Informe de Laboratorio n3

 

 

PCR Y ELECTROFORES ELECTROFORESIS IS

Brayan V Paternina, Oscar C Novoa, José S Támara. [email protected], [email protected], [email protected]  [email protected]

RESUMEN

ABSTRACT

En este informe de laboratorio, se

In this this la labo bora rato tory ry repo report rt,, the the resu resultltss

muestran los resultados obtenidos en el

obtained in the PCR and electrophoresis

proceso de PCR y electroforesis, donde

process are found, where the presence of 

se ev evid iden enci cia a la pr pres esen enci cia a de ADN ADN de

DNA of different species is evidenced, a

diferentes especies, ya que se obtuvieron

large number of copies of the fragment of 

un gran número de copias del fragmento

interest are obtained, which conclude this;

de interés, que nos permitió concluir esto;

pig

se encontró ADN de cerdo y humano,

differ dif ferent entiat iated ed by the ref refere erence nce pri primer merss

diferenciados

and the the spec ecifific ic bas base pair irss that that are

por

los

primers

de

and

human

DNA

refe refere renc ncia ia y lo loss re resp spec ectiv tivos os pa pare ress de

modified during practice.

bases obtenidos durante la práctica.

Keyw Ke ywor ords ds:: Primers.

Pala Pa labr bras as cl clav aves es:: elec electr trof ofor ores esis is,, PC PCR, R, Primers.

1

were

El Elec ectr trop opho hore resi sis, s,

found,

PC PCR, R,

 

INTRODUCCIÓN

(PCR,

por

sus

siglas

en

inglés),

desarrollada por Kary Mulliliss y que

La gran gran co comp mple lejijida dad d de los los pr proc oces esos os

revolucionó la biología molecular y la forma

biológicos en los seres vivos ha sido por 

en

años la razón por la que los investigadores

cómo

nucleicos

han centrado su atención en descifrar los

se

estudiaban

en

ese

los ácidos

momento(1).

La

implementación de la reacción en cadena

mecanismos que se esconden detrás de

de la polimerasa (PCR), es una técnica

esos proc rocesos(1 s(1), para lo cual han

muyy util mu utiliz izad ada a en el la labo bora rato tori rio o co con n el

nece ne cessitita ado una ser erie ie de pr proc oce eso soss y

obje ob jetitivo vo de am ampl plifi ifica carr un frag fragme ment nto o de

técnicas que facilitan el estudio y la calidad

 ADN millones de veces en la misma del mismo de las diferentes muestras de

secu se cuen enci cia a de nucl nucleó eótitido do con con el uso uso de

 ADN evaluadas en el laboratorio, así como

cebadores en ciclos repetitivos entre unas

la calidad de estos estudios. Varios grupos

30 y 40 ve vece ces, s, pe perm rmiti itien endo do el post poster erio ior  r 

de investigadores han mostrado un gran

análisis

interés por desarrollar métodos sensibles y reproducibles

que

les

estand est andari arizar zar

pro protoc tocolo oloss

los

experi experimen mental tales es

dirigidos

al

pro roto toccolo loss

estudio

del

muestra

según

los

métodos

de

evaluación

de

los

resultados obtenidos en mediante PCR se puede utilizar la electroforesis, mediante la

como co mo han han ido ido ap apar arec ecie iend ndo o di dife fere rent ntes es cu cuyo yoss

la

requerimien reque rimientos tos del investiga investigador(2) dor(2).  Entre

permitan

para estudiar los ácidos nucleicos. Es así

tec tecno nollog ogía íass

de

cual podemos separar fragmentos de ADN

es está tán n

y ARN en función de su tamaño,

ADN;

visualizarlos mediante una sencilla tinción,

probablemente, la más importante sea la

y de esta forma determinar el contenido de

re reac acci ción ón en ca cade dena na de la poli polime mera rasa sa

ácidos nucleicos de una muestra, teniendo 2

 

una un a es estitima maci ción ón de su co conc ncen entr trac ació ión n y grad grado o de ente entere reza za.. Pode Podemo moss ad adem emás ás

METODOLOGÍA

extraer del gel los fragmentos de ADN que

1. Se pr prep epaaró la mez mezcl claa pa parra PCR sean se an de inte interé rés, s, para para post poster erio iorm rmen ente te

(master mix).

utilizarlos en diferentes aplicaciones(3).  La

 

idea de utilizar la técnica de electroforesis

Se prepararon los reactivos y materi mat eriale aless nec necesa esario rioss pa para ra el

a tr trav avés és de un una a matr matriz iz par para analiz alizar  ar 

número

mue mu est stra rass de ADN cor orre resp spo ond nde e a Vin Vin

de

muestras

que

Thor Th orne ne,, un bi bioq oquí uími mico co de dell In Inst stititut uto o de

fuer fueron on proc proces esad adas as,, má máss un

Virología de Glasgow, quien a mediados

cont co ntro roll po posi sititivo vo y un cont contro roll negativo.

de los años 60 del pasado siglo estaba inte intere resa sado do en ca cara ract cter eriz izar ar la lass di dist stin inta tass

 

Se

marcaron

los

tubos

formas de ADN que se obtenían de

Eppe Ep pend ndo orf a util utiliz izar ar con el

partículas purificadas de polyomavirus. Su

rótulo correspondiente.

razonamiento era que una combinación de

 

Se calc calcul uló ó la ca cant ntid idad ad de la

fuerzas eléctricas y de fricción permitiría el

mezcla de PCR necesaria para

despla des plazam zamien iento to y se separ parac ación ión en funció función n

el

dell ta de tama maño ño o to topo polo logí gía a de di dife fere rent ntes es

reac reacci cion ones es,, ca cada da un una a co con n un

moléculas de ADN. Éste es exactamente el

volumen final de 25 uL.

principio en que se basa la electroforesis



número

3

de

Se llenó el formato de reactivos para master mix:

de ácidos nucleicos(3).

deseado

 

MEZCLA DE REACCIÓN Reactivos

Con



tubos de reacción.

Con final

inicial  Agua

filtrada -

Se di dist stri ribu buye yero ron n 22 uL en lo loss 4



Se adicionaron 3 uL de agua estéril para preparar el control negativo o

-

blanco reactivo.

estéril

2. Adi Adició ción n de la m mue uestr straa de ADN ADN.. Buffer de PCR

5x

1x 

Se tran transf sfiri irier eron on lo loss tubo tuboss a la

NaCl2

25mM

1.5mM

zona estipulada para siembra de

dNTP’s

2mM

0.2mM

muestras. 

Cebador 2For

10mM

0.5mM

Cebador 

10mM

0.5mM

Se adic adicio iona naro ron n 3 uL de cada cada muestra a cada tubo y se mezcló.

504Rev 

Se adicionaron 3 uL de control

Taq Polimerasa 5u/uL

1.25u

positivo de ADN al último tubo

 ADN

-

para preparar el control positivo

-

de reacción. 

  Se Prep Prepar aró ó la me mezc zcla la de PCR PCR de

3. Rea Reacci cción ón de aampl mplifi ificac cación ión.. 

acue ac uerd rdo o al cálc cálcul ulo o re real aliz izad ado o co con n

acomodaron los tubos en el bloque.

todos los reactivos y en el orden 

indicado en la tabla. 

Se encendió EL termociclador y se

El programa denominado gyrB lepto presentó el perfil térmico:

Se Mezcló bien la master mix

4

 

Tris- Base 2.7 gramos

Cicl Etapas

Temper   Tiempo(



os

atura



 Ácido Bórico 1.37 gramos gramos



EDTA 0.5 M pH 8.0 1 ml

min)

(°C) 1

Desnaturali

94

2. Se mezclaron los reactivos en un beaker 

2

de vidrio con un volumen inicial de 30 ml

zación inicial Desnaturali 35

1

3. Cuando se disolvieron los reactivos se 94

0.30

aforó el volumen a 50 mL y se almacenó

zación

con la concentración 5X hasta su uso.

 Alineación

58

0.30

4. Con la concentración de trabajo de 5X

Extensión

72

48

se hizo una dilución a una concentración

Extensión

72

de 0.5X con un volumen final de 310 mL

5

que fue utilizado en la cámara de

final

elec electr trof ofor ores esis is y prep prepar arac ació ión n del del ge gell de agarosa de la siguiente manera: Los productos de PCR se analizaron en 

una un a elec electr trof ofor ores esis is en ge gell de ag agar aros osa a al

31

ml

del

buffer

TBE

a

concentración 5x

1.5% a 80Voltios por 60min. 

PREPARACIÓN DEL BUFFER TBE 5x

279 ml de agua destilada

5. Se agitó vigorosamente y se rotuló con

1. Para la preparación de 50 mL de TBE a

la concentración de trabajo de 0.5 X.

una un a co conc ncen entr trac ació ión n de tr trab abaj ajo o de 5X se agregan los siguientes reactivos:

5

 

buffer cubrió por lo menos un milímetro por encima del gel.

PREPARACIÓN DEL GEL DE AGAROSA

5. Se prepararon las muestras de ADN en papel

1. Se pesaron 1.8 gramos de agarosa y en una probeta se midió un volumen de

parafinado

de

la

siguiente

manera:

100 ml de TBE a la concentración de



tr trab abaj ajo o 0. 0.5 5 X. Se Co Colo loca caro ron n esto estoss

3 uL de buffer de carga (buffer  green).

reactivos en un recipiente de vidrio de



5 de la muestra de ADN.

200 ml y se calentó solución hasta que

6. Se Sembraron las muestras de ADN en

se diso disolv lvió ió la ag agar aros osa a ev evita itand ndo o que que

cada pozo del gel de agarosa.

hirviera.

2. Se

Ensambló

la

cámara

de

7. Lo Loss el elec ectr trod odos os se co cone nect ctar aron on de la

electr ele ctrofo ofores resis is y los pe peine iness don donde de se

cámara de electroforesis a la fuente de

realizó el gel de agarosa.

poder de acuerdo a los colores

3. Cuando el recipiente que contenía la agarosa

bajó

de

tempera rattura

in indi dica cado dos. s. Se en ence cend ndió ió la fuen fuente te de

se

poder y se corrieron las muestras a un

adicionaron 3 uL de gelstar, se

voltaje de 90 V durante 35 minutos.

dispensó la agarosa en la cámara con

8. El gel se trasladó al transiluminador de

los peines. Y se dejó solidificar.

lu luzz ul ultr trav avio iole leta ta pa para ra vi visu sual aliz izar ar lo loss

4. Se Colocó el plato con el gel en el

resu resultltad ados os ob obte teni nido dos; s; se gu guar ardó dó un

tanque de electroforesis que contenía

registro fotográfico del gel de agarosa

buffer TBE 0.5x y se retiró el peine. El

con el fotodocumentador.

6

 

amarillo, rojo, azul y naranja corresponden a

las

muestras

1,2,3,4,5

y

6 

respectivamente. 

RESULTADOS

De acuerdo a los valores obtenidos en la figura 1 y comparándolos con la tabla 2, se puede saber a qué especie corresponde cada muestra; se obtuvo que: 

Muestra 1: corresponde a perro.



Muestra 2: corresponde a vaca.



Muestra 3: corresponde a humano.



Muestra 4: corresponde a carnero.



Muestra 5: corresponde a cerdo.



Muestra 6: corresponde a carnero.

Figura Fig ura 1:  Res Result ultado ados s ob obten tenido idos s en la electrofor elect roforesis esis (marc (marcació ación n de band bandas). as). Cuadro Cua dro mor morad ado: o: mar marcad cador; or; cu cuadr adro o gri gris: s: control contr ol posit positivo; ivo; cuad cuadro ro turqu turquesa, esa, verde verde,,

ESPECIE

PRIMER

BANDA

Humano

Human

334

741f  Tabl Ta bla a 1. Va Valo lore res s de re refe fere renc ncia ia

Perro

Dog 368f

680

Cerdo

Pig 573f

453

Carnero

Goat 894f

132

Vaca

Cow 121f

561

Primer vertebrados

7

 

Fi Figu gura ra 2: La mu mues estr tra a de es este te in info form rme e corresponde al número 5, es decir, a la muestra de cerdo lo que correspondería a un

tamaño

de

453pb.

Al

hacer 

comparación con la figura 1, la muestra obte ob teni nida da se serí ría a un una a ap apro roxi xima maci ción ón a la encerrada de color amarillo.

En la PCR, la reacción se somete

ANALISIS La reacción en cadena de la polimerasa

repetidamente a un ciclo de cambios de

(PCR) es una técnica de laboratorio común

temperatura que permiten la producción de

utilizada para hacer muchas copias de una

muchas copias de la región blanco.

región particular de ADN. La PCR depende

 Por lo general, el objetivo de la PCR es

de una ADN polimerasa termoestable (la

producir suficiente ADN de la región blanco

Taq polimerasa), y requiere de cebadores

para pa ra qu que e pu pued eda a an anal aliz izar arse se o us usar arse se de

de ADN diseñados específicamente para la

alguna otra manera. Por ejemplo, el ADN

región de ADN de interés.

amplificado por PCR se puede secuenciar,

8

 

vi vissual aliz izar ar

gel.

Para la realización de la electroforesis se

Habi Ha bitu tual alme ment nte, e, los los re resu sultltad ados os de un una a

ut utililiz izó ó un co cont ntro roll ne nega gatitivo vo y un co cont ntro roll

reacción de PCR se visualizan (se hacen

positivo. El control positivo es un tubo que

visibles) al usar electroforesis en gel.(4)

contiene ADN de una muestra que se haya

La electroforesis en geles de agarosa o

amplificado adecuadamente y cuyo patrón

poliacrilamida es una de las metodologías

de bandas es conocido. De esta manera,

más utilizadas en el laboratorio en todo lo

pued pu ede e es espe pera rars rse e qu que, e, si la reac reacci ción ón se

re rela laci cion onad ado o con el tr trab abaj ajo o con con ác ácid idos os

llevó a cabo correctamente, esta muestra

nucl nu clei eico cos. s.

el elec ectr trof ofor ores esis is

si siem empr pre e sa salg lga. a. En caso caso co cont ntra rari rio, o, si el

podemo pod emoss sep separa ararr fra fragme gmento ntoss de ADN y

PCR no generó bandas en ninguna de las

 ARN

tamaño,

muestras, ni siquiera en el control positivo,

visualizarlos mediante una sencilla tinción,

puede suponerse que el error radica en

y de esta forma determinar el contenido de

que se olvidó agregar algún ingrediente o

ácidos nucleicos de una muestra, teniendo

bien que los ciclos de temperatura no se

una un a es estitima maci ción ón de su co conc ncen entr trac ació ión n y

llevaron a cabo adecuadamente, ya sea

grad grado o de ente entere reza za.. Pode Podemo moss ad adem emás ás

por problemas de la máquina o bien por 

extraer del gel los fragmentos de ADN que

error al elegir el programa de amplificación.

sean se an de inte interé rés, s, para para post poster erio iorm rmen ente te

(5)

utilizarlos utiliz arlos en dif diferent erentes es aplicac aplicaciones iones.. La

El control negativo se trata de una muestra

electroforesis en geles de agarosa es el

en

método estándar para separar y purificar 

compon com ponent entes es de la rea reacci cción ón,, exc except epto o el

fragmentos de ADN cuando no se requiere

DNA.. el contro DNA controll neg negati ativo vo se utiliz utiliza a para para

un alto poder de resolución .(3)

comprobar

en

por por

ele lect ctro rofo fore ressis

Me Medi dian ante te

función

la

de

su

en

9

la

que

se

que

incluyen

ninguno

todos

de

los

los

 

componentes

de

la

reacción

está

ante an teri rior orme ment nte, e, po porr otro otro la lado do,, el cont contro roll

contaminado con DNA de otra procedencia

negativo

y que que no se ha han n pr prod oduc ucid ido o er erro rore ress de

contaminación presente en las muestras .

manejo

(6)

que

hayan

provocado

la

contaminación cruzada entre muestras.(6)

nos

indica

que

no

hubo

CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos fueron producto

Teniendo

de la comparación entre los valores (pares

en

cuenta

lo loss

resultados

obtenidos en esta práctica de laboratorio,

de base ses) s) de refe refere ren nci cia a de dis istitin nta tass

se pude concluir que las muestras

especies ya conocidas (Tabla 1. Valores

pr pres ese entan ntan

mí mín nim ima a

co cont ntam amin ina aci ció ón,

la

de ref refere erenci ncia a Pri Primer mer ver verteb tebrad rados) os),, y los muestra 3 corresponde a fragmentos de

re resu sultltan ante tess du dura rant nte e la pr prác áctitica ca.. Es Esta ta

gene ge ness hu huma mano no,, la mu mues estr tra a nu nume mero ro 5

comparación nos permitió saber a qué tipo

pert pe rten enec ece e a frag fragme ment ntos os de ge gene ness de

de especie pertenecía cada muestra, cabe

cerdo, y la muestra numero 2 corresponde

acla ac lara rarr que es esto toss valo valore ress no fu fue ero ron n

a fragmentos de genes de vaca.

exactos, sino una aproximación al valor de

Los controles positivos y negativos se usan

referencia ya conocido. Teniendo entonces

con el fin de comprobar que la reacción se

así que la muestra 1 pertenece a perro, la

haya dado de manera adecuada y que no

muestra 2 corresponde a vaca, la muestra

haya

4 y 6 pertenecen a carnero, la muestra 5 a

contaminación

respectivamente.

cerdo y la muestra numero 3 corresponde a hu huma mano no.. Grac Gracia iass al cont contro roll posi posititivo vo,, podemos interferir que la reacción se llevó a cabo correctamente, como se mencionó 10

en

la

prueba

 

4.

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11

 

12