UNIVERSIDAD DEL CAUCA FACULT ACULTAD DE D E CIENCIAS CI ENCIAS NATURALES, NATURALES, EXACTAS Y DE LA EDUCACIÓN DEPARTAMENTO DEPARTAMENTO DE QUÍMICA LABORATORIO DE BIOQUÍMCA I: BIOMOLECULAS Elaborado por: Brandon Rosero López (
[email protected])
Determinación cuantitativa de proteínas proteínas y determinación cualitativa de Caseína. 1. Objeti jetivvos.
Determinar la concentración de muestras problemas y muestras conocidas a partir de una curva de calibración Realizar el procedimiento de separación de la caseína se!n su punto isoel"ctrico. Resultados 2. Resultados Concentración
Absorbancia 1
Absorbancia 2
Absorbancia 3
0 10 20 30 40 50
0,000 0,011 0,017 0,029 0,03 0,036
0,00 0,007 0,012 0,02 0,025 0,031
0,00 0,013 0,017 0,019 0,024 0,032
Tabla 1. Resultados de la curva de calibración de Albúmina para la primera sesión sin o!r", cada Absorbancia Absorbancia #ue tomada por di#erentes $rupos a 2%0 nm& Concentración
Absorbancia 1
Absorbancia 2
Absorbancia 3
0 10 20 30 40 50
0,000 0,009 0,012 0,015 0,024 0,026
0,000 0,1% 0,00% 0,016 0,3 0,052
0,000 0,002 0,023 0,09 0,011 0,035
Tabla 2. Resultados de la curva de calibración de Albúmina para la primera sesión con o!r" con un tiempo de reacción de 10 min& 'ada Absorbancia #ue tomada por di#erentes di#erentes $rupos a 760 nm&
Determinación cuantitativa cuantitativa de proteínas y determinación determinación cualitativa cualitativa de Caseína .
Concentración
Absorbancia 1
Absorbancia 2
0 10 20 30 40 50
0,000 0,003 0,006 0,00% 0,011 0,012
0,000 0,004 0,007 0,00% 0,011 0,013
Tabla 3. Resultados de la curva de calibración de 'ase(na para la primera sesión sin o!r"& 'ada Absorbancia Absorbancia #ue tomada por di#erentes $rupos
Concentración
Absorbancia 1
Absorbancia 2
Absorbancia 3
0 10 20 30 40 50
0,000 )0,026 )0,026 )0,015 )0,02% 0,012
0,000 0,002 0,003 0,005 0,010 0,042
0,000 )0,027 )0,02% )0,02% )0,01% )0,010
Tabla . Resultados de la curva de calibración de 'ase(na para la primera sesión con o!r" con un tiempo de reacción de 10 min& 'ada Absorbancia #ue tomada por di#erentes di#erentes $rupos& Concentración Absorbancia 1 Absorbancia 2 0 50 100 150 200 250
0,000 0,049 0,0%0 0,115 0,147 0,1%3
0,000 0,033 0,071 0,104 0,136 0,170
Tabla !. Resultados de la curva de calibración de Albúmina para la se$unda sesión sin o!r"& 'ada Absorbancia Absorbancia #ue tomada por di#erentes $rupos Concentración
Absorbancia 1
0 50 100 150 200 250
0,000 )0,007 0,05% 0,121 0,19% 0,202
Absorbancia 2 0,000 0,056 )0,016 0,002 0,02% 0,196
Tabla ". Resultados de la curva de calibración de Albúmina para la se$unda sesión con o!r" un tiempo de reacción de 10 min&
Determinación cuantitativa cuantitativa de proteínas y determinación determinación cualitativa cualitativa de Caseína .
Concentración
Absorbancia 1
0 50 100 150 200 250
0,000 )0,004 0,074 0,12% 0,217 0,23%
Absorbancia 2 0,000 0,050 )0,010 )0,002 0,047 0,236
Tabla #. Resultados de la curva de calibración de Albúmina para la se$unda sesión con o!r" un tiempo de reacción de 30 min& as absorbencias #ueron tomadas por di#erentes $rupos Concentración Absorbancia 1 Absorbancia 2 0 50 100 150 200 250
0,000 0,044 0,020 0,127 0,163 0,19%
0,000 0,029 0,0%2 0,117 0,155 0,200
Tabla $. Resultados de la curva de calibración de 'ase(na para la se$unda sesión sin o!r", cada Absorbancia #ue tomada por di#erentes $rupos& Concentración
Absorbancia 1
Absorbancia 2
0 50 100 150 200 250
0,000 0,013 0,0%9 0,091 0,14% 0,1%2
0,000 )0,03 0,025 0,043 0,131 0,15%
Tabla %. Resultados de la curva de calibración de 'ase(na para la se$unda sesión con o!r" " un tiempo de reacción de 10 min, cada Absorbancia #ue tomada por di#erentes $rupos& Concentración
Absorbancia 1
Absorbancia 2
0 50 100 150 200 250
0,000 0,050 0,075 0,110 0,1%5 0,244
0,000 0,01% 0,077 0,10% 0,11% 0,160
Tabla 1&. Resultados de la curva de calibración de 'ase(na para la se$unda sesión con o!r" " un tiempo de reacción de 30 min, cada Absorbancia #ue tomada por di#erentes $rupos&
Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .
'uestra
Albumina de *uevo +esconocida
Absorbanci Absorbancia a sin con (o)ry (o)ry 1& min ))) 0,904 ))) 1,6%3
Absorbancia con (o)ry 3& min ))) )))
Tabla 11. Resultados para las muestras de Albúmina, cada muestra #ue tratada por di#erentes $rupos, para la primera sesión& 'uestra
'ase(na 1 'ase(na 2
Absorbanci Absorbancia a sin con (o)ry (o)ry 1& min ))) 0,01% ))) 0,0%%
Absorbancia con (o)ry 3& min ))) )))
Tabla 12. Resultados para la muestra de 'ase(na cada muestra #ue tratada por di#erentes $rupos, para la primera sesión& 'uestra
uestra problema 1 -sólida. uestra problema 2 -li/uida. Albúmina de uevo
Absorbanci Absorbancia a sin con (o)ry (o)ry 1& min 0,067
0,016
0,142
0,115
0,133
0,106
Absorbancia con (o)ry 3& min )0,001
0,112 0,105
Tabla 13. Resultados para las muestras de Albúmina, cada muestra #ue tratada por di#erentes $rupos, para la se$unda sesión 'uestra
'ase(na con $rasa 'ase(na sin $rasa
Absorbanci Absorbancia a sin con (o)ry (o)ry 1& min 0,129 0,135
)0,014 )0,052
Absorbancia con (o)ry 3& min )0,031 0,013
Tabla 1. Resultados para las muestras de 'ase(na cada muestra #ue tratada por di#erentes $rupos, para la se$unda sesión
Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .
3. An*lisis y resultados.
La determinación de la concentración de proteínas es com!n en los laboratorios. E#isten diversos m"todos para dic$a operación% entre ellos podemos encontrar el m"todo de Biuret% el m"todo de &zul de 'oomasie% el m"todo de Lory% cada uno tiene una determinada sensibilidad% pero este !ltimo (Lory) combina el reactivo de Biuret y el reactivo de olin% lo *ue proporciona una me+or sensibilidad al m"todo. En eneral el m"todo se desarrolla en unos determinados pasos estandarizados% se inicia con la ,abricación de una curva de calibración% para ello es necesario la utilización de un patrón% en nuestro caso se utilizaron - patrones% primero la &lbumina y la seundo la caseína% posteriormente se realiza una lectura en el espectro,otómetro el cual arro+ara un valor determinado de absorbancia de cada patrón% ,inalmente con el previo tratamiento de la muestras problemas se realiza la lectura de absorbencias% las cuales con la ayuda de la ecuación de las curvas de calibración se determina su concentración. Las reacciones *uímicas ocurridas en la e#perimentación se presentan y se describen a continuación. El m"todo de Lory inicia con la adición del reactivo de Biuret a las muestras a traba+ar% el reactivo de Biuret est compuesto por una disolución bsica de sul,ato de cobre ('u/01) lo cual permite la ,ormación de un comple+o oranometlico donde el centro metlico ser el 'u-2% los pares electrónicos presentes en los tomos de 3itróeno se coordinan al centro metlico% adems debido a la eometría plana del enlace peptídico y la tetra$"drica del carbono 4% los cuatro enlaces coordinados entre los nitróenos y catión cobre (55) solo es posible si en la cadena de 46aminocidos e#isten dos% tres o ms enlaces peptídicos se!n se trate de una estructura $"lice o pleada de la proteína. La coordinación de los cationes cobre (55) se repite sistemticamente a lo laro de todo la estructura de cadena proteica. El medio bsico en el cual est presente el /ul,ato de 'obre% permite la ,ormación de $idró#ido de cobre ('u(07)-) el cual se disocia como 'u-2 y -076% por lo tanto $ay iones c!pricos presentes en solución acuosa para poder reaccionar% adems de ello evita la reducción a 'obre (5).
+i,ura 1. Reacción del reactivo de iuret con los enlaces pept(dicos& Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .
8ara aumentar la sensibilidad de la reacción de Biuret% el comple+o proteína6'u-2 se $ace reacciona con el reactivo de ilon6 'iocalteus% dando una coloración azul% con un m#imo de absorción de 9; nm . Esta coloración se atribuye a la reducción del ?cido ,os,omolibdico ,os,otunstico a azul de $eteropolimolibdeno de composición no de,inida por medio de los residuos tirosilos% tripto,anilos% ye una menor rado% cisteínilos e $istidilos de la proteína *ue ,orman comple+o con 'u-2 . Anas determinadas características del m"todo de Lory son la intensidad de la coloración% *ue varía con la composición de aminocidos de de la proteína% es ms sensible *ue el m"todo de Biuret. El rano es de ;%=6 = mmL. la reacción de Lory se puede represar mediante el siuiente es*uema (,iura -).
+i,ura 2. s/uema para la reacción de o!r"&
La e#perimentación para esta prctica se realizó en dos sesiones en la primera sesión no se obtuvieron los resultados esperado% debido a una serie de errores e#perimentales cometidos por cada rupo de traba+o% uno de ellos ,ue el no desenrasado de las muestras de caseína% la cual se e#tra+o en ,unción del punto isoel"ctrico% otro error *ue se cometió ,ue el tiempo de reacción para Lory% cada rupo no se sincronizo para poder obtener un buen resultado% los valores obtenidos en esta sesión se reportaron en las tablas =% -% % 1% == y =-. /e tomó un rano de concentraciones para las curvas de calibración de ; a ; ppm% *ue es un rano muy pe*ueCo para las muestras% en las ,iuras se representan las curvas de calibración realizadas para la alb!mina (tabla =) en donde la absorbancia - corresponde la tomada por mi rupo. /e realizó una comparación entre etas tres r,icas y se obtiene *ue la me+or ra,ica para representativa es la *ue nosotros realizamos debido a *ue el coe,iciente de 8irson (R -) posee una mayor linealidad *ue las dems (ver tabla =). Coe-iciente de earson / R2 0 cuación de la recta
Absorbancia 1
Absorbancia 2
Absorbancia 3
0,957
0,997
0,934
"0,000711 0,002714
" 0,000602 0,000333
" 0,000557 0,00357
Tabla 1!. 'oe#icientes " ecuaciones de las rectas representadas en la #i$ura 3& Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .
0!04 0!04 0!03 A"#$"%&'(% 1 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+ A"#$"%&'(% 2 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+ L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+ A"#$"%&'(% 3 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 3+
0!03 Absorbancia
0!02 0!02 0!01 0!01 0 0
10
20
30
40
50
0
Concentracion / ppm
+i,ura 3. 'omparación entre las curvas de calibración para la tabla 1&
& las mismos patrones se les adiciono el reactivo de Lory *ue se tomó un tiempo de reacción apro#imadamente durante =; minutos% los resultado de esta parte de la e#perimentación se consinan en la tabla -. /e procedió a ra,icar los datos obtenidos para cada rupo% la r,ica 1 re,le+a los datos presentes en la tabla -. La absorbancia corresponde a la tomada por nuestro rupo. 0!1 0!0/ 0!0. 0!00!0 0!05 Absorbancia 0!04 0!03 0!02 0!01 0
A"#$"%&'(% 1 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+ A"#$"%&'(% 2 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+ L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+ A"#$"%&'(% 3 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 3+ 0
10 20 30 40 50 0
Concentracion / ppm
+i,ura . 'omparación de las curvas de calibración para la tabla 2& Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .
/i comparamos estas tres curvas de calibración la me+or se para ,iura 1 (ver tabla =9) se puede observar *ue la curva de absorbancia = posee me+or linealidad *ue las dems por lo tanto es la me+or Coe-iciente de earson / R2 0 cuación de la recta
Absorbancia 1
Absorbancia 2
Absorbancia 3
0,964
0,7%3
0,1%2
" 0,000509 0,001619
" 0,000%69 ) 0,00104%
" 0,000769 0,007619
Tabla 1". 'oe#icientes " ecuaciones de las rectas representadas en la #i$ura 4&
La muestra para la curva de calibración de 'aseína se realizó por di,erentes rupos en donde como patrón primario se utilizó caseína con un buen porcenta+e de pureza% en la tabla se representan las absorbancias de cada concentración obtenida% se representaron las r,icas correspondiente en la ,iura % en la tabla = se especi,ica las características de la ,iura . 0!01 0!01 0!01 0!01 Absorbancia
A"#$"%&'(% 1 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+ A"#$"%&'(% 2 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+ L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+
0!01 0 0 0 0
10 20 30 40 50 0
Concentracion / ppm
+i,ura !. 'omparación de las curvas de calibración para la tabla 3&
Coe-iciente de earson / R2 0 cuación de la
Absorbancia 1 0,9%4
Absorbancia 2 0,975
" 0,000246 0,000524
" 0,000249 0,000952
Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .
recta Tabla 1#. 'oe#icientes " ecuaciones de las rectas representadas en la #i$ura 5&
/e!n la ,iura y la tabla = la me+or linealidad la representa la absorbancia =. & los patrones se les adiciono Lory y se de+ó reaccionar durante =; min y se obtuvieron los datos *ue estn consinados en la tabla 1% se compararon estos datos con una r,ica *ue se representa en la ,iura 9 y las características de las r,icas se representan en la tabla =. 0!05 0!04 0!03 0!02 0!01 Absorbancia
0 0!01
0
10 20 30 40 50 0
0!02
A"#$"%&'(% 1 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+ A"#$"%&'(% 2 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+ A"#$"%&'(% 3 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 3+
0!03 0!04 Concentracion / ppm
+i,ura ". 'omparación de las curvas de calibración para la tabla 4&
Coe-iciente de earson / R2 0 cuación de la recta
Absorbancia 1 0,0445
Absorbancia 2 0,631
" 0,0001%6 ) 0,01%476
" 0,000674 ) 0,006524
Absorbancia 3 0,011
" )0,000066 ) 0,016%57
Tabla 1$. 'oe#icientes " ecuaciones de las rectas representadas en la #i$ura 6&
La ra,ica *ue posee mayor linealidad es la de absorbancia -. En la seunda sesión se lleó a un acuerdo por cada rupo en donde se acordó una me+or sincronización% un desenrasado de muestra de caseína% y la corrección para la concentraciones de la curva de calibración% los resultados obtenidos en esta sesión se consinaron en las tablas %9% % % F y =;. &$ora se proceder de la misma manera para ra,icar y comparar los resultados de di,erentes rupos% y posteriormente a este se comparar los datos de la primera sesión con los de la seunda sesión. Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .
La ra,ica muestra la comparación de los resultados de la tabla *ue corresponde a la curva de calibración de la &lb!mina% en la tabla =F se representa las características de la ,iura . 'abe resaltar *ue la absorbancia ,ue tomada por nuestro rupo 0!2 0!1. 0!1 0!14 0!12 Absorbancia
A"#$"%&'(% 1 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+ A"#$"%&'(% 2 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+
0!1 0!0. 0!0 0!04 0!02 0 0
50 100 150 200 250 300 Concentracio / ppm
+i,ura #. 'omparación de las curvas de calibración para la tabla 5& Albumina sin o!r" se$unda sesión&
Coe-iciente de earson / R2 0 cuación de la recta
Absorbancia 1 0,995
Absorbancia 2 0,999
" 0,000711 0,006%10
" 0,0006%1 0,000524
Tabla 1%. 'oe#icientes " ecuaciones de las rectas representadas en la #i$ura 7&
/e concluye *ue la r,ica &bsorbancia - posee mayor linealidad. /e adicionaron a los patrones el reactivo de Lory y se tomó un tiempo de reacción de =; minutos% estos datos estn consinados en la tabla 9% la ,iura y la tabla -; representan las características de las r,icas.
Coe-iciente de earson / R2 0 cuación de la recta
Absorbancia 1 0,935
Absorbancia 2 0,3%7
" 0,000965 ) 0,02523%
" 0,000522 ) 0,020952
Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .
Tabla 2&. 'oe#icientes " ecuaciones de las rectas representadas en la #i$ura %&
0!25 0!2 0!15 Absorbancia
A"#$"%&'(% 1 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+ A"#$"%&'(% 2 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+
0!1 0!05 0 0 50 100150200250300 0!05 Concentracion / ppm
+i,ura $. 'omparación de las curvas de calibración para la tabla 6& Albúmina con o!r" con 10 min de reacción, se$unda sesión&
La ra,ica absorbancia = posee la me+or linealidad. /e tomó un tiempo de reacción de ; minutos los resultados estn consinados en la tabla % se compararon las dos absorbancias tomadas y estas se presentan en la ,iura F y en la tabla -=. 0!3 0!25 0!2 0!15
A"#$"%&'(% 1 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+ A"#$"%&'(% 2 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+
A"#$"%&'(% 0!1 0!05 0 0
100
200
300
0!05
'#&')&$%'(#&
Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .
+i,ura %. 'omparación de las curvas de calibración para la tabla 7& Albúmina con un tiempo de reacción de 30 min, se$unda sesión&
Coe-iciente de earson / R2 0 cuación de la recta
Absorbancia 1 0,9525
Absorbancia 2 0,45%2
" 0,0011 ) 0,0274
" 0,0007 ) 0,0307
Tabla 21. 'oe#icientes " ecuaciones de las rectas representadas en la #i$ura 9&
8ara la curva de calibración de la caseína se tomaron las mismas concentraciones y se prepararon los patrones% primero se midieron las absorbancias sin Lory estos datos se consinaron en la tabla % se representaron los datos en la ,iura =; y las características de estas se representaron en la tabla --. 0!25 0!2 0!15 A"#$"%&'(% 1 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+ A"#$"%&'(% 2 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+
A"#$"%&'(% 0!1 0!05 0 0
50 100 150 200 250 300
C#&')&$%'(#&
+i,ura 1&. 'omparación de las curvas de calibración para la tabla %& 'ase(na sin o!r", se$unda sesión&
Coe-iciente de earson / R2 0 cuación de la recta
Absorbancia 1 0,903
Absorbancia 2 0,996
" 0,000% ) 0,0119
" 0,000% ) 0,003%
Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .
Tabla 22. 'oe#icientes " ecuaciones de las rectas representadas en la #i$ura 10&
De la misma manera se representaron los valores de la tabla F *ue corresponden a un tiempo de reacción de =; minutos. 0!2 0!15 0!1 A"#$"%&'(% 1 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+ A"#$"%&'(% 2 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+
A( T(6) 0!05 0 0
50 100 150 200 250 300
0!05
A( T(6)
+i,ura 11. 'omparación de las curvas de calibración para la tabla 9, 'ase(na con un tiempo de reacción de 10 min, se$unda sesión&
Coe-iciente de earson / R2 0 cuación de la recta
Absorbancia 1 0,960
Absorbancia 2 0,%603
" 0,000% ) 0,0069
" 0,0007 ) 0,0377
Tabla 23. 'oe#icientes " ecuaciones de las rectas representadas en la #i$ura 11&
8ara un tiempo de reacción de los patrones con caseína de ; minutos los datos obtenidos se representan en la tabla =;% se ra,icaron los datos (,iura =-) y las características se representaron en la tabla -1.
Coe-iciente de earson / R2 0 cuación de la recta
Absorbancia 1 0,972
Absorbancia 2 0,96%
" 0,0009 ) 0,0079
" 0,0006 ) 0,0006
Tabla 2. 'oe#icientes " ecuaciones de las rectas representadas en la #i$ura 12& Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .
0!3 0!25 0!2
A"#$"%&'(%
0!15
A"#$"%&'(% 1 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+ A"#$"%&'(% 2 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+
0!1 0!05 0 0 50 100150200250300
C#&')&$%'(#&
+i,ura 12. 'omparación de las curvas de calibración para la tabla 10& 'ase(na con o!r" con un tiempo de reacción de 30 min, se$unda sesión&
En comparación de las dos sesiones de traba+o en la seunda sesión se obtuvo un resultado me+or% debido a *ue se tuvo un mayor cuidado de traba+o% se tomaron las me+ores ra,icas de cada sesión teniendo en cuanta el coe,iciente de 8earson *ue se encuentran en las respectivas tablas para cada r,icas y se compararon en las ,iuras =%=1 y = y=9% no se puedo comparar los tiempos de reacción de ; min debido a *ue solo se realizó una vez% en la seunda sesión% pero si se observan sus respectivos coe,icientes de 8earson $ay unas absorbancias *ue poseen mayor linealidad. 0!1. 0!1
R7 8 1
0!14 0!12 0!1
A"#$"%&'(% 0!0.
R7 8 1
0!0 0!04
P$()$% ) (#& L(&)%$ *P$()$% ) (#&+ S)9&;% )(#& L(&)%$ *S)9&;% )(#&+
0!02 0 0 50 100 150 200 250 300
C#&')&$%'(#&
Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .
+i,ura 13. 'omparación de las curvas de calibración de la primera " la se$unda sesión para la Albúmina sin o!r"& 0!25 R7 8 0!/4
0!2 0!15
A"#$"%&'(%
0!1 R7 8 0!/
0!05
S)9&;% )(#& L(&)%$ *S)9&;% )(#&+ P$()$% ) (#& L(&)%$ *P$()$% ) (#&+
0 0
50 100 150 200 250 300
0!05
C#&')&$%'(#&
+i,ura 1. 'omparación de las curvas de calibración de la primera " la se$unda sesión para la Albúmina con o!r" " 10 min de reacción& 0!25 0!2
R7 8 1
0!15 P$()$% ) (#& L(&)%$ *P$()$% ) (#&+ S)9&;% )(#& L(&)%$ *S)9&;% )(#&+
A( T(6) 0!1 0!05 R7 8 0!/.
0 0
50 100 150 200 250 300
A( T(6)
+i,ura 1!. 'omparación de las curvas de calibración de la primera " la se$unda sesión para la 'ase(na sin o!r"
Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .
0!2 0!1.
R7 8 0!/
0!1 0!14 0!12
A"#$"%&'(%
0!1
P$()$% ) (#& L(&)%$ *P$()$% )(#&+ S)9&;% )(#& L(&)%$ *S)9&;% )(#&+
0!0. 0!0 0!04
R7 8 0!3
0!02 0 0
50 100 150 200 250 300
C#&')&$%'(#&
+i,ura 1". 'omparación de las curvas de calibración de la primera " la se$unda sesión para la 'ase(na con o!r" " un tiempo de reacción de 10 min&
La comparación de los traba+os realizados en la primera y la seunda sesión permiten observa la ran di,erencia e#istente% anteriormente se $an nombrado aluno problemas *ue ,ueron correidos para poder obtener un me+or resultado el cual es muy evidente% adems se puede observar *ue una curva de calibración sirve siempre y cuando en el lote de traba+o los paramentos utilizados sean constantes% en otras palabras *ue no cambien nin!n reactivo% o al!n paso de la e#perimentación% o la calibración del espectro,otómetro y $asta los e#perimentadores. /e de,ine sensibilidad como la pendiente de la curva de calibración de inter"s% esta de,inición aceptada por la 5A8&' % aun*ue esta tambi"n est dada por los límites de detección y los límites de cuanti,icación% en la tabla - se comparan las pendientes de las rectas de las r,icas de la seunda sesión de traba+o. /i se observa las pendientes *ue corresponden a la adición de Lory poseen un mayor rado de sensibilidad% *ue es el resultado esperado. 'uestra Albúmina 'ase(na
in (o)ry 0,0006%1 0,000%0
1& min con (o)ry 0,000965 0,000%0
3& min con (o)ry 0,0011 0,0009
Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .
Tabla 2!. 'omparación de la sensibilidad de las curvas de calibración realiadas en la se$unda sesión, se tomaron las pendientes de las meores curvas de calibración se$ún el par8metro de coe#iciente de earson
Las muestras estudiadas se reportan en las tablas = y =1% el tratamiento preliminar de las muestras se realizaron de la siuiente manera. Las muestras correspondientes a la tabla = ,ueron sólida y li*uida% la muestra sólida correspóndete a lec$e en polvo se llevó a una concentración de ;; ppm% en donde se diluyeron ;%- en -; mL de aua% despu"s se tomó - mL y se a,oro a - con aua% con la muestra li*uida (muestra problema -) se realizaron diluciones se tomaron - mL y se a,oraron a - mL de aua% la muestra de albumina de $uevo se preparó tomando el volumen total de la clara del $uevo la *ue se diluyo en -; mL de aua% posteriormente se centri,uo para poder eliminar suspensiones espumosas *ue podrían actuar como inter,erencia en la medida% Las muestras reportadas en la tabla =1 se prepararon de la siuiente manera% La muestra correspondiente a la caseína con rasa se preparó a partir de ;; mL de lec$e% en donde se llevó a un p7 entre 16 unidades con cido cítrico (limón) para realizar la separación en ,unción del p5 (presencia del Giterion)% la mezcla se de+ó reposar durante = día% posteriormente se centri,uo veces y se eliminó el lí*uido sobrenadante separando la muestra sólida el cual se lavó con aua y para así arantizar la eliminación de partículas de cido cítrico% se secó la caseína en la estu,a a una temperatura de 6; H'% de a*uí despu"s del secado se tomaron ;%= de caseína y se a,oro a -; mL con aua (1;; ppm)% parte de la muestra de caseína se e#tra+o y se realizó un proceso de desenrasado% se adiciono etanol lo *ue arantizaba esto% y así evitar un reporte erróneo de la medida de la absorbancia% se tomaron ;%;= y se a,oraron con aua a =;; mL (=;; ppm). 'on la ayuda de las ecuaciones de las me+ores curvas de calibración para la alb!mina y la caseína se proceder a calcular la concentración de las muestras problemas (tabla = y =1). 8ara la alb!mina las me+ores rectas se pueden observar en las tablas =F% -; y -=% cuyas ra,icas corresponden a las ,iuras % y F respectivamente. 8ara la muestra problema = (tabla =) cuya absorbancia sin el reactivo de Lory es ;%;9 y ecuación de curva de calibración es y =0,000681 x + 0,000524 se calcula la concentración de la siuiente manera: 8rimero la variable independiente representa la concentración (ppm) y la Iariable dependiente y representa la &bsorbancia% por ende si despe+amos de la ecuación de la recta podemos encontrar el valor de la concentración de la muestra *ue $a absorbido un una determinada lonitud de onda. x
=
y m
−
b
(1)
En donde m es la pendiente de la recta y b es el intercepto. &$ora reemplazamos cada valor en (=) y se obtiene Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .
x
=
0,067 0,000681
−
0,000524
=
98,38 ppm
/e procede de la misma manera para cada valor correspondiente de la tabla = y =1 con su respectiva ecuación de recta y se enera la tabla -9.
'uestra
uestra problema 1 -sólida. uestra problema 2 -li/uida. Albúmina de uevo 'ase(na $rasosa 'ase(na sin $rasa
Concentración /ppm0 0 min 10min 30 min 9%,3% 16,61 )0,%%2
20%,52
119,20
101,%5
195,30 161,26 166,26
150,94 )17,50 )64,50
95,4% )34,44 14,45
Tabla 2". Resultado de las concentraciones en ppm para cada muestra problema tratada
Los resultados obtenidos no ,ueron los esperados% las inconsistencias corresponden a determinados errores% si se observa en las tablas = y =1 $ay absorbancias con valores neativos% en la literatura se encontró *ue este tipo de errores se deben a cuatro tipos de posibles causas % la primera es la no presencia de muestra en la celda% una seunda causa es la mala inserción de la celda en el e*uipo% una tercera causa puede ser una selección errónea de la lonitud de onda% una cuarta causa es la calibración errónea del espectro,otómetro% cada una de estas causa tiene una posible solución por e+emplo para la tercera causa se debe a+ustar la lonitud de onda al rano compatible con el anlisis% en nuestro caso se realizó la medición a sus respectivas lonitudes de ondas para enerar la m#ima absorción de la muestra% para la reacción sin Lory ,ue -; y para las reacciones con Lory ,ue 9;% *ue coinciden con los valores teóricos reportados % alunas muestras presentaron una absorción muc$o menor a las del rano permitido% $aciendo *ue estas absorbancias este por deba+o del límite de detección (intercepto de la recta en el e+e de las ordenadas) J /e podría pensar en una interpolación de la recta para permitir *ue la absorbancia caia dentro de la curva de calibración% pero analíticamente no se puede realizar ya *ue la curva de calibración es una parte de una curva% adems los límites de detección y cuanti,icación dela curva de calibración obtenida se!n los parmetros obtenidos se vería a,ectados y la desviación estndar de estos aumentaría por ende el error tambi"n aumentaría% otro posible error es el error 7umano% ya *ue las muestras problemas ,ueron tratadas por di,erentes personas% y es sabido *ue cada persona tiene un determinado error de traba+o. La concentración de la muestra total es posible calcular a partir de las concentraciones obtenidas por la absorbancia% si se $ace una relación entre la concentración Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .
obtenida a unos determinados ramos o mL traba+os con el peso o volumen total de la muestra. &$ora en,aticemos un poco sobre la e#tracción de la caseína% es sabido *ue la lec$e posee diversas proteínas de las cuales la caseína es la ms abundante representando ms de ;K de contenido total de proteínas. Las caseínas de la lec$e tienen pesos moleculares *ue oscilan entre -.;;; y 1;.;;;J las ms importantes son la 4% la y la M% *ue representan% respectivamente% el ;% ; y =K del total de las caseínas. En la lec$e% estas proteínas se asocian entre sí para ,ormar micelas% *ue se encuentran estabilizadas y solubilizadas racias a la presencia de la caseína M% y del calcio (ver ,iura =).
+i,ura 1#. icelas de case(na en la lec*e&
La propiedad característica de la caseína es su ba+a solubilidad a p7 1%9. El p7 de la lec$e es 9%9 apro#imadamente% estando a ese p7 la caseína carada neativamente y solubilizada como sal clcica. /i se aCade cido a la lec$e% la cara neativa de la super,icie de la micela se neutraliza (los rupos ,os,ato se protonan) y la proteína neutra precipita
+i,ura 1$& Reacción para la etracción dela case(na&
'omo recomendaciones para un me+or resultado en el traba+o se pueden enumerar: 1. 8ara enerar un me+or resultado la e#tracción de la caseína se debe realizar con un
cido d"bil y diluido para así arantizar un me+or control en el radiente de p7 -) /i la absorbancia es mayor al límite superior del rano de medida% siempre se puede realizar la dilución correspondiente para introducirla en el rano del m"todo. 8ero si Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .
) 1) ) 9)
es in,erior al límite de cuanti,icación del m"todo seleccionado% $ay *ue emplear un m"todo ms sensible. 8ara la determinación de la absorbancia despu"s de la adición del reactivo de Lory% se debería planear un m"todo para poder arantizar una sincronía en con el tiempo de reacciones estimado El desenrasado de la muestra de caseína es importante para evitar inter,erencias% es por ello *ue el lavado adecuado con etanol ayuda a reducir este inconveniente 8ara el tratamiento de la muestra de albumina es necesario $acer un determinado n!mero de centri,uaciones para eliminar las inter,erencias posibles% estas con la ayuda de la ,uerza centrí,ua pueden llevarse a la separación de la disolución. /e deben tener en cuenta los parmetros *ue puedan enerar un valor neativo en la medida de absorbancia y solucionarlos de manera e,iciente y precisa. 4. Conclusiones
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La comparación del traba+o de varios rupos pudo rea,irmar *ue cada persona tiene un determinado estilo de traba+o lo *ue es un parmetro importante al momento de realizar un anlisis cuantitativo% adems es importante tener en cuenta *ue para un determinado lote de muestras le corresponde una determinada curva de calibración% una determinada calidad de reactivo% adems una determinada especie de reactivos. Las pendientes de cada una de las rectas son las sensibilidades de cada uno de los m"todos% y sus valores tambi"n son los correspondientes coe,icientes de absorción de los comple+os proteína6reactivo. El m"todo de Lory posee una me+or sensibilidad *ue el m"todo de Biuret% esto se pudo comprobar con la sensibilidad ( pendiente de la recta se!n la 5A8&') de cada curva de calibración realizada% adems el coe,iciente de 8erson es un parmetro lineal *ue arantiza la calidad y la eneración de resultados proporcionales a la concentración del analito en las muestras dentro de un determinado rano La eliminación de cual*uier tipo de inter,erencias de las muestras de traba+o arantizara un me+or reporte en el anlisis% adems si la absorbancia de la muestra est dentro del rano de medida del m"todo seleccionado% mediante la ecuación de la recta de calibrado se puede calcular la concentración de proteína de la disolución problema. !. 4iblio,ra-ía
:1; , 'rouc* R& rincipios de an8lisis instrumental, 6 ta d, editorial? 'en$a$e earnin$ eico +&@ 200%, p8$& 20& :2; *ttp?catedras&/uimica&unlp&edu&ar/o3Apuntesroteinas&pd# -consultado 2%042013.
Determinación cuantitativa de proteínas y determinación cualitativa de Caseína .
:3; *ttp?!!!&bvsde&pa*o&or$bvsacdcd29laboratoriocap11&pd# -consultado 11052013. :4;*ttp?depa&#/uim&unam&mam"darc*iveroABCA+DEFCDD'AGRDBHAI12313&pd# -'onsultado 11052013. :5;*ttp?!!!&u*u&es4%0004034documentosJ20deJ20tetopracticasprotocoloIpracticasIalimentosI0%I09&pd# -'onsultado 11052013.
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