Informe - Actividad Peroxidasa y Pseudoperoxidasa

ACTIVIDAD PEROXIDASA Y PSEUDOPEROXIDASA EN EXTRACTO DEL FRUTO DE Daucus carota Y SANGRE HUMANA Angulo, Diana; Estrada, Luis F. y Gutiérrez, Gustavo. Espacio de Laboratorio de Bioquímica Facultad de Ciencias Naturales Universidad Icesi 1. RESULTADOS Se llevaron a cabo, en términos generales, dos grupos de ensayos: con muestras nativas y con muestras desnaturalizadas a fin de determinar si la actividad peroxidasa; descomposición del peróxido de hidrogeno H2O2 en oxígeno molecular O2 y agua H2O, se debe a la actividad de una enzima (Peroxidasa) u otro tipo de agente químico (Pseudoperoxidasa). Los resultados obtenidos en los ensayos con muestras nativas se encuentran en la tabla 1, en contraste, los resultados obtenidos con las muestras de extracto de fruto de Daucus carota y sangre humana desnaturalizadas se encuentran en la tabla 2. Cabe anotar la función de la bencidina, un reactivo incoloro que al oxidarse en presencia de oxígeno (Generado por la descomposición del H2O2) genera un viraje de color característico. Tabla 1. Resultados de ensayos con muestras nativas Muestra (mL)

Bencidina (gotas)

H2O2 (Gotas)

Resultado

Zanahoria

2

3

Positivo

Sangre diluida

2

3

Positivo

Tabla 2. Resultados de ensayos con muestras desnaturalizadas Muestra (mL)

Bencidina (gotas)

H2O2 (Gotas)

Resultado

Zanahoria

2

3

Positivo

Sangre diluida

2

3

Negativo

Adicionalmente, se puso a prueba la persistencia de la enzima en un tejido de algodón, manchándola con una muestra nativa de sangre, enjuagándola con agua y posteriormente realizando sobre ésta la prueba con peróxido de hidrógeno y bencidina generando un positivo como resultado. Tabla 3. Ensayo: presencia de actividad peroxidasa sobre una tela con residuos de sangre Material

Resultado

Tela con residuos de sangre

Positivo

Nota: Al agregar peróxido de hidrógeno sobre la tela no se observó la formación de burbujas, sin embargo si se generó el cambio de color al agregar la bencidina.

2. ANÁLISIS DE RESULTADOS

Es pertinente, en primera instancia, comentar un poco acerca del reactivo que hizo posible: La bencidina. Comenzando por el rearreglo que hace posible su síntesis con relativa facilidad (Figura 1)[1,2], éste compuesto de relativa sencillez estructural ofrece una alternativa sencilla para la determinación de la presencia de sangre sobre superficies como las telas, lo que resulta en una aplicación sin precedentes en criminalística, dado que como puede observarse en la tabla 3, aun enjuagando con abundante agua la superficie; es posible detectar la presencia de actividad peroxidasa; intuyendo así la presencia de sangre.

Figura 2. Esquema de reacción, oxidación de Bencidina

Figura 1. Rearreglo en síntesis de bencidina

Continuando, es conveniente definir los términos peroxidasa y Pseudoperoxidasa, dónde el último hace referencia a un compuesto no enzimático capaz de catalizar la descomposición del peróxido de hidrógeno (Permanganato de sodio, por ejemplo), mientras el primero hace referencia a una enzima con actividad peroxidasa. El método planteado permite diferenciar la presencia entre una y otra sustancia ya que si existe actividad peroxidasa antes de someter la muestra a altas temperaturas pero dicha actividad desaparece luego del calentamiento es posible intuir que el catalizador es termolábil, tal como las enzimas, pero si dicha actividad no desaparece después del calentamiento es posible afirmar que se trata de un catalizador no termolábil como los permanganatos y se estaría hablando de actividad pseudoperoxidasa.

La formación del compuesto coloreado que genera la oxidación de la bencidina (Figura 2) [3] es rápida y además es favorecida por el hecho de que la descomposición del peróxido de hidrogeno (de la cual se obtiene el oxígeno necesario para llevar a cabo la oxidación) es, termodinámicamente hablando, muy [4] favorable lo cual hace que el resultado sea de inmediato observable.

Al contrastar a tabla número 1 con la número 2 es fácil notar quién es quién, como puede observarse la actividad peroxidasa en la muestra de sangre desapareció después del calentamiento, mientras que la del extracto de zanahoria no, por tanto se puede afirmar que se trata de un compuesto pseudoperoxidasa mientras que la reacción es de tipo enzimático en el caso de sangre.

3. CONCLUSIONES  Es posible afirmar que la descomposición del peróxido de hidrogeno en la sangre es de tipo enzimático.  Por las pruebas realizadas después del proceso de calentamiento se concluye que la zanahoria cuenta con compuestos tipo pseudoperoxidasa.  Con el ensayo de la tela manchada de sangre y posteriormente enjuagada se demostró que la presencia de las peroxidasas persiste después del lavado, por tanto sugiriendo que es posible determinar facilmente la presencia de sangre residual en una prenda.

4. BIBLIOGRAFÍA 1. H. J. Shine, H. Zmuda, K. H. Kwart, A. G. Horgan, C. Collins, B. E. Maxwell: Mechanism of the benzidine rearrangement. Kinetic isotope effects and transition states. Evidence for concerted rearrangement, in: J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 955–956 2. H. J. Shine, H. Zmuda, K. H. Kwart, A. G. Horgan, M. Brechbiel: Benzidine rearrangements. 16. The use of heavy-atom kinetic isotope effects in solving the mechanism of the acid-catalyzed rearrangement of hydrazobenzene. The concerted pathway to benzidine and the nonconcerted pathway to diphenyline, in: J. Am. Chem. Soc. 1982, 104, 2501–2509 3. Philip David Josephy, Michael Novak (2013) “Reactive electrophilic metabolites of aromatic amine and amide carcinogens” Frontiers in Bioscience S5, 341-359. 4. Polmar, Norman; Kenneth J. Moore (2004). Brassey's. ed. Cold War Submarines: The Design and Construction of U.S. and Soviet Submarines. pp. 35– 36