Download Informe de Inmovilizacion de Enzimas...
“DETERMINACIÓN EXPERIMENTAL DE LAS CONDICIONES DE OPERACIÓN
PARA EL PROCESO DE HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE ALMIDÓN DE YUCA NATIVA DE LA REGIÓN AMAZÓNICA EN LA CIUDAD CIUD AD DE LETICIA
Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ingeniería Departamento de Ingeniería Química Bogotá D.C. 2010” Juan P. Escamilla, Paula T. Fernández, Karen Ka ren B. Guerrero, Ana X. Salamanca
[email protected] ,
[email protected], karen.guerrero@ estudiantes.uamerica.edu.co
[email protected]
INFORME DE ARTICULO CIENTIFICO Departamento de Ingeniería Química, Universidad de América, Bogotá, Colombia conformacionales de la enzima, pero
FUENTE:
por otra parte se hace indispensable
MATRIZ:
el uso de un biocatalizador por factores como la alta retención de
Matriz de Alginato de Calcio Para el sistema de inmovilización, se
actividad por defecto de la baja tasa de transferencia y la perdida de
eligió el método de atrapamiento en
enzima por efecto de la geométrica
resina polimérica mediante la matriz
esférica que limita la presencia de
de alginato de calcio, porque ofrece
sustrato en el núcleo por efecto del
que el procedimiento sea aún más
espesor de la capa.
fácil,
además
ofrece
una
alta
estabilidad de la enzima inmovilizada y
no
altera
las
características
El estudio que se realizado, lo que busco fue manipular la geometría y
las características físicas de la matriz
El método de inmovilización utilizado
de inmovilización.
se preparó en dos etapas:
Como se muestra en la figura No.1 la PRIMERA ETAPA
matriz de inmovilización tipo coraza núcleo AZE, consta de una serie de biocatalizadores
que
se
acoplan
geométricamente a él. En este se introdujo: Núcleo inerte de algin alginato ato de calcio
(Merck para inmovilización) que es recubierto con una lámina de
Pr Prod oduc ucci ción ón de un núcleo compue núcleo compuesto sto por 3% (w/v) de algi algina nato to de calc calcio io (Merck para inmovilización)geli ficadas en 0,5 M CaCl Ca Cl dura durant nte e 16 168 8 hora horass ut utili iliza zand ndo o la metodología propuesta por (S (Ser erra rato to B 20 2004 04). ).
alginato de calcio-material zeolítico que contiene la enzima.
Tabla No.1
SEGUNDA ETAPA Cubrimiento de dell núcleo con una lámina de alginato de calcio, material zeolítico y enzi enzima ma (A (AZE ZE). ). Pa Para ra esta esta lá lámi mina na la solu soluci ción ón ut utililiz izó ó una concentración de enzima y alginato de calcio del 25% y del 3% (w (w//v) re resp spec ecttiv ivam amen entte, por su parte tres (3) concentraciones de zeo eolilitta fuer fueron on pr prob obad ada as para para la lass enzi enzima mass GC62 GC626 6 (α 57amilasa) y GZYMER 480 (glucoamilasa) que fueron de 0%,1%,2% y 3% (w/v) en 50 mL de solución la cual fue llevada a volumen con agua desionizada y esterilizada.
Etapas del método de
inmovilización .
Figura No.1 Método
de inmovilización de tipo coraza núcleo AZE.
Figura
No.2
Metodología de inmovilización, biocatalizador tipo coraza núcleo AZE.
El proceso de recubrimiento con de la
grupo de enzimas que degradan el
lámina
almidón,
AZE,
se
llevó
al
cabo
los
glicógenos
y
los
mediante la inmersión del núcleo en
oligosacáridos de manera aleatoria
la solución AZE a cada concentración
liberando grupos de sacáridos de
de zeolita y enzima (AIC0A, AIC1A, AIC2A, AIC3A, AIC0G, AIC1G,
menor peso molecular.
AIC2G, AIC3G), posteriormente el núcleo
esférico
recubierto
es
introducido en una solución de CaCl al 0,5 M por un periodo de 15 minutos donde
la
lámina
es
finalmente
gelificada. Con el fin de mantener el biocatalizador
hidratado
y
α amilasas: La α amilasa es una
de
las
más
populares industria,
importantes
amilasas esta
de
se
y la
encuentra
distribuida a lo largo del reino
en
condiciones de máxima esterilidad, el catalizador coraza-núcleo AZE es introducido en una solución de buffer de acetato al 0.05 M que contiene 0.0006 M de CaCl2, debidamente clasificadas y almacenados a 4 °C. [1]
animal, microbiano y de las plantas. Comercialmente se produce extracelularmente por medio de varios microorganismos como Aspergillus niger, A. oryzae, Bacillus
amyloliquefaciens,
Bacillus lichemiformis, Bacillus stearothermophilus,
ENZIMA:
los
cuales
son fácil manipulables tanto en
Amilasa de la familia de las
sus condiciones de cultivo como
hidrolasas: Catalizan las reacciones
en sus características genéticas,
de
ofreciendo así una diversa serie
hidrólisis
del
almidón
son
proteínas. Cumplen con una función
de
específica dentro del metabolismo.
proporcionan
Estas están compuestas por cadenas
características
o ensambles de polipéptidos que
específicas como los rangos de
poseen una actividad catalítica en
pH y temperatura.
forma nativa. Las amilasas son el
condiciones a
que las
le
enzimas
funcionales
un ritmo menor, sin embargo la gran
ventaja que tiene frente a sus
Glucoamilasas:
Esta
amilasa
producida por un hongo fue la
homologas
es
la
de
tener
la
capacidad de transformar el almidón
tercera enzima amilolítica descubierta después de la α y la
completamente a glucosa.
β amilasa.
INMOVILIZACION
ENZIMA
ENZIMATICA
Durante el proceso de inmovilización
de
enzimas por adsorción
FUNCION:
no covalente sobre un soporte, se presentan
La finalidad de la inmovilización
cambios significativos del
enzimática es la producción de
microambiente sobre el
azúcares fermentables a partir de
cual la enzima actúa, lo que ocasiona una alta
almidón de yuca amazónica nativa en un proceso en el cual se confina o localiza a la enzima en una región definida del espacio, para dar lugar a
Inmovilización por solvatación que tienen Adsorción
lugar entre las moléculas enzimáticas y el solvente que las rodea. Estas fuerzas
nativas
que
una forma insoluble que retiene su
mantienen la solvatación
actividad catalítica permitiendo su
pueden
reutilización varias veces. Existen varios métodos de inmovilización. cataliza la hidrólisis sucesiva de los enlaces α 1-4 de los glucanos finales
llegar
a
ser
perturbadas provocando un proceso de desorción del soporte sobre la enzima La
inmovilización
covalente de la enzima
no reducidos, lo que produce la β -D-
en un soporte puede
glucosa como un producto de la
tener efectos físicos y/o Inmovilización por químicos que modifican
hidrólisis lo que indica que es una
Enlaces covalentes la enzima y dependen de
enzima de tipo invertida que presenta
la naturaleza física y/o
una exo-acción. Este tipo de enzima
química
también hidroliza los enlaces α 1 -6 a
del
soporte
usado. En general los enlaces
covalentes
tienen
una membrana de (1-
como
100 µm.)
característica general la irreversibilidad
de
los
enlaces enzima-soporte, la rigidez conformacional de la enzima debido al ataque multipunto y la alteración de la entidad química producto de las modificación
químicas
experimentadas por la reacción,
Estos métodos utilizan precursores compatibles con las moléculas enzimáticas formando la membrana de atrapamiento durante el Atrapamiento proceso de inmovilización lo que le confiere a la enzima un estado de retención física o de interacción de enlaces covalente. Tabla No.2 Clases de inmovilización.
estas
características alteran el
1. Inmovilización por Adsorción. El
comportamiento enzimático en sectores como la actividad, la selectividad
y
estabilidad
la del
biocatalizador. Por otro lado las variables críticas
solución
de
enzima
en
contacto con una superficie adsorbente porosa, durante ese instante la enzima se une al
comportamiento de la
soporte por presencia de diferentes
enzima inmovilizada son:
interacciones físicas y químicas
la enzima y el soporte,
como: fuerzas iónicas, fuerza de
valores
van der Waals y puentes de
de
temperatura, usado
e
pH, buffer
inhibitorios
hidrogeno,
(Doran
1998;
presentes en el medio Consiste en la
Katchalski-Katzir 1993) lo que promueve la interacción entre
preparación
enzima - interface sólida – sustrato
de
una
proporción de enzimas que pueden estar en de enzimas
una
que podrían favoreces el
tiempo de reacción entre
Encapsulamiento
procedimiento se realiza al llevar
estado
disuelto
liofilizado
y
durante la reacción.
o son
enclaustradas física o químicamente
con
esferas semipermeables de polímero que poseen
2. Inmovilización
por
enlaces
covalentes. fundamenta su trabajo en la formación de fuertes enlaces
covalentes entre la enzima y el soporte. En general los enlaces covalentes son formados por la reacción química entre un residuo de amino acido (AAR) localizado en la superficie de la enzima y una función activa que es unida a la
4. Atrapamiento. consiste en el confinamiento
de
las
enzimas
sobre una matriz en la cual los componentes del catalizador han sido
dispersados
(enzimas
solubles o insolubles) en un medio
superficie del soporte.
fluido
(solución
generalmente)
polimérica
generando
una
mezcla soluble que por acción de
3. Encapsulamiento de enzimas. Consiste en la en la formación de un tipo de membrana física en forma de barrera alrededor de una preparación distingue atrapamiento
enzimática del por
y
método el
tipo
se de de
encapsulamiento realizado y el numero simultaneo de enzimas retenidas.
un precursor como la irradiación, la foto activación o la iniciación química, formando una membrana permeable que captura las enzimas de manera química o física.
VENTAJAS Y DESVENTAJAS:
VENTAJAS
DESVENTAJAS
Fácil extracción de lla a enzima del producto final.
Problemas de transferencia de masa debido al diámetro de
poro
Posible utilización en sistemas
Reutilización del biocatalizador.
de
la
Disminución en la actividad catalítica.
Mayor concentración de enzima
Posible
por unidad de volumen. resistencia
alteración
a
temperatura, concentración de concentración
de
la
conformación de la enzima
las
respecto a su estado natural.
condiciones de operación (pH, sustrato,
tamaño
Mayor
al
partícula.
continuos.
o
La gran heterogeneidad del
sistema enzima -soporte donde
de
puede
producto).
existir
distintas
de
proteína
Mayor control del proceso.
fracciones
Aumento de la estabilidad del
inmovilizadas con un diferente
número de uniones al soporte.
biocatalizador. Disminución de los costos de
La
Posibilidad de utilizar distintas configuraciones y modos de
del
biocatalizador es más costosa
proceso.
preparación
que con la enzima libre. Diferentes gradientes
de
producción (por lotes, continuo,
concentración del sustrato en la
etc.)
partícula inmovilizada.
VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE INMOVILIZACION POR ADSORCION:
TIPO DE
FACTORES QUE
MATERIAL UTILIZADO
AFECTAN LA INMOVILIZACION
Soportes
pH del medio
inorgánicos
VENTAJAS Fácil
(control de la carga de la
Resinas de
superficie).
Presencia de
iones.
Caolinita
Gel de
Solventes en
el medio.
adsorción. Los derivados
enzimática.
obtenidos son
Los derivados
poco estables
poro.
Polímeros
Bentonita
controlan la
especificidad
No hay
Diámetro de
iónico neutrales
parámetros que
cambios en la
de los
Económico.
Fuerza iónica.
intercambio
La estabilización
preparación.
Minerales
DESVENTAJAS
son estables
desde el punto de
en medios de
vista mecánico.
trabajo con
fosfato de
bajo contenido
calcio
de agua.
La unión al
soporte es débil. Altas
Vidrio poroso
concentraciones
Alúmina
de sal o sustrato
Carbón
pueden generar desorción de la
Sílica / Sílica
proteína.
gel
Cambios
conformacionales de la estructura de las proteínas.
VENTAJAS
Y
DESVENTAJAS
DE
INMOVILIZACION
POR
ATRAPAMIENTO:
TIPO DE MATERIAL UTILIZADO Pre polímeros
FACTORES QUE AFECTAN LA
VENTAJAS
DESVENTAJAS
INMOVILIZACION Control de las
Mayor resistencia
Sustrato con
fotoentrecruzab
condiciones de
de la enzima a las
moléculas de bajo
les.
polimerización.
diferencias de
peso molecular.
Poliacrilamida.
Colágeno.
del polímero en
Alginato.
la solución.
Carraginato O resina de
Problemas por
resistencia a la
Mayor resistencia
de la enzima a las
difusión a través
Control de pH.
gradientes de
de la matriz que
Control de
concentración.
repercute en
calor.
Concentración
temperatura.
poliuretano.
de los
volumen de
solventes
matriz.
soporte con el medio utilizado.
Reutilización del biocatalizador.
Conocimiento
Disminución de la
actividad enzimática por
Aumento de vida media de la
unidad.
enzima.
de no afectar la proteína.
Reacción del
del grupo activo con el fin
cinéticas.
enzimas por
Concentración
utilizados.
diferencias
Mayor volumen de
La enzima no
Precipitación de la
sufre ninguna
proteína por efecto
alteración en su
del solvente.
estructura.
[1] Tesis DETERMINACIÓN EXPERIMENTAL DE LAS CONDICIONES DE OPERACIÓN PARA EL PROCESO DE HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE ALMIDÓN DE YUCA NATIVA DE LA REGIÓN AMAZÓNICA EN LA CIUDAD DE LETICIA, WILHER ANDRÉS VILLADA PINILLA Ingeniero Químico Universidad Nacional de Colombia Bogotá D.C. http://www.bdigital.unal.edu.co/3882/1/293752.2010.pdf
2010;
