Informe carbohidratos

1

Determinación cualitativa y cuantitativa de azúcares reductores. Beltrán Beltrán Jadir Esteban Universidad Nacional de Colombia sede Manizales

Información del artículo abstract Historia del artículo: Recibido: 1 de septiembre de 2017 Palabras claves: Carbohidrato Azúcar reductor Método DNS Dilución Espectrofotómetro

1.

El propósito de esta investigación se encuentra en aplicar y entender diferentes métodos que han sido utilizados para la identificación cualitativa y cuantitativa de algunos carbohidratos, en especial utilizando el método DNS para la identificación de azucares reductores, con ayuda de una curva de calibración. El principal resultado obtenido en la muestra fue de 40,26 g/L y la conclusión principal es que los métodos experimentales son de gran importancia a la hora de entender el funcionamiento de los carbohidratos.

Introducción

Los carbohidratos son compuestos orgánicos que contienen carbono, hidrógeno y oxígeno. Son las moléculas fundamentales de almacenamiento de energía en la mayoría de los seres vivos y forman parte de diversas estructuras de las células vivas. Los carbohidratos -o glúcidos- pueden ser moléculas pequeñas, (azúcares), o moléculas más grandes y complejas (Curtis, Barnes, Schnek, Massarini; Biología). Por lo tanto, al ser moléculas con estas funciones tan fundamentales  para la vida, requieren un estudio de sí el cual permita tener conocimientos que sirvan para lograr avances científicos. Dentro de los diferentes tipos de carbohidratos, existen los llamados azucares reductores, los cuales tienen como especialidad el poseer un grupo funcional aldehído o cetona añadido en su estructura molecular y con esto tener la capacidad de reducir otros compuestos por acción de la reactividad del doble enlace del oxígeno. Durante este informe de practica experimental se espera conocer el contenido de azucares reductores de forma cualitativa y cuantitativa de una solución X, para conseguir estos objetivos se hace uso de tres métodos experimentales, cada uno con su propósito en la identificación de azúcares. En primer lugar, se aplicó el método de Benedict para determinar de forma cualitativa la presencia de azúcares reductivos en una solución, esto se logra por la reacción que ocurre entre el reactivo de Benedict que contiene cobre y el azúcar reductor. Otro método de determinación cualitativa que se implementó en el laboratorio fue el de Lugol, este sirve para la identificación de almidón, esto se puede lograr si agregamos el reactivo de Lugol el cual en presencia de azucares reductivos experimenta un cambio de coloración. El procedimiento que permitió la determinación cuantitativa de azúcares en una solución X la cual no ha sido estudiada

 previamente fue el DNS. Este método se basa en la preparación de patrones para construir una curva de calibración la cual origina una ecuación en la que se pueden ubicar los valores obtenidos y con esto encontrar la concentración de azúcar. Lo anterior haciendo uso del espectrofotómetro para calcular absorbancias en las soluciones. 2. Materiales y métodos

 Materiales 

Tubos de ensayo



Estufa



Beaker 250 ml



Placa de calentamiento



Gradilla



Recipiente con hielo



Cubeta espectrofotométrica



Espectrofotómetro



Pipetas 1,2 y 5 ml



Pipeteador 

2.1 Identificación cualitativa por medio del método de Benedict Prepare tres tubos de ensayo en donde se elaborará el patrón teórico negativo, el patrón teórico positivo y un tercero el cual contendrá la muestra que se desea analizar, el patrón teórico negativo consiste en un tubo de ensayo que contiene 2 ml de H2O + 1 ml de reactivo Benedict, el positivo consta de 2 ml de H2O + 1 ml de reactivo Benedict + 2 ml de glucosa 0,4% y en el tercer tubo de ensayo simplemente se agregarán 2 ml de la muestra problema + 1 ml de reactivo Benedict. Es importante resaltar que se deben colocar los tubos en calentamiento para

2

 producir un aceleramiento en la reacción, este proceso se da en  baño de agua hirviendo durante 5 minutos, para al final comparar las coloraciones producidas. La velocidad de reacción es muy importante. La fructosa reacciona muy rápidamente, glucosa y galactosa más lentamente. Incluso el almidón y la celulosa darán resultados débiles si la solución se calienta ampliamente. (Universidad Nacional, n.d.; Firdouse y Alam, 2011). 2.2 Identificación cualitativa de almidón por medio del método de Lugol

Curva patrón 2

   m    n    0 1.5    4    5    a 1    a    i    c    n 0.5    a     b    r    o 0    s     b    A

y = 0.4137x + 0.0165 R² = 0.9975

1.644 0.895

0.24 0 0.09 0 1

0.436 2

3

4

5

Concentración (g/L)

Consiste en la preparación de dos patrones teóricos, negativo y  positivo, en dos tubos de ensayo diferentes. El negativo con 2 ml de H2O + 5 gotas del reactivo de Lugol, mientras el positivo con 2 ml de solución de almidón al 10% + 5 gotas del reactivo de Lugol. Con respecto a la muestra, en un tercer tubo de ensayo se agregan 2 ml de la muestra problema + 5 gotas del reactivo de Lugol. Posterior a la preparación en los tres tubos de ensayos, se deben observar los cambios de color y comparar para analizar los resultados. 2.3 Determinación cuantitativa de azúcares reductores por medio del método DNS Es de gran importancia saber que este método tiene un rango de medición de 0 hasta 4 g/L. El procedimiento consiste en diseñar una curva de calibración de concentración vs absorbancia, para esto es necesario disponer de cuatro tubos de ensayo en lo s cuales se depositarán diferentes pero conocidas concentraciones de glucosa disuelta en agua en un rango de 0 a 4 g/L, a este paso se le llama,  preparación de patrones del método DNS. Posterior a la preparación de los patrones, se involucra la solución X con concentración desconocida, a la cual se le debe hacer una suposición de concentración, en este caso corresponde a 30 g/L, esto con el fin de hacer más soluciones con concentraciones menores a la que se supuso, de esta manera se tendrán tres soluciones relacionadas a la solución problema con ciertas concentraciones supuestamente conocidas, para la  práctica experimental, 20 g/L, 2 g/L y 0,2 g/L. Para continuar con el experimento, es necesario calentar en baño de maría durante 5 minutos para luego retirar y enfriar en hielo y con esto guardar en la oscuridad durante 15 minutos. El paso final consiste en medir la absorbancia que debe ser tomada en el espectrofotómetro a una longitud de onda óptima de 540 nm y con esto poder construir una curva de calibración que me relacione las variables. 3. Resultados Tabla 1. Ilustración detallada de recolección de datos del método DNS.

Tubo 1 2 3 4 5 6 7

Concentración

Absorbancia

0 (blanco) 0,25 0,5 1 2 4 Muestra

0 0,09 0,240 0,436 0,895 1,644 1,127

Fig. 1. Curva patrón absorbancia vs concentración

Al tomar los datos de absorbancia se obtiene un R=0,9987 lo que indica la alta correlación entre los datos necesarios para la construcción de la curva de calibración, dando como resultado una ecuación para la recta igual a: Abs=0,4137[ ]+0,0165 donde [ ] es la concentración en g/L de glucosa. Al analizar las tres soluciones derivadas de la muestra  problema, se determinó una absorbancia fuera del rango de 0-4 g/L, como era de esperarse, pues es aquella muestra con supuesta concentración de 20 g/L, para las que tienen concentración supuesta de 2 g/L y 0,2 g/L s e obtuvieron valores de absorbancia de 1,127 y 0,7 respectivamente. Tabla 2. Ilustración detallada de supuestas concentraciones. Comparación con [ ] Supuesta real

concentración [g/L] 20 2 0,2

20/30 2/30 0,2/30

Absorbancia

2,53 1,127 0,7

Remplazando para 1,127 como valor de absorbancia en la ecuación se obtiene un valor para la concentración de: 1,127=0,4137[ ]+0,0165 [ ]=2,6843 g/L Remplazando para 0,7 como valor de absorbancia en la ecuación se obtiene un valor para la concentración de: 0,7=0,4137[ ]+0,0165 [ ]=1,6521 g/L Para poder determinar la verdadera concentración de la solución problema, es necesario identificar los factores de dilución de aquellas diluciones con concentración menor a la que se supuso inicialmente, este paso será mostrado a continuación: *La suposición inicial que corresponde a 30 g/L ahora será la concentración real R. *Las concentraciones de 20 g/L, 2g/L y 0,2g/L serán equivalentes a 20/30 de R, 2/30 de R y 0,2/30 de R, respectivamente. Si nos fijamos en los valores dados por la concentración de suposición de 2g/L: (2/30) *R=2,6843g/L R=40,26 g/L

3

Ahora si se hace el enfoque en la concentración de 0,2 g/L: (0,2/30) *R=1,6521g/L R=247,815 g/L 4. Fundamento químico y resultados

4.1 Método de Benedict El procedimiento se basa en observar el cambio de coloración que se genera en la reacción del reactivo de Benedict con el medio en el cual se disuelve, ya que este reactivo contiene sulfato cúprico, el cual por e Cu 2+ adquiere un color azul, pero que, en contacto con un azúcar reductor, se reduce dicho ion a Cu+  que se distingue por su color rojo-naranja (Universidad Jorge Tadeo Lozano, Laboratorio de Química Orgánica). 4.2 Método de Lugol Este método se usa para identificar polisacáridos. El almidón en contacto con unas gotas de Reactivo de Lugol (disolución de yodo y yoduro potásico) toma un color azul-violeta característico. La coloración producida por el Lugol se debe a que el yodo se introduce entre las espiras de la molécula de almidón. No es, por tanto, una verdadera reacción química, sino que se forma un compuesto de inclusión que modifica las  propiedades físicas de esta molécula, apareciendo la coloración azul violeta. El color que dan los polisacáridos con el Lugol (solución de I 2 y de IK) se debe a que el I 2 ocupa espacios vacíos en las hélices de la cadena de unidades de glucosa, formando un compuesto de inclusión que altera las propiedades físicas del polisacárido, especialmente la absorción lumínica. Esta unión del I 2  a la cadena es reversible, y por calentamiento desaparece el color, que al enfriarse reaparece. En presencia de almidón, el Lugol genera un color azul oscuro ( Morrison y Boyd, Química Orgánica.). 4.3 Método DNS La técnica colorimétrica se basa principalmente en una reacción de los grupos reductores de los azucares con el reactivo oxidante DNS, seguido de una determinación espectrofotométrica. Se utilizará el reactivo 3,5 dinitrosalicilato (DNS); este reactivo fue introducido por Summer en 1921 para la determinación de sustancias reductoras en sangre y orina. Resultados: En presencia de azúcares reductores el 3,5 dinitrosalicilato es reducido a 3,5 diminosalicilato. Este compuesto presenta un máximo de absorción a 540 nm y, por lo tanto, el valor de la absorbancia a dicha longitud de onda será  proporcional a la concentración de azúcares reductores  presentes en el medio. 5. Discusión

Los datos obtenidos para la construcción de la curva de calibración se correlacionaron de buena manera obteniéndose un coeficiente de correlación de 0,9975 demostrando el buen  procedimiento experimental que se dio a la preparación de  patrones, sin embargo, a partir del análisis cuantitativo que se realizó a la solución de concentración desconocida de glucosa,

se logró obtener dos diluciones de menor concentración las cuales entraron en el rango de absorbancia válido para la ecuación de la curva de calibración. Estas diluciones tenían un valor con respecto a la solución real (R) de 2/30 R y 0,2/30 R, donde lo ideal sería obtener valores de R cercarnos para así dar una aproximación apropiada de la concentración de la solución  problema. Lamentablemente, la solución 2/30 R arrojó un resultado para R=40,26 g/L y la de 0,2/30 R de R=247,815 g/L,  produciéndose así resultados muy alejados, con una diferencia de 207,555 g/L. Con los resultados anteriores es difícil obtener una óptima y concisa respuesta a la concentración en glucosa de la muestra  problema, probablemente se realizó el procedimiento experimental con algunos errores sistemáticos producidos por el corto tiempo que se disponía para llevar a cabo el algoritmo. Debido a lo mencionado anteriormente, procesos de enfriamiento con hielo y reposo en oscuridad por aproximadamente 15 minutos para las diluciones con supuesta concentración, fueron ignorados por falta de tiempo, es quizás esto un factor que influyó negativamente en la obtención de medidas de absorbancia que eran de gran importancia en el momento del cálculo algebraico de la concentración real R. A pesar de los resultados con alto margen de diferencia se puede asumir que aquella dilución correspondiente a 0,2/30 R pudo tener un procedimiento erróneo el cual derivo en aquel resultado con tan alta concentración de glucosa (247,815 g/L), ya que si se hace un enfoque en la dilución de 2/30 R se obtiene una concentración real R con un valor que entra en el rango lógico que se habló durante la práctica experimental (40,26 g/L). Por lo anterior, el valor que se tomará en cuenta como resultado final de la práctica será de 40,26 g/L como concentración de glucosa en la solución problema. 6. Conclusiones

A partir de método experimentales se puede deducir de forma  precisa la presencia de azúcares reductores en soluciones. Esto se puede lograr de forma cuantitativa, por medio de métodos con el de Benedict o Lugol, donde involucran fenómenos físicos y químicos como la reducción de iones o cambios de coloración en las soluciones al ser puestas en contactos con los reactivos fundamentales del método, además también es posible identificar la concentración de soluciones de glucosa por medio del método DNS el cual por medio de una detallada curva de calibración permite encontrar dicha concentración. Es por esto que se puede concluir que el laboratorio de Biología celular y microbiología es muy práctico a la hora de entender el comportamiento de algunos carbohidratos y con esto lograr un adecuado aprendizaje sobre este importante grupo de moléculas fundamentales para la vida. Referencias

- Curtis, Barnes, Schnek, Massarini; Biología, 7ma Edición. - Universidad Nacional, n.d.; Firdouse y Alam, 2011. - Universidad Jorge Tadeo Lozano, Laboratorio de Química Orgánica. - Morrison y Boyd, Química Orgánica.

4