Informe caseina

February 19, 2019 | Author: JohanaS21 | Category: Milk, Coordination Complex, Proteins, Copper, Ph
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caseina...

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UNIVERSIDAD DEL CAUCA FACULT ACULTAD DE D E CIENCIAS CI ENCIAS NATURALES, NATURALES, EXACTAS Y DE LA EDUCACIÓN DEPARTAMENTO DEPARTAMENTO DE QUÍMICA LABORATORIO DE BIOQUÍMCA I: BIOMOLECULAS Elaborado por: Brandon Rosero López ([email protected])

 Determinación cuantitativa de proteínas proteínas y determinación cualitativa de Caseína. 1. Objeti jetivvos.

Determinar la concentración de muestras problemas y muestras conocidas a partir  de una curva de calibración Realizar el procedimiento de separación de la caseína se!n su punto isoel"ctrico.  Resultados 2.  Resultados Concentración

Absorbancia 1

Absorbancia 2

Absorbancia 3

0 10 20 30 40 50

0,000 0,011 0,017 0,029 0,03 0,036

0,00 0,007 0,012 0,02 0,025 0,031

0,00 0,013 0,017 0,019 0,024 0,032

 

Tabla 1. Resultados de la curva de calibración de Albúmina para la primera sesión sin  o!r", cada Absorbancia Absorbancia #ue tomada por di#erentes $rupos a 2%0 nm& Concentración

Absorbancia 1

Absorbancia 2

Absorbancia 3

0 10 20 30 40 50

0,000 0,009 0,012 0,015 0,024 0,026

0,000 0,1% 0,00% 0,016 0,3 0,052

0,000 0,002 0,023 0,09 0,011 0,035

Tabla 2. Resultados de la curva de calibración de Albúmina para la primera sesión con  o!r" con un tiempo de reacción de 10 min& 'ada Absorbancia #ue tomada por di#erentes di#erentes  $rupos a 760 nm&

 Determinación cuantitativa cuantitativa de proteínas y determinación determinación cualitativa cualitativa de Caseína .

Concentración

Absorbancia 1

Absorbancia 2

0 10 20 30 40 50

0,000 0,003 0,006 0,00% 0,011 0,012

0,000 0,004 0,007 0,00% 0,011 0,013

 

Tabla 3. Resultados de la curva de calibración de 'ase(na para la primera sesión sin  o!r"& 'ada Absorbancia Absorbancia #ue tomada por di#erentes $rupos

Concentración

Absorbancia 1

Absorbancia 2

Absorbancia 3

0 10 20 30 40 50

0,000 )0,026 )0,026 )0,015 )0,02% 0,012

0,000 0,002 0,003 0,005 0,010 0,042

0,000 )0,027 )0,02% )0,02% )0,01% )0,010

 

Tabla . Resultados de la curva de calibración de 'ase(na para la primera sesión con  o!r" con un tiempo de reacción de 10 min& 'ada Absorbancia #ue tomada por di#erentes di#erentes  $rupos& Concentración Absorbancia 1 Absorbancia 2 0 50 100 150 200 250

0,000 0,049 0,0%0 0,115 0,147 0,1%3

0,000 0,033 0,071 0,104 0,136 0,170

 

Tabla !. Resultados de la curva de calibración de Albúmina para la se$unda sesión sin  o!r"& 'ada Absorbancia Absorbancia #ue tomada por di#erentes $rupos Concentración

Absorbancia 1

0 50 100 150 200 250

0,000 )0,007 0,05% 0,121 0,19% 0,202

Absorbancia 2 0,000 0,056   )0,016   0,002 0,02% 0,196  

Tabla ". Resultados de la curva de calibración de Albúmina para la se$unda sesión con  o!r" un tiempo de reacción de 10 min&

 Determinación cuantitativa cuantitativa de proteínas y determinación determinación cualitativa cualitativa de Caseína .

Concentración

Absorbancia 1

0 50 100 150 200 250

0,000 )0,004 0,074 0,12% 0,217 0,23%

Absorbancia 2 0,000 0,050 )0,010 )0,002 0,047   0,236  

Tabla #. Resultados de la curva de calibración de Albúmina para la se$unda sesión con  o!r" un tiempo de reacción de 30 min& as absorbencias #ueron tomadas por di#erentes  $rupos Concentración Absorbancia 1 Absorbancia 2 0 50 100 150 200 250

0,000 0,044 0,020 0,127 0,163 0,19%

0,000 0,029 0,0%2 0,117 0,155 0,200

 

Tabla $. Resultados de la curva de calibración de 'ase(na para la se$unda sesión sin  o!r", cada Absorbancia #ue tomada por di#erentes $rupos& Concentración

Absorbancia 1

Absorbancia 2

0 50 100 150 200 250

0,000 0,013 0,0%9 0,091 0,14% 0,1%2

0,000 )0,03 0,025 0,043 0,131 0,15%

Tabla %. Resultados de la curva de calibración de 'ase(na para la se$unda sesión con  o!r" " un tiempo de reacción de 10 min, cada Absorbancia #ue tomada por di#erentes  $rupos& Concentración

Absorbancia 1

Absorbancia 2

0 50 100 150 200 250

0,000 0,050 0,075 0,110 0,1%5 0,244

0,000 0,01% 0,077 0,10% 0,11% 0,160

 

Tabla 1&.  Resultados de la curva de calibración de 'ase(na para la se$unda sesión con  o!r" " un tiempo de reacción de 30 min, cada Absorbancia #ue tomada por di#erentes  $rupos&

 Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .

 'uestra

 Albumina de *uevo  +esconocida

Absorbanci   Absorbancia a sin con  (o)ry  (o)ry 1& min ))) 0,904 ))) 1,6%3

 Absorbancia con (o)ry 3& min ))) )))

Tabla 11. Resultados para las muestras de Albúmina, cada muestra #ue tratada por  di#erentes $rupos, para la primera sesión&  'uestra

'ase(na 1 'ase(na 2

Absorbanci   Absorbancia a sin con  (o)ry  (o)ry 1& min ))) 0,01% ))) 0,0%%

 Absorbancia con (o)ry 3& min ))) )))

Tabla 12. Resultados para la muestra de 'ase(na cada muestra #ue tratada por di#erentes  $rupos, para la primera sesión&  'uestra

 uestra problema 1 -sólida.  uestra problema 2 -li/uida.  Albúmina de uevo

Absorbanci   Absorbancia a sin con  (o)ry  (o)ry 1& min 0,067

0,016

0,142

0,115

0,133

0,106  

 Absorbancia con (o)ry 3& min )0,001

0,112 0,105

Tabla 13. Resultados para las muestras de Albúmina, cada muestra #ue tratada por  di#erentes $rupos, para la se$unda sesión  'uestra

'ase(na con $rasa 'ase(na sin $rasa

Absorbanci   Absorbancia a sin con  (o)ry  (o)ry 1& min 0,129 0,135

)0,014 )0,052

 Absorbancia con (o)ry 3& min )0,031 0,013

Tabla 1. Resultados para las muestras de 'ase(na cada muestra #ue tratada por di#erentes  $rupos, para la se$unda sesión

 Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .

3. An*lisis y resultados.

La determinación de la concentración de proteínas es com!n en los laboratorios. E#isten diversos m"todos para dic$a operación% entre ellos podemos encontrar el m"todo de Biuret% el m"todo de &zul de 'oomasie% el m"todo de Lory% cada uno tiene una determinada sensibilidad% pero este !ltimo (Lory) combina el reactivo de Biuret y el reactivo de olin% lo *ue proporciona una me+or sensibilidad al m"todo. En eneral el m"todo se desarrolla en unos determinados pasos estandarizados% se inicia con la ,abricación de una curva de calibración% para ello es necesario la utilización de un  patrón% en nuestro caso se utilizaron - patrones% primero la &lbumina y la seundo la caseína% posteriormente se realiza una lectura en el espectro,otómetro el cual arro+ara un valor determinado de absorbancia de cada patrón% ,inalmente con el previo tratamiento de la muestras problemas se realiza la lectura de absorbencias% las cuales con la ayuda de la ecuación de las curvas de calibración se determina su concentración. Las reacciones *uímicas ocurridas en la e#perimentación se presentan y se describen a continuación. El m"todo de Lory inicia con la adición del reactivo de Biuret a las muestras a traba+ar% el reactivo de Biuret est compuesto por una disolución bsica de sul,ato de cobre ('u/01) lo cual permite la ,ormación de un comple+o oranometlico donde el centro metlico ser el 'u-2% los pares electrónicos presentes en los tomos de  3itróeno se coordinan al centro metlico% adems debido a la eometría plana del enlace  peptídico y la tetra$"drica del carbono 4% los cuatro enlaces coordinados entre los nitróenos y catión cobre (55) solo es posible si en la cadena de 46aminocidos e#isten dos% tres o ms enlaces peptídicos se!n se trate de una estructura $"lice o pleada de la  proteína. La coordinación de los cationes cobre (55) se repite sistemticamente a lo laro de todo la estructura de cadena proteica. El medio bsico en el cual est presente el /ul,ato de 'obre% permite la ,ormación de $idró#ido de cobre ('u(07)-) el cual se disocia como 'u-2 y -076% por lo tanto $ay iones c!pricos presentes en solución acuosa para poder reaccionar% adems de ello evita la reducción a 'obre (5).

+i,ura 1. Reacción del reactivo de iuret con los enlaces pept(dicos&  Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .

8ara aumentar la sensibilidad de la reacción de Biuret% el comple+o proteína6'u-2 se $ace reacciona con el reactivo de ilon6 'iocalteus% dando una coloración azul% con un m#imo de absorción de 9; nm . Esta coloración se atribuye a la reducción del ?cido ,os,omolibdico  ,os,otunstico a azul de $eteropolimolibdeno de composición no de,inida  por medio de los residuos tirosilos% tripto,anilos% ye una menor rado% cisteínilos e $istidilos de la proteína *ue ,orman comple+o con 'u-2 . Anas determinadas características del m"todo de Lory son la intensidad de la coloración% *ue varía con la composición de aminocidos de de la proteína% es ms sensible *ue el m"todo de Biuret. El rano es de ;%=6 = mmL.  la reacción de Lory se puede represar mediante el siuiente es*uema (,iura -).

+i,ura 2. s/uema para la reacción de o!r"&

La e#perimentación para esta prctica se realizó en dos sesiones en la primera sesión no se obtuvieron los resultados esperado% debido a una serie de errores e#perimentales cometidos  por cada rupo de traba+o% uno de ellos ,ue el no desenrasado de las muestras de caseína% la cual se e#tra+o en ,unción del punto isoel"ctrico% otro error *ue se cometió ,ue el tiempo de reacción para Lory% cada rupo no se sincronizo para poder obtener un buen resultado% los valores obtenidos en esta sesión se reportaron en las tablas =% -% % 1% == y =-. /e tomó un rano de concentraciones para las curvas de calibración de ; a ; ppm% *ue es un rano muy pe*ueCo para las muestras% en las ,iuras  se representan las curvas de calibración realizadas para la alb!mina (tabla =) en donde la absorbancia - corresponde la tomada por mi rupo. /e realizó una comparación entre etas tres r,icas y se obtiene *ue la me+or ra,ica para representativa es la *ue nosotros realizamos debido a *ue el coe,iciente de 8irson (R -) posee una mayor linealidad *ue las dems (ver tabla =). Coe-iciente de  earson / R2 0  cuación de la recta

 Absorbancia 1

Absorbancia 2

Absorbancia 3

0,957

0,997

0,934

 "0,000711   0,002714

" 0,000602 0,000333

" 0,000557 0,00357 

Tabla 1!. 'oe#icientes " ecuaciones de las rectas representadas en la #i$ura 3&  Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .

0!04 0!04 0!03 A"#$"%&'(% 1 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+ A"#$"%&'(% 2 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+ L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+ A"#$"%&'(% 3 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 3+

0!03 Absorbancia

0!02 0!02 0!01 0!01 0 0

10

20

30

40

50

0

Concentracion / ppm

+i,ura 3. 'omparación entre las curvas de calibración para la tabla 1&

& las mismos patrones se les adiciono el reactivo de Lory *ue se tomó un tiempo de reacción apro#imadamente durante =; minutos% los resultado de esta parte de la e#perimentación se consinan en la tabla -. /e procedió a ra,icar los datos obtenidos para cada rupo% la r,ica 1 re,le+a los datos presentes en la tabla -. La absorbancia corresponde a la tomada por nuestro rupo. 0!1 0!0/ 0!0. 0!00!0 0!05 Absorbancia 0!04 0!03 0!02 0!01 0

A"#$"%&'(% 1 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+ A"#$"%&'(% 2 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+ L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+ A"#$"%&'(% 3 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 3+ 0

10 20 30 40 50 0

Concentracion / ppm

+i,ura . 'omparación de las curvas de calibración para la tabla 2&  Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .

/i comparamos estas tres curvas de calibración la me+or se para ,iura 1 (ver tabla =9) se  puede observar *ue la curva de absorbancia = posee me+or linealidad *ue las dems por lo tanto es la me+or  Coe-iciente de  earson / R2 0  cuación de la recta

 Absorbancia 1

Absorbancia 2

Absorbancia 3

0,964

0,7%3

0,1%2

 "  0,000509  0,001619

"  0,000%69 ) 0,00104%

"  0,000769  0,007619

Tabla 1". 'oe#icientes " ecuaciones de las rectas representadas en la #i$ura 4&

La muestra para la curva de calibración de 'aseína se realizó por di,erentes rupos en donde como patrón primario se utilizó caseína con un buen porcenta+e de pureza% en la tabla  se representan las absorbancias de cada concentración obtenida% se representaron las r,icas correspondiente en la ,iura % en la tabla = se especi,ica las características de la ,iura . 0!01 0!01 0!01 0!01 Absorbancia

A"#$"%&'(% 1 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+ A"#$"%&'(% 2 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+ L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+

0!01 0 0 0 0

10 20 30 40 50 0

Concentracion / ppm

+i,ura !. 'omparación de las curvas de calibración para la tabla 3&

Coe-iciente de  earson / R2 0  cuación de la

 Absorbancia 1 0,9%4

Absorbancia 2 0,975

 "  0,000246  0,000524

"  0,000249  0,000952

 Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .

recta Tabla 1#. 'oe#icientes " ecuaciones de las rectas representadas en la #i$ura 5&

/e!n la ,iura  y la tabla = la me+or linealidad la representa la absorbancia =. & los  patrones se les adiciono Lory y se de+ó reaccionar durante =; min y se obtuvieron los datos *ue estn consinados en la tabla 1% se compararon estos datos con una r,ica *ue se representa en la ,iura 9 y las características de las r,icas se representan en la tabla =. 0!05 0!04 0!03 0!02 0!01 Absorbancia

0 0!01

0

10 20 30 40 50 0

0!02

A"#$"%&'(% 1 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+ A"#$"%&'(% 2 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+ A"#$"%&'(% 3 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 3+

0!03 0!04 Concentracion / ppm

+i,ura ". 'omparación de las curvas de calibración para la tabla 4&

Coe-iciente de  earson / R2 0  cuación de la recta

 Absorbancia 1 0,0445

Absorbancia 2 0,631

 "  0,0001%6 ) 0,01%476

"  0,000674 ) 0,006524

Absorbancia 3 0,011

"  )0,000066 ) 0,016%57 

Tabla 1$. 'oe#icientes " ecuaciones de las rectas representadas en la #i$ura 6&

La ra,ica *ue posee mayor linealidad es la de absorbancia -. En la seunda sesión se lleó a un acuerdo por cada rupo en donde se acordó una me+or  sincronización% un desenrasado de muestra de caseína% y la corrección para la concentraciones de la curva de calibración% los resultados obtenidos en esta sesión se consinaron en las tablas %9% % % F y =;. &$ora se proceder de la misma manera para ra,icar y comparar los resultados de di,erentes rupos% y posteriormente a este se comparar  los datos de la primera sesión con los de la seunda sesión.  Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .

La ra,ica  muestra la comparación de los resultados de la tabla *ue corresponde a la curva de calibración de la &lb!mina% en la tabla =F se representa las características de la ,iura . 'abe resaltar *ue la absorbancia ,ue tomada por nuestro rupo 0!2 0!1. 0!1 0!14 0!12 Absorbancia

A"#$"%&'(% 1 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+ A"#$"%&'(% 2 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+

0!1 0!0. 0!0 0!04 0!02 0 0

50 100 150 200 250 300 Concentracio / ppm

+i,ura #. 'omparación de las curvas de calibración para la tabla 5& Albumina sin o!r"  se$unda sesión&

Coe-iciente de  earson / R2 0  cuación de la recta

 Absorbancia 1 0,995

Absorbancia 2 0,999

 "  0,000711  0,006%10

"  0,0006%1  0,000524

Tabla 1%. 'oe#icientes " ecuaciones de las rectas representadas en la #i$ura 7&

/e concluye *ue la r,ica &bsorbancia - posee mayor linealidad. /e adicionaron a los  patrones el reactivo de Lory y se tomó un tiempo de reacción de =; minutos% estos datos estn consinados en la tabla 9% la ,iura  y la tabla -; representan las características de las r,icas.

Coe-iciente de  earson / R2 0  cuación de la recta

 Absorbancia 1 0,935

Absorbancia 2 0,3%7  

 "  0,000965 ) 0,02523%

"  0,000522 ) 0,020952

 Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .

Tabla 2&. 'oe#icientes " ecuaciones de las rectas representadas en la #i$ura %&

0!25 0!2 0!15 Absorbancia

A"#$"%&'(% 1 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+ A"#$"%&'(% 2 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+

0!1 0!05 0 0 50 100150200250300 0!05 Concentracion / ppm

+i,ura $. 'omparación de las curvas de calibración para la tabla 6& Albúmina con o!r" con 10 min de reacción, se$unda sesión&

La ra,ica absorbancia = posee la me+or linealidad. /e tomó un tiempo de reacción de ; minutos los resultados estn consinados en la tabla % se compararon las dos absorbancias tomadas y estas se presentan en la ,iura F y en la tabla -=. 0!3 0!25 0!2 0!15

A"#$"%&'(% 1 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+ A"#$"%&'(% 2 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+

A"#$"%&'(% 0!1 0!05 0 0

100

200

300

0!05

'#&')&$%'(#&  

 Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .

+i,ura %. 'omparación de las curvas de calibración para la tabla 7& Albúmina con un tiempo de reacción de 30 min, se$unda sesión&

Coe-iciente de  earson / R2 0  cuación de la recta

 Absorbancia 1 0,9525

Absorbancia 2 0,45%2

 "  0,0011 ) 0,0274

"  0,0007 ) 0,0307 

Tabla 21. 'oe#icientes " ecuaciones de las rectas representadas en la #i$ura 9&

8ara la curva de calibración de la caseína se tomaron las mismas concentraciones y se  prepararon los patrones% primero se midieron las absorbancias sin Lory estos datos se consinaron en la tabla % se representaron los datos en la ,iura =; y las características de estas se representaron en la tabla --. 0!25 0!2 0!15 A"#$"%&'(% 1 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+ A"#$"%&'(% 2 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+

A"#$"%&'(% 0!1 0!05 0 0

50 100 150 200 250 300

C#&')&$%'(#&  

+i,ura 1&. 'omparación de las curvas de calibración para la tabla %& 'ase(na sin o!r",  se$unda sesión&

Coe-iciente de  earson / R2 0  cuación de la recta

 Absorbancia 1 0,903

Absorbancia 2 0,996  

 "  0,000% ) 0,0119

"  0,000% ) 0,003%

 Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .

Tabla 22. 'oe#icientes " ecuaciones de las rectas representadas en la #i$ura 10&

De la misma manera se representaron los valores de la tabla F *ue corresponden a un tiempo de reacción de =; minutos. 0!2 0!15 0!1 A"#$"%&'(% 1 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+ A"#$"%&'(% 2 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+

A( T(6) 0!05 0 0

50 100 150 200 250 300

0!05

A( T(6)

+i,ura 11. 'omparación de las curvas de calibración para la tabla 9, 'ase(na con un tiempo de reacción de 10 min, se$unda sesión&

Coe-iciente de  earson / R2 0  cuación de la recta

 Absorbancia 1 0,960

Absorbancia 2 0,%603

 "  0,000% ) 0,0069

"  0,0007 ) 0,0377 

Tabla 23. 'oe#icientes " ecuaciones de las rectas representadas en la #i$ura 11&

8ara un tiempo de reacción de los patrones con caseína de ; minutos los datos obtenidos se representan en la tabla =;% se ra,icaron los datos (,iura =-) y las características se representaron en la tabla -1.

Coe-iciente de  earson / R2 0  cuación de la recta

 Absorbancia 1 0,972

Absorbancia 2 0,96%

 "  0,0009 ) 0,0079

"  0,0006 ) 0,0006 

Tabla 2. 'oe#icientes " ecuaciones de las rectas representadas en la #i$ura 12&  Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .

0!3 0!25 0!2

A"#$"%&'(%

0!15

A"#$"%&'(% 1 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+ A"#$"%&'(% 2 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+

0!1 0!05 0 0 50 100150200250300

C#&')&$%'(#&  

+i,ura 12. 'omparación de las curvas de calibración para la tabla 10& 'ase(na con o!r" con un tiempo de reacción de 30 min, se$unda sesión&

En comparación de las dos sesiones de traba+o en la seunda sesión se obtuvo un resultado me+or% debido a *ue se tuvo un mayor cuidado de traba+o% se tomaron las me+ores ra,icas de cada sesión teniendo en cuanta el coe,iciente de 8earson *ue se encuentran en las respectivas tablas para cada r,icas y se compararon en las ,iuras =%=1 y = y=9% no se  puedo comparar los tiempos de reacción de ; min debido a *ue solo se realizó una vez% en la seunda sesión% pero si se observan sus respectivos coe,icientes de 8earson $ay unas absorbancias *ue poseen mayor linealidad. 0!1. 0!1

R7 8 1

0!14 0!12 0!1

A"#$"%&'(% 0!0.

R7 8 1

0!0 0!04

P$()$% ) (#& L(&)%$ *P$()$% ) (#&+ S)9&;% )(#& L(&)%$ *S)9&;% )(#&+

0!02 0 0 50 100 150 200 250 300

C#&')&$%'(#&  

 Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .

+i,ura 13. 'omparación de las curvas de calibración de la primera " la se$unda sesión  para la Albúmina sin o!r"& 0!25 R7 8 0!/4

0!2 0!15

A"#$"%&'(%

0!1 R7 8 0!/

0!05

S)9&;% )(#& L(&)%$ *S)9&;% )(#&+ P$()$% ) (#& L(&)%$ *P$()$% ) (#&+

0 0

50 100 150 200 250 300

0!05

C#&')&$%'(#&  

+i,ura 1. 'omparación de las curvas de calibración de la primera " la se$unda sesión  para la Albúmina con o!r" " 10 min de reacción& 0!25 0!2

R7 8 1

0!15 P$()$% ) (#& L(&)%$ *P$()$% ) (#&+ S)9&;% )(#& L(&)%$ *S)9&;% )(#&+

A( T(6) 0!1 0!05 R7 8 0!/.

0 0

50 100 150 200 250 300

A( T(6)

+i,ura 1!. 'omparación de las curvas de calibración de la primera " la se$unda sesión  para la 'ase(na sin o!r"

 Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .

0!2 0!1.

R7 8 0!/

0!1 0!14 0!12

A"#$"%&'(%

0!1

P$()$% ) (#& L(&)%$ *P$()$% )(#&+ S)9&;% )(#& L(&)%$ *S)9&;% )(#&+

0!0. 0!0 0!04

R7 8 0!3

0!02 0 0

50 100 150 200 250 300

C#&')&$%'(#&  

+i,ura 1". 'omparación de las curvas de calibración de la primera " la se$unda sesión  para la 'ase(na con o!r" " un tiempo de reacción de 10 min&

La comparación de los traba+os realizados en la primera y la seunda sesión permiten observa la ran di,erencia e#istente% anteriormente se $an nombrado aluno problemas *ue ,ueron correidos para poder obtener un me+or resultado el cual es muy evidente% adems se  puede observar *ue una curva de calibración sirve siempre y cuando en el lote de traba+o los paramentos utilizados sean constantes% en otras palabras *ue no cambien nin!n reactivo% o al!n paso de la e#perimentación% o la calibración del espectro,otómetro y $asta los e#perimentadores. /e de,ine sensibilidad como la pendiente de la curva de calibración de inter"s% esta de,inición aceptada por la 5A8&' % aun*ue esta tambi"n est dada por los límites de detección y los límites de cuanti,icación% en la tabla - se comparan las pendientes de las rectas de las r,icas de la seunda sesión de traba+o. /i se observa las pendientes *ue corresponden a la adición de Lory poseen un mayor  rado de sensibilidad% *ue es el resultado esperado.  'uestra  Albúmina 'ase(na

in (o)ry 0,0006%1 0,000%0

1& min con (o)ry 0,000965 0,000%0

3& min con (o)ry 0,0011 0,0009

 Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .

Tabla 2!. 'omparación de la sensibilidad de las curvas de calibración realiadas en la  se$unda sesión, se tomaron las pendientes de las meores curvas de calibración se$ún el   par8metro de coe#iciente de earson

Las muestras estudiadas se reportan en las tablas = y =1% el tratamiento preliminar de las muestras se realizaron de la siuiente manera. Las muestras correspondientes a la tabla = ,ueron sólida y li*uida% la muestra sólida correspóndete a lec$e en polvo se llevó a una concentración de ;; ppm% en donde se diluyeron ;%-  en -; mL de aua% despu"s se tomó - mL y se a,oro a - con aua% con la muestra li*uida (muestra problema -) se realizaron diluciones se tomaron - mL y se a,oraron a - mL de aua% la muestra de albumina de $uevo se preparó tomando el volumen total de la clara del $uevo la *ue se diluyo en -; mL de aua% posteriormente se centri,uo para poder eliminar suspensiones espumosas *ue podrían actuar como inter,erencia en la medida% Las muestras reportadas en la tabla =1 se prepararon de la siuiente manera% La muestra correspondiente a la caseína con rasa se preparó a partir de ;; mL de lec$e% en donde se llevó a un p7 entre 16 unidades con cido cítrico (limón) para realizar la separación en ,unción del p5 (presencia del Giterion)% la mezcla se de+ó reposar durante = día% posteriormente se centri,uo  veces y se eliminó el lí*uido sobrenadante separando la muestra sólida el cual se lavó con aua y para así arantizar la eliminación de partículas de cido cítrico% se secó la caseína en la estu,a a una temperatura de 6; H'% de a*uí despu"s del secado se tomaron ;%=  de caseína y se a,oro a -; mL con aua (1;; ppm)% parte de la muestra de caseína se e#tra+o y se realizó un proceso de desenrasado% se adiciono etanol lo *ue arantizaba esto% y así evitar un reporte erróneo de la medida de la absorbancia% se tomaron ;%;=  y se a,oraron con aua a =;; mL (=;; ppm). 'on la ayuda de las ecuaciones de las me+ores curvas de calibración para la alb!mina y la caseína se proceder a calcular la concentración de las muestras problemas (tabla = y =1). 8ara la alb!mina las me+ores rectas se pueden observar en las tablas =F% -; y -=% cuyas ra,icas corresponden a las ,iuras % y F respectivamente. 8ara la muestra problema = (tabla =) cuya absorbancia sin el reactivo de Lory es ;%;9 y ecuación de curva de calibración es  y =0,000681  x + 0,000524 se calcula la concentración de la siuiente manera: 8rimero la variable independiente     representa la concentración (ppm) y la Iariable dependiente y representa la &bsorbancia% por ende si despe+amos  de la ecuación de la recta podemos encontrar el valor de la concentración de la muestra *ue $a absorbido un una determinada lonitud de onda.  x

=

 y m



b

(1)

En donde m es la pendiente de la recta y b es el intercepto. &$ora reemplazamos cada valor en (=) y se obtiene  Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .

 x

=

0,067 0,000681



0,000524

=

98,38  ppm

/e procede de la misma manera para cada valor correspondiente de la tabla = y =1 con su respectiva ecuación de recta y se enera la tabla -9.

 'uestra

 uestra problema 1 -sólida.  uestra problema 2 -li/uida.  Albúmina de uevo 'ase(na $rasosa 'ase(na sin $rasa

Concentración /ppm0 0 min 10min 30 min 9%,3% 16,61 )0,%%2

20%,52

119,20

101,%5

195,30 161,26 166,26

150,94 )17,50 )64,50

95,4% )34,44 14,45

Tabla 2".  Resultado de las concentraciones en ppm para cada muestra problema tratada

Los resultados obtenidos no ,ueron los esperados% las inconsistencias corresponden a determinados errores% si se observa en las tablas = y =1 $ay absorbancias con valores neativos% en la literatura se encontró *ue este tipo de errores se deben a cuatro tipos de  posibles causas % la primera es la no presencia de muestra en la celda% una seunda causa es la mala inserción de la celda en el e*uipo% una tercera causa puede ser una selección errónea de la lonitud de onda% una cuarta causa es la calibración errónea del espectro,otómetro% cada una de estas causa tiene una posible solución por e+emplo para la tercera causa se debe a+ustar la lonitud de onda al rano compatible con el anlisis% en nuestro caso se realizó la medición a sus respectivas lonitudes de ondas para enerar la m#ima absorción de la muestra% para la reacción sin Lory ,ue -; y para las reacciones con Lory ,ue 9;% *ue coinciden con los valores teóricos reportados % alunas muestras  presentaron una absorción muc$o menor a las del rano permitido% $aciendo *ue estas absorbancias este por deba+o del límite de detección (intercepto de la recta en el e+e de las ordenadas) J /e podría pensar en una interpolación de la recta para permitir *ue la absorbancia caia dentro de la curva de calibración% pero analíticamente no se puede realizar ya *ue la curva de calibración es una parte de una curva% adems los límites de detección y cuanti,icación dela curva de calibración obtenida se!n los parmetros obtenidos se vería a,ectados y la desviación estndar de estos aumentaría por ende el error  tambi"n aumentaría% otro posible error es el error 7umano% ya *ue las muestras problemas ,ueron tratadas por di,erentes personas% y es sabido *ue cada persona tiene un determinado error de traba+o. La concentración de la muestra total es posible calcular a partir de las concentraciones obtenidas por la absorbancia% si se $ace una relación entre la concentración  Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .

obtenida a unos determinados ramos o mL traba+os con el peso o volumen total de la muestra. &$ora en,aticemos un poco sobre la e#tracción de la caseína% es sabido *ue la lec$e posee diversas proteínas de las cuales la caseína es la ms abundante representando ms de ;K de contenido total de proteínas. Las caseínas de la lec$e tienen pesos moleculares *ue oscilan entre -.;;; y 1;.;;;J las ms importantes son la 4% la  y la M% *ue representan% respectivamente% el ;% ; y =K del total de las caseínas. En la lec$e% estas proteínas se asocian entre sí para ,ormar micelas% *ue se encuentran estabilizadas y solubilizadas racias a la presencia de la caseína M% y del calcio  (ver ,iura =).

+i,ura 1#. icelas de case(na en la lec*e&

La propiedad característica de la caseína es su ba+a solubilidad a p7 1%9. El p7 de la lec$e es 9%9 apro#imadamente% estando a ese p7 la caseína carada neativamente y solubilizada como sal clcica. /i se aCade cido a la lec$e% la cara neativa de la super,icie de la micela se neutraliza (los rupos ,os,ato se protonan) y la proteína neutra precipita

+i,ura 1$& Reacción para la etracción dela case(na&

'omo recomendaciones para un me+or resultado en el traba+o se pueden enumerar: 1. 8ara enerar un me+or resultado la e#tracción de la caseína se debe realizar con un

cido d"bil y diluido para así arantizar un me+or control en el radiente de p7 -) /i la absorbancia es mayor al límite superior del rano de medida% siempre se puede realizar la dilución correspondiente para introducirla en el rano del m"todo. 8ero si  Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .

) 1) ) 9)

es in,erior al límite de cuanti,icación del m"todo seleccionado% $ay *ue emplear un m"todo ms sensible. 8ara la determinación de la absorbancia despu"s de la adición del reactivo de Lory% se debería planear un m"todo para poder arantizar una sincronía en con el tiempo de reacciones estimado El desenrasado de la muestra de caseína es importante para evitar inter,erencias% es  por ello *ue el lavado adecuado con etanol ayuda a reducir este inconveniente 8ara el tratamiento de la muestra de albumina es necesario $acer un determinado n!mero de centri,uaciones para eliminar las inter,erencias posibles% estas con la ayuda de la ,uerza centrí,ua pueden llevarse a la separación de la disolución. /e deben tener en cuenta los parmetros *ue puedan enerar un valor neativo en la medida de absorbancia y solucionarlos de manera e,iciente y precisa. 4. Conclusiones









La comparación del traba+o de varios rupos pudo rea,irmar *ue cada persona tiene un determinado estilo de traba+o lo *ue es un parmetro importante al momento de realizar un anlisis cuantitativo% adems es importante tener en cuenta *ue para un determinado lote de muestras le corresponde una determinada curva de calibración% una determinada calidad de reactivo% adems una determinada especie de reactivos. Las pendientes de cada una de las rectas son las sensibilidades de cada uno de los m"todos% y sus valores tambi"n son los correspondientes coe,icientes de absorción de los comple+os proteína6reactivo. El m"todo de Lory posee una me+or sensibilidad *ue el m"todo de Biuret% esto se  pudo comprobar con la sensibilidad ( pendiente de la recta se!n la 5A8&') de cada curva de calibración realizada% adems el coe,iciente de 8erson es un parmetro lineal *ue arantiza la calidad y la eneración de resultados proporcionales a la concentración del analito en las muestras dentro de un determinado rano La eliminación de cual*uier tipo de inter,erencias de las muestras de traba+o arantizara un me+or reporte en el anlisis% adems si la absorbancia de la muestra est dentro del rano de medida del m"todo seleccionado% mediante la ecuación de la recta de calibrado se puede calcular la concentración de proteína de la disolución  problema. !. 4iblio,ra-ía

:1; , 'rouc* R& rincipios de an8lisis instrumental, 6 ta  d, editorial? 'en$a$e earnin$ eico [email protected] 200%, p8$& 20& :2; *ttp?catedras&/uimica&unlp&edu&ar/o3Apuntesroteinas&pd# -consultado 2%042013.

 Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .

:3; *ttp?!!!&bvsde&pa*o&or$bvsacdcd29laboratoriocap11&pd# -consultado 11052013. :4;*ttp?depa&#/uim&unam&mam"darc*iveroABCA+DEFCDD'AGRDBHAI12313&pd#  -'onsultado 11052013. :5;*ttp?!!!&u*u&es4%0004034documentosJ20deJ20tetopracticasprotocoloIpracticasIalimentosI0%I09&pd#  -'onsultado 11052013.

 Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .

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