INFORME DE BIOQUIMICA-IDENTIFICACIÓN DE PROTEINAS-2013-1

FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL. 2013

UNIVERSIDAD CONTINENTAL

NOTA: TITULO:

PRACTICA DE BIOQUIMICA: “IDENTIFICACIÓN DE PROTEINAS” INTEGRANTES:

CODIGO:

 Barrera Aliaga Rocío……………………………….. 2011205335  Curipaco Gamarra Ángela………….……………….2012118946  López Rojas Richard Pool…………………………..2010204122  Rojas Hinostroza Katty………………………………2011119117  Sinche Castillón Iván Teófilo………………………..2010200173  Veli Seguil Katherine,………………………………..2010204818 SECCIÓN: BI 1003

2013-I COMENTARIO:……………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ……………………………………………

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FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL. 2013 INDICE OBJETIVOS .......................................................................................................................................4 GENERAL: .............................................................................................................................. 4 ESPECIFICO: ........................................................................................................................... 4 MARCO TEORICO ...........................................................................................................................5 MATERIALES Y METODOS ...........................................................................................................8 METODOS .........................................................................................................................................9 PROCEDIMIENTO ............................................................................................................................9 EXPERIMENTO 1 “COAGULACIÓN DE LAS PROTEÍNAS” ..................................... 9 EXPERIMENTO 2 “ADICION DE SACAROSA” .......................................................... 10 EXPERIMENTO 3 “FACTOR pH” .................................................................................. 11 EXPERIMENTO 4 “PRUEBA DE BIURET”.................................................................. 11 EXPERIMENTO 5 “PRUEBA DE LA DESNATURALIZACION DE LA CASEINA” 12 RESULTADO E INTERPRETACION (CONCLUSION) ............................................................ 13 EXPERIMENTO 1 ............................................................................................................ 13 EXPERIMENTO 2 ............................................................................................................ 13 EXPERIMENTO 3 ............................................................................................................ 14 EXPERIMENTO 4 ............................................................................................................ 14 EXPERIMENTO 5 ............................................................................................................ 15 DISCUSION DE RESULTADO .................................................................................................... 16 EXPERIMENTO 1 ............................................................................................................ 16 EXPERIMENTO 2 ............................................................................................................ 16 EXPERIMENTO 3 ............................................................................................................ 16 EXPERIMENTO 4 ............................................................................................................ 17 EXPERIMENTO 5 ............................................................................................................ 17 CUESTIONARIO ............................................................................................................................ 19 BIBLIOGRAFIA ............................................................................................................................... 22 ANEXOS .......................................................................................................................................... 23

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INTRODUCCION Las proteínas intervienen en casi todas las propiedades que caracterizan a los seres vivos. Son las macromoléculas intracelulares más abundantes y se encuentran en todos los compartimientos de las células. Gracias a la acción de las proteínas, los seres vivos son capaces de producir miles de moléculas diferentes a partir de fotones solares, elementos y compuestos sencillos como O2, N2, H2O, NH3, CO2 y glucosa. Cada una de estas moléculas se sintetiza en el momento preciso y en la cantidad adecuada para que las células se adapten a las condiciones ambientales y se reproduzcan. En esta práctica de laboratorio realizaremos pequeños experimentos con tal reconocerlos a partir de sus propiedades que presentan, una de estas es que forman cadenas largas de proteínas dándole diferentes estructuras de diferentes niveles, las cuales son propensos a sufrir una desnaturalización (destrucción de sus estructuras secundarias y

terciarias), por agentes

químicos y también por la variación de temperatura y pH. Otra manera de reconocerlos es a partir de un reactivo el cual se activa cuando hay presencia de cadenas peptídicas que son uniones específicas entre los aminoácidos. El sulfato de cobre liberando el ion “Cu” el cual interactúa con los electrones libres de átomos “N” y tornando de color violeta a la muestra que se le agrega este reactivo, siempre y cuando se encuentre cadenas peptídicas.

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OBJETIVOS GENERAL:  Determinar pruebas de laboratorio que nos permitan el estudio de las propiedades

fisicoquímicas

de

las

proteínas,

así

como

su

identificación en cualquier espécimen biológico. ESPECIFICO:  Comprensión de las diferentes

estructuras que presentan las

proteínas y que son propensos a su destrucción mediante la modificación de temperatura y pH.  Usar un carbohidrato con el fin de retardar o acelerar la desnaturalización de la proteína al elevarle la temperatura.  Determinar la presencia de proteínas en la yema de huevo modificándole el factor pH.  Comprensión de pruebas químicas con la cual se puede cuantificar las pretinas, y también si se encuentra en dicho espécimen biológico.  Reconocimiento a través del rompimiento de su estructuras tridimensional específica, en este caso el de la caseína.

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FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL. 2013 MARCO TEORICO Una proteína es una macromolécula, (secuencia de aminoácidos la cual está unida por un enlace peptídico) de elevado peso molecular, aunque en la naturaleza exista una gran variedad de aminoácidos más de 300, pero solo 20 forman proteínas que difieren en tamaño, forma, carga, capacidad de formar puentes de hidrogeno o enlaces desulfuro y reactividad química. FUNCIONES CELULARES Los seres vivos presentan gran variedad de reacciones químicas para obtener y utilizar la energía contenida en los enlaces de las moléculas, en ausencia de un catalizador, estas reacciones se realizan a una velocidad inferior a la necesaria para cumplir con los requerimientos celulares, sin embargo, en el interior de las células un tipo particular de proteínas, las enzimas aceleran estas reacciones químicas para que se lleven a cabo a una velocidad compatible con las necesidades celulares. Las proteínas también transportan y regulan el flujo de moléculas y electrones a través de las membranas; de esta manera hacen posible la transmisión de información entre células y órganos. El papel de otras proteínas es estructural: determinan la estructura celular y la extracelular, y forman cabellos y tendones. El sistema inmunitario produce otro tipo particular de proteínas, los anticuerpos, capaces de distinguir a las moléculas propias de las ajenas. Además, las proteínas controlan la expresión de las actividades celulares mediante su unión a secuencias específicas del DNA. Son también los componentes principales de los músculos y de otros sistemas capaces de transformar la energía química de los alimentos en trabajo mecánico. Las proteínas también forman parte de los sensores que nos permiten ver, oír y degustar, entre otros.

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FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL. 2013 LAS PROTEINAS SON POLIMEROS DE ORIGEN GENETICO CON UNA COFORMACION ESPACIAL DEFINIDA Cada célula puede contener miles de proteínas diferentes cuya concentración depende de su función. Los seres humanos son capaces de sintetizar alrededor de 100 000 proteínas diferentes, y solo una pequeña fracción de estas se ha estudiado. La información necesaria para construir todas y cada una de estas cadenas se encuentra en el material genético de nuestras células el DNA. La información contenida del DNA es transformada por la maquinaria celular en la secuencia de aminoácidos de las proteínas. LAS PROTEINAS SON CADENAS DE L-AMINOACIDOS Las proteínas son polímeros lineales de aminoácidos unidos entre sí, mediante enlaces peptídicos. Hay un gran número de aminoácidos en la naturaleza; cientos de ellos son de origen biosintetico; sin embargo; solo 20 comunes en las proteínas de todos los seres vivos. EXTENSION Y VARIEDAD DE LAS CADENAS POLIPEPTIDICAS El termino proteína se aplica a los polipéptidos, generalmente mayores a 50 aminoácidos, capaces de adoptar una estructura tridimensional especifica. Algunas proteínas son sintetizadas en grandes cantidades limitadas durante periodos específicos. El tamaño de estas proteínas varía enormemente, entre 50 y 2500 aminoácidos, aunque la mayoría tienen entre 300 y 500. Hay proteínas monoméricas, formadas por una sola cadena, y proteínas oligomericas en las que la proteína funcional requiere la asociación no covalente de dos a más cadenas. El número de secuencias diferencias que se pueden generar a partir de la combinación de 20 aminoácidos es enorme. Por ejemplo, una cadena de 200 aminoácidos puede tener 20200 secuencias diferentes. Este número es mayor que el estimado de átomos en el universo (1079); esto requiere decir que solo una pequeña fracción de todas estas posibilidades se ha utilizado por las diferentes formas de vida que ha existido en el planeta.

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FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL. 2013 CONFORMACION ANTIVA DE LAS PROTEINAS La estructura covalente determina la libertad conformacional de los átomos en las moléculas. Polímeros sintéticos como el poliestireno, donde todas las moléculas tienen la misma estructura covalente, no adoptan una conformación tridimensional especifica; en una población de estas moléculas, cada una de ellas adopta una conformación diferente. En contraste, en una población de proteínas la misma estructura covalente, casi todas la macromoléculas en solución adoptan una conformación tridimensional semejante, con pequeñas variaciones llamada conformación nativa. La mejor prueba de esta homogeneidad estructural es la formación de cristales de proteína, donde miles de millones de moléculas idénticas forman un arreglo cristalino macroscópico. La formación de una red cristalina requiere que las moléculas presentes en todas las células unitarias del cristal adopten la misma conformación. A mediados del siglo XIX, se obtuvieron por primera vez cristales de una proteína, la hemoglobina.1 COAGULACIÓN DE LAS PROTEÍNAS Las proteínas debido al gran tamaño de sus moléculas forman con el agua soluciones coloidales que pueden precipitar formándose coágulos al ser calentadas a temperaturas superiores a 70ºC o al ser tratadas con soluciones salinas, ácidos, alcohol, etc. La coagulación de las proteínas es un proceso irreversible y se debe a su desnaturalización por los agentes indicados que al actuar sobre la proteína la desordenan por destrucción de sus estructuras secundaria y terciaria. PRUEBA DE BIURET La prueba de Biuret sirve para identificar cadenas polipeptídicas de más de tres residuos de aminoácidos. El cobre del reactivo de Biuret interacciona con los electrones libres de los átomos de nitrógeno de los aminoácidos dando un compuesto de color característico.

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En 1996, SUMNER fue el primero en cristalizar una enzima, la ureasa.

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FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL. 2013 MATERIALES Y METODOS RELACION DE REACTIVOS, MATERIALES

ETANOL

CUADRO DE LISTA DE MATERIALES CANTIDAD 2–2

OTROS MATERIALES

MATERIALES

CAPACIDAD

VASOS PRECIPITADO

250 ml, 100 ml

8

TUBOS DE ENSAYO

--------

1

GRADILLA

--------

4

PIPETAS

10 ml

1

BURETA

25 ml

1

PROPIPETA

---------

1

PICETA CON AGUA DESTILADA

---------

8

TIRAS DE PAPEL PANPHEA

8

-------

CANTIDAD

MATERIAL

1

Huevo

1

Limón

25 mL

Vinagre

25 mL

Leche

FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL. 2013 METODOS o

PAPEL PANPHEA:  Tomamos una tira de papel panphea y sumerjimos la parte de cuadritos de colores que tiene en un extremo y esperamos unos minutos.  Retiramos las tiras y observamos la coloracion que tomo cada una de los cuadritos y buscamos la secuencia de colores que tomo en la tabla.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTO 1 “COAGULACIÓN DE LAS PROTEÍNAS”

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FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL. 2013 EXPERIMENTO 2 “ADICION DE SACAROSA”

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FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL. 2013 EXPERIMENTO 3 “FACTOR pH”

EXPERIMENTO 4 “PRUEBA DE BIURET”

Fundamento: La prueba de Biuret sirve para identificar cadenas polipeptídicas de más de tres residuos de aminoácidos. El cobre del reactivo de Biuret interacciona con los electrones libres de los átomos de nitrógeno de los aminoácidos dando un compuesto de color característico.

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22 2

3 3

3

1. Prepare 3 tubos de ensayo y colocar en cada tubo 2 ml de diferentes soluciones proteicas.

2. Añadir en cada tubo 2ml de disolución de hidróxido sódico. Agitar y dejar caer cuatro o cinco gotas de una solución al 1% de sulfato de cobre. Ver los resultados.

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1

2

3

FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL. 2013

EXPERIMENTO 5 “PRUEBA DE LA DESNATURALIZACION DE LA CASEINA”

A

B

1.- ROTULE 2 TUBOS Y AGREGE LECHE A TEMPERATURA AMBIENTE

2.- EN EL TUBO “A” AGREGAR JUGO DE LIMON. 3.- EN EL TUBO “B” AGREGAR VINAGRE.

A

B 4.- AGITAR Y OBSERVAR TOMAR NOTA.

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FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL. 2013 RESULTADO E INTERPRETACION (CONCLUSION) EXPERIMENTO 1 “COAGULACIÓN DE LAS PROTEÍNAS”

 Como se pudo observar en el momento de la adición del HCl en el tubo B y el alcohol etílico en el tubo C la velocidad en que se coaguló fue mayor el tubo B.  La coagulación en el tubo a fue muy lenta aun cuando el agua estaba en su punto de ebullición este se coagulo después de 3 minutos. EXPERIMENTO 2 “ADICION DE SACAROSA”

 De acuerdo a lo observado llegamos a la siguiente conclusión, en la práctica de Adición de Sacarosa las proteínas reducen su temperatura de coagulación al añadir sacarosa elevando la velocidad de desnaturalización de estas.

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FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL. 2013 EXPERIMENTO 3 “FACTOR pH”

 De acuerdo a lo observado llegamos a la siguiente conclusión, en la práctica de factor pH no hubo casi nada de cambio ya que la muestra usada no contiene proteínas. EXPERIMENTO 4 “PRUEBA DE BIURET”

Resultado Se observó una reacción que produjo un color lila fuerte y en la base se formó unos trocitos de color azul. Se observó un cambio de color lila suave y en la base formo unos trocitos de color azul.

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FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL. 2013 EXPERIMENTO 5 “PRUEBA DE LA DESNATURALIZACION DE LA CASEINA”

A

Después de dejarlo reposar por unos minutos se llegó a formar grumos pequeños en la leche la cual se pudo distinguir, también se puso más fluido.

B

Después de unos minutos se observó la leche de color rosa, se pudo distinguir grumos pero muy poco, casi no se distinguía

 La leche presenta en su composición proteínas en este caso la caseína, esta al cambio de pH se desnaturalizo, el color del tubo “B” se debe al color del vinagre, también se puede decir que la leche presenta proteínas.  El jugo de limón y el vinagre presentan un pH acido la cual perturbo el pH de la leche haciendo que esta de coagule.

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FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL. 2013 DISCUSION DE RESULTADO EXPERIMENTO 1 “COAGULACION DE LAS PROTEINAS” Las cadenas de proteínas que presenta la clara del huevo se encuentran enrolladas adoptando una forma esférica. Las cuales son denominadas proteínas globulares. Al someterlo a temperaturas altas como a un baño maría, el calor hace que las cadenas de proteínas se desenrollen y se formen enlaces que unen unas cadenas con otras. Este cambio se denomina cambio de estructura o desnaturalización de las proteínas globulares. Como evidencia de esto podemos observar un cambio de color y un cambio en la consistencia de la clara del huevo. De la misma manera pasa cuando se le añade sustancias muy acidas las cuales modifican y rompen los enlaces de las proteínas, desnaturalizando, cambiando su estructura tridimensional a una más básica. EXPERIMENTO 2 “ADICION DE SACAROSA” Como sabemos la sacarosa está compuesta por una molécula de glucosa y otra de fructuosa, al aumentar la temperatura por acción de enzimas esta se descompone en (+)D-glucosa y ()D-fructuosa, la mezcla se llama “azúcar invertido”. En la aplicación de nuestro experimento se usó la sacarosa en solución, como vimos en los resultados este disminuyo la temperatura de ebullición, elevando así la velocidad en que las proteínas se desnaturalizaran. A una alta concentración de azucares corresponde a una disminución de la actividad del agua y de la humedad relativa de equilibrio. Por esto vimos que las temperaturas y velocidades de coagulación fueron diferentes. EXPERIMENTO 3 “FACTOR pH” El factor pH es un agentes que provocan la desnaturalización de una proteína se llaman agentes desnaturalizantes. Se distinguen agentes físicos (calor) y pH. El pH o coagulación de la yema del huevo, es además de afectar a la envoltura acuosa de las proteínas también afectan a la carga eléctrica de los grupos ácidos y básicos de las cadenas laterales de los aminoácidos. Esta

alteración

de

la

carga

superficial

de

las

proteínas

elimina

las

interacciones electrostáticas que estabilizan la estructura terciaria y a menudo provoca su precipitación. La solubilidad de una proteína es mínima en su punto

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FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL. 2013 isoeléctrico, ya que su carga neta es cero y desaparece cualquier fuerza de repulsión electrostática que pudiera dificultar la formación de agregados. Cuando la temperatura es elevada aumenta la energía cinética de las moléculas con lo que se desorganiza la envoltura acuosa de las proteínas, y se desnaturalizan. Asimismo, un aumento de la temperatura destruye las interacciones débiles y desorganiza la estructura de la proteína, de forma que el interior hidrófobo interacciona con el medio acuoso y se produce la agregación y precipitación de la proteína desnaturalizada. EXPERIMENTO 4 “PRUEBA DE BIURET” La prueba de biuret nos permite saber que compuesto

con el que

estamos trabajando es una proteína haciéndose de una color violeta, para esto se utilizó el sulfato de cobre, lo cual agregarlo a cualquier alimento, al convertirse a un color violeta entonces quiere decir que e s una proteína, mientras no cambie de color a violeta no será una proteína y tal vez sea un lípido o también contiene lípido a la vez como la clara del huevo. Aparecerá una coloración violeta-rosácea característica esto debido a la presencia de enlaces peptídico (- CO- NH -) que se destruye al liberarse los aminoácidos. El reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de proteínas, y vira a rosa cuando se combina con polipéptidos de cadena corta. El Hidróxido de Potasio no participa en la reacción, pero proporciona el medio alcalino es necesario para que tenga lugar. Se usa normalmente en el ensayo de Biuret, un método colorimétrico que permite determinar la concentración de proteínas de una muestra mediante. Para poder saber si una sustancia es proteína o no utilizamos la reacción de biuret, pero para saber realmente si es una proteína la sustancia tiene que colorearse de color violeta así sabremos que es una proteína.

EXPERIMENTO 5 “PRUEBA DE LA DESNATURALIZACION DE LA CASEINA” La leche está compuesta principalmente de agua, azucares, grasas y caseína.

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FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL. 2013 Cuando se le agrega el vinagre que presenta un pH acido la CASEINA se separa formando grumos los cuales se pudo ver en el experimento, por otro lado los otros componentes como las grasas, azucares quedan disueltas en el agua. Como las proteínas presentan estructuras determinadas la cual le ayuda a cumplir sus diversas funciones, esto implica una interacción de entre los aminoácidos que las conforman y las moléculas del medio, fundamentalmente agua, adquiriendo una conformación natural de máxima estabilidad la cual no debe perderse, en este experimento realizado se produce una perturbación a esta estabilidad rompiendo la estructura tridimensional a través de la variación del pH.

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FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL. 2013 CUESTIONARIO 1. El grupo guanidino

de la arginina es uno de los

más básicos de todos los grupos orgánicos. Explique ¿porque? Según a sus propiedades acido-base de los -aminoacidos se clasifica a la lisina, arginina e histidina como

-aminoacidos básicos por poseer en la cola de su

respectiva estructura grupos de muy alto carácter básico (un grupo amino, grupo guanidino y un grupo imidazol respectivamente).2 El grupo guanidino tiene una estructura más compleja que el grupo amino, que está unido a una cola de hidrocarburos alifáticos.3 Es un compuesto muy cristalino dado que se forma a partir de la oxidación de la guanina (es una base nitrogenada), por esa razón la arginina es muy básico dado que el beta-guadinil derivado del alfa-aminovalerianico: la guanidina es la amida de la urea y es un compuesto fuertemente básico de todos los componentes de la proteína (punto isoeléctrico 10,8). 2. Escriba una reacción que indique la manera en que se podía usar el 2,4-dinitrofluorobenceno para identificar al aminoácido Nterminal de Val- Ala- Gly, ¿qué productos esperaría (después de la hidrólisis) cuando se tratan a la Val- Lys -Gly con 2,4 – dinitrofluorobenceno? Actualmente existen varias alternativas para secuenciar los aminoácidos de una proteína (la mayoría de ellas realizadas en secuenciadores automatizados), al principio, el método de SANGER fue casi el único con el que se contaba para este fin. Y las determinaciones debían hacerse de forma manual. Las

proteínas

se

tratan

con

DINITROCLOROBENCENO

(DNCB)

o

DINITROFLUOROBENCENO (DNFB) en condiciones alcalinas y el producto dinitrofenilado se hidroliza con HCl. Este procedimiento libera a los aminoácidos N-

2

ROGELIO OCAMPO, LUZ AMALA, LUZ ADRIANA BETANCUR, DIANA FARCELA OCAMPO, “CURSO PRACTICO DE QUIMICA ORGANICA. ENFOCADO A LA BIOLOGIA Y ALIMENTOS” 3 MARY K. CAMPBELL, SHAWN OARRELL, “BIOQUIMICA”

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FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL. 2013 terminales dinitrofenilados, los cuales luego se identifican por cromatografía en papel o en gel de sílice, en referencia a aminoácidos dinitrofenilados conocidos.4

3. El tratamiento de la oxitocina con ciertos agentes reductores (como el sodio en amoniaco liquido) genera un solo cambio químico que puede revertirse por la oxidación con el aire. ¿Qué cambios químicos hay? La oxitocina es una hormona, y al interactuar con un agente reductor se produce una reacción reducción-oxidación en la que se da una transferencia de electrones. 4. Cuando

una

proteína

está

formada

por

varias

cadenas

polipeptídicas, cada una de estas cadenas se denomina……….. porque el nombre Porque las proteínas al presentar una secuencia de varias cadenas polipeptidicas con estructura tercearia. Estructura terciaria está determinada por la secuencia de aminoácidos (provenientes de la estructura primaria). Cuanto más complejo sea y más cadenas pilipeptidicas tenga su estructura tridimensional cambiara esa es la diferencia 5. Unión de oxígeno y estructura de la hemoglobina. Se utiliza la ingeniería genética para modificar la interfase entre subunidades de hemoglobina las variantes resultantes se presentan en disolución principalmente como dimeros

(tetrameros α2β2 hay

pocos, o ninguno). Estas variantes, ¿unirán oxigeno más débilmente o más fuerte? Explique su respuesta.

4

OSCAR ROJAS ESPINOZA, “INMUNOLOGIA DE MEMORIA”

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FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL. 2013 La hemoglobina es una cromoproteína que se encarga de transportar el oxígeno en la sangre, se trata de una proteína tetramerica que se encuentra en elevada concentración en los glóbulos rojos. La hemoglobina está formada por cuatro subunidades dos de tipo alfa y dos de tipo beta, cada uno de estas sub unidades puede unir una molécula de oxígeno a través de su grupo “HEMO” 5

5

Hemoglobin: Molecule of the Month, Hemoglobin morphs

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FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL. 2013 BIBLIOGRAFIA Laguna, J. y Pia, E. 1979. Bioquímica. 3ª. Ed. La prensa Medica Mexicana. Plummer, D. T. 1981. Introducción a la Bioquímica Práctica. Mc Graw Hill Latinoamericana Laguna, J. P. V., F. M., y Enrique Piña, Bioquímica. 6ª. corregido y aumentado, Ed. La prensa Médica Mexicana 2009. http://www.juntadeandalucia.es/averroes/recursos_informaticos/concurso2001/ac cesit_4/proteinas.html

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FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL. 2013 ANEXOS

INDICADOR DE pH PAPEL PANPHEA

REACTIVOS USADOS PARA LOS EXPERIMENTOS REALIZADOS

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TOMANDO NOTA DE LOS RRESULTADOS OBTENIDOS