Informe de Microbiología N°03 - Preparación de Medios de Cultivo (3

 

“Año de la Universalización de la Salud “

UNIVERSIDAD NACIONAL NACIONAL DE PIURA FACULTAD DE INGENERIA PESQUERA DEPARTAMENTO ACADEMICO DE INGENERIA PESQUERA

INFORME 3 “MEDIOS DE CULTIVO Y SOLUCIONES” CURSO ALUMNOS

:

MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS

: ARRUNATEGUI TIMANA CRISTHIAN

 

TALLEDO RAMIREZ CESAR 

DOCENTE:: DOCENTE

ING. LEYTON MASIAS HUALTER

FECHA

:

1 DE ABRIL DE 2020

INTRODUCCIÓN

 

El mantenimiento de los microorganismos consiste en la conservación de ellos y de sus características por largos periodos. A través de los años, se han desarrollado varios métodos de conservación de microorganismos, que se basan en la reducción de su actividad metabólica. La selección del método de conservación depende de varios factores. (Allaert et al 2003) En muchos países, hay entidades que tienen colecciones de cultivos y se dedican al mantenimiento de los microorganismos (brindan una garantía de sus características). Muchas de estas colecciones son reconocidas internacionalmente; por medio de ellas, se puede adquirir la mayoría de los microorganismos existente. Existen varios métodos para la conservación de los microorganismos; todos buscan que las células sufran el daño mínimo y se preserven por el máximo periodo posible. (Garcés (Garcés,, A. 2001)

La mayoría mayoría de los estudios estudios relaci relaciona onados dos con bacter bacterias ias se llev llevan an a cab caboo en el laboratorio, por esta razón, se han desarrollado una cantidad de medios de cultivo. Las bacterias que con mayor frecuencia se estudian son las heterótrofas, y se utilizan medioss de cultivo medio cultivo que contiene contienenn sustancias sustancias tales como azúc azúcares, ares, sale sales, s, peptonas, peptonas, extractos de carne o levadura, así como amortiguadores apropiados. Los medios de cultivo cult ivo pueden ser líquid líquidos os o sólidos sólidos si contie contienen nen agar como agente agente solidificant solidificante. e. Los líquidos se conocen como “caldos” y los sólidos como “agares”. (Caballero, 1999).

Al cult cultiv ivar ar ba bact cter eria iass en el la labo bora rato tori rioo se debe debe te tene nerr en cuen cuenta ta la lass vari variad adas as necesidades nutricionales y condiciones físicas y químicas de ambiente que ellas se desarrollan. Es obvio, que la escogencia del medio de cultivo apropiado, así como de las las cond condic icio ione ness a la lass qu quee és éste te se some someta ta,, son indi indisp spen ensa sabl bles es para para logr lograr ar un crecimiento óptimo de una determinada bacteria. (Garcés, A. 2001) Algunas bacterias pueden crecer bien en casi cualquier medio de cultivo; otras requieren medios especiales y otras no pueden crecer en ninguno de los medios inertes existentes hasta ahora. Los microbios que se introducen en un medio de cultivo paraenque crescandesecultivo denominan inóculo.cultivo. Los microbios multiplican un medio se denominan (Gerard etque al, crecen 2007). y se Los tipos de medios de cultivo: medios generales; permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos. Medios de enriquecimiento; favorecen el crecimiento de un determ determina inado do tipo tipo de microo microorga rganis nismo, mo, sin lle llega garr a inh inhibi ibirr tot totalm alment entee el crecimiento del resto. Medios selectivos; permiten el crecimiento de un tipo de microo mic roorga rgani nismo smoss de deter termin minado ado,, inhibi inhibiend endoo el desar desarrol rollo lo de los dem demás. ás. Medios Medios diferenciales; son aquellos en los que se ponen de relieve propiedades que un determinado tipo de microorganismo posee (Madigan, 2003). Un mi micr croo oorg rgan anis ismo mo ne nece cesi sita ta pa para ra cr crec ecer er nutr nutrie ient ntes es que que le apor aporte tenn ener energí gíaa y elementos químicos para la síntesis de sus constituyentes celulares. Dependiendo de

 

la fuente de carbono que utilizan, los microorganismos se pueden clasificar en auto autotr trof ofos os si es el CO2 CO2 at atmo mosf sfér éric icoo (mic (micro roor orga gani nism smos os que que foto fotosi sint ntet etiz izan an)) y heterotrofos si utilizan carbono orgánico. (Gaviño, 1972). Los objetivos de la práctica fueron capacitarnos para la preparación de medios de cultivo y en la reconstitución de medios deshidratados y ajustar el pH de los medios de cultivo usando los diferentes recursos ´para su determinación.

II.-

MATERIAL Y MÉTODOS

CALDO NUTRITIVO

Agua Peptona Extracto de carne NaCl

1000ml 10gr 3gr 5gr

50ml 0.5gr 0.15gr 0.25gr

 





Las medidas de los componentes componentes del caldo nutritivo fueron proporcionadas a 100ml; sin embrago en el laboratorio se prepararon solo 50 ml del caldo, por lo que se ajustaron las medidas. Agregamos en un matraz todos los ingredientes, anteriormente pesados en una balanza con  precisión para obtener un buen cultivo, finalmente agregamos el agua (50ml) y lo llevamos a calentar a la cocina hasta que todo se mezcle y se disuelva.

 AGAR NUTRITIVO NUTRITIVO

Agua Agar 

1000ml 15gr

25ml 0.375gr

Al caldo nutritivo preparado anteriormente, una vez que está completamente mezclados los componentes, se extrae en otro matraz 25 ml a los cuales se le agrega 0.375gr de Agar, y se lleva a la cocina y se calienta (esteriliza) hasta que se disuelva junto con los nutrientes; éste servirá para hacer un medio solido.

 AGAR MANITOL SALADO SALADO Agua Peptona Extracto de carne NaCl Manitol R.F Agar



1000ml 10gr 1gr 75gr 10gr 0.025 12gr

En este caso, el medio de cultivo viene ya constituido por todos los ingredientes en polvo: 108 gr en 1000ml; por tanto pesamos 5.4gr, que es lo que corresponde a 50ml de agua, que fue lo que se preparó en el laboratorio. Se pesó con precisión en la balanza, se agrego en un matraz junto con los 50 ml de agua, y luego se llevó a la cocina para ser calentado hasta que se disuelva. Éste medio de cultiv cultivoo sirve para identificar el creci crecimiento miento de microorganismo microorganismoss manitol positivos o manitol negativos.

 AGAR MCCONKEY 

Agua Peptona

1000ml 17gr

 

Protospel Lactosa Sales biliares NaCl Agar Rojo neutro

3gr 10gr 1.5 gr 5gr 13.5 0.03gr

Cristal violeta

0.001gr





El medio de cultivo viene ya constituido por todos los ingredientes en polvo: 50 gr en 1000ml; por tanto pesamos 2.5gr, que es lo que corresponde a 50ml de agua, que fue lo que se preparó en el laboratorio. Se pesó con precisión en la balanza, se agrego en un matraz  junto con los 50 ml de agua, y luego se llevó a la cocina para ser calentado hasta que se disuelva. El PH uutilizado tilizado es 7.1. Finalmente se reparte 2ml de cada medio de cultivo en tubitos de ensayo para ser  esterilizados en el autoclave por 15 minutos a 121 °C a 15 lbs de presión. Luego de ello los medios de agar se dejan reposar en forma inclinada.

 PARA AJUSTAR EL El PH requerido es 7.1; es decir básico por ende aplicamos una solución de NaOH para ajustar. Sacamos por medio de la fórmula W=V.Pm.M los gramos de NaOH que se agregarán a 50ml de agua, resultando 0.2 gr de NaOH para ajustar el PH.

IV.- RESULTADOS Obtuvimos los cuatro medios de cultivo:

CALDO NUTRITIVO NUTRITIVO 25ml; A LOS 25 ml RESTANTES SE LES AGREGÓ O.375gr DE AGAR PARA CONVERTIRLOS EN MEDIODE CULTIVO SÓDIO (AGAR NUTRITIVO)

 

AGAR MACCONKEY; LUEGO DE HABERLA CANLENTADO HASTA QUE SE DISUELVA COMPLETAMENTE.

AGAR MANITOL; LUEGO DE HABERLO CALENTADO PARA QUE SE DISUELVAN LOS COMPONENTES.

SE REPARTIÓ 2ml DE CALDO NUTRITIVO Y AGAR NUTRITIVO EN DIFERENTES TUBITOS DE ENSAYO, DEBIDAMENTE ESTERILIZADOS, PARA QUE NO ENTREN EN CONTACTO CON

EL AGAR MACCONKEY Y AGAR MANITOL SE DEJARON EN SUS RESPECTIVOS MATRAZ, Y SE ESTERILIZARON PARA SER YEVADOS AL AUTOCLAVE JUNTO CON LOS TUBOS DE ENSAYO

 

V.-

DISCUSIÓN

Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias sustancias inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones  para las reacciones químicas que tengan lugar.  (Rodriguez, 2005).  Por ende cada medio de cultivo que preparamos en el laboratorio se le agregó componentes como la peptona que es una buena fuente de nitrógeno, el extracto de carne para la extracción de proteínas, aminoácidos, eltica NaCl para aportar sales otros componentes los dan dan ca cara ract cter erís ísti cas s nece ne cesa sari rias as allasmedi me dioo necesarias, para para qu quee y pu pued edan an cr crec ecer er ci cier erto to cuales ti tipo po les de microorganismos. Por ejemplo en el agar manitol se agregó 75 gr de NaCl que es una cantidad superior a la de los demás cultivos, lo que indica que en tal medio crecerán microorganismos halófilos. Por ello Allaert et al ,2003 refiere que los componentes de

las células son: carbono que representa alrededor del 50% del peso seco, oxígeno (32%), nitrógeno (14%), fósforo (3%), azufre (entorno al 1%) y otros elementos traza entre los que se encuentran Fe, K, Mg, Mn, Co,Mb, Cu y Zn. La elaboración de medios de cultivo requiere proporcionar los elementos antes citados en una forma asimilable. Así, por ejemplo, el C debe estar en forma de carbono orgánico para los heterotrofos y como CO2 para los autotrofos, el N en forma de NH4, de NO3 o de  NO2- o en forma de aminoácidos a los que se pueda tomar su grupo amino; el P debeAdemás, estar en forma de PO4 3-, el procede de aminoácidos sulfurados o de SO4 2-, etc. en ciertos casos, es Snecesario añadir a los medios de cultivo algunos

 

aminoácidos o vitaminas que determinados tipos de microorganismos no pueden sintetizar. Por otra parte, los medios de cultivo pueden ser líquidos o sólidos si se añade algún agente solidificarte que no sea consumible por los microorganismos (normalmente agar). En función de los microorganismos que pueden crecer en ellos, los medios  pueden se serr ge gennera erales, es, sel selec ecttiv ivos os cua uand ndoo fa favo vore reccen el cre reci cimi mien entto de cier erto toss microorganismos mientras suprimen el de otros (por ejemplo, el medio SPS para clostridios), diferenciales cuando alguno de sus componentes permite identificar las colonias de un tipo de microorganismos (por ejemplo medios con hematíes para identificar colonias de microorganismos hemolíticos), selectivo-diferencial selectivo-diferenciales es cuando combinan las dos características anteriores (por ejemplo, el agar de MacConkey para identificar Escherichia coli), y medios de enriquecimiento que permiten aislar un tipo determinado de microorganismo a partir de una mezcla una población mixta de gran tamaño. (Allen (Allen,, 2008). Se preparó cuatro tipos de cultivos entre ellos los no exigentes como el caldo nutritivo al cual luego se le agregó la cantidad de agar  necesaria para 25ml y así preparar el agar nutritivo, en éste caso el caldo constituyó un medio liquido, mientras el agar un medio sólido, los dos medios restantes también fueron sólidos ya que en su composición se encontraba el agar. En el caso del agar Manitol, posee en su composición una mayor cantidad de NaCl;   Es un medio selectivo para estafilococos debido a la alta concentración de cloruro sódico (75 g/L). La mayoría de los microorganismos no crecen a esta concentración de sal, mien mi entr tras as que que lo loss es esta tafi filo loco coco cos, s, en entr tree lo loss que que se encu encuen entr tran an los los del del géne género ro Staphylococcus, sí lo hacen. Incorpora manitol como fuente de carbono y rojo fenol comoo indica com indicador dor,, lo que permit permitee aprove aprovecha charr la cor correl relaci ación ón que exi existe ste entre entre la  patogenia y la capacidad fermentadora del manitol de los estafilococos para establecer un diagnóstico presuntivo y sirve, por lo tanto, como indicativo de la  presencia de Staphylococcus aureus. Los estafilococos patógenos fermentan el manito man itoll y produc producen en coloni colonias as amaril amarillas las.. Los est estafi afiloc lococo ocoss no pat patóge ógenos nos no lo fermentan y producen colonias de color rosa. En que el caso del Macconkey es undades medio dequímic cultivo yroorga diferencial, ya pon pone e agar de manifi man ifiest estoo la las s tanto propie propiedad es bioquí bio micas asselectivo del mic microo rganis nismo; mo; distinguiendo así las bacterias gram negativas que pueden fermentar la lactosa (Lac+) y las que no pueden (Lac-). Al utilizar la lactosa en el medio, bacterias Lac+ como Escherichia coli, Enterobacter   yy Klebsiella producen acidez acidez,, lo cual baja el PH bajo 6,8 lo que tiene como consecuencia la aparición de colonias de color  rosadas o rojas. Bacterias que no fermenten la lactosa como Salmonella, Proteus y Shigella utilizaran  utilizaran peptona  peptona  en su lugar, formando ammonio, ammonio, lo cual incrementa el PH del agar , formando colonias blancas o incoloras. El agar es un extracto seco obtenido de diversas especies de algas marinas que tiene la propiedad propiedad de formar un gel. El análisis análisis químic químicoo arrija arrija un contenido en metales metales

 

como máximo de: 0.5x 10-3 % de plomo, 1x 10-3 de hierro,0-1 % de magnesio, 0,2% de calcio y 0.4 % de sodio. No contiene sustancias antibacterianas. Si se trabaja con medios de cultivo de pH ácido (