Informe 7 Cultivo in Vitro de Meristemos

Cultivo in vitro de meristemos Castro W., Velásquez G .

ESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITO Departamento de Ciencias de la Vida, Facultad de Biotecnología Laboratorio de cultivo de tejidos vegetales Sangolquí-Ecuador RESUMEN

En el presente trabajo se estudió el cultivo in vitro de meristemos con el objetivo de obtener plantas libres de virus y otros patógenos. La metodología utilizada durante este estudio consistió en tomar explantes (yemas apicales) de plantas de Iresine herbstii  que fueron sometidos a una desinfección con una solución solución al 1 % de detergente detergente más cinco cinco gotas de Tween durante 10 minutos, después se las lavo dos veces con agua destilad y una con agua estéril, después se colocó los explantes en una solución de alcohol al 90% durante 1 minuto y una solución de cloro al 2% más tres gotas de Tween Tween 20 durante 10 minutos más. Para la siembra se lavó los explantes tres veces con agua estéril y se los cultivo en medio MS enriquecido con: 1 mg L -1 de KIN, 0,25 mg L-1 de AIA, 100 mg L-1 de mioinositol, 0,5 mg L-1 de tiamina, 2 mg L-1 de glicina, 30 g L-1 de azúcar y 6,5 g L -1 de agar, pH ajustado a 5,2. Después de dos semanas de incubación en luz natural, a 20° C de temperatura y a 62% de humedad en el ambiente, se observó observó oxidación 50,00 %, necrosis 8,33 % de los explantes, contaminación 8,33 % y respuesta 16,66 % en otros.

INTRODUCCIÓN

La Iresine herbstii  es una planta ornamental muy popular debido al color de sus hojas purpura o verde y por sus flores blancas que crecen de manera rápida, otra de las características para que esta planta se encentre en muchos jardines es que en regiones con temperaturas anuales puede permanecer todo el año sin presentar ningún problema (Pereira, 2007). Las plantas ornamentales han sido de gran estudio en los últimas décadas debido al gran poder de comercialización que ellas tiene, por lo que la producción industrial a gran masa de estas especies es de relevante importancia a nivel económico y una de las

mejores formas para hacerlo es la biotecnología por medio del cultivo in vitro. En la actualidad muchas plantas ornamentales como el geranio han sido de intensos estudio tanto en mejoramiento genético como en su propagación masiva (Alonso, 2002). En las yemas se encuentran un grupo de células que conforman los meristemos. La siembra in vitro de meristemos permite regenerar plantas libres de virus, por la gran asepsia que presentan estos explantes (Roca, W. Mroginski, L. 1993). Los meristemos no poseen tejido vascular, lo que los mantiene parcialmente aislados del resto de la planta. Dado que la mayoría de

los virus y bacterias que son endopatógenos de las plantas, se movilizan por los haces vasculares, es por ello que se usa el cultivo in vitro de meristemos para la propagación de plantas que tengan mayor oportunidad de estar libres de patógenos (Frank, S. & Robert, V. 2004) Es importante mencionar que el medio de cultivo que vaya a ser utilizado, debe ser rico en elementos minerales, en particular el potasio debe estar en un nivel alto para una mejor multiplicación vegetativa, teniendo en cuenta estas consideraciones, una buena opción es el medio de cultivo de Murashige y Skoog 1962, (MS), y algunos reguladores de crecimiento, en concentraciones apropiadas, para que cumpla todos los requerimientos de los meristemos y se encuentren en la capacidad de inducir al crecimiento de plantas libres de virus o cualquier contaminación (Smith, R. 1992). El objetivo del presente trabajo fue cultivar in vitro meristemos de Iresine herbstii  utilizando medio MS enriquecido con ciertos reguladores de crecimiento. METODOLOGÍA

Muestreo

Como material experimental se utilizaron explantes de tallo con yema de Iresine herbstii. Desinfección del explante

Se lavó las muestras con agua corriente para retirar todas las impurezas. Posterior a esto se las sumergió en una solución al 1 % de detergente más cinco gotas de Tween 20 durante 10 minutos en agitación. Se enjuagó las muestras, dos veces con agua destilada y

una con agua estéril, se eliminó el agua y se las sumergió en alcohol al 90% durante 1 minuto, sin realizar ningún enjuague se sumergió las muestras en una solución de cloro al 2 % más tres gotas de Tween 20, durante 10 minutos en agitación. Finalmente se procedió a realizar tres lavados con agua estéril dentro de la cámara de siembra. Siembra e Incubación

Después de realizados los tres lavados dentro de la cámara, se colocaron los instrumentos metálicos sobre la superficie, se aspergearon con etanol 90% y se flamearon. Se colocó la muestra sobre la superficie estéril y se quitaron las capas de tejidos hasta llegar al meristemo. Los explantes fueron sembrados en frascos con medio MS enriquecido con: 1 mg L -1 de KIN, 0,25 mg L-1 de AIA, 100 mg L-1 de mioinositol, 0,5 mg L-1 de tiamina, 2 mg L-1 de glicina, 30 g L-1 de azúcar y 6,5 g L-1 de agar, pH ajustado a 5,2, en cada recipiente se colocó un explante. Se incubó dos semanas en luz natural, a 20° C de temperatura y a 62% de humedad en el ambiente y se observo los resultados.

RESULTADOS

Figura 1: Imágenes de los resultados del cultivo in vitro de meristemos de Iresine herbstii  en medio MS; A: explante oxidado; B: explante quemado; C: Respuesta de un explante.

Tabla 1: Resultados del cultivo in vitro de Iresine herbstii en medio MS.

Resultado en los explantes

Número de medios

Porcentaje

Oxidación

6

50,00 %

Quemados

2

16,66 %

Respuesta

2

16,66 %

Contaminados

1

8,33 %

Necrosis

1

8,33 %

Total

12

100 %

En el presente ensayo se obtuvo el 16,66 % (tabla 1) de respuesta de explantes (figura 1 C) de los doce meristemos sembrados, siendo la oxidación de estos uno de los principales inconvenientes con un 50,00 % de explantes como se muestra en la tabla 1 y figura 1 A, algunos otros inconvenientes menores fueron por necrosis y explantes quemados con el 8,33 % y 16,66 % respectivamente y se muestra un porcentaje bajo en la contaminación con un 8,33 %.

DISCUSIÓN

De manera general se puede decir que los meristemos apicales tienen más probabilidad de estar libres de virus que los meristemos axilares los cuales se confirman en los resultados, y que si los meristemos provienen de una planta en plena actividad hay mayor probabilidad de obtener plantas libres de virus. Teniendo en cuenta lo citado anteriormente podemos mencionar que la contaminación (fúngica) observada en los resultados del presente estudio se debió a que algunos de los explantes de los cuales se extrajeron los meristemos fueron yemas axilares. La contaminación bacteriana se presentó en un porcentaje bajo de explantes sembrados lo cual es muy importante ya que este es un factor limitante en el éxito del establecimiento aséptico de los cultivos in vitro. La presencia de microorganismos contaminantes ocurre principalmente cuando la planta donante crece directamente en el campo y está expuesta a plagas, enfermedades, polvo y otros agentes, sin ningún tipo de control ambiental (Ramírez-Villalobos, M. y Salazar, E. 1997). La oxidación de los explantes es decir la generación de sustancias de naturaleza fenólica, cuya oxidación produce un oscurecimiento de los explantes se ve incrementado cundo en el medio existen una excesiva concentración de reguladores de crecimiento (Quintero., et al, 2003). Otro de los motivos por los cuales existe la presencia de compuesto fenólicos se encuentra asociadas con tejidos somáticos vegetales expuestos a situación de estrés, como por ejemplo el daño físico provocado durante el

aislamiento del explante de la planta madre. Los explantes jóvenes de la angiospermas generalmente secretan al medio de cultivo polifenoles oxidados visibles como pigmentos marrones o negros (Olmos., et al, 2010). La necrosis y la oxidación de los explantes tiene un porcentaje alto sobre todo al no incluir al medio de cultivo sustancias que los pueda contrarrestar como carbón activado al igual que el acido cítrico y el acido ascórbico respectivamente (Vega., et al, 2007). Los explantes quemados y necrosados presentes en el cultivo in vitro se deben principalmente por la utilización de alcohol y de cloro a concentraciones altas por largos periodos de tiempo lo cual es necesario estandarizar bien las concentraciones de estos dos métodos de desinfección para bajar los porcentajes de estos resultados (Coba. 2009).

Estos resultados nos pueden llevar a afirmar que para el establecimiento de material vegetal en condiciones in vitro se requiere de la existencia de un banco de donantes que garantice su calidad fitosanitaria (Jiménez, E. 1998).

CONCLUSIONES

Podemos concluir gracias a esto que se ha dado una gran mejoría en los operadores al momento de sembrar los explantes ya que los resultados obtenidos en esta práctica son mucho mejores que prácticas anteriores donde se observó un alto porcentaje de contaminación de 8,33 %.

Los resultados obtenidos en este trabajo indican la necesidad de estandarizar el cultivo in vitro de plantas que se desee investigar y de desarrollar estrategias para lograrlo de mejor manera, como la utilización de muestras producidas en condiciones in vitro, para así tener la completa seguridad de que los explantes utilizados nos garanticen la obtención de plantas libres contaminantes.

El 16,66 % de respuesta en los meristemos de Iresine herbstii  nos indica que la metodología utilizada tanto para la desinfección como para la respuesta de los meristemos fue correcta saco en las concentraciones de alcohol y de cloro y los tiempos de exposición de los explantes por los altos porcentajes en explantes quemados y necrosados de casi un 30,00 % entre los dos.

BIBLIOGRAFÍA

Pereira, C. 2007. “Plnatas y flores, Iresine herbsti i ”. Consultado el 25 de junio del 2011 http://plantayflor.blogspot.com/2008/08/ire sine-herbstii-iresine-el-gnero.html

Alonso, M. 2002. “Biotecnología aplicada a mejora de Pelargonium”. Universidad Complutense de Madrid. Facultad de cc. Biológicas. Bepartamento de Genética. Coba, M. 2009. “Rescate de Fragaria chiloensis var. Huachi especie de frutilla en peligro de extinción, a través de la técnica de cultivo in vitro utilizando meristemos y hojas”. Escuela Politécnica del Ejército Departamento de Ciencias de la Vida Ingeniería en Biotecnología. Frank, S. & V, Robert. 2004. Las Plantas Vasculares: Forma y Función. Consultado el 25 de junio del 2011. http://www.biologia.edu.ar/botanica/tema1 5/15-1vasculares.htm Jimenez, E. 1998. “Cultivo de ápices y meristemos”. Propagación y mejora genética de plantas por biotecnología. Santa Clara. Moutia, M. & Dookun, A. 1999. “Evaluation of surface sterilization and hot water treatment on bacterial contaminants in bud culture of sugarcane”. Expl. Agric. 35: 265274.

Olmos, S. Luciani, G. & E, Galdeano. 2010. “Métodos de propagación y propagación de germoplasma”. Biotecnología y mejoramiento vegetal. 5, (1). Ramírez-Villalobos, M. & Salazar, E. 1997. “Establecimiento in vitro de segmentos nodales de guayabo (Psidium guajava L.)”. Rev. Fac. Agrom. (LUZ). 1997, 14: 497-506 Roca, W. Mroginski, L. 1993 “Cultivo de Tejidos en la Agricultura Fundamentos y Aplicaciones”. Colombia. Sierra, R. 2002. “El Álamo temblón: bases para su cultivo, gestión y conservación”. Editorial Aedos. Primera Edición. España. Smith, R. 1992. “Plant Tissue Culture, Techniques and Experiments”. USA. Academic Press, Inc. Vega C., Bermejo J., Villegas G., Quezada G., Aguilar M., Conde E., 2007. “propagación masiva de Polylepis tomentella Weddell ssp. nana mediante técnicas de cultivo in vitro”