PCR Y ELECTROFORES ELECTROFORESIS IS
Brayan V Paternina, Oscar C Novoa, José S Támara.
[email protected],
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RESUMEN
ABSTRACT
En este informe de laboratorio, se
In this this la labo bora rato tory ry repo report rt,, the the resu resultltss
muestran los resultados obtenidos en el
obtained in the PCR and electrophoresis
proceso de PCR y electroforesis, donde
process are found, where the presence of
se ev evid iden enci cia a la pr pres esen enci cia a de ADN ADN de
DNA of different species is evidenced, a
diferentes especies, ya que se obtuvieron
large number of copies of the fragment of
un gran número de copias del fragmento
interest are obtained, which conclude this;
de interés, que nos permitió concluir esto;
pig
se encontró ADN de cerdo y humano,
differ dif ferent entiat iated ed by the ref refere erence nce pri primer merss
diferenciados
and the the spec ecifific ic bas base pair irss that that are
por
los
primers
de
and
human
DNA
refe refere renc ncia ia y lo loss re resp spec ectiv tivos os pa pare ress de
modified during practice.
bases obtenidos durante la práctica.
Keyw Ke ywor ords ds:: Primers.
Pala Pa labr bras as cl clav aves es:: elec electr trof ofor ores esis is,, PC PCR, R, Primers.
1
were
El Elec ectr trop opho hore resi sis, s,
found,
PC PCR, R,
INTRODUCCIÓN
(PCR,
por
sus
siglas
en
inglés),
desarrollada por Kary Mulliliss y que
La gran gran co comp mple lejijida dad d de los los pr proc oces esos os
revolucionó la biología molecular y la forma
biológicos en los seres vivos ha sido por
en
años la razón por la que los investigadores
cómo
nucleicos
han centrado su atención en descifrar los
se
estudiaban
en
ese
los ácidos
momento(1).
La
implementación de la reacción en cadena
mecanismos que se esconden detrás de
de la polimerasa (PCR), es una técnica
esos proc rocesos(1 s(1), para lo cual han
muyy util mu utiliz izad ada a en el la labo bora rato tori rio o co con n el
nece ne cessitita ado una ser erie ie de pr proc oce eso soss y
obje ob jetitivo vo de am ampl plifi ifica carr un frag fragme ment nto o de
técnicas que facilitan el estudio y la calidad
ADN millones de veces en la misma del mismo de las diferentes muestras de
secu se cuen enci cia a de nucl nucleó eótitido do con con el uso uso de
ADN evaluadas en el laboratorio, así como
cebadores en ciclos repetitivos entre unas
la calidad de estos estudios. Varios grupos
30 y 40 ve vece ces, s, pe perm rmiti itien endo do el post poster erio ior r
de investigadores han mostrado un gran
análisis
interés por desarrollar métodos sensibles y reproducibles
que
les
estand est andari arizar zar
pro protoc tocolo oloss
los
experi experimen mental tales es
dirigidos
al
pro roto toccolo loss
estudio
del
muestra
según
los
métodos
de
evaluación
de
los
resultados obtenidos en mediante PCR se puede utilizar la electroforesis, mediante la
como co mo han han ido ido ap apar arec ecie iend ndo o di dife fere rent ntes es cu cuyo yoss
la
requerimien reque rimientos tos del investiga investigador(2) dor(2). Entre
permitan
para estudiar los ácidos nucleicos. Es así
tec tecno nollog ogía íass
de
cual podemos separar fragmentos de ADN
es está tán n
y ARN en función de su tamaño,
ADN;
visualizarlos mediante una sencilla tinción,
probablemente, la más importante sea la
y de esta forma determinar el contenido de
re reac acci ción ón en ca cade dena na de la poli polime mera rasa sa
ácidos nucleicos de una muestra, teniendo 2
una un a es estitima maci ción ón de su co conc ncen entr trac ació ión n y grad grado o de ente entere reza za.. Pode Podemo moss ad adem emás ás
METODOLOGÍA
extraer del gel los fragmentos de ADN que
1. Se pr prep epaaró la mez mezcl claa pa parra PCR sean se an de inte interé rés, s, para para post poster erio iorm rmen ente te
(master mix).
utilizarlos en diferentes aplicaciones(3). La
idea de utilizar la técnica de electroforesis
Se prepararon los reactivos y materi mat eriale aless nec necesa esario rioss pa para ra el
a tr trav avés és de un una a matr matriz iz par para analiz alizar ar
número
mue mu est stra rass de ADN cor orre resp spo ond nde e a Vin Vin
de
muestras
que
Thor Th orne ne,, un bi bioq oquí uími mico co de dell In Inst stititut uto o de
fuer fueron on proc proces esad adas as,, má máss un
Virología de Glasgow, quien a mediados
cont co ntro roll po posi sititivo vo y un cont contro roll negativo.
de los años 60 del pasado siglo estaba inte intere resa sado do en ca cara ract cter eriz izar ar la lass di dist stin inta tass
Se
marcaron
los
tubos
formas de ADN que se obtenían de
Eppe Ep pend ndo orf a util utiliz izar ar con el
partículas purificadas de polyomavirus. Su
rótulo correspondiente.
razonamiento era que una combinación de
Se calc calcul uló ó la ca cant ntid idad ad de la
fuerzas eléctricas y de fricción permitiría el
mezcla de PCR necesaria para
despla des plazam zamien iento to y se separ parac ación ión en funció función n
el
dell ta de tama maño ño o to topo polo logí gía a de di dife fere rent ntes es
reac reacci cion ones es,, ca cada da un una a co con n un
moléculas de ADN. Éste es exactamente el
volumen final de 25 uL.
principio en que se basa la electroforesis
número
3
de
Se llenó el formato de reactivos para master mix:
de ácidos nucleicos(3).
deseado
MEZCLA DE REACCIÓN Reactivos
Con
tubos de reacción.
Con final
inicial Agua
filtrada -
Se di dist stri ribu buye yero ron n 22 uL en lo loss 4
Se adicionaron 3 uL de agua estéril para preparar el control negativo o
-
blanco reactivo.
estéril
2. Adi Adició ción n de la m mue uestr straa de ADN ADN.. Buffer de PCR
5x
1x
Se tran transf sfiri irier eron on lo loss tubo tuboss a la
NaCl2
25mM
1.5mM
zona estipulada para siembra de
dNTP’s
2mM
0.2mM
muestras.
Cebador 2For
10mM
0.5mM
Cebador
10mM
0.5mM
Se adic adicio iona naro ron n 3 uL de cada cada muestra a cada tubo y se mezcló.
504Rev
Se adicionaron 3 uL de control
Taq Polimerasa 5u/uL
1.25u
positivo de ADN al último tubo
ADN
-
para preparar el control positivo
-
de reacción.
Se Prep Prepar aró ó la me mezc zcla la de PCR PCR de
3. Rea Reacci cción ón de aampl mplifi ificac cación ión..
acue ac uerd rdo o al cálc cálcul ulo o re real aliz izad ado o co con n
acomodaron los tubos en el bloque.
todos los reactivos y en el orden
indicado en la tabla.
Se encendió EL termociclador y se
El programa denominado gyrB lepto presentó el perfil térmico:
Se Mezcló bien la master mix
4
Tris- Base 2.7 gramos
Cicl Etapas
Temper Tiempo(
os
atura
Ácido Bórico 1.37 gramos gramos
EDTA 0.5 M pH 8.0 1 ml
min)
(°C) 1
Desnaturali
94
2. Se mezclaron los reactivos en un beaker
2
de vidrio con un volumen inicial de 30 ml
zación inicial Desnaturali 35
1
3. Cuando se disolvieron los reactivos se 94
0.30
aforó el volumen a 50 mL y se almacenó
zación
con la concentración 5X hasta su uso.
Alineación
58
0.30
4. Con la concentración de trabajo de 5X
Extensión
72
48
se hizo una dilución a una concentración
Extensión
72
de 0.5X con un volumen final de 310 mL
5
que fue utilizado en la cámara de
final
elec electr trof ofor ores esis is y prep prepar arac ació ión n del del ge gell de agarosa de la siguiente manera: Los productos de PCR se analizaron en
una un a elec electr trof ofor ores esis is en ge gell de ag agar aros osa a al
31
ml
del
buffer
TBE
a
concentración 5x
1.5% a 80Voltios por 60min.
PREPARACIÓN DEL BUFFER TBE 5x
279 ml de agua destilada
5. Se agitó vigorosamente y se rotuló con
1. Para la preparación de 50 mL de TBE a
la concentración de trabajo de 0.5 X.
una un a co conc ncen entr trac ació ión n de tr trab abaj ajo o de 5X se agregan los siguientes reactivos:
5
buffer cubrió por lo menos un milímetro por encima del gel.
PREPARACIÓN DEL GEL DE AGAROSA
5. Se prepararon las muestras de ADN en papel
1. Se pesaron 1.8 gramos de agarosa y en una probeta se midió un volumen de
parafinado
de
la
siguiente
manera:
100 ml de TBE a la concentración de
tr trab abaj ajo o 0. 0.5 5 X. Se Co Colo loca caro ron n esto estoss
3 uL de buffer de carga (buffer green).
reactivos en un recipiente de vidrio de
5 de la muestra de ADN.
200 ml y se calentó solución hasta que
6. Se Sembraron las muestras de ADN en
se diso disolv lvió ió la ag agar aros osa a ev evita itand ndo o que que
cada pozo del gel de agarosa.
hirviera.
2. Se
Ensambló
la
cámara
de
7. Lo Loss el elec ectr trod odos os se co cone nect ctar aron on de la
electr ele ctrofo ofores resis is y los pe peine iness don donde de se
cámara de electroforesis a la fuente de
realizó el gel de agarosa.
poder de acuerdo a los colores
3. Cuando el recipiente que contenía la agarosa
bajó
de
tempera rattura
in indi dica cado dos. s. Se en ence cend ndió ió la fuen fuente te de
se
poder y se corrieron las muestras a un
adicionaron 3 uL de gelstar, se
voltaje de 90 V durante 35 minutos.
dispensó la agarosa en la cámara con
8. El gel se trasladó al transiluminador de
los peines. Y se dejó solidificar.
lu luzz ul ultr trav avio iole leta ta pa para ra vi visu sual aliz izar ar lo loss
4. Se Colocó el plato con el gel en el
resu resultltad ados os ob obte teni nido dos; s; se gu guar ardó dó un
tanque de electroforesis que contenía
registro fotográfico del gel de agarosa
buffer TBE 0.5x y se retiró el peine. El
con el fotodocumentador.
6
amarillo, rojo, azul y naranja corresponden a
las
muestras
1,2,3,4,5
y
6
respectivamente.
RESULTADOS
De acuerdo a los valores obtenidos en la figura 1 y comparándolos con la tabla 2, se puede saber a qué especie corresponde cada muestra; se obtuvo que:
Muestra 1: corresponde a perro.
Muestra 2: corresponde a vaca.
Muestra 3: corresponde a humano.
Muestra 4: corresponde a carnero.
Muestra 5: corresponde a cerdo.
Muestra 6: corresponde a carnero.
Figura Fig ura 1: Res Result ultado ados s ob obten tenido idos s en la electrofor elect roforesis esis (marc (marcació ación n de band bandas). as). Cuadro Cua dro mor morad ado: o: mar marcad cador; or; cu cuadr adro o gri gris: s: control contr ol posit positivo; ivo; cuad cuadro ro turqu turquesa, esa, verde verde,,
ESPECIE
PRIMER
BANDA
Humano
Human
334
741f Tabl Ta bla a 1. Va Valo lore res s de re refe fere renc ncia ia
Perro
Dog 368f
680
Cerdo
Pig 573f
453
Carnero
Goat 894f
132
Vaca
Cow 121f
561
Primer vertebrados
7
Fi Figu gura ra 2: La mu mues estr tra a de es este te in info form rme e corresponde al número 5, es decir, a la muestra de cerdo lo que correspondería a un
tamaño
de
453pb.
Al
hacer
comparación con la figura 1, la muestra obte ob teni nida da se serí ría a un una a ap apro roxi xima maci ción ón a la encerrada de color amarillo.
En la PCR, la reacción se somete
ANALISIS La reacción en cadena de la polimerasa
repetidamente a un ciclo de cambios de
(PCR) es una técnica de laboratorio común
temperatura que permiten la producción de
utilizada para hacer muchas copias de una
muchas copias de la región blanco.
región particular de ADN. La PCR depende
Por lo general, el objetivo de la PCR es
de una ADN polimerasa termoestable (la
producir suficiente ADN de la región blanco
Taq polimerasa), y requiere de cebadores
para pa ra qu que e pu pued eda a an anal aliz izar arse se o us usar arse se de
de ADN diseñados específicamente para la
alguna otra manera. Por ejemplo, el ADN
región de ADN de interés.
amplificado por PCR se puede secuenciar,
8
vi vissual aliz izar ar
gel.
Para la realización de la electroforesis se
Habi Ha bitu tual alme ment nte, e, los los re resu sultltad ados os de un una a
ut utililiz izó ó un co cont ntro roll ne nega gatitivo vo y un co cont ntro roll
reacción de PCR se visualizan (se hacen
positivo. El control positivo es un tubo que
visibles) al usar electroforesis en gel.(4)
contiene ADN de una muestra que se haya
La electroforesis en geles de agarosa o
amplificado adecuadamente y cuyo patrón
poliacrilamida es una de las metodologías
de bandas es conocido. De esta manera,
más utilizadas en el laboratorio en todo lo
pued pu ede e es espe pera rars rse e qu que, e, si la reac reacci ción ón se
re rela laci cion onad ado o con el tr trab abaj ajo o con con ác ácid idos os
llevó a cabo correctamente, esta muestra
nucl nu clei eico cos. s.
el elec ectr trof ofor ores esis is
si siem empr pre e sa salg lga. a. En caso caso co cont ntra rari rio, o, si el
podemo pod emoss sep separa ararr fra fragme gmento ntoss de ADN y
PCR no generó bandas en ninguna de las
ARN
tamaño,
muestras, ni siquiera en el control positivo,
visualizarlos mediante una sencilla tinción,
puede suponerse que el error radica en
y de esta forma determinar el contenido de
que se olvidó agregar algún ingrediente o
ácidos nucleicos de una muestra, teniendo
bien que los ciclos de temperatura no se
una un a es estitima maci ción ón de su co conc ncen entr trac ació ión n y
llevaron a cabo adecuadamente, ya sea
grad grado o de ente entere reza za.. Pode Podemo moss ad adem emás ás
por problemas de la máquina o bien por
extraer del gel los fragmentos de ADN que
error al elegir el programa de amplificación.
sean se an de inte interé rés, s, para para post poster erio iorm rmen ente te
(5)
utilizarlos utiliz arlos en dif diferent erentes es aplicac aplicaciones iones.. La
El control negativo se trata de una muestra
electroforesis en geles de agarosa es el
en
método estándar para separar y purificar
compon com ponent entes es de la rea reacci cción ón,, exc except epto o el
fragmentos de ADN cuando no se requiere
DNA.. el contro DNA controll neg negati ativo vo se utiliz utiliza a para para
un alto poder de resolución .(3)
comprobar
en
por por
ele lect ctro rofo fore ressis
Me Medi dian ante te
función
la
de
su
en
9
la
que
se
que
incluyen
ninguno
todos
de
los
los
componentes
de
la
reacción
está
ante an teri rior orme ment nte, e, po porr otro otro la lado do,, el cont contro roll
contaminado con DNA de otra procedencia
negativo
y que que no se ha han n pr prod oduc ucid ido o er erro rore ress de
contaminación presente en las muestras .
manejo
(6)
que
hayan
provocado
la
contaminación cruzada entre muestras.(6)
nos
indica
que
no
hubo
CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos fueron producto
Teniendo
de la comparación entre los valores (pares
en
cuenta
lo loss
resultados
obtenidos en esta práctica de laboratorio,
de base ses) s) de refe refere ren nci cia a de dis istitin nta tass
se pude concluir que las muestras
especies ya conocidas (Tabla 1. Valores
pr pres ese entan ntan
mí mín nim ima a
co cont ntam amin ina aci ció ón,
la
de ref refere erenci ncia a Pri Primer mer ver verteb tebrad rados) os),, y los muestra 3 corresponde a fragmentos de
re resu sultltan ante tess du dura rant nte e la pr prác áctitica ca.. Es Esta ta
gene ge ness hu huma mano no,, la mu mues estr tra a nu nume mero ro 5
comparación nos permitió saber a qué tipo
pert pe rten enec ece e a frag fragme ment ntos os de ge gene ness de
de especie pertenecía cada muestra, cabe
cerdo, y la muestra numero 2 corresponde
acla ac lara rarr que es esto toss valo valore ress no fu fue ero ron n
a fragmentos de genes de vaca.
exactos, sino una aproximación al valor de
Los controles positivos y negativos se usan
referencia ya conocido. Teniendo entonces
con el fin de comprobar que la reacción se
así que la muestra 1 pertenece a perro, la
haya dado de manera adecuada y que no
muestra 2 corresponde a vaca, la muestra
haya
4 y 6 pertenecen a carnero, la muestra 5 a
contaminación
respectivamente.
cerdo y la muestra numero 3 corresponde a hu huma mano no.. Grac Gracia iass al cont contro roll posi posititivo vo,, podemos interferir que la reacción se llevó a cabo correctamente, como se mencionó 10
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12
