Etapa de preparación  Etapa de ejecución  Etapa de examen de resultados Este será el plan de trabajo que permitirá alcanzar los objetivos propuestos aquí. A continuación se detallarán cada uno de los componentes de lo mencionado.

¿EN QUÉ CONSISTE LA ETAPA DE PREPARACIÓN? Consistirá en organizar todo lo necesario para el trabajo experimental (lista de materiales, equipos y reactivos) y ensayar pruebas de habilidad tanto con los protocolos experimentales como con los equipos (pruebas operacionales). También se realizarán ensayos acerca de la adaptación de ciertos métodos experimentales de acuerdo a nuestras posibilidades técnicas

y

económicas.

Finalmente

se

ensayarán

las

pruebas

exploratorias de los rangos óptimos de concentraciones, tiempos y temperaturas de operación. En la etapa de preparación, antes de ensayar los métodos de análisis, se fijarán los factores que determinen la calidad de las materias primas y de los productos obtenidos; pues es imperativo primero determinar qué parámetros evaluaremos y en función de esto, se establecerán los respectivos métodos para el control de calidad.

¿EN QUÉ CONSISTE LA ETAPA DE EJECUCIÓN? En referencia a la etapa anterior, donde se ensayaron pruebas exploratorias y preparatorias, en esta etapa se llevarán a cabo las pruebas finales y de reproducibilidad. En la redacción de este experimento se detallaran los procedimientos finales y sus resultados.

Página | 17

¿EN

QUÉ

CONSISTE

LA

ETAPA

DE

EXAMEN

DE

experimento,

aquí

RESULTADOS? De

acuerdo

a

la

información

obtenida

del

corresponderá analizar todos los resultados obtenidos y sus eficiencias. De acuerdo al informe de resultados.

4.2.

FIJACIÓN DE LOS FACTORES DE CALIDAD

El fundamento que regirá la selección de los métodos de análisis para el control de calidad de las materias primas y de los productos, se refiere a los factores que conjuntamente establecen su calidad. Los siguientes son los factores que definen la calidad de la papaya apta para la recolección de su látex: o Estado de madurez: entre 9-14 meses de plantación o Tamaño adecuado: papaya tamaño mediano (tipo hawaiana) o La bibliografía recomienda que las condiciones ambientales para la recolección del látex sean: o Condiciones de trabajo: evitar contacto prolongado con el ambiente o Color blanco.- un cambio a pardo claro-oscuro indica la desnaturalización del enzima. Esta característica sensorial es una forma rápida y eficaz acerca de la calidad del látex después de un periodo de almacenamiento. o Olor ácido.- La oxidación además de producir un cambio de color en el látex también produce un olor a sulfuro de hidrógeno; esta es otra alternativa para evaluar la calidad del látex.

4.3.

PROCEDIMIENTO DE LABORATORIO

4.3.1. EXTRACCIÓN

DEL

LÁTEX

QUE

CONTIENE

LA

PAPAÍNA Para la extracción del látex se seleccionan frutos verdes y completamente desarrollados, de 3-4 meses de edad aproximadamente. El número de frutas Página | 18

que deben tomarse para efectuar las sangrías puede variar de seis a diez o más. Usualmente el número seleccionado es arbitrario.

El fruto puede recibir varias incisiones repetidamente a intervalos de cinco a ocho días, hasta que el fruto del látex comience a disminuir, al extremo que justifique la remoción de la fruta del árbol. Se ha reportado que incisiones hechas cada dos semanas proporcionan mayores rendimientos que las realizadas semanalmente. También el tamaño del fruto tiene importancia en el rendimiento del látex. Los frutos de 2 a 2.5 meses de edad presentan las más altas producciones de látex y papaína cruda. Igualmente, frutas de 23 a 25 cm. de largo producen los más altos rendimientos en ambos productos y tienen una mayor

actividad

de

extracción.

Todas las incisiones deben ser hechas verticalmente y no más de 4 sangrías deben hacerse a un fruto al mismo tiempo. Cuando la fruta, independientemente de su tamaño comienza a presentar los primeros síntomas de madurez, la producción de látex y la concentración de enzimas disminuyen rápidamente.

4.3.2. PROCESAMIENTO DEL LÁTEX El látex debe ser procesado (secado) inmediatamente después de ser extraído del fruto. El proceso de secado puede hacerse a pleno sol o también utilizando otra fuente de calor. En este último caso, el uso de hornos es esencial. El diseño y características del tipo de horno más adecuado dependen de la disponibilidad de la fuente de calor. Éstos deben ser regulados para garantizar un suministro promedio de 25 ºC, ya que el calor excesivo destruye el principio activo de la papaína. Si se proporcionan las condiciones óptimas de calor, el proceso de secado del látex puede ser completado en aproximadamente 20 horas. Página | 19

El látex coagulado puede producir el 25% de su peso en polvo seco, el cual aún contiene 6-10% de humedad y presenta una coloración blancocremosa. El producto comercial se considera de buena calidad cuando tiene la capacidad de digerir 35 veces su propio peso. La pérdida de calidad está asociada con numerosos factores, entre los cuales merecen destacarse, la edad de los árboles, madurez de los frutos, tiempo de extracción del látex, velocidad de secado, cantidad de lluvia caída, temperatura a la cual el látex es secado, sistema de almacenamiento, etc. La papaína comienza a mostrar signos de descomposición por la liberación de fuertes olores deproductos volátiles, acompañados por un rápido cambio de color blanco cremoso a marrón.

4.3.3. SISTEMA DE SECADO  LÁTEX SECADO CON AIRE CALIENTE Utilizando aire caliente, se obtiene un producto de color oscuro y grumoso, que necesita molienda para su posterior utilizaci6n. La presencia de oxigeno durante el tratamiento térmico, y el tiempo que dura

el

proceso

(6

horas),

son

dos

factores,

que

influyen

considerablemente en la baja actividad de la papaína seca. Sumado a los otros dos factores, esta la molienda, posterior al secado, que debe ser realizada para brindar un producto homogéneo. En este último proceso, el producto se somete a exposici6n al aire y q calentamiento, ocasionado por las fuerzas de fricción durante la molienda. Por el tiempo de exposición al aire, que es mayor que en los dos casos anteriores, el producto seco puede absorber humedad del medio ambiente. La actividad proteolítica de las muestras empacadas al vacio, es mayor que las empacadas sin vacio durante el periodo de almacenamiento. 4.3.4.

DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Página | 20

Para la determinación de la actividad enzimática, se detallaran a continuación los dos métodos, utilizados para comprobar la existencia de la enzima papaína y su efectividad.

1. Método de coagulación de leche (Balls and Hoover). Hay diferentes métodos de comprobación de actividad de una enzima. Este método confía en la capacidad de la papaína en coagular la leche, los análisis se realizaran en 10 mililitros de leche deshidratada, a diferentes concentraciones de papaína (0.0025, 0.005, 0.01 y 0.02) gramos por mililitro de ácido acético, una vez preparada la solución de papaína con ácido agregar a la leche (0.5, 1, 2, 4, 6 y 7) mililitros respectivamente. Esterilizar los instrumentos que se van a utilizar en el autoclave por 45 minutos, y luego colocarlos en la estufa a 120ºC por 30 minutos para eliminar residuos de agua. Se deja enfriar a temperatura ambiente (28 ± 2 ºC).  Pesar 7.75 gramos de leche en polvo.  Colocar 54 mililitros de agua en un vaso de precipitación.  Diluir la leche en el agua y calentarla a 30ºC en un baño de agua y mantener esta temperatura, en una cocineta eléctrica.  Pesar las diferentes cantidades del polvo de látex seco (0.0025, 0.005, 0.01 y 0.02) gramos por mililitros de ácido acético.  A una cantidad determinada de leche (10 mililitros), agregar las cantidades de la solución de látex seco diluido en ácido acético (0.5, 1, 2, 4, 6 y 7) mililitros.  Mezclar el contenido a fondo y controlar el tiempo que demora para detectar la coagulación de la leche (formación de coágulos).  El tiempo tomado para alcanzar esta etapa, de cuando el polvo de látex seco diluido en el ácido fue agregado a la leche, se registra para cada uno de los experimentos.  Las diversas cantidades de muestra del polvo de látex seco usado deben dar una gama de los tiempos de coagulación entre 20 y 150 segundos para los resultados óptimos.

Página | 21