Informe de laboratorio. Biotecnologia vegetal.docx

INFORME: LABORATORIO DE BIOTECNOLOGIA Y VIVERO (SEMILLA)

CAMILO ALEJANDRO CORREGIDOR FONSECA

TECNICO EN PRESERVACION DE RECURSOS NATURALES FIRAVITOBA (BOY) SENA- CEDEAGRO 2013

INFORME: LABORATORIO DE BIOTECNOLOGIA Y VIVERO (SEMILLA)

CAMILO ALEJANDRO CORREGIDOR FONSECA

INFORME DE LABORATORIO

ING. OMAR ARIEL CAMARGO GONZALEZ

TECNICO EN PRESERVACION DE RECURSOS NATURALES FIRAVITOBA (BOY) SENA-CEDEAGRO 2013

PREAMBULO

En los procedimientos de cultivo descritos hasta la década de los ochenta, no se hace ninguna referencia al control ambiental en el desarrollo de las plantas in vitro. Sin embargo, las tasas de crecimiento, desarrollo y muchas de las características fisiológicas y morfológicas de las plantas formadas in vitro están influenciadas por el ambiente físico, químico y gaseoso de los recipientes. El incremento de conocimientos acerca del control ambiental del cultivo de tejidos en condiciones estériles, está provocando una evolución de las distintas técnicas empleadas en la microopropagacion de plantas. El ambiente in vitro en recipientes con baja tasa de ventilación presenta unas tasas bajas de flujo de materia y energía, con mínimas variaciones de temperatura, elevada humedad relativa y grandes cambios diarios de la concentración de CO2 en el interior de los recipientes. El tipo de recipiente de cultivo (tamaño, forma, material y sistema de cierre) puede condicionar la evolución de la composición gaseosa en su interior durante el período de cultivo. Ante los distintos factores de estrés que tienen que soportar durante las fases de la microopropagacion las plantas producidas en recipientes con nulo o escaso intercambio gaseoso, pueden manifestar alteraciones o déficit en cuanto a su estructura anatómica, morfológica y fisiológica. Como consecuencia, estas plantas presentan un fenotipo incapaz de sobrevivir al transplante directo al invernadero o campo. Actualmente se pueden utilizar diferentes métodos para controlar el ambiente en las distintas fases de la microopropagacion, ya sean cultivos heterótrofos, mixótrofos o autótrofos. La elección de la mejor estrategia va a depender de varios factores, destacando la especie, el número de transplantes requerido y la relación calidad precio entre otros.

INTRODUCCION

El cultivo in vitro, microopropagacion o propagación vegetal in vitro, es el cultivo de células, tejidos u órganos de plantas en un medio aséptico que le aporta los nutrientes necesarios para su desarrollo. En este medio y con algunas condiciones físicas y químicas apropiadas, las células tienen la habilidad de desarrollarse, desdiferenciarse, producir metabolitos, multiplicarse y hasta regenerar un organismo entero" en cuyo caso, la nueva planta será genéticamente idéntica a la planta madre, y su desarrollo se dará en un periodo de tiempo mucho más corto. Así pues, para lograr cualquiera de estos propósitos se debe iniciar con la utilización de pequeñas muestras de tejidos vegetales (explante) que tras una adecuada desinfección superficial, son transferidos asépticamente a medios nutritivos líquidos o semisólidos y almacenados bajo condiciones ideales de temperatura y fotoperíodicidad que garanticen un rápido desarrollo. Los medios de cultivo, líquidos o semisólidos, difieren básicamente por la presencia de un gelificante, contienen carbohidratos como fuente de carbono y energía (generalmente sacarosa), sumado a minerales, vitaminas, aminoácidos, suplementos orgánicos y en muchos casos fitohormonas o compuestos sintéticos conocidos como reguladores de crecimiento, son mensajeros químicos vegetales secretados en un determinado tejido y que actúan en el mismo tejido, o en otro distinto de la planta y por ello, se les considera biocatalizadores junto con los enzimas y las vitaminas. Las hormonas vegetales pertenecen a cinco grupos cada uno de los cuales exhibe propiedades fuertes de regulación del crecimiento en plantas y pueden ser activos a muy bajas concentraciones dentro de la planta, estos grupos son: Auxinas, Citoquininas, Giberelinas, Acido Abscísico y Etileno.

OBJETIVO GENERAL

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Esta práctica busca el conocimiento e implementación de algunas técnicas básicas del cultivo de tejidos vegetales.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

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Inducir desdiferenciación tisular en explantos provenientes de diferentes tejidos vegetales. Acelerar el crecimiento de plantas utilizando medios nutritivos suplementado con fitohormonas. Desarrollar el protocolo de tratamiento y desinfección de semillas. Implementar el manejo adecuado de semillas en laboratorio y vivero. Conocer la utilidad y el manejo del equipo básico, instrumentos y herramientas de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales.

EXPLANTE

Varios factores deben ser tenidos en cuenta en la elección del explante apropiado para el establecimiento de los cultivos in vitro, entre ellos: OBJETIVO DEL CULTIVO Si bien es difícil tratar de clasificar las aplicaciones que se persiguen con el cultivo de tejidos, se podría esquematizarlas en aplicaciones para: • Estudios básicos. En este caso, los explantes cultivados pueden ser diversos. Si lo único que se quiere lograr es un sistema de callos para estudiar algún proceso fisiológico, se puede cultivar cualquier órgano, tejido o célula viva. En este caso en que lo único que se busca es la inducción de callos, lo ideal es cultivar explantes jóvenes, derivados de semillas en germinación, donde se obtienen respuestas rápidas y, en general, hay menores problemas de contaminación con microorganismos. A veces se hace uso del cultivo de tejidos porque representa un sistema experimental que simplifica la complejidad generada por los fenómenos de correlación entre las distintas partes que normalmente están presentes en una planta entera. El explante que se usará estará condicionado por lo que se quiere estudiar. Ej: Lulo de la selva. • Obtención de plantas con sanidad controlada. Es muy común la utilización del cultivo de tejidos para la obtención de plantas libres de virus. El explante ideal para ello es el meristema (dependiendo de la especie, de 0,2-0,5mm de longitud) consistente del domo y de un par de primordios foliares. • Micropropagación. En este caso dependerá del sistema que se quiere utilizar. Si lo que se quiere explotar es la brotación de meristemas, los ápices terminales y los segmentos uninodales de ramas jóvenes constituyen excelentes explantes. En este caso el cultivador de tejidos debe conocer perfectamente la biología de la reproducción de la planta para aprovechar aquellos explantes que en forma natural son propágulos. En cambio, si se pretende micropropagar mediante el empleo de semillas sintéticas) el explante original deberá posibilitar la inducción de la embriogénesis somática. En este caso, la utilización de embriones zigóticos inmaduros u hojas, suelen ser frecuentes como explantes. • Obtención de híbridos interespecíficos. Una de las primeras aplicaciones del cultivo de tejidos en la agricultura lo constituyó su empleo como ayuda para la obtención de híbridos derivados de cruzamientos interespecíficos, donde se produce el aborto temprano de embriones. En estos casos, el explante cultivado es el embrión cigótico en estadios tempranos de su desarrollo. Con la misma finalidad también se utilizan ovarios u óvulos fecundados. • Obtención de plantas de semillas con embriones rudimentarios. Para esta finalidad los explantes pueden ser semillas (por ej. orquídeas) o bien, se aíslan los embriones en un estado temprano de desarrollo («corazón») como en el caso de yerba mate o de algunas variedades de duraznero. • Obtención de plantas haploides (considerando como haploide a un esporofito que contiene el complemento gamético de cromosomas). En este caso, los explantes más utilizados son las anteras, aunque también pueden emplearse microsporas aisladas, óvulos y ovarios no fertilizados. • Inducción de variación somaclonal. En este caso se pueden utilizar varios explantes, pero si la finalidad de su utilización es la aplicación en planes de mejoramiento genético de plantas, los explantes utilizados deben posibilitar la regeneración de plantas enteras.

• Producción y/o conversión de sustancias útiles. Se puede utilizar una gran variedad de explantes. Los de raíces suelen ser muy utilizados. • Obtención de híbridos somáticos. Para esta finalidad se recurre a la fusión de protoplastos. En la mayoría de los casos se aíslan los protoplastos de mesófilos de hojas y de suspensiones celulares. • Conservación e intercambio de germoplasma. Los meristemas son los explantes preferidos para el desarrollo de sistemas de conservación a mediano y largo plazo (críoconservación con nitrógeno líquido) y para el intercambio de material genético. • Establecimiento de suspensiones celulares. En este caso se recomienda iniciar los cultivos a partir de explantes extraídos de semillas en germinación (hipocótilo, epicótilo, cotiledones, raíces). POSIBILIDAD DE CONTAMINACION CON MICROORGANISMOS.

De ser posible, se deben cultivar explantes de plantas donantes que crecen en condiciones de invernadero, con ello se reduce sustancialmente las tasas de contaminación. Por otra parte, es recomendable evitar el uso de «explantes sucios» (raíces, rizomas) que provienen de plantas crecidas en macetas o en el campo, dado que en la mayoría de los casos no es posible conseguir una buena desinfección de los mismos. EDAD FISIOLOGICA

Este es un aspecto de gran influencia en la morfogénesis. Como regla general se puede decir que cuando más joven e indiferenciado se encuentre el explante a cultivar, mejor será su respuesta in vitro. Es por ello que los meristemas apicales y axilares son ampliamente usados en numerosas especies. En el caso de la micropropagación de plantas leñosas, la edad del explante es un factor crítico. Si los tejidos son jóvenes, la micropropagación tiene mayores posibilidades de ser exitosa que con tejidos maduros. Este hecho genera la necesidad de realizar tratamientos de rejuvenecimiento de las plantas donantes de explantes.

TAMAÑO En general, cuanto más grande sea el explante mayores serán las posibilidades de inducir la proliferación de callos o la regeneración directa de órganos. Sin embargo, a mayor tamaño de explante también son mayores las probabilidades de que los cultivos se contaminen con microorganismos. También es necesario tener en cuenta que existe un tamaño mínimo del explante, que depende de la especie y del material vegetal, por debajo del cual no es fácil lograr el establecimiento de los cultivos. Los explantes muy pequeños suelen requerir del empleo de medios más complejos o de los denominados medios acondicionados. EPOCA DEL AÑO

Es un factor que suelen tener mucha importancia en la microopropagacion y que generalmente está asociado al grado de dormición que presentan ciertos explantes (yemas, por ejemplo) y también con la posibilidad de mayor o menor proliferación de microorganismos.

ASEPCIA

Uno de los principales problemas que se presentan cuando se tratan de establecer los cultivos es el de la contaminación de los mismos con diversos tipos de microorganismos (hongos, levaduras, bacterias, fitoplasmas, virus). El ambiente generado por explante medio de cultivo condiciones físicas de incubación es altamente propicio para la proliferación de muchos de estos microorganismos que pueden provocar la destrucción de los cultivos. Es difícil cuantificar el impacto de estas pérdidas, pero en promedio, en laboratorios dedicados a la micropropagación se lo puede estimar en alrededor del 10%. En el mejor de los casos, estos microorganismos no destruyen los cultivos pero compiten con el explante por los nutrientes del medio de cultivo o bien lo modifican. Es muy difícil conseguir cultivos estrictamente asépticos dado que en la mayoría de los casos es altamente probable que los mismos contengan virus y fitoplasmas, por lo que en la práctica, cuando se refiere a cultivos asépticos, en general se quiere significar que son cultivos donde no se produce la proliferación de hongos y bacterias.

MEDIOS DE CULTIVO Un medio de cultivo puede ser definido como una formulación de sales inorgánicas y compuestos orgánicos requeridos para la nutrición y manipulación de los cultivos. Existen numerosas formulaciones, cada una de las cuales comprende entre 6 y 40 compuestos. Para dar una idea de la cantidad de formulaciones disponibles, George y col, luego de revisar más de 3.000 trabajos científicos describen en dos tomos (casi 1.000 páginas en total) más de 2.000 medios de cultivo. También dos empresas multinacionales ofrecen para la venta más de 60 medios cada una, listos para su utilización especialmente en la micropropagación comercial de plantas. En la siguiente tabla se presentan tres medios que son muy usados en la actualidad. Básicamente, los medios de cultivo se componen de compuestos que suministran: • Una fuente de carbono • Nutrientes minerales • ·Sustancias vitamínicas • Sustancias reguladoras del crecimiento • Agente gelificante (en el caso de medios semisólidos)

CONDICIONES AMBIENTALES PARA LA INCUBACION La incubación de los cultivos se debe llevar a cabo en condiciones controladas. Por lo menos en lo que se refiere a temperatura, calidad e intensidad de luz, fotoperíodo, humedad atmosférica e higiene. Estas condiciones se logran con el empleo de cámaras climatizadas o cuartos especialmente preparados con aire acondicionado (frío-calor) y una buena y uniforme circulación de aire en el interior y dotados de un buen sistema de alarma para cortar la iluminación en caso de no funcionar el aire acondicionado. En general, los cultivos son incubados a temperatura constante de 25-28 ºC, con ciclo de luz/oscuridad de 16/8horas. La luz es generalmente provista por lámparas fluorescentes del tipo «luz día» con una irradiancia de entre 50 y 200μmol m-2s-1. La humedad atmosférica debe ser elevada (80- 90%). ACLIMATACION DE LAS PLANTAS REGENERADAS IN VITRO Durante el período de incubación, los cultivos son expuestos a condiciones ambientales disímiles al ambiente externo. La atmósfera interna se caracteriza por presentar una

considerable variación diurna en la concentración de CO2, humedad relativa elevada, temperatura constante e intensidad lumínica baja. A su vez, el medio de cultivo compuesto por concentraciones elevadas de azúcares (en aquellos sistemas heterótrofos y semiautótrofos de micropropagación), sales y reguladores del crecimiento, sumado a la ausencia de microorganismos, generan anormalidades morfológicas, anatómicas y fisiológicas que las plantas deberán corregir cuando son transferidas al ambiente externo. Este período de adaptación al nuevo hábitat es llamado fase o etapa de aclimatación. La estrategia a implementarse durante el mencionado ciclo deberá contemplar el control minucioso de los parámetros ambientales (humedad, temperatura y luz) de tal manera que permita disminuir la deshidratación y, al mismo tiempo, estimular la fotosíntesis con el objeto de generar un rápido crecimiento de los plantines. El retraso en el desarrollo de la cutícula y la escasa funcionalidad del aparato estomático que presentan las hojas de la mayoría de las especies cultivadas in vitro, determinan una alta tasa de transpiración que puede ocasionar la muerte por deshidratación.

PROCEDIMIENTO

Preparación de los medios de cultivo: Para esta práctica se deben preparar y esterilizar bajo condiciones de calor húmedo (15 psi/ 121 ºC/ 20 minutos) los siguientes medios de cultivo: 1.Inducción de callos: preparar 60 ml de MS (pH: 5.7-5.8), suplementado con sacarosa (3%), vitaminas, agar (0.8%) y sin reguladores de crecimiento (medio control) y 60 ml de medio control enriquecido con las condiciones hormonales descritas por la instructora. Se sugiere relación auxina:citoquinina (1:1 o 2:1) 2.Crecimiento: preparar 60 ml de MS (pH: 5.7-5.8), enriquecido con sacarosa (3%), vitaminas, gar (0.8%) y sin reguladores de crecimiento (medio control) y 60 ml de medio control enriquecido con las condiciones hormonales descritas por el profesor. Se sugiere relación auxina:citoquinina (1:1 o 1:2) 3. Proceso de desinfección del material vegetal: Una vez lavado el material vegetal con agua y jabón, se sumerge inicialmente en etanol (70%, 2 min) y posteriormente en 50 ml hipoclorito de sodio (2%, 15 min.). Pasado este período de tiempo, de elimina el desinfectante, se hacen tres lavados consecutivos (5 min. cada uno), se transfiere en condiciones estériles a los medios de cultivo y se almacena bajo condiciones controladas de temperatura y fotoperiodicidad.

SEGUIMIENTO A REALIZAR EN LA PRÁCTICA

1. Revisar los cultivos de tejidos vegetales y anotar los avances que estos presenten, incluyendo aparición de callos, contaminaciones, organogénesis y aumento en longitud o tamaño. 2. Realizar subcultivos rutinarios y continuar el desarrollo de estos.

Manual de laboratorio de Biotecnología NORMAS DE SEGURIDAD PARA LA UTILIZACIÓN DEL ESPACIO EN PRÁCTICAS DE LABORATORIO

*Use bata de laboratorio para cada práctica y no utilice calzado destapado *Use guantes, tapaboca, lentes de protección, y máscara con filtros, cuando se requieran. *No pipetee con la boca, use un pipeteador *No se lleve los dedos a la boca, ojos o nariz, ni respire directamente sobre ningún reactivo pues sus vapores pueden ser tóxicos *No ingiera alimentos o bebidas en el laboratorio *No use durante las prácticas anillos, cadenas, prendedores, pulseras o collares *No deposite alimentos en las neveras, ni consuma el hielo que allí se produce *No se admiten en el laboratorio personas que no estén matriculadas en el respectivo curso, por favor no reciba visitas *No ubique bolsos, tulas, maletines o paquetes, en los lugares de trabajo.

UTILIZACIÓN DE REACTIVOS *Todo reactivo preparado debe rotularse con el nombre del reactivo, la persona que lo preparó y la fecha de preparación *No arroje por los sumideros ácidos, bases o algún otro reactivo, por favor depositelos en los recipientes de desecho *Evite derrames de sustancias en las mesas de trabajo, así se previene que algún compañero se queme la piel o se deteriore la ropa. *No arroje al piso ningún reactivo *No arroje al piso papeles u otros elementos. Por favor utilice el recipiente para la basura.

VENTAJAS

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A partir de un individuo de alto vigor genético se pueden obtener miles de descendientes en un mismo periodo. La propagación se realiza independientemente de las condiciones ambientales. Es el método más eficaz para la obtención de plantas totalmente libres de enfermedades. Producto del saneamiento y rejuvenecimiento que provoca el cultivo in vitro se aumenta el rendimiento en un 20% a un 40%. Permite en el campo ciclos productivos sincrónicos que facilitan la planificación de las actividades de siembra y cosecha.

GLOSARIO

Auxinas: Grupo de hormonas vegetales (naturales o sintéticas), que producen elongación celular, y en algunos casos división celular; frecuentemente inducen la aparición de raíces adventicias e inhiben el desarrollo de yemas adventicias (en los vástagos). Ejemplo el ácido 2,4diclorofenoxiacético (2,4-D) Citoquininas: Grupo de hormonas vegetales (naturales o sintéticas), que inducen la división celular y frecuentemente la formación yemas adventicias (en los vástagos). En la mayor parte de los casos inhiben el desarrollo de raíces adventicias. Las citoquininas disminuyen la dominancia apical. Ejemplo: 6-benzilaminopurina (BA). Callo: Tejidos no organizados, formados por células diferenciadas y no diferenciadas, que se dividen de forma activa y que generalmente se originan en zonas dañadas (por heridas), o en cultivo de tejidos.

BIBLIOGRAFIA

farmacia.udea.edu.co/~fsegura/tejidos.zip Dodds J.H., Roberts L.W., 1985, Somatic embryogenesis, En: Experiments in Plant Tissue Cultura, Cambridge University Press, 122-132. Montoya H. L. M., 1991, Cultivo de tejidos vegetales. Universidad Nacional de Colombia, Seccional Medellín. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Departamento de Agronomía. Murashige T., Skoog F., 1962, A revised médium for rapid growth and bioassays with tobacco tisuee cultures, Physiol. Plant., 15:473-97 Pierik R.L.M., 1990, Cultivo in vitro de las plantas superiores. Ediciones MundiPrensa, Madrid.

ANEXOS