informe de microbiologia medios de cuultivos.docx

“Año de la consolidación del Mar Grau” Microbiología farmacéutica I UANCV - EAP:FYB

UNIVERSIDAD ANDINA NESTOR CACERES VELASQUEZ

FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUIMICA MICROBIOLOGIA FARMACEUTICA I (PRACTICA)

PRACTICA Nº 07 MEDIOS DE CULTIVO DOCENTE: Q.F. Fredy Catacora Yucra

ALUMNO: Ever Nilson Choque Tiacacala

GRUPO DE PRACTICAS: 7.30 am – 9:30 am

SEMESTRE: VII

Juliaca – Puno – Perú

Microbiología farmacéutica I

UANCV - EAP:FYB

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y ESTERILIZACION

OBJETIVOS: -

Conocer, diferenciar, clasificar y preparar (pesada, preparación esterilización y conservación) los diferentes medios de cultivo utilizados en el laboratorio de microbiología. Preparar un medio de cultivo completo añadiendo cada uno de sus suplementos. Conocer los medios de cultivo de uso general, diferencial y selectivo.

FUNDAMENTOS TEÓRICOS

Medios de Cultivo

Gran parte de la microbiología depende de la capacidad de cultivar y mantener microorganismos en un laboratorio, y esto sólo es posible si se dispone de los medios de cultivo adecuados.

Un medio de cultivo es un sustrato o solución de nutrientes, en los que crecen y se multiplican los microorganismos en el laboratorio, con el objeto de aislar las diferentes especies bacterianas, proceder a su identificación y llevar a cabo estudios complementarios. Los medios especiales son imprescindibles para aislar e identificar los microorganismos, evaluar la sensibilidad a los antibióticos, analizar agua y alimentos, en microbiología industrial y otras actividades. Aunque todos los microorganismos necesitan fuentes de energía, carbono, nitrógeno, fósforo, azufre y varios minerales, la composición precisa de un medio adecuado dependerá de la especie que se quiere cultivar, porque las necesidades nutricionales varían considerablemente. El conocimiento del hábitat normal de un microorganismo es a menudo útil para elegir un medio de cultivo apropiado, porque sus necesidades de nutrientes reflejan su ambiente natural. Un medio se utiliza frecuentemente para seleccionar y cultivar microorganismos específicos o para facilitar la identificación de una especie en particular. En estos casos, la función del medio estará también determinada por su composición.

Agentes gelificantes.

Microbiología farmacéutica I

UANCV - EAP:FYB

El agar es un polímero sulfatado de azúcares, obtenido de algas Consistencia

Líquidos Sólidos Semisólido Complejos

Composición

Sintéticos Semisintéticos

Enriquecimiento o Multiplicación Selectivos o Inhibidores Enriquecidos Utilización o función

Diferenciales Identificación Transporte

marinas, compuesto principalmente por D-galactosa, 3,6-anhidro-Lgalactosa y ácido D-glucurónico. Es un buen agente solidificador porque, una vez que se funde en agua hirviendo, puede enfriarse hasta una temperatura de 40 a 42º c, sin endurecerse, y no fundirá de nuevo hasta que no se alcance una temperatura de 80 a 90ºC. Es también excelente porque la mayoría de los microorganismos no pueden degradarlo. Puede utilizarse para diferentes fines, aunque los más importantes son: agar comercial para la industria alimenticia, agar bacteriológico, agares purificados y agarosa, utilizada para electroforesis en gel. Aproximadamente la mitad de todo el agar que se produce se utiliza en trabajo microbiológico, por lo que es importante la ausencia de metales tóxicos. La gelatina es una proteína animal obtenida de los huesos. Tiene el inconveniente de que es hidrolizada por muchas bacterias, y además su uso está muy limitado porque su punto de fusión es bajo (licua a temperatura ambiente) razón por la que no puede utilizarse para cultivos a 37ºC, que es la temperatura óptima de crecimiento para muchos microorganismos.

Microbiología farmacéutica I

UANCV - EAP:FYB

Los medios de cultivo pueden clasificarse según diferentes criterios, pero los más importantes son aquellos que se basan en:

1 Según su consistencia Medios Líquidos. Son los que se presentan en este estado, denominándose por ello caldos. Contienen los nutrientes antes citados, con adición de algún tampón, capaz de mantener el pH adecuado. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtención de una suspensión bacteriana de una determinada concentración. Ejemplos: caldo nutritivo, caldo tioglicolato, agua peptonada, etc.

Medios Sólidos. Se prepara añadiendo un agente gelificante a un medio líquido determinado. Los más usados son gelatina y agar. Este conjunto, convenientemente esterilizado, se vierte en una placa de Petri o en tubos. Las exigencias nutritivas y las condiciones físico-químicas son similares a las de los medios líquidos. Pero, a diferencia de ellos, presentan la posibilidad de obtener colonias aisladas, siempre que la cantidad de inóculo esté suficientemente diluida. En este caso se puede observar la existencia de colonias separadas unas de otras, y cada una constituye un clon (conjunto de bacterias que provienen de una célula madre, con el mismo patrimonio hereditario y las mismas características fisiológicas).

Microbiología farmacéutica I

UANCV - EAP:FYB

Ej.: agar nutritivo, agar EMB, CLDE y todos los medios de aislamiento primario y de identificación.

Medios Semisólidos. Se preparan a partir de medios líquidos, agregando un agente solidificante en una proporción menor que para preparar medios sólidos. Uno de sus usos es la investigación de la movilidad de las bacterias. Ej.: agar cepa, SIM, medios base para utilización de aminoácidos.

2 Según su composición. Medios complejos. Son aquellos que contienen ingredientes cuya composición no es exactamente definida, y por consiguiente no es rigurosamente constante. Además, no se conoce exactamente la proporción de cada uno de sus componentes. Esto tiene ciertos inconvenientes en condiciones experimentales, donde la reproducibilidad no podrá ser exacta. En la práctica estos medios dan excelentes resultados y son los más empleados. Ejemplo: caldo nutritivo. Medios Sintéticos Son aquellos que poseen exclusivamente componentes químicos definidos (se conocen todos los componentes) disueltos en agua destilada, donde la proporción de cada uno de sus componentes es conocida exactamente. Entre ellos se encuentran los medios mínimos, pues en ellos se intenta comprobar el crecimiento de una bacteria determinada, con muy pocos nutrientes. Los medios definidos son ampliamente usados en investigación, pues a menudo se quiere conocer qué está metabolizando el microorganismo experimental. Ejemplos: medio basal de sales y una fuente de carbono determinada.

Medios Semisintéticos. Cuando alguno de sus componentes no tiene composición definida. En estos casos, se añaden factores de crecimiento bajo la forma de un extracto orgánico complejo, como por ejemplo, extracto de levaduras, peptona cono fuente de nitrógeno, glucosa como fuente de carbono.

3 Según su utilización o función.

Microbiología farmacéutica I

UANCV - EAP:FYB

Medios de Enriquecimiento. Se basan en la libre competencia por los sustratos. Son siempre líquidos que favorecen o permiten la multiplicación de unas bacterias, inhibiendo parcialmente la de otras. Pueden ser: de enriquecimiento propiamente dichos, que se basan en las propiedades metabólicas del microorganismo, o de enriquecimiento selectivo, en cuyo caso se agrega un agente de selección que puede ser, un colorante, un antibiótico, etc. Este agente de selección no favorece el desarrollo del microorganismo a enriquecer, sino que inhibe a la flora acompañante. Ejemplos: 

  

agua peptonada alcalina, se utiliza para V cholera (donde el pH alcalino inhibe a todas las enterobacterias menos al Vibrio) caldo selenito, actúa inhibiendo el desarrollo de casi todas las enterobacterias menos de Salmonella y Shigella. caldo tioglicolato caldo infusión cerebro corazón (BHI)

Medios Selectivos (o Inhibidores) Pueden ser sólidos o líquidos, a los que se les agrega uno o más agentes de selección. Favorecen el crecimiento de microorganismos particulares, en los que la “selectividad” se consigue alterando las condiciones físicas del medio o añadiendo compuestos químicos, que sean nocivos para las bacterias cuyo crecimiento no interesa. Los medios inhibidores pueden considerarse una variante más restrictiva de los medios selectivos. Las posibilidades de selección son infinitas y existen decenas de medios selectivos especiales disponibles. Ejemplos: - Agar Endo, eosina azul de metileno (EMB o Levine), agar MacConkey. (Las sales biliares o colorantes como la fucsina básica y el cristal violeta, componentes de estos medios, favorecen el crecimiento de bacterias gramnegativas, al inhibir el crecimiento de bacterias grampositivas). - Agar salmonella-shigella (SS): medio selectivo para recuperar Salmonella spp y Shigella spp. (Las sales biliares, el citrato de sodio y el verde brillante son inhibidores de los grampositivos y de algunos gramnegativos. Las posibles colonias de Shigella aparecen amarillas y las posibles de Salmonella aparecen negras). - Agar Tayer Martin: el medio base es agar chocolate con agregado de antibióticos para inhibir el desarrollo de bacterias contaminantes: - trimetroprima para inhibir Proteus spp y otros gramnegativos, - vancomicina para inhibir grampositivos y - nistatina para inhibir levaduras. Medios Diferenciales. Son siempre sólidos y se utilizan para diferenciar colonias. Son medios que diferencian entre grupos distintos de bacterias e incluso

Microbiología farmacéutica I

UANCV - EAP:FYB

permiten una identificación tentativa según las características biológicas del microorganismo. A estos medios se les agrega, por ejemplo, un indicador de pH que permite diferenciar a microorganismos que fermentan un determinado hidrato de carbono. Ejemplos: -

-

-

-

Eosina azul de metileno (EMB- Levine): permite diferenciar bacilos gram negativos fermentadores y no fermentadores de lactosa. Las bacterias no fermentadoras dan colonias transparentes y las fermentadoras rosa o rojas, y E coli da colonias con brillo verde metálico. Estas coloraciones son producidas por la presencia del indicador de pH eosina amarilla y del colorante azul de metileno (éste inhibe el desarrollo de la mayoría de los gram positivos y junto a la eosina sirve como indicador de fermentación ya que a pH ácido los colorantes precipitan). El agar MacConkey es tanto diferencial como selectivo, contiene lactosa y colorante rojo neutro, las colonias fermentadoras de lactosa aparecen de color rosa a rojo y son fácilmente distinguibles de las no fermentadoras. Agar MacConkey-sorbitol. Es un medio diferencial que permite sospechar en 24 hs la presencia de E coli O157 en materia fecal, dado que esta especie no fermenta el sorbitol. El agar Xilosa-lisina-desoxicolato (XLD) sirve para diferenciar patógenos entéricos. La mayoría de los no patógenos fermentan lactosa, sacarosa o xilosa y producen colonias amarillas. Shigella spp. no fermenta estos azúcares y da colonias rojas. Salmonella spp y Edwarsiella spp fermentan xilosa pero producen lisina decarboxilasa produciendo cadaverina que neutraliza los ácidos de la fermentación y dan colonias rojas con centros oscuros porque producen ácido sulfúrico. Agar cisteína lactosa deficiente en electrolitos (CLDE), contiene lactosa y permite diferenciar las bacterias fermentadoras de lactosa (colonias amarillas) de las no fermentadoras (colonias incoloras).

Medios Enriquecidos. Son medios a los que se le agrega un nutriente extra (además de las sustancias nutritivas normales, incorporan una serie de factores indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes). Pueden ser líquidos o sólidos. En estos medios no crece un determinado grupo de bacterias sino todas. Este enriquecimiento se hace por adición de sangre u otros productos biológicos (sangre, suero, leche, huevo, bilis, líquido ascítico, etc.) que aportan dichos factores. En ocasiones es posible añadir suplementos artificiales a los medios para producir un enriquecimiento del mismo, por ejemplo Polivitex, Isovitalex, etc. Ejemplos: agar sangre, agar chocolate, caldo infusión cerebrocorazón, caldo tristona-soya.

Medios de Identificación.

Microbiología farmacéutica I

UANCV - EAP:FYB

Son los medios destinados a comprobar alguna cualidad específica que puede servirnos para reconocer la identidad de un microorganismo. Estos medios han de poseer los elementos necesarios para asegurar el crecimiento de los microorganismos, el sustrato específico que vaya a ser metabilozado y el indicador que nos muestre el resultado. Ejemplos.: agar citrato de Simons, agar sulfhídrico-indol-movilidad (SIM), agar manitol salado, agar DNAsa, agar triple azúcar hierro (TSI), y en general, cualquier medio al que se le haya añadido un elemento diferencial, son medios utilizados para identificación. Actualmente están apareciendo en el mercado una gran cantidad de medios específicos de identificación para ciertos microorganismos, con lo cual se consigue simultáneamente identificar los gérmenes a partir de la placa de cultivo gracias a la utilización de sustratos cromogénicos específicos.

Medios de Transporte. Se usan para transporte de aquellas muestras que no van a procesarse de inmediato o que deban ser trasladadas de un laboratorio a otro, y que puedan contener microorganismos “fastidiosos” para su desarrollo por lo que se debe impedir el sobrecrecimiento de bacterias que colonizan con frecuencia piel y mucosas. Estos medios son generalmente semisólidos, tamponados y sin sustancias nutritivas. Ejemplos: Stuart-Amies, Cary-Blair, etc.

MATERIALES:

MATERIAL DE VIDRIO: -

Balones Palcas Petri Probetas graduadas Tubos de ensayo

OTROS MATERIALES: -

Algodón Espátula Gasa Gradilla Mechero bunsen Papel Kraft Pabilo Agua destilada

Microbiología farmacéutica I

UANCV - EAP:FYB

EQUIPOS: -

Autoclave Balanza Potenciómetro PH-metro

MEDIOS DE CULTIVO: Medios Solidos: -

Agar Agar Agar Agar Agar Agar

eosina azulde metilieno (EMB) manitol salado Mc Conkey Muller Hinton nutritivo. salmonella shigella (ss)

Medios líquidos: -

Agua peptonada Caldo cerebro de corazón Caldo lactosado Caldo nutritivo

PARTE EXPERIMENTAL

La preparación de un buen medio de cultivo es fundamental para un buen diagnóstico bacteriológico. El éxito de la preparación está influenciado por una serie de factores como:

Microbiología farmacéutica I      

UANCV - EAP:FYB

Exactitud de la pesada y perfecta medición del volumen de agua Control de pH Correcta disolución del medio de cultivo Correcta esterilización Correcta conservación del medio de cultivo Correcto fraccionamiento.

Para la preparación de medios se parte de mezclas deshidratadas de los compuestos que la integran. Habitualmente sólo es necesario añadir agua y esterilizar en autoclave, pero en algunas ocasiones es necesario añadir después de la esterilización algún componente termolábil que no hubiera resistido el calor.

Los medios deshidratados presentan ventajas: -

son muy estables, su utilización es muy simple, pudiendo prepararse poco tiempo antes de su utilización, una pequeña cantidad del producto permite la preparación de una importante cantidad de medio, no necesitando un gran volumen de almacenamiento, son económicos.

PROCEDIMIENTO:

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO:

1

Determinar la cantidad que vamos a preparar, es decir el número de medos de cultivo en cajas Petri y en los tubos de ensayo. Se recomienda la siguiente cantidad. Cajas Petri---------------------15-20ml Tubos de ensayo--------------20 ml Por tanto se desea preparar en 5 cahas Petri, se emplea l regla de tres simple: 1 cajas de Petri----------------20 ml 5 cajas de Petri----------------Xml

X=5x20/1=100ml

2

Pesar la cantidad de gramos del medio de cultivo que se desea preparar: ejemplo agar nutritivo. Para esto debemos fijarnos en las

Microbiología farmacéutica I

UANCV - EAP:FYB

instrucciones de preparación para determinar el mediante una simple regla de tres debemos calcular. Para nuestro agar que viene a ser el agar nutritivo

peso.

Luego

Cálculos: 20gr de 1000ml

agar

nutritivo----------------

Xgr----------------------------------------40ml X=20grx40ml/1000ml X=0.8gr. Y así pesamos 0.8 gr de muestra a preparar

Microbiología farmacéutica I

3

UANCV - EAP:FYB

Luego se mezclan las cantidades de agua destilada y los gramos del medio de cultivo. La mezcla preparada en el matraz de Erlenmeyer se diluye realizando movimientos circulares de la preparación con la mano y calentando a la llama del mechero para acelerar el proceso.

4

Luego

se realiza la esterilización en el autoclave a una presión de 1.5 atmosferas, 120ºC y por 15 minutos. Hay algunos medios de cultivo que no deben esterilizarse al autoclave.

Microbiología farmacéutica I

UANCV - EAP:FYB

5

Luego se realiza el vaciado a los recipientes estériles (cajas Petri y tubos de ensayo) de forma rápida ya que el agar solidifica rápido a 40ºC en el caso de medios sólidos. Siempre en el área protegida por llama del mechero que crea un ambiente estéril.

6

Dejar enfriar los medios de cultivo con la tapa semiabierta en el caso de las cajas de Petri. Dejar enfriar los medos de cultivo con la tapa semiabierta en el caso de las cajas de Petri, para evitar la formación de gotas de condensación en su interior.

7

Microbiología farmacéutica I 8

UANCV - EAP:FYB

Luego guardar en forma invertida, envolviendo previamente en papel Kraft o papel madera, en la sección de conservación de un refrigerador.

RESULTADOS y CONCLUSIONES:

Microbiología farmacéutica I

UANCV - EAP:FYB

CONCLUSIONES: -

-

Por medio de esta práctica al investigar la teoría y realizar la preparación de un medio de cultivo, se logró la elaboración adecuada de los mismos, así como la selección apropiada para el uso que se les dará posteriormente a los medios del método de esterilización que eliminaría los restos microbianos que pudiesen haber quedado en el medio de cultivo ya que si existe alguno de estos, ya no sería adecuado para el uso que se le pudiera llegar a dar. Por último, se aprendió a envolver correctamente los medios de cultivo y que estos cuando se almacenan en cajas de petri deben colocarse inversamente para evitar su deshidratación por evaporación y de esta manera no tener que desechar las muestras.

CUESTIONARIO: 1 -

Cuáles son los constituyentes de los medios de cultivo? COMPONENTES DE UN MEDIO DE CULTIVO Sales inorgánicas Fuentes de carbohidratos Reguladores de crecimiento Vitaminas Aminoácidos Complejos orgánicos Reguladores de crecimiento vegetales Antioxidantes Material de soporte Agua

Microbiología farmacéutica I

2

UANCV - EAP:FYB

Mencione los medios de cultivo que no deben esterilizarse al autoclave.

En el caso del medio TCBS, no se autoclava porque algunos de sus componentes se degradan con la temperatura de autoclave, como la bilis de buey. Además, el medio TCBS es un medio altamente selectivo, es hipersalino y con pH muy alcalino. Solamente sobreviven bacterias halo y alcalinotolerantes, como las bacterias del género Vibrio, así que no se necesita esterilizar porque su riesgo de contaminación es muy bajo.

El medio Agar SS en su composición tiene productos que se degradan con el calor. En estos casos se esteriliza por filtración a través de filtros de 0.22 micrones. Bibliografía.

1

Microbiología Clínica. Módulo 1. Taxonomía y Fisiología Microbiana. Recolección y transporte de muestras para el diagnóstico de infecciones. AAM- Colegio de Bioquímicos de la Provincia de Entre Ríos- Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas Universidad Nacional del Litoral. 1997.

Microbiología farmacéutica I 2

3

4

UANCV - EAP:FYB

Microbiología Clínica. Módulo 2. Procesamiento inicial de las muestras para el diagnóstico mocrobiológico. AAM- Colegio de Bioquímicos de la Provincia de Entre Ríos- Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas Universidad Nacional del Litoral. 1997 Díaz Martín GA. Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico. Medios de cultivo. Apuntes. Segundo curso: Laboratorio de Diagnóstico Clínico Unidad Temática 14-1, Bloque temático III. 2004-2005. Vullo D, Waschman M, Alche L. Microbiología en práctica. Manual de técnicas de laboratorio para la enseñanza de la microbiología básica y aplicada. Ed. Atlante. 2000. Cap. 7, 47-50.